CN107174595B - 桐花树叶正丁醇提取物及其制备和治疗前列腺癌的应用 - Google Patents
桐花树叶正丁醇提取物及其制备和治疗前列腺癌的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种桐花树叶正丁醇提取物及其制备方法,将桐花树叶加入乙醇浸泡得到桐花树叶乙醇总提物,将乙醇总提物中乙醇挥发后,加入石油醚进行萃取,获取下层水相,下层水相先加乙酸乙酯进行萃取,获得下层水相后加正丁醇继续萃取,获取上层正丁醇部位提取物,再经水浴干燥,即得。体外分子生物学实验研究表明,桐花树叶正丁醇提取物对人前列腺癌PC3、DU145细胞具有增殖抑制作用,并可抑制人前列腺癌细胞PC3和DU145的转移。因此,桐花树叶正丁醇提取物在制备治疗前列腺癌药物方面具有潜在应用前景,可用于制备抗前列腺癌药物。深入开发桐花树叶正丁醇提取物可以扩大桐花树的使用范围,为癌症治疗开辟新途径。
Description
技术领域
本发明属于桐花树技术领域,尤其涉及一种桐花树叶正丁醇提取物及其制备和治疗前列腺癌的应用。
背景技术
红树林植物桐花树(Aegiceras corniculatum),又名蜡烛果,浪柴,红蒴等,系紫金牛科蜡烛果属植物,属红树植物分布很广的植物之一,一般分布在热带,亚热带海岸的中滩、内滩。民间用药记载其茎皮和叶熬汁对糖尿病、哮喘和风湿等疾病有一定的疗效。现代药理研究发现桐花树提取物具有细胞毒性、抗真菌、止泻、抗氧化与保肝等药理作用,但对桐花树叶正丁醇部位提取物抗癌的研究尚未见有报道。
前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是老年男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一,其发病率居欧美发达国家男性恶性肿瘤之首,死亡率居第2位,仅次于肺癌。随着我国人口老龄化和生活方式的改变、男性平均寿命的延长以及医学诊断技术的提高,我国PCa发病率和检出率已呈显著上升趋势。
由于PCa发病隐匿,早期临床症状常不典型。因此,大多数PCa确诊时已发生转移或进入晚期。PCa的发病主要受年龄、种族和家庭遗传的影响,同时也与激素、营养有关。其主要的治疗方法有雄激素剥夺疗法、根治性前列腺切除术、化疗和局部照射疗等。目前,80%以上的PCa晚期患者在临床上使用雄激素阻断治疗,但这是一种有争议的并且疗效不明确的治疗手段。超过半数的PCa晚期患者在接受化疗药物/靶向治疗后(如紫杉醇或多烯紫杉醇),很快会出现耐药,不得不采用其他的姑息疗法,例如使用磷酸雌二醇氮芥(Estramustine Phosphate,EMP),以及类固醇进行治疗。但是,临床效果令人失望。大约有半数以上的患者在一至两年内死亡。因此,从中医药中寻求新型、安全有效的的治疗药物是目前治疗前列腺癌的重要研究方向。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种桐花树叶正丁醇提取物及其制备和治疗前列腺癌的应用,以扩大桐花树的使用范围,为癌症治疗开辟新途径。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
桐花树叶正丁醇提取物在制备治疗前列腺癌药物方面的应用。
药物为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膏剂、合剂、混悬剂,该药物以桐花树叶正丁醇部位为活性成分,加入常规辅料按照常规工艺制成。
前列腺癌源于人前列腺癌细胞PC3、DU145。
桐花树叶正丁醇提取物的制备方法,将桐花树叶加入乙醇浸泡得到桐花树叶乙醇总提物,将乙醇总提物中乙醇挥发后,加入石油醚进行萃取,获取下层水相,下层水相先加乙酸乙酯后加正丁醇继续萃取,获取上层正丁醇部位提取物,再经水浴干燥,即得。
上述桐花树叶正丁醇提取物的制备方法,按以下操作进行:将桐花树叶晒干打成粗粉,加入25倍量95%乙醇浸泡7天;通过减压浓缩得到桐花树叶乙醇总提物,将乙醇总提物加纯水溶解成混悬液,挥发至无乙醇味后,加入石油醚进行萃取,获取下层水相,将下层水相加乙酸乙酯继续萃取,得到的下层水相继续加正丁醇继续萃取,获得上层正丁醇部位提取物,将上层正丁醇部位提取物水浴干燥,即得桐花树叶正丁醇提取物。
上述制备方法得到的桐花树叶正丁醇提取物。
为充分开发桐花树资源,发明人建立了一种桐花树叶正丁醇提取物的制备方法,将桐花树叶加入乙醇浸泡得到桐花树叶乙醇总提物,将乙醇总提物中乙醇挥发后,加入石油醚进行萃取,获取下层水相,下层水相先加乙酸乙酯后加正丁醇继续萃取,获取上层正丁醇部位提取物,再经水浴干燥,即得。体外分子生物学实验研究表明,桐花树叶正丁醇提取物对人前列腺癌PC3、DU145细胞具有增殖抑制作用,并可抑制人前列腺癌细胞PC3和DU145的转移。因此,桐花树叶正丁醇提取物在制备治疗前列腺癌药物方面具有潜在应用前景,可用于制备抗前列腺癌药物。深入开发桐花树叶正丁醇提取物可以扩大桐花树的使用范围,为癌症治疗开辟新途径。
附图说明
图1是本发明桐花树叶正丁醇提取物对人前列腺癌细胞增殖抑制作用的结果图。
图2是本发明桐花树叶正丁醇提取物对人前列腺癌细胞活性影响的平板克隆形成实验结果图。
图3是本发明桐花树叶正丁醇提取物对人前列腺癌细胞活性影响的结果柱状图。
图4是本发明桐花树叶正丁醇提取物对人前列腺癌细胞迁移抑制作用的划痕实验结果图。
图5是本发明桐花树叶正丁醇提取物对人前列腺癌细胞迁移抑制作用结果的柱状图。
图6是本发明桐花树叶正丁醇提取物诱导前列腺癌细胞凋亡结果的流式细胞仪图。
图7是本发明桐花树叶正丁醇提取物诱导前列腺癌细胞凋亡结果的柱状图。
具体实施方式
一、桐花树叶正丁醇部位提取物(NACL)的制备
1.药材:桐花树叶采于广西防城港,经广西北部湾海洋研究中心许铭本鉴定为金牛科蜡烛果属植物桐花树的叶子。
2.提取与分离:将桐花树叶晒干打成粗粉(2500g),加入25倍量(62.5L)95%乙醇浸泡7天;通过减压浓缩得到桐花树叶乙醇总提物,将乙醇总提物加纯水溶解成混悬液,挥发至无乙醇味后,加入石油醚进行萃取,获取下层水相,将下层水相加乙酸乙酯继续萃取,得到的下层水相继续加正丁醇继续萃取,获得上层正丁醇部位提取物,将上层正丁醇部位提取物水浴干燥,即得桐花树叶正丁醇提取物。
二、桐花树叶正丁醇部位提取物药效学研究
1.实验材料
细胞株——人前列腺癌细胞PC3,DU145由广西医科大学转化医学研究中心提供。
药材——桐花树叶
主要试剂和耗材——
主要试剂——
凋亡试剂盒(Pharmingen FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit 1):美国RayBiotech公司;
细胞增殖检测试剂盒(MTS):美国promega公司;
结晶紫染色液:中国碧云天公司;
氯仿、异丙醇、无水乙醇、水合氯醛等为国产分析纯试剂。
主要耗材——
25cm2细胞培养瓶:美国BD公司;
6cm细胞培养皿、10cm细胞培养皿:美国BD公司;
细胞6孔板、24孔板、96孔板:美国BD公司;
15毫升离心管、50毫升离心管:美国BD公司;
冻存管:美国BD公司;
移液管:美国corning公司;
枪头盒、EP管、PCR管:美国AXYGEN公司;
主要仪器——
电动移液器、可调式移液器、低温高速离心机:德国Eppendorf公司生产;
细胞培养孵箱、生物安全柜、液氮罐:美国Thermo科学公司;
-80℃生物超低温冰箱:美国Thermo科学公司;
超净工作台:苏州金净公司;
37℃细菌培养箱、烤箱:中国精宏公司;
倒置荧光显微镜:日本OLYMPUS公司;
掌上离心机:美国Thermo Fisher Scientific公司;
高压灭菌锅、-20℃生物冰箱、4℃生物冰箱:中国海尔公司;
碎冰制冰机:日本Sanyo公司;
计算机:中国联想公司;
Nanodrop 2000分光光度计:美国Thermo Scientific公司;
电磁搅拌器、酶联免疫检测仪:美国Thermo Scientific公司。
2.实验方法
2.1 细胞增殖实验(MTS)
(1)待细胞处于对数生长期时,用真空泵吸走细胞培养基,加入DPBS清洗细胞,弃掉DPBS后加入0.25%胰酶,待细胞大部分都可以脱离培养瓶时,加入含10%胎牛血清的完全培养基终止消化,用移液枪吸取培养液将细胞从培养瓶壁上吹打下来,转移至15ml离心管中,放入离心机中设置1000转/分钟,离心3分钟,用真空泵吸走上清,加入5ml完全培养基重悬、混匀,进行细胞计数,重悬,将细胞的密度调整为2×104个/ml,在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液,即使得每个孔2000个细胞,每组设置3个复孔,共设5个给药梯度组(25,37.5,50,75,100μg/ml),以及培养液对照组、DMSO对照组。置于37℃,5%CO2恒温孵箱中进行常规培养。
(2)配置待测药物母液:取待测药物0.2g溶解于2ml DMSO中配成100mg/ml的母液,提取物不易溶解,需置于超声仪超声溶解,并用0.22μm尼龙过滤筛过滤后分装于EP管,保存于-20℃。
(3)待细胞培养贴壁后,各列分别加入不同浓度梯度的桐花树叶正丁醇部位提取物(25,37.5,50,75,100μg/ml),对照组加入等体积的含对应浓度DMSO的完全培养基,以及单独只含完全培养基的对照组。继续培养24、48、72h。
(4)分别在培养24、48、72h后,用排枪于每孔加入20μl完全融化后的Cell Titer96 Aqueous One Solution Reagent,然后将细胞放回培养箱中继续培养2h,于酶标仪上在490nm波光处处读取吸光度值。将无细胞仅含培养基的孔作为空白孔,制作表格,纵坐标为细胞活力,横坐标为药物浓度,绘制出MTS结果图。并用软件计算细胞生长抑制率,其公式为:
(5)以上实验重复3次,用SPSS 21检验统计分析,与空白组相比,P<0.01,差异有显著性;并用GraphPad Prism 5作线性图,求出IC50。
2.2 单细胞克隆形成实验
(1)取对数生长期的细胞常规消化,重悬细胞,反复吹打,尽量使细胞充分分散,使分散度达到95%以上,细胞计数,调整细胞浓度为200个/ml,每孔接种2ml于6孔板中,培养过夜。
(2)第二天加药,设两个药物浓度,分别为12.5,25μg/ml,另设一个空白组(完全培养液)。
(3)细胞经药物作用4天后,弃掉培养液,重新给同样的药物。
(4)当两个细胞团交合时,用真空泵吸走培养液,加DPBS缓冲液清洗两次,然后用4%的多聚甲醛固定15min。
(5)吸弃多聚甲醛,用结晶紫染色液染色35min。
(6)回收结晶紫,用DPBS缓冲液清洗两次,吸走DPBS缓冲液,将六孔板用扫描仪扫描。
(7)用SPSS 21检验统计分析本实验重复三次的结果,与空白组相比,P<0.01,差异有显著性,并用GraphPad Prism 5作柱状图;
2.3 细胞划痕实验
(1)在6孔板的背面借助直尺用marker笔画横线,每条线距离大约0.5cm左右,使6孔板的每个孔有5条直线经过。
(2)将细胞消化下来的细胞离心后重悬计数后,以8×105个/孔接种于6孔板中,每组设置2个复孔。
(3)第二天细胞贴壁后铺满整个孔时,用丝裂霉素(0.5μg/ml)处理细胞,DU145处理浓度为10μg/ml,PC320μg/ml,3小时后,再辅助以直尺,用10μl的枪头均匀的于六孔板背面上标记的线画痕,确保画的每条痕宽度一致,垂直背面的直线。
(4)用真空泵吸去含丝裂霉素的培养基,用DPBS清洗2遍六孔板后弃掉,加入完全培养基。给药组浓度为12.5μg/ml,空白组为完全培养基。分别于22h时于显微镜下拍照,拍照时确保每孔每次拍照的位置保持一致。
(5)运用image J进行伤口面积分析,计算伤口愈合率。细胞爬行的距离即0小时的宽度减去该时间点的宽度。迁移率=1-拍照时的伤口面积/0小时伤口面积×100%。用SPSS21检验统计分析,与空白组相比,P<0.01,差异有显著性,并用GraphPad Prism 5作柱状图;
2.4 细胞凋亡
(1)取对数生长期的细胞消化后接种于六孔板,于第二天给药,设置两个浓度组,一个对照组。药物处理24h、48h、72h后,用BD细胞周期试剂盒处理细胞。
(2)取适量BD凋亡试剂盒中10×缓冲盐溶液配成1×的缓冲液。分别在24、48、72h将三组细胞取出,弃去上清,加入提前预冷的DPBS清洗。加入0.25%胰酶消化细胞,用移液枪吸取培养液将细胞从培养瓶壁上吹打下来,转移至15ml离心管中,放入离心机中设置1000转/分钟,离心3分钟,去掉上清。
(3)取6个EP管,以A-F命名,用1×缓冲盐溶液重悬各组细胞,计数后调为1×106个/ml,从空白组分别取100μl细胞悬浮液于A-D四个EP管,从两个给药组分别取100μl细胞悬浮液于E,F管。
(4)向A,E,F管分别加入BD凋亡试剂盒中的AV和PI试剂各5μl。向B管加入5μl AV试剂,C管加入5μl PI试剂,混匀后置于黑暗的室温中避光存放15min。
(5)于每个EP管中分别加入1×的缓冲盐溶液400μl,混匀静置15min后用流式细胞仪进行检测。
(6)用软件GraphPad Prism 5分析作柱状图。
2.5 统计学分析
应用SPSS统计软件处理分析数据,进行组间比较,*,P<0.05,差异具有统计学意义,**,P<0.01差异具有显著性统计学意义。
3.实验结果
3.1 细胞增殖实验结果
桐花树叶正丁醇部位提取物对人前列腺癌细胞PC3,DU145具有增殖抑制作用,其IC50如表1所示,细胞活性曲线如图1所示。
表1 桐花树叶正丁醇部位提取物作用于前列腺癌细胞的IC50(μg/ml)
3.2 单细胞克隆形成实验结果
桐花树叶正丁醇部位提取物可明显抑制人前列腺癌细胞PC3,DU145的克隆形成,并与给药浓度呈浓度依赖性。DU145细胞的对照组克隆形成率为53.63%,高、低浓度给药组克隆形成率分别为23.88%、40.00%;PC3细胞的对照组克隆形成率为59.38%,高、低浓度给药组克隆形成率分别为12.50%、29.88%。细胞克隆形成数如图2和图3所示。
3.3 细胞划痕实验
桐花树叶正丁醇部位提取物对前列腺癌细胞的迁移具有明显的抑制作用,与对照组比较具有显著差异(P<0.01)。经桐花树叶正丁醇部位提取物(12.5μg/ml)作用22h后,DU145对照组和给药组的愈合率分别为74.17%、8.22%;PC3对照组和给药组的愈合率分别为100.00%、4.00%。结果如图4和图5所示。
3.4 流式凋亡检测结果
桐花树叶正丁醇部位提取物可诱导人前列腺癌细胞PC3,DU145凋亡,高浓度组与对照组比较具有显著差异(P<0.01),具体结果如图6和图7所示。
Claims (2)
1.桐花树叶正丁醇提取物在制备治疗前列腺癌药物方面的应用,其特征在于:所述提取物按以下方法制备:将桐花树叶加入95%乙醇浸泡得到桐花树叶乙醇总提物,将乙醇总提物中乙醇挥发后,加入石油醚进行萃取,获取下层水相,下层水相先加乙酸乙酯后加正丁醇继续萃取,获取上层正丁醇部位提取物,再经水浴干燥,即得;所述前列腺癌源于人前列腺癌细胞PC3、DU145。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述药物为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膏剂、合剂、混悬剂。
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红树植物桐花树叶抗炎镇痛活性部位研究;黄晓冬等;《中药材》;20151231;第38卷(第12期);第2590-2593页,尤其是第2590页右栏2.1节 * |
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