CN110393751B - 金匮要略方葶苈大枣泻肺汤水提物在制备抑制食管癌细胞药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及金匮要略方葶苈大枣泻肺汤水提物在制备抑制食管癌细胞药物中的应用，可有效解决制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC‑1、TE‑1细胞的药物问题，葶苈大枣泻肺汤药物为葶苈子10g、大枣12枚，加药物重量15‑20的水浸泡1小时，电炉武火煮沸，文火煎煮1h，过滤，滤液浓缩，该浓缩液具有显著抑制食管癌EC9706、Eca109、EC‑1、TE‑1细胞的功效，有效用于制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC‑1、TE‑1细胞的药物。本发明原料丰富，制备方法简单，易生产制备，为研究抑制食管癌细胞迁移、增殖、浸润的方剂提供了理论和技术支持，治疗食管癌有实际的临床意义。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种金匮要略方葶苈大枣泻肺汤水提物在制备抑制食管癌细胞药物中的应用。
背景技术
食管癌主要有食管鳞癌和腺癌两种病理类型，据2018年全世界癌症报告显示，亚洲仍然是食管鳞癌的高危地区，在我国主要以食管鳞癌为主，长期吸烟，过度饮酒，饮食过快、过热，喜爱食用腌菜，爱咀嚼槟郎，心理因素，家族史，饮食习惯，健康意识等与食管癌的发生关系密切。引起食管癌的主要原因总结为吸烟、肥胖和胃酸反流等。食管癌早期症状大多不甚明显，部分患者会出现进食吞咽时梗塞感，剑突或胸骨后不舒服或疼痛感，食物通过缓慢及滞留感，咽喉干燥和紧缩感等表现；临床诊治大多数食管癌患者发现吞咽困难时已经发生转移，处于中晚期，这时会出现进行性吞咽困难、体重下降、烧心、消化道出血等表现，用药效果不甚明显，预后效果很差，失去了根治机会，5生存率只有10％左右，但早期食管癌(上皮内癌和黏膜内癌)的5年生存率可达90％以上。目前虽然关于食管癌早期诊断、早期治疗的技术有所提高，但大部分食管癌患者依然是出现了转移才明确诊断的。
目前西医治疗食管癌早期及中期以手术切除为主，配合放、化疗及靶向治疗为辅。但食管癌起病多隐匿，早期症状不明显，很多患者确诊时已发展至晚期，有手术机会的患者仅占20％～30％。90％以上的食管癌患者需要接受化疗，但由于食管癌常发生淋巴结复发转移，因此难以根治，且以化疗为主结合放疗的综合治疗手段，多以铂类药物为主，多年来的临床实践证明，此疗效并不十分理想，存在无效、复发、耐药、转移等问题，不良反应明显，治疗后5年存活率仅为14％，且放疗、化疗等手段主要的作用机制在于直接杀伤肿瘤细胞，但同时正常细胞也被大量杀伤，进而使人体的免疫系统收到破坏。这种治疗方式多数情况下不能从根本上治愈癌症，甚至会加重免疫系统的破坏并导致基因突变，因此食管癌的治疗亟需除手术以外的其他方法治疗。食管癌患者特别是中晚期错过手术时机的病人，疗效更差。而中医药在扶助人体正气，调整人体气血阴阳平衡方面有不可替代的优势，，有广阔的应用空间，对中晚期病人可以单独使用，也可以联合用药，对于年老且不能耐受手术的病人的应用，对于复发转移病人的运用，对于手术后病人的运用。因此运用中医药治疗食管癌成为越来越重要的手段。现代科技突飞猛进，在医学上运用现代分子生物学技术对食管癌已经进行了许多方面的研究，指出食管癌的恶性特征之一是其细胞的无限增值能力，与其他多数癌症一样，导致食管癌患者死亡的重要原因是转移和浸润，同时也是临床面临的最大治疗障碍。增殖、迁移、浸润是肿瘤细胞重要的生物学特性，所以，找到可以抑制食管癌细胞迁移、增殖、浸润的方剂，那么在食管癌的临床治疗中肯定会有深远意义。但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种金匮要略方葶苈大枣泻肺汤水提物在制备抑制食管癌细胞药物中的应用，可有效解决制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的药物问题。
本发明解决的技术方案是，从《金匮要略》157方中(除去与《伤寒论》重复方剂)筛选出葶苈大枣泻肺汤，葶苈大枣泻肺汤药物为葶苈子10g、大枣12枚，加药物重量15-20的水浸泡1小时，根据金匮要略原方煎煮方法要求，电炉武火煮沸，文火煎煮约1h，纱布滤去残渣，过滤，滤液浓缩至含生药量为0.5g/mL的浓缩液，该浓缩液具有显著抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的功效，有效用于制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的药物。
本发明原料丰富，制备方法简单，易生产制备，开拓了葶苈大枣泻肺汤的药用价值和商业价值，特别是为研究抑制食管癌细胞迁移、增殖、浸润的方剂提供了理论和技术支持，治疗食管癌有实际的临床意义，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌TE-1细胞增殖的影响曲线图。
图2为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌TE-1细胞迁移的影响曲线图。
图3为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌TE-1细胞浸润的影响曲线图。
图4为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌EC-1细胞增殖的影响曲线图。
图5为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌EC-1细胞迁移的影响曲线图。
图6为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌EC-1细胞浸润的影响曲线图。
图7为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌Eca109细胞增殖的影响曲线图。
图8为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌Eca109细胞迁移的影响曲线图。
图9为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌Eca109细胞浸润的影响曲线图。
图10为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌EC9706细胞增殖的影响曲线图。
图11为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌EC9706细胞迁移的影响曲线图。
图12为本发明葶苈大枣泻肺汤对食管癌EC9706细胞浸润的影响曲线图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
运用MTT法，从《金匮要略》157首方中筛选出可以显著抑制食管癌四种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)活性的有效方剂；倒置显微镜观察筛选出的有效方剂对食管癌四种细胞形态的改变，并拍照记录；流式细胞术检测并分析筛选出的方剂对食管癌四种细胞生长周期的影响；应用RTCA实时无标记细胞分析仪，实时监测、研究并分析筛选出的方剂对食管癌四种细胞增殖、迁移、浸润的影响；用软琼脂克隆形成实验，观察并分析筛选出的方对食管癌四种细胞克隆形成的影响，葶苈大枣泻肺汤药物为葶苈子10g、大枣12枚，加药物重量15-20的水浸泡1小时，根据金匮要略原方煎煮方法要求，电炉武火煮沸，文火煎煮约1h，纱布滤去残渣，过滤，滤液浓缩至含生药量为0.5g/mL的浓缩液，该浓缩液具有显著抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的功效，有效用于制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的药物。
经实验取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下：
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞
人食管癌细胞株EC9706、Eca109由北京协和医科大学肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠，人食管癌细胞株EC-1、TE-1购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
1.1.2方药来源
本实验所选方为《金匮要略》全部方共计157首(原书共205首方，其中4首只列方名未载药物，除去与《伤寒论》重复方剂，共157首)，所用中药购于河南中医药大学第三附属医院。
1.1.3细胞培养的主要试剂及设备
RPMI1640培养基、DMEM培养基(GIBCO公司)、胎牛血清(FBS)(AusGeneX公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、DMSO(二甲基亚砜)(Amresco公司)、MTT(Sigma公司)、ELx800型酶标仪(BIO-TEK公司)、FACSCalibur流式细胞仪(BD公司)、Matrigel胶(Corning公司)、RTCAxCELLigence DP system、E-Plate 16VIEW检测板、CIM-Plate 16夹具、CIM-Plate16检测板(艾森生物科技有限公司)、细胞周期试剂盒(KeyGEN BioTECH公司)、琼脂糖(Bio West公司)
1.2方法
1.2.1药物配制
按《金匮要略》原方剂药物组成和用量配方，就原方总量的一定比例取药，让方剂总重量在10g以上，单味中药用量保持在3g以上，根据方剂总重量，超纯水用量是方剂总重量的15-20倍，选择合适大小的烧杯，清洗干净后烘干，打开精密电子称，准确称取方剂中的各药物，称量后放入清洗干净烘干的烧杯中，并在烧杯瓶身做好标记，先用超纯水洗去杂质，再加15-20倍超纯水，用干净的保鲜膜盖好烧杯口，浸泡1小时，根据《金匮要略》原方煎煮方法要求，电炉武火煮沸，文火煎煮约1h，六层纱布滤去残渣，过滤至干净的50mL离心管中，其滤液浓缩至含生药量为0.5g/mL。将滤液3000r/min离心30min，取上清，双层滤纸过滤。然后在超净台里用0.22μm微孔滤器过滤至消毒过的15mL离心管中，测其药液浓度，用封口条带封好离心管口，做好标记和日期，-20℃避光保存、备用。取一定量的药液，用含10％的胎牛血清的培养基，采用倍比稀释法，配制成浓度为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL的8个浓度梯度药液，-20℃冰箱避光保存、备用。
1.2.2细胞培养
从液氮中迅速取出冻存的细胞株EC9706、ECa109、EC-1、TE-1，1min内水浴快速解冻细胞。吸出细胞悬液转移到15mL离心管中，分别补加10mL DMEM或RPMI1640培养基，吹打混匀，1000rpm×10min离心，弃上清，加入不含血清的培养基5mL，吹打混匀，细胞计数，EC9706、细胞用含10％胎牛血清的MEM培养基以1×106个细胞/皿(10mL细胞悬液)接种于
培养皿中，ECa109、EC-1、TE-1细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基以1×106个细胞/皿(10mL细胞悬液)接种于
培养皿中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，2～3天传代1次。
1.2.3MTT法检测《金匮要略》方剂抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖的量效关系
细胞接种：取对数生长期的食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞，胰蛋白酶消化、离心，计数后以1×106个/板的细胞密度接种于96孔平面培养板，200μl/孔，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱培养中培养。药液配制：选取一定量的药液，用含10％胎牛血清(FBS)的培养基，采用倍比稀释法配制成浓度为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL的8个浓度梯度药液。细胞贴壁24h后，弃上清，分别加入各备选药物，200μl/孔，前3列作为对照组，用200μL移液枪加入含10％胎牛血清(FBS)培养基(200μL/孔)，后九列分别加入已经配好的待测药液(加之前每个EP管内液体都要振荡均匀)，依次对应，加完药液后置于37℃、饱和湿度的、5％CO2细胞培养箱中继续培养，药物作用48h后，弃上清，每孔加入100μl含10％MTT的培养基，放置培养箱4个小时后，弃孔内上清液，每孔加入150μl DMSO，放置于摇床上晃动15分钟待孔内台盼蓝充分溶解混匀后用酶标仪(波长设置为570nm/630nm)测光吸收值(即OD值)，将结果输入excel表格，按照公式计算：抑制率(％)＝(1-加药组OD值/对照组OD值)×100％，计算出所测方剂的不同药物浓度对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖的抑制率。
初筛筛选结果标准：考虑到药物、试剂、设备、操作因素等，最高浓度的抑制率必须在30％以上，IC50﹤1600μg/mL，且只要有一种细胞符合即可。将初筛出抑制率较高的方剂再次进行复筛，直至结果稳定，复筛筛选结果标准：浓度在200μg/mL时抑制率必须在30％以上，符合四种细胞，有浓度梯度趋势，IC50﹤600μg/mL，选出对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞抑制率均高且稳定的3首方剂，进行时效检测，并绘制量效、时效关系曲线。
1.2.4用倒置显微镜仔细观察四种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)形态变化
将食管癌四种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)以1×106cells/皿的形式接种于
培养皿中。设对照组、葶苈大枣泻肺汤组，细胞培养时间达到24h后，吸走上清液，往相应的细胞培养皿中加入方剂的半数抑制率(IC50)为最终浓度的含10％胎牛血清(FBS)的培养基，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱继续培养。药物作用48h后，取出细胞培养皿，置于倒置显微镜下，仔细观察每组细胞形态学变化，每组细胞在倒置显微镜下同时放大100倍、200倍、400倍拍照，做好记录。
1.2.5细胞周期分析
分别以1×106个细胞/皿接种四种细胞到Φ10cm培养皿中，每种细胞分别设置空白对照组、葶苈大枣泻肺汤组，置于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24小时后，吸走上清液，在相应的细胞培养皿中加入方剂的半数抑制率(IC50)为最终浓度的含％10胎牛血清(FBS)的培养基。继续培养48小时后，弃各皿上清，PBS清洗细胞两次，每皿加3mL 0.25％胰蛋白酶消化，3～5分钟后倒置显微镜下观察细胞开始脱壁，加3mL含血清培养基终止消化，将细胞悬液转至15mL离心管内进行离心，2000rpm/min，5min，弃上清。之后四种细胞分别按细胞周期试剂盒步骤要求处理细胞，最后300目尼龙滤膜直接过滤到流式检测管中，每样本获取2×104个细胞荧光信号，激发波长488nm，用CellQuest Pro获取、MODFIT软件检测食管癌四种细胞EC-1，Eca109，TE-1，EC9706周期分布。周期分布用G0/G1％，S％，G2/M％表示。
1.2.6细胞增殖、迁移、浸润检测
先将matrigel基质胶4℃融化，使用预冷的无血清培养基按1:40比例稀释matrigel胶，冰上操作，防止matrigel胶凝固，超净台内将做浸润实验的CIM-Plate板上室和下室从包装袋中取出，将CIM夹具放在超净台上，使蓝色标志点位于夹具的左上方，将上室平稳地放到夹具对应的凹槽中，采用反向加样法，每孔先加入50μl稀释好的matrigel胶，再吸出30μl，整个过程避免产生气泡，孔中最终保留20μl matrigel胶包被CIM-Plate上室。将CIM-Plate上室连同夹具放入37℃培养箱中使其凝固(约4小时)，凝固时上室置于CIM夹具上，保证悬空不触碰电极。
待matrigel胶凝固后，开始细胞浸润、迁移、增殖实验：
(1)待matrigel胶凝固后，将CIM夹具放在超净台上，使蓝色标志点位于夹具的左上方，将做浸润和迁移实验的CIM-Plate板下室平稳放到CIM夹具对应凹槽中，在下室对照组每孔中加入165μl含血清培养基，加药组每孔加入含有IC50浓度药液的含血清培养基165μl，各组三个复孔，注意加液时避免产生气泡，使加入的培养基在下室的孔内形成凸出的弯月面。
(2)将夹具连同下室沿逆时针旋转90度，然后分别将迁移板上室和铺有matrigel胶的浸润板上室中传感器一面置于各自下室上并按压扣上，放置时注意上、下室贴有蓝点的孔相对应，要避免气泡的产生。将上室放到下室上之后，立即用手向下按压，可听到两次卡扣卡入的声音。
(3)在迁移和浸润板上室中均加入30μl无血清培养基，将CIM装置置于培养箱中平衡1小时，平衡后放到实时无标记细胞功能分析仪上，系统自动进行扫描(“Scan Plate”)→检查是否接触良好(在“Message”页面显示Connection OK)→开始检测基线(Background)
确定所选择的孔接触正常，所有孔的Cell Index低于0.063。
(4)在板子平衡期间制备细胞悬液：将细胞培养皿从培养箱中取出，弃去原培养基，加入5mL不含血清培养基，十字摇晃洗细胞，吸去培养基，重复再洗一遍，吸去培养基，加入3mL含0.25％EDTA的胰酶消化细胞，待细胞变圆脱壁后加入0.5mL血清中止消化，将细胞液转移到15mL离心管中，1000转/分离心10分钟，加入10mL无血清培养基重悬细胞，计数，调整细胞浓度为5×104cells/mL。
(5)将测好基线的CIM迁移板和浸润板从仪器上取出，上室每孔加入100μl含5×103cells无血清细胞悬液，加药组另加入IC50浓度的药液5μl。
(6)细胞接种后将CIM迁移和浸润板在超净台上静置30分钟，待细胞沉降后将迁移和浸润板放回实时无标记细胞功能分析仪上，系统自动扫描“Scan Plate”后，开始细胞迁移和浸润实时动态检测，每隔10分钟测量一次，各检测48小时。
(7)细胞增殖：在超净台内取出E-Plate16板，每孔加入50μl培养基，放到实时无标记细胞功能分析仪上进行自动扫描和基线检测，将做迁移和浸润实验后余下的细胞用含血清培养基制备1×105cells/mL细胞悬液，将测好基线的E-Plate板从仪器上取出，每孔中加入100μl含1×104cells含血清细胞悬液，静置30分钟，放到培养箱中的实时无标记细胞功能分析仪上开始检测。待第二天20-24小时加药组加入IC50浓度的药液5μl，继续检测。
1.2.7细胞克隆形成实验
先将1.2％琼脂糖放在水浴锅中溶化，然后与2×RPMI1640和2×DMEM含血清培养基(含20％FBS)，按1:1的比例配置成0.6％的底层琼脂液，打开6孔板，每孔加入3mL 0.6％的底层琼脂液，放置超净台内静置凝固。正常处理细胞，消化细胞，细胞计数，调细胞浓度为1×104cells/mL，然后将0.6％的低熔点琼脂糖2×1640和2×DMEM培养基按1:1的比例配置成0.3％的上层琼脂液，每孔加入2mL 0.3％的上层琼脂液和100μl细胞悬液(500个/皿)，加药组每孔加入10μl含IC50浓度的药液，接着置于37℃、饱和湿度的、5％CO2细胞培养箱中培养；培养时间为2周然后在倒置荧光显微镜下观察细胞克隆形成情况，最后拍照，计算细胞克隆形成率。
(细胞克隆形成率＝平均细胞集落数每孔接种细胞数×100％)。
1.2.8统计分析
使用IBM SPSS21.0回归分析对实验结果进行分析。
2结果
2.1方剂筛选结果
运用MTT法，从《金匮要略》157首方中(原书共205首方，其中4首只列方名未载药物，除去与《伤寒论》重复方剂，共157首)，其中以IC50﹤1600μg/mL作为筛选有效方剂的标准，共选出有效方剂36首。然后对这36首方剂进行复筛，复筛3遍，得出11首有效方剂，且这11首对四种细胞增殖均有抑制作用，IC50﹤1600μg/mL。对复筛得出的11首有效方剂，再次筛选3遍，最终筛选出葶苈大枣泻肺汤(方药组成：葶苈子10g，大枣12枚)，水煎剂浓度在200μg/mL时抑制率在30％以上，有浓度梯度趋势，IC50﹤600μg/mL，对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞抑制率均高且稳定。
2.2《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖作用的量效关系
8个不同浓度梯度对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖的抑制率，随着药物浓度的升高而呈现出增强趋势，表现出明显的剂量-效应依赖关系(表1～2)。以各方剂的浓度为横坐标，以8个不同浓度梯度的该方对食管癌4种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)增殖的抑制率为纵坐标，运用IBM SPSS21.0软件回归分析进行绘图。
表1葶苈大枣泻肺汤抑制食管癌4种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)增殖的量效关系
表2水煎剂抑制食管癌4种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)增殖的IC50浓度
| 细胞 | 葶苈大枣泻肺汤水煎剂IC50抑制浓度(μg/mL) |
| EC9706 | 621.426 |
| Eca109 | 441.671 |
| EC-1 | 298.207 |
| TE-1 | 497.303 |
2.3《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖作用的时效关系
5个不同时间点对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖的抑制率，随着药物作用于细胞时间的逐次延长而抑制率呈现上升趋势，表现出明显的时间-效应依赖关系(见表3)。以各方剂的浓度为纵坐标，以五个不同时间点为横坐标，进行绘图。
表3葶苈大枣泻肺汤抑制食管癌4种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)增殖的时效关系
2.4《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌四种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)形态学影响
以《金匮要略》方葶苈大枣泻肺汤药物浓度的半数抑制率(即IC50值)分别作用于人食管癌TE-1、EC-1、Eca109、EC9706细胞，药物作用48小时后，把细胞置于倒置显微镜下观察其形态变化，分别在放大100倍、200倍、400倍的时候拍照记录。
TE-1细胞：对照组细胞分布均匀，生长状态好，细胞致密均匀，紧贴皿壁，形状规则圆润，作三角拖尾状，细胞边界清晰，细胞核表现出明显的分裂相；葶苈大枣泻肺汤组在细胞数量明显下降，有漂浮较多的死细胞，细胞之间有间隙，透光度下降，出现细胞碎片。
EC-1细胞：对照组细胞分布均匀，生长状态好，细胞致密均匀，紧贴皿壁，贴壁生长，以多边形或梭型的形状存在，细胞核表现出明显的分裂相；葶苈大枣泻肺汤组在细胞数量明显下降，有细胞碎片，透光度下降，细胞皱缩且细胞内部形态不规则。
Eca109细胞：对照组细胞分布均匀，生长状态好，细胞致密均匀，紧密排列呈条梭形，紧贴皿壁，贴壁生长，葶苈大枣泻肺汤组在细胞数量明显下降，透光度下降，细胞外缘模糊。
EC9706细胞：对照组细胞分布均匀，生长状态好，细胞致密均匀，紧密排列呈梭型或者多边形，紧贴皿壁，贴壁生长，细胞边界清晰明了，形态规整，贴壁生长，细胞核表现出明显的分裂相；葶苈大枣泻肺汤组在细胞数量明显下降，有多些漂浮的死细胞，出现些细胞碎片，透光度下降，细胞外缘模糊。
要说明的是，图1-图12因在做金匮要略方选择试验时，是将诃梨勒散与白头翁加甘草阿胶汤、葶苈大枣泻肺汤同时进行的试验，因此，将诃梨勒散与白头翁加甘草阿胶汤、葶苈大枣泻肺汤的试验结果绘制在一起，以节约资源，提高试验效率，甘草阿胶汤、葶苈大枣泻肺汤另行提出专利申请，特此说明。
2.5《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌四种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)细胞周期的影响。
2.5.1《金匮要略》方葶苈大枣泻肺汤应用于人食管癌TE-1对细胞周期的影响
与对照组相比，葶苈大枣泻肺汤组在S期增加，葶苈大枣泻肺汤组G2/M期的细胞百分比减少。(见表4)。
表4食管癌TE-1细胞周期测定结果
2.5.2《金匮要略》三方应用于人食管癌EC-1对细胞周期的影响
与对照组相比，葶苈大枣泻肺汤组S期和G2/M期细胞百分比增加，G0/G1期期减少。
(见表5)。
表5食管癌EC-1细胞周期测定结果
2.5.3《金匮要略》方葶苈大枣泻肺汤应用于人食管癌Eca109对细胞周期的影响
与对照组相比，葶苈大枣泻肺汤组S期增加，G0/G1期和的G2/M期细胞百分比减少。
(见表6)
表6食管癌Eca109细胞周期测定结果
2.5.4《金匮要略》方葶苈大枣泻肺汤应用于人食管癌EC9706对细胞周期的影响
与对照组相比，葶苈大枣泻肺汤组S期的细胞百分比增加明显，G2/M期的细胞百分比明显减少。(见表7)。
表7食管癌EC9706细胞周期测定结果
2.6《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对人食管癌四种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)细胞浸润、迁移、增殖的影响
2.6.1《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对人食管癌TE-1细胞增殖的影响(见图1)
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌TE-1细胞的增殖。
2.6.2《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌TE-1细胞迁移的影响(见图2)
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌TE-1细胞的迁移。
2.6.3《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌TE-1细胞浸润的影响
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌TE-1细胞的浸润。
2.6.4《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌EC-1细胞增殖的影响
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌EC-1细胞的增殖。
2.6.5《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌EC-1细胞迁移的影响(见图5)
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌EC-1细胞的迁移。
2.6.6《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌EC-1细胞浸润的影响(见图6)
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌EC-1细胞的浸润。
2.6.7《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌Eca109细胞增殖的影响(见图7)
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌Eca109细胞的增殖。
图7葶苈大枣泻肺汤对食管癌Eca109细胞增殖的影响
2.6.8《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌Eca109细胞迁移的影响(见图8)
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌Eca109细胞的迁移。
2.6.9《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌Eca109细胞浸润的影响(见图9)
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌EC-1细胞的浸润。
2.6.10《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对人食管癌EC9706细胞增殖的影响(见图10)
葶苈大枣泻肺汤能抑制人食管癌EC9706细胞的增殖。
2.6.11《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌EC9706细胞迁移的影响(见图11)
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌EC9706细胞的迁移。
2.6.12《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌EC9706细胞浸润的影响(见图12)
葶苈大枣泻肺汤能抑制食管癌EC9706细胞的浸润。
2.7《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)克隆形成的影响(见表8)
葶苈大枣泻肺汤可以影响食管癌细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)克隆的形成。在食管癌细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)克隆球大小和形态方面，均有明显改变，与对照组相比，加药组细胞形态不规则，克隆球变小。
表8《金匮要略》方葶苈大枣泻肺汤对食管癌四种细胞克隆形成的影响
3讨论
3.1《金匮要略》与食管癌诊疗之间的关系
《金匮要略》为医圣张仲景所著的一部百科式的临床著作，是我国第一部理法方药具备的医学典籍，也是我国现存最早的一部论述诊治杂病的专书，奠定了中医辨证论治的基础。《金匮要略》一方面有中医基础理论的基本内容，另一方面也有临床学科的相关属性。《金匮要略》以脏腑经络论杂病，保持着脏腑辨证的精神，脏腑病证的证候特征，是以其脏腑、经络病变为病理基础的，所以脏腑经络辨证方法，对临床各科皆有普遍指导意义。《金匮要略》运用脏腑经络辨证，一方面对于临床实践上有着很好的指导意义和实用价值，另一方面对于后世临床医学的发展有着重大的意义和深厚的影响，所以，被古今医家赞誉为方书之祖、医方之经，治疗杂病的典范。《金匮要略》中脏腑经络的传变规律与癌症病原发病灶侵犯其他脏器、组织或是癌症转移引起相应的临床表现有许多雷同之处，所以学习《金匮要略》，对于扩宽临床思路，提高综合辨析和诊治疑难病证的能力有着奇特的作用，所以，是学习中医必看的古典医籍，且在癌症的诊疗中具有深远影响。
《金匮要略》这一书中并没有叙述食管癌，但其学术思想、诊断治疗对现代食管癌病变的治疗有着重要的影响。在临床实践和理论上对食管癌病变的治疗具有较高的实用价值和指导意义，其中书中所记述的多数方剂目前仍然用于食管癌的治疗。在当前中医临床实践研究中，食管癌的治疗用到鳖甲煎丸、下瘀血汤、大黄蛰虫丸、大柴胡汤皂荚丸、调味承气瓜蒌薤白半夏汤、薏苡附子败酱散等。
3.2中医对《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)与食管癌的病机分析
葶苈大枣泻肺汤见于《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证并治第七》，有三条论述，“肺痈，喘不得卧，葶苈大枣泻汤主之”。“肺痈胸满胀，一身面目浮肿，鼻塞清涕出，不闻香臭酸辛，咳逆上气，喘鸣迫塞，葶苈大枣泻汤主之”。“支饮不得息，葶苈大枣泻汤主之”。该方剂在《金匮要略》原文中组成简单，就2味中药组成，分别是葶苈子和大枣。前两条论述肺痈邪实壅滞的证治。邪犯于肺，肺气壅滞，故胸部胀满而不能平卧；肺失通调，不能输布津液，水气停留则一身面目浮肿。肺窍不利，故鼻塞流清涕，嗅觉失灵，不闻香臭酸辛；肺气失于宣降，故咳嗽上气，喘鸣迫塞。治疗当开泻肺气，行水祛饮。葶苈子药性辛苦寒，能开泻肺气，清热利水。恐其药性猛烈而上正气，故配以大枣甘温安中并缓和药性。最后一条论述支饮阻肺而不得息(不得息即呼吸困难)的证治。支饮阻肺，气机不利，故见呼吸困难。治疗当泻肺逐饮，开闭利气。本方既可以用于治疗“肺痈喘不得卧者”，亦可以用于治疗“支饮不得息”。虽然一属肺痈，一归痰饮，但是二者总的病机都是痰涎壅盛，邪实气闭，临床治病，重在辩证，只要证候相同，也可异病同治。《神农本草经》：味辛，苦，寒。治癥瘕积聚，结气，饮食寒热，破坚逐邪，通利水道。《本草经疏》：葶苈禀阴金之气以生，故其味辛苦，大寒无毒。气薄味厚，阳中阴也。为手太阴经正药，故仲景泻肺汤用之。亦入手阳明，足太阴经。肺属金，主皮毛，膀胱属水，藏精液，肺气壅塞则膀胱与焉，譬之上窍闭则下窍不通，下窍不通则水湿泛溢，为喘满，为肿胀，为积聚，种种之病生矣。辛能散，苦能泄，大寒沉阴能下行逐水，故能疗《本经》所主诸病。《本草崇原》：葶苈花实黄色，根白味辛，盖禀土金之气化。禀金气，故主治癥瘕积聚之结气。禀土气，故主治饮食不调之寒热。破坚逐邪，金气盛也。通利水道，土气盛也。本条论述的总的病机为痰涎壅盛，而痰性属阴，其性粘滞缠绵，易遏阻于食管，痰浊为有形之邪，易阻碍气机的运行，痰浊阻滞气机，痰气胶阻于咽喉致食管癌患者出现吞咽困难、胸膈痞闷等症，故常用化痰止咳平喘药进行化痰散结，因此葶苈大枣泻肺汤不仅可以治疗肺痈，痰饮引起的咳嗽，还可以治疗因痰涎壅盛出现吞咽困难、胸膈痞闷等症的食管癌。在临床研究中有出现食管癌病人咳嗽、吞咽困难的症状，认为病机是痰水壅堵，病人进食不畅，损伤脾胃，运化水谷精微功能失常，痰水内生，痰水随气停滞在食管附近，造成咳嗽、吞咽不适等症状。因此可以推知，食管癌病人有咳嗽、吞咽困难的症状，且中医病机为痰水壅堵，而葶苈大枣泻肺汤可以治疗痰水壅堵造成咳嗽、吞咽困难，进一步得知食管癌病机与痰水壅堵有关。
综上所述，葶苈大枣泻肺汤可以治疗因中气虚陷推动气血运行不畅形成的痰浊瘀血造成的食管癌；热毒伤阴，热毒内蕴，伤阴耗液，炼液成痰，热毒痰浊留滞脏腑、经络日久，形成瘀血，结聚在局部形成肿块造成的食管癌；痰水壅盛，痰性属阴，其性粘滞缠绵，易遏阻于食管，痰浊为有形之邪，易阻碍气机的运行，痰浊阻滞气机，痰气胶阻于咽喉而形成的食管癌。
3.3《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)的抗肿瘤研究
葶苈大枣泻肺汤，方药组成为葶苈子和大枣。
《神农本草经》：“葶苈子主癥瘕积聚结气，饮食寒热，破坚逐邪，通利水道。”现代药理研究表明，葶苈子提取物具有强心作用、利尿作用，葶苈子在很低剂量时，即可发挥显著的抗癌效果。葶苈子中的苄基芥子油具有广谱抗菌作用；在对人鼻咽癌细胞和千田子宫颈癌细胞方面有较强的抑制作用，在对艾氏腹水癌小鼠的癌细胞有突出的遏制效应，并且基本上没有副作用。葶苈子醇沉组分能够提高正常小鼠HC50，表明它可以提高机体免疫功能；葶苈子醇沉组分可以促进体外T淋巴细胞和B淋巴细胞的增值，进而提高细胞免疫和体液免疫功能。
3.4《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对人食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1四种细胞活性的抑制作用
葶苈大枣泻肺汤分别作用于人食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1四种细胞，结果表明对四种细胞增殖活性的抑制作用呈现出时间依赖和剂量依赖关系。
作用于四种细胞后，细胞形态变化有较大差异。对不同细胞的作用也有明显差异。EC9706细胞镜下形状多饱满，呈圆形，细胞内可以看到分裂细胞核；Eca109细胞镜下形状多饱满且呈多边形，形态小，分裂细胞核较多；EC-1细胞镜下形状多为梭型且形状多不规则，边界清晰，分裂细胞核明显；TE-1细胞镜下形状多三角形，形态较大，棱角模糊，这说明三方对分裂能力不同的食管癌细胞的生长均有抑制作用，也说明不同的方作用于食管癌细胞的发病机制可能会有差异，这对于研究经方治疗癌证机制的多重性，有深远作用。
从对食管癌四种细胞周期的影响看，葶苈大枣泻肺汤将食管癌TE-1、EC-1、Eca109、EC9706细胞周期均阻滞于S期，还将EC-1细胞阻滞于G2/M期。说明葶苈大枣泻肺汤组主要将细胞阻断于S期而抑制食管癌细胞生长。
3.5《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞增殖、迁移、浸润、克隆的影响
葶苈大枣泻肺汤对食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞的增殖、迁移、浸润、克隆形成率在一定程度上有抑制作用。其中分化程度较高的细胞TE-1和中分化程度的细胞EC9706,迁移、浸润能力较强，效果明显；而分化程度较低的细胞EC-1和细胞Eca109迁移、浸润能力不是很强，效果不太明显，可能与细胞本身特点有关，也有可能是药物对其的影响。作用于细胞增殖时，与对照组相比，刚加药时，细胞出现了短时的增殖高凸，然后出现对增殖的抑制趋势，表明药物作用于肿瘤细胞时做了一个及时反应。集落形成率表示细胞的独立生存能力，各种因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变，贴壁的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖能力的细胞，克隆形成率反映了细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大。从实验结果可以看出，与对照组相比，大小改变，数量减少，表明药物抑制细胞克隆形成。
3.6研究《金匮要略》方剂抗食管癌作用的重要意义
目前，我国食管癌的发病率和死亡率每年都在呈递增趋势，已经成为威胁人类生命健康的死亡杀手，不仅给家庭带来了沉重的经济负担，给病人带来痛苦，而且也给社会带来巨大的压力。《金匮要略》涉及到多种肿瘤的病因病机、临床表现、治疗方药及预后，药物配方精炼有效，而且药价病人家庭也能相应的负担得起，所以从《金匮要略》中能够找到防治食管癌的有效方剂，对于临床和科研有着深远影响。
本发明筛选出得葶苈大枣泻肺汤对食管癌四种细胞均有显著抑制作用，查阅国内外文献资料目前尚无关于这三首方药治疗食管癌得临床和实验研究报道，可为临床治疗食管癌提供有效方药，为实验研究提供依据。
4.结论
(1)《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌四种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)在细胞增殖活性方面有着明显的抑制作用，且对食管癌四种细胞增殖的抑制作用呈现剂量依赖和时间依赖关系。
(2)葶苈大枣泻肺汤将食管癌TE-1、EC-1、Eca109、EC9706细胞周期均阻滞于S期。
(3)《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌四种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)的增殖、迁移、浸润均有抑制作用。
(4)《金匮要略》方(葶苈大枣泻肺汤)对食管癌四种细胞(EC9706、Eca109、EC-1、TE-1)的克隆形成有抑制作用。
(5)食管癌恶性表型与中气虚陷、湿热(毒)伤阴、痰水壅堵病机相关。
以上表明，本发明原料丰富，制备方法简单，易生产制备，具有显著的抑制食管癌TE-1、EC-1、Eca109、EC9706细胞的功效，有效用于制备抑制食管癌TE-1、EC-1、Eca109、EC9706细胞的药物，开拓了治疗食管癌药物的新途径和葶苈大枣泻肺汤的药物价值和市场价值，是治疗食管癌上的创新，并为实验研究和治疗食管癌提供了理论和技术支持，有显著的经济和社会效益。
Claims (1)
1.一种金匮要略方葶苈大枣泻肺汤水提物在制备抑制食管癌EC9706、Eca109、EC-1、TE-1细胞药物中的应用，葶苈大枣泻肺汤药物为葶苈子10g、大枣12枚，加药物重量15-20倍的水浸泡1小时，根据金匮要略原方煎煮方法要求，电炉武火煮沸，文火煎煮1h，纱布滤去残渣，过滤，滤液浓缩至含生药量为0.5g/mL的浓缩液。
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| 张爱萍治疗食管癌经验撷要;张权等;《中国民间疗法》;20180831;第26卷(第8期);第17-18页 * |
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