CN105669630A - 适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇h查尔酮的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法，其制备工艺流程为：明日叶→醇水提取→石油醚脱叶绿素→硅胶柱吸附脱氧二氢黄当归醇H查尔酮→水洗脱糖类等水溶性杂质→正己烷与乙酸乙酯的混合溶剂洗脱脱氧二氢黄当归醇H查尔酮→甲醇二次重结晶→脱氧二氢黄当归醇H查尔酮精制品。本发明工艺流程简单、易控，所制得的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮产品纯度高；动物活体对比实验表明：本发明所制得的明日叶脱氧二氢黄当归醇H查尔酮对肝癌细胞间隙血管生长有显著的抑制作用，促进癌细胞坏死，符合靶向药物特征，可作为一种肝癌肿瘤血管生成抑制剂，适于用作肝癌靶向药物。

Description

适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法

技术领域

本发明涉及一种从明日叶中提取查尔酮的方法，尤其涉及一种适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法。

背景技术

癌症已成为21世纪全人类的健康杀手，亦是各国政府和科学家投入大量财力和人力重点攻克的重大科技难题之一。

据全国肿瘤登记中心发布的2012年数据显示，中国每年新增癌症病例约350万，约有250万人因此去世。人一生中患恶性肿瘤的几率是22％，除生活习惯、环境外，诊断与治疗很重要。

在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。其中，肝癌患者所占比例11.6％。从药物治疗消费市场看，2008年中国治癌药市场289.86亿，2014年是837.65亿，增长了17％。靶向药物每天治疗的费用为600-800元，药企的效益可见一斑。

靶向药物是目前最先进的用于治疗癌症的药物，是针对肿瘤基因开发的，能够识别肿瘤细胞上特有的基因，可以阻止癌细胞的生长，是抗肿瘤药重要发展方向。靶向治疗原理：是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点(该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段)，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹”。

2007年3月29日，美国《连线》杂志评出了全球最具“创新精神”的四十强企业，谷歌、苹果和一家名为基因泰克(Genentech)的公司占据了三甲的席位。其中，基因泰克是一家生物制药公司，总部位于美国加利福尼亚州(以下简称加州)旧金山，近年来在美国知名度越来越高，这次能够在众多传统及生物制药同行中独占鳌头，甚至把雅虎、微软等IT行业的巨头也甩在身后，主要得益于他们强大的创新实力，特别是在肿瘤治疗药物研发上的卓越表现。

基因泰克的成功，源于强大的“产品线”，它目前已在三个领域，即肿瘤、免疫、组织生长和修复领域占据了重要地位。但其中，最令同行羡慕的还是它在肿瘤治疗药物，特别是靶向治疗药物的研发方面所取得的巨大成就。基因泰克研发的药物Avastin(音译：阿瓦斯丁)、Heceptin(中文商品名赫赛汀)、Rituxan(在中国叫做Mabthera，中文商品名美罗华)以及Tarceva(中文商品名特罗凯)，均是针对肿瘤抗原的靶向治疗药物，在全球的销量非常可观。以阿瓦斯丁为例，它是一种单克隆抗体，可以选择性地抑制肿瘤细胞的血管内皮生长因子(VEGF)，后者能够刺激新血管形成。因此，在用药后，肿瘤细胞的新生血管难以生成，肿瘤细胞将可能因缺乏养分而被“饿死”。正由于如此巧妙的机制，该药早在问世之前即被业界看好，甚至有媒体称之为“有史以来最好卖的药物”。上市之后，更是深受医生和患者的好评。据悉，仅在2007年第四财季，其销量即已突破6亿美元。目前在美国，这种药物主要与化疗药物联合使用，用于大肠癌转移的治疗。

我国有规模药企约4000家，做靶向药物的企业不足10家。其中，杭州贝达药业的小分子靶向药物“凯美纳”被誉为中国医药“两弹一星”，它2006年获临床实验批文，对照物国际名药“易瑞沙”(英国阿斯利康)。2011年获准上市后，中国成为继美、英之后拥有完全自主知识产权靶向抗癌药的第三个国家；凯美纳也一举打破肺癌靶向治疗长期被进口药垄断的局面，成为全球第三个、亚洲第一个靶向抗癌药。凯美纳2012年销售额达到3.6亿元，2013年销售额达到4.75亿元，刷新了中国创新药物销售纪录。

全国最大药企江苏恒瑞医药股份有限公司2014年12月宣布用于治疗晚期胃癌的新型药物：艾坦(阿帕替尼)正式在上市销售。阿帕替尼是一个全新小分子靶向药物，它是血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)的小分子酪氨酸激酶抑制剂。通过高度选择性竞争细胞内VEGFR-2的ATP结合位点，阻断下游信号转导，抑制酪氨酸激酶的生成从而抑制肿瘤组织新血管的生成，最终达到治疗肿瘤的目的。它是目前标准化疗失败后的晚期胃癌治疗药物中唯一的被证实有效的小分子靶向药物，显著延长晚期胃癌患者的生存时间。艾坦也是国家“十一五”、“十二五”重大新药创制专项，我国首个完全自主研发的抗胃癌新药。

上述靶向药物为化学合成或者生物化学合成药物。在有药效的同时，药物不良反应等毒副总作用较大是这类药的缺陷。2015年医学与生理学诺贝尔奖获得者屠呦呦从中药青蒿中提取的天然药物青蒿素在治疗世界性疾病疟疾方面取得了令世界瞩目的成就，中草药是药物宝库名副其实，它做大的优点就是来自天然产物，毒副作用很小。

明日叶，又名长寿草、长寿菜等，属原生芹科多年生草本植物，因其具有今日采剪明日就长出新芽的极强生长能力，故而获得明日叶之称。

我国名医李时珍早在《本草纲目》(1593年)中将明日叶谓之“滨海当归”，明确其味甘、辛，性温，归肝、心、大肠经。在日本著《大和本草》(1709年)和《重订本草纲目启蒙》(1844年)中均有明日叶可强壮身体、保健益寿之功效的记载。近十多年来的国内外研究发现，明日叶含有10多种矿物元素、16种必需氨基酸以及丰富的叶绿素、黄酮泛酸、胆碱、芸香苷等活性物质；食用明日叶对风湿痛、糖尿病、脂肪肝、肝硬化、动脉硬化、高血压等多种疾病有一定预防和治疗作用。

国内近2-3年来已有种植明日叶和生产明日叶茶、胶囊、饮片等保健品，以及面条、甜点等食品的宣传报道。国内外已有大量研究证明，明日叶安全无毒，是一种市场前景光明的天然药物资源，目前已成为国内外在天然植物化学物与药草领域中的一大研究热点。

查尔酮是一类含有二苯基丙烯酮结构及其衍生物的化合物，在明日叶的根、茎、叶中均有较高含量，其中以根部的含量最为丰富。目前在明日叶中已分离鉴定出8种查尔酮类物质，其中含量最多的为黄当归醇与4-羟基德里辛。查尔酮类物质分子结构柔性较大，易与受体结合，能表现出多方面生物活性，也是一种重要的有机药中间体。国内外均有研究报道，明日叶查尔酮类物质具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗肿瘤、降血脂、降血压等多种生物活性，其中以对肿瘤细胞的抑制作用特别引人关注；有体外研究报道，查尔酮能够诱发人类神经母细胞瘤细胞(IMR-32)的细胞凋亡，抑制其生长，且随着浓度升高其抑制率也随之提高。

还有研究报道，查尔酮对HL-60、CRL1579、A549/AZ521等人类肿瘤细胞株均有细胞毒性作用，抑制其生长增殖。体内动物实验则显示，查尔酮对小鼠皮肤癌、腹水瘤、肝癌等肿瘤均有良好的抑制作用。有研究认为，明日叶查尔酮的抑瘤机制，可能是通过调控caspase-3、Bax以及DJ-1等蛋白的表达，从而引发肿瘤细胞的凋亡来实现的。肿瘤血管生成与肿瘤的生长进展有密切关系，以肿瘤血管生成为靶向是目前肿瘤治疗的一种重要手段，但至今尚未见有关于明日叶查尔酮对肿瘤血管生成影响作用的研究报道。

目前查尔酮的获得还是从明日叶干粉或者新鲜叶茎中提取，并获得了一定规模的生产。在已有的技术中，所获得的查尔酮产品为明日叶全酮产品，然而在明日叶中已知有8种查尔酮类衍生物，单一的查尔酮，尤其是脱氧双氢黄当归醇H查尔酮的制备方法以及在肝癌治疗方面的应用目前未见有报道。

发明内容

本发明的目的是，提供一种适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法，其工艺简单、提取率高，所制得的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮纯度高。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是，一种适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，按质量比1︰6，将明日叶与醇水体系混合，升温到70℃搅拌浸取24h后过滤，得滤液A；其中，所述醇水体系的醇水比为体积比5︰1；

第二步，将所得滤液A与石油醚按体积比1︰1的比例混合，室温下搅拌10h；

然后，静置分层，再除去叶绿素杂质，取水醇相B。

第三步，将水醇相B上硅胶柱置换反应3h；

然后，水洗，以除去糖类及其他水溶性小分子；

最后，用正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂洗脱、蒸发、烘干，得到脱氧双氢黄当归醇H查尔酮粗品C；

上述正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂中，正己烷与乙酸乙酯的体积比为1-5︰1-3；

第四步，将脱氧双氢黄当归醇H查尔酮粗品C用甲醇溶解，重结晶2-3次，除去杂质，即得脱氧二氢黄当归醇H查尔酮成品。

优选为，上述醇水体系中的醇为甲醇、乙醇或丙三醇。

进一步优选，上述明日叶为新鲜明日叶或者经过自然晾晒干燥后，再经烘干干燥、粉碎得到的含水量在10％以下的干粉。

进一步优选，采用上述适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法所制得的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮，可用作肝癌靶向药物，24h给药量≥25mg/kg。

上述技术方案直接带来的技术效果是，工艺流程简单、易控，所制得的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮产品纯度高。

按照上述的适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法，脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取率为0.87-3.84％；

说明：采用上述适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法所制得的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮，其结构是为：

实验结果表明：按上述方法所制得的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮，用小鼠做活体实验，结果表明：其对肝癌细胞间隙血管的生长具有显著的抑制作用，可促进癌细胞坏死，符合靶向药物特征，可用作治疗肝癌的靶向药物，24h给药量≥25mg/kg。

附图说明

图1为实施例1所制得的产品在光学显微镜下的照片；

图2为实施例1所制得的产品的紫外和可见光谱分析谱图；

图3为实施例1所制得的产品的红外光谱分析谱图；

图4为实施例1所制得的产品的质谱分析谱图；

图5-A为实施例1所制得的产品动物活体对比实验肿瘤对照组电镜照片；

图5-B为实施例1所制得的产品动物活体对比实验低剂量B组电镜照片；

图5-C为实施例1所制得的产品动物活体对比实验高剂量C组电镜照片；

图5-D为实施例1所制得的产品动物活体对比实验恩度组电镜照片。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

提取方法，步骤如下：

第一步，将1Kg新鲜明日叶打成料浆，按料浆与醇水比5:1(V/V)的醇水体系1:6的比例混合，升温到70℃搅拌浸取24h后过滤，得滤液A6.5L。

第二步，将A和石油醚按体积比1:1比例混合，室温搅拌10h，静置分层，除去叶绿素杂质，取水醇相B6L。

第三步，将B上硅胶柱置换反应3h，水洗除去糖类等水溶性小分子，最后用正己烷：乙酸乙酯＝1:1的混合溶剂洗脱得滤液3.6L，蒸发、烘干，得到脱氧双氢黄当归醇H查尔酮粗品C18.3g。

第四步，将C用甲醇溶解，重结晶2次，得到脱氧二氢黄当归醇H查尔酮精制品10.2g，提取率1.02％。

实施例2

除正己烷：乙酸乙酯＝1:3、重结晶次数为3次之外，其余均同实施例1。

说明：所得到脱氧二氢黄当归醇H查尔酮精制品9.3g，提取率0.93％。

实施例3

除正己烷：乙酸乙酯＝5:1之外，其余均同实施例1。

说明：所得到脱氧二氢黄当归醇H查尔酮精制品11.5g，提取率11.5％。

实施例4

除正己烷：乙酸乙酯＝2:1、重结晶次数为3次之外，其余均同实施例1。

说明：所得到脱氧二氢黄当归醇H查尔酮精制品8.7g，提取率0.87％。

实施例5

提取方法，包括以下步骤：

(1)将1Kg明日叶干粉，按与醇水比5:1(V/V)的醇水体系1:6的比例混合，升温到70℃搅拌浸取24h后过滤，得滤液A：5.3L。

(2)将A和石油醚按体积比1:1比例混合，室温搅拌10h，静置分层，除去叶绿素杂质，取水醇相B：4.7L。

(3)将B上硅胶柱置换反应3h，水洗除去糖类等水溶性小分子，最后用正己烷：乙酸乙酯＝1:1的混合溶剂洗脱得滤液3.1L，蒸发、烘干，得到双氢黄当归醇H查尔酮粗品C57.1g。

(4)将C用甲醇溶解，重结晶2次，得到脱氧二氢黄当归醇H查尔酮精制品38.4g，提取率3.84％。

实施例6

除正己烷：乙酸乙酯＝3:1、重结晶次数为3次之外，其余均同实施例5。

说明：所得到脱氧二氢黄当归醇H查尔酮精制品30.7g，提取率3.07％。

实施例7

除正己烷：乙酸乙酯＝1:3、重结晶次数为3次之外，其余均同实施例5。

说明：所得到脱氧二氢黄当归醇H查尔酮精制品32.4g，提取率3.24％。

产品的检验与检测：

选取实施例1作为代表性实施例，将实施例1所制得的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮样品，分别进行可见光光学显微镜下观测产品外观、紫外和可见光谱分析、红外光谱分析、质谱分析和动物活体实验。结果分别如图1-5所示，具体如下：

1、可见光光学显微镜下观测产品外观

取所制得的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮晶体在玻璃片上展开，置于可见光光学显微镜下观测晶体颜色和外观形状，如图1所示，能清楚看到淡黄色针状晶体。

2、紫外、可见光谱分析结果：

如图2所示，紫外和可见光区最大吸收峰有1个宽峰：λmax＝350-430nm。

因为在蓝紫色短波区有明显吸收，故晶体呈淡黄色。

3、红外光谱分析

如图3所示，在3400处有酚羟基吸收峰，在2910、2830处有甲基、亚甲基吸收峰，在1603处有羰基吸收峰，1039处有甲氧基吸收峰，603处有宽的苯环吸收峰。

说明：以上特征峰与脱氧二氢黄当归醇H查尔酮结构相呼应。

4、质谱分析

说明：图4的质谱图中，每一条线表示一个峰，代表一种离子；图中的横坐标为离子质荷比(m/z)的数值，纵坐标为相对强度，即每一个峰和最高峰(称基峰)的比值。

如图4所示，最高峰质量＝337.10；最大m/z＝355。

说明：最高峰质量337.10的物质为脱氧二氢黄当归醇H，这与文献值相一致。

5、动物活体对比实验：

实验对象：小鼠活体；

实验目的：对小鼠肝癌肿瘤细胞血管生成的抑制作用；

5.1实验材料

5.1.1明日叶脱氧二氢黄当归醇H查尔酮样品。

5.1.2实验动物与细胞

SPF健康级昆明种小鼠(合格证号SC)(K鲁20080002)由山东鲁抗医药实验动物中心提供，体重20±2g，数量60只，雌雄各半，常规饲养，适应性饲养1周。

H22肝癌细胞种鼠由山东医学科学院药物研究所提供，腹水传代，第三代用于实验。

5.1.3主要试剂及药品

RPMI-1640培养液，胎牛血清：赛默飞世尔生物化学制品有限公司；优级胎牛血清：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；噻唑蓝(MTT)：美国Sigma-Aldrich公司；DMSO：北京索莱宝科技有限公司；二氨基联苯胺显色液(DAB)试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司；多聚赖氨酸、一抗、SP、Dab：河北博海生物工程开发有限公司；恩度(已上市靶向药物，本实验作为对照试样)：山东先声麦得津生物制药有限公司。

3.1.4主要仪器和设备

超低温冰箱：Thermo-Scientific-Forma702型，美国赛默飞世尔科技有限公司；显微镜：BX51T-PHD-J11型，日本Olympus公司；倒置生物显微镜：XDS-1B型，重庆光电仪器有限公司；CMOS：日本Olympus公司；多功能真彩色细胞图象分析系统：美国MediaCyberneticsImage-ProPlus；流式细胞仪：FC-500MPL型，美国贝克曼库尔特公司；全自动酶标仪：RT-6000型，美国Rayto公司。

5.2动物活体实验方法与步骤：

5.2.1动物模型

移植原代H22肝癌细胞于小鼠腹腔并传代6d，无菌条件下抽取2ml腹水，加入一定比例生理盐水进行稀释后用0.4％台盼蓝计数，要求细胞活力＞95％，再按常规方法将处于对数生长期的细胞制成细胞悬液(1×104ml)，取0.2mlH22肝癌细胞悬液在消毒后的受试小鼠右腋窝处接种。动物模型建立操作流程在1h内完成。

5.2.2动物实验分组

50只SPF健康级昆明种小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半；每组处理条件如下：

1)低剂量B组：以5mg/kg浓度AC体积灌胃；

2)高剂量C组：以50mg/kg浓度AC体积灌胃；

3)恩度处理组(阳性对照组)：给予等量生理盐水灌胃，并以4mg/kg剂量腹腔注射恩度；

4)肿瘤对照组：给予等量的生理盐水灌胃及腹腔注射。

上述各组处理每天早晨7点1次，连续处理10d，第11d受试小鼠眼球取血后颈椎脱臼全部处死，取瘤组织待检。

5.2.3微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达

本实验采用免疫组化法检测MVD及VEGF蛋白的表达，具体实验步骤如下：

1)取材：将小鼠右腋窝下移植瘤组织剥离，用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗后分解成小的组织块；

2)固定和包埋：上步骤所得的组织用4％多聚甲醛进行固定，后用不同浓度的乙醇进行浸泡(70％乙醇30min、80％乙醇30min、90％乙醇30min两次、95％乙醇30min2次、100％乙醇30min2次)，再经二甲苯浸泡30min2次、55℃石蜡中浸泡30min2次，然后用铜制模具包埋；

3)切片：将组织切成厚度为5μm的薄切片，后附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，并在60℃下过夜；

4)脱蜡、入水：将步骤3所得薄切片按以下顺序浸泡：二甲苯浸泡5min2次，100％乙醇、95％乙醇、90％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各5min2次，用自来水冲洗后再用PBS冲洗2次；

5)1％甲醇双氧水，室温10min，蒸馏水洗1次，0.1MPBS洗3次×5min；

6)于切片滴加抗原修复液，室温10min，0.1MPBS洗3次×5min；

7)于切片滴加正常山羊血清封闭液，室温20min，并甩去多余液体；

8)于切片滴加第一抗体，4℃下过夜，0.1MPBS洗3次×5min；

9)于切片滴加生物素化第二抗体(IgG)，37℃、20min，0.1MPBS洗3次×5min；

10)于切片滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃、20min，0.1MPBS洗3次×5min；

11)显色剂(DAB)显色:采用DAB显色试剂盒，1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀加至标本上，显色6min后充分水洗；

12)苏木素复染细胞核1min，用水充分漂洗，用1％盐酸酒精分化，再经1％胺水反蓝、充分水洗，经不同浓度乙醇依次脱水(70％乙醇5min、80％乙醇5min、90％乙醇5min2次、95％乙醇5min2次、100％乙醇5min2次)脱水，二甲苯5min2次脱水，后用中性树脂封片；

13)观察：用显微镜观察实验组及对照组的组织相(阳性、阴性)。每个切片随机选择5个视野，400×400放大，在显微镜下每个视野细胞中(1000细胞)，计算阳性细胞的百分比。VEGF计数方法参照Park等所述方法。

MVD则按照Weidner的方法来计算：在低倍镜下选择CD34阳性细胞密度最高的地区，然后转换到高倍镜(×400)，其中每个孤立棕色的血管内皮细胞或内皮细胞集群视作一个血管化，每个样本随机选择5个视野，计算微血管密度。

5.2.4统计学分析

所有的数据均采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，以均数±标准差(x±s)表示。多组数据间比较采用单因素方差分析，两组比较釆用t检验，显著性概率P<0.05为差异有统计学意义

(说明：P>0.05表示无显著性差异；0.01<P<0.05表示显著性差异，以*标记；P<0.01表示极显著性差异，则以**标记；以下均同)。

5.3实验结果与分析

5.3.1明日叶脱氧二氢黄当归醇H查尔酮对H22肝癌小鼠移植瘤细胞増殖活性的影响各组细胞增殖活性测定结果如表1。高剂量C组和恩度对照组肿瘤细胞增殖活性分别为0.506±0.032、0.516±0.014，较肿瘤对照组(1.330±0.089)均显著性降低(P＜0.05)，低剂量B组相较则无显著性差异(P＞0.05)。

表1各组小鼠肝癌细胞增殖活性(x±s，n＝10)

分组	n	增殖活性(A)	抑制率(％)
				肿瘤对照组	10	1.330±0.089	—
低剂量B组	10	0.982±0.052b	26.23
				高剂量C组	10	0.506±0.032a	62.04
恩度组	10	0.516±0.014a	61.29

说明：上表1中a表示P＜0.05，b表示P＞0.05。

5.3.2明日叶脱氧二氢黄当归醇H查尔酮对小鼠H22肝癌移植瘤MVD蛋白表达的影响

1)肉眼观察肿瘤血管生成情况

肿瘤对照组和低剂量B组瘤组织体积大、颜色红润、质脆，瘤块假膜不完整，部分浸润生长至腿部肌肉，剥离时易出血；高剂量C组与恩度组体积相对较小，颜色略苍白、质韧，瘤块假膜完整，剥离时基本无出血。

2)显微镜观察肿瘤血管生成情况

肿瘤对照组和低剂量B组均表现为肿瘤组织内小片坏死，肿瘤细胞生长旺盛，间质血管丰富；高剂量C组与恩度组则表现为肿瘤组织内坏死区增大，间质血管较稀少，有明显的纤维化形成。

3)MVD计数及其蛋白图像

由表2可见，低剂量B组与肿瘤对照组相比，MVD计数没有明显差异(P＞0.05)；高剂量C组MVD计数分别为4.5±1.286，与肿瘤对照组相比，MVD计数均有显著性差异(P＜0.05)：

表2小鼠肝癌MVD计数

说明:上表2中a，与肿瘤对照组比较，P＜0.05；b，与肿瘤对照组比较，P＞0.05。

如图5-B所示，与肿瘤对照组相比，低剂量B组小鼠肿瘤显微镜下棕褐色微血管数目差异不明显，血管分布较浓密；相反，如图5-C所示，高剂量C组以及恩度组小鼠肿瘤在显微镜观察下呈棕褐色条索状，血管稀疏，微血管密度明显下降，即生成或生长受到明显抑制。

5.3.3明日叶脱氧二氢黄当归醇H查尔酮对小鼠H22肝癌移植瘤VEGF蛋白表达的影响结果由表3和图5可知，肿瘤对照组中阳性表达细胞数目多而且颜色深，呈现强表达(见图5-A)，阳性表达率为56.26％。

高剂量C组与恩度组中阳性表达细胞数目少且颜色浅，呈现弱表达(分别见图5-C、图5-D)，阳性表达率分别26.12％和12.22％，明显低于肿瘤对照组(P＜0.05)。

各组评分见下表3。

表3小鼠H22肝癌内皮细胞VEGF蛋白的表达

分组	n	阳性细胞数(n)	阳性率％(A)	显色强度(B)	评分IHS
						肿瘤对照组	5000	2813	56.26	3	9
低剂量AC组	5000	2188	43.75	3	6
						高剂量AC组	5000	1306	26.12*	2	4
恩度组	5000	611	12.22*	1	2

说明：上表3中“*”组，与肿瘤对照组相比，P＜0.05。

评分标准：IHS＝A×B。其中，A为阳性细胞数分级0～1％＝0、1～10％＝1、10～50％＝2、50～80％＝3、80～100％＝4；B为阳性细胞显色强度分级0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)。

5.4结论

血管生成是机体形成新生血管组织的过程，血管生成的发生分为生理性及病理性两类情况，生理方面有胚胎发育及子宫内膜增生等，而病理方面则常常在创伤修复、慢性炎症、免疫反应以及肿瘤生成过程中发生。大量实验结论证实：肿瘤血管生成是一个复杂的过程，对肿瘤的生长十分重要，是肿瘤代谢的关键途径，与肿瘤的生长、转移等均有着密切的关系。如果肿瘤中无新血管生成，肿瘤将处于休眠或“饿死”状态。

MVD是利用针对血管内皮细胞抗原的免疫组化技术对肿瘤血管进行定量，可直接量化反映肿瘤血管生成的程度，是评估肿瘤血管生成水平的重要指标。大量研究证实，MVD是一个独立而重要的预后因素，MVD的增高往往预示着肿瘤组织正在快速生长、易发生转移与预后不良。

本实验结果显示，高剂量C组(图5-C)较肿瘤对照组(图5-A)小鼠肿瘤组织在显微镜观察下呈棕褐色条索状，血管稀疏，微血管密度明显下降，在MVD计数结果中，高剂量C组MVD计数分别为4.5±1.286，与肿瘤对照组相比，均有显著性差异(P＜0.05)，该结果与染色观察结果一致。

低剂量B组与高剂量C组MVD计数比较均有显著性差异,说明明日叶脱氧二氢黄当归醇H查尔酮对MVD的表达水平具有剂量-效应关系。

血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤学领域药物发展和基础研究重要指标。

VEGF诱导的血管渗透性导致蛋白在间质沉积，从而促进血管生成。

VEGF的过量表达则与多种肿瘤的发展和恶性预后有关，如肝癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌等。本实验中，肿瘤对照组VEGF阳性表达细胞数目多而且颜色深，呈现强表达，而高剂量C组VEGF阳性表达细胞数目少且颜色浅，呈现弱表达，阳性表达率均显著低于肿瘤对照组，说明明日叶脱氧二氢黄当归醇H查尔酮可通过降低VEGF水平来抑制H22肝癌小鼠肿瘤组织的生长。其抑制作用水平与已上市靶向药物恩度(参见图5-D)相当。

动物活体对比实验表明：本发明所制得的明日叶脱氧二氢黄当归醇H查尔酮，可作为一种肝癌肿瘤血管生成抑制剂，适用于作肝癌靶向药物。

Claims (5)

1.一种适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，按质量比1︰6，将明日叶与醇水体系混合，升温到70℃搅拌浸取24h后过滤，得滤液A；其中，所述醇水体系的醇水比为体积比5︰1；

第二步，将所得滤液A与石油醚按体积比1︰1的比例混合，室温下搅拌10h；

然后，静置分层，再除去叶绿素杂质，取水醇相B。

第三步，将水醇相B上硅胶柱置换反应3h；

然后，水洗，以除去糖类及其他水溶性小分子；

最后，用正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂洗脱、蒸发、烘干，得到脱氧双氢黄当归醇H查尔酮粗品C；

上述正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂中，正己烷与乙酸乙酯的体积比为1-5︰1-3；

第四步，将脱氧双氢黄当归醇H查尔酮粗品C用甲醇溶解，重结晶2-3次，除去杂质，即得脱氧二氢黄当归醇H查尔酮成品。

2.根据权利要求1所述的适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法，其特征在于，所述醇水体系中的醇为甲醇、乙醇或丙三醇。

3.根据权利要求1或2所述的适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法，其特征在于，所述明日叶为新鲜明日叶或者经过自然晾晒干燥后，再经烘干干燥、粉碎得到的含水量在10％以下的干粉。

4.根据权利要求1或2所述的适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法，其特征在于，所述脱氧二氢黄当归醇H查尔酮可用作肝癌靶向药物，24h给药量≥25mg/kg。

5.根据权利要求4所述的适于用作肝癌靶向药物的脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的提取方法，其特征在于，所述脱氧二氢黄当归醇H查尔酮的结构是为：