CN104547120A - 一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物及其制备方法和应用。本发明的一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物,由以下重量份的各原料药组成:川穹15-25份,丹参10-15份,焦山楂10-20份,党参15-25份,葛根15-25份,赤芍15-25份,桂枝5-10份以及水红花子5-15份。本发明的中药组合物具有活血化瘀、益气通络之功,经临床验证疗效满意。同时,本发明通过研究该中药组合物对阿尔茨海默病动物模型的抗阿尔茨海默病作用及作用机制,为进一步研发治疗阿尔茨海默病的中药新药提供了客观依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和应用,特别涉及一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物及其制备方法和应用,本发明属于中药技术领域。
背景技术
随着社会的发展和人口的老龄化,老年人的精神卫生方面的疾病日益突出,尤其危害最严重的阿尔茨海默病病人越来越多,阿尔茨海默病的发病随年龄的增长而增加。目前,世界上阿尔茨海默病的发病率男性为30.5‰,女性为48.2‰,美国85岁以上痴呆发病率达47.2‰。在西方国家里,阿尔茨海默病正逐渐取代卒中,位居神经科疾病之首。我国阿尔茨海默病的病人总数已占世界第一位,预期到2050年,我国65岁以上和80岁以上的老年人和高龄老人将占总人口的35‰和22‰,届时,AD患者可达到2500万。现在我国60岁以上人口已超过10‰,跨入老龄化国家。我国65岁以上老年人群阿尔茨海默病的发病率达到4.5‰,75岁以上为11‰,85岁以上高于30‰,估计阿尔茨海默病病人约有540万~720万,其中约有0.1‰~7.2‰为严重痴呆,必须得到监护性照顾;约有2‰~15‰为轻中度痴呆,病人过着依赖性的生活。该病严重地影响老年人的生活质量,给国家、社会和家庭带来沉重的负担。今后随着老年人口的增加,患病人数还会继续增加。因此,对AD病的防治是一个不容忽视的问题。世界各方面研究颇多,但至今仍无有效的治疗措施。中药由于其含有多种化学成分,能够针对疾病的多个靶点,在治阿尔茨海默病这种多因素、多病理靶点的复杂性疾病方面具有独特的优势。
大量的临床和实验资料显示,中药在延缓阿尔茨海默病进程保护神经细胞、抑制氧化应激反应和抗兴奋性毒性等方面研究取得了一定进展。诸多研究显示了中医药治疗阿尔茨海默病的潜力和优越性。如果单纯用中医药能有效控制早期阿尔茨海默病症状,将可避免西药的毒副作用,大大增强患者服药的依从性,从而为长期治疗阿尔茨海默病,有效控制阿尔茨海默病进程奠定基础,这或许是中医药治疗阿尔茨海默病的发展方向。
发明内容
针对现有问题,本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物。全方具活血化瘀、益气通络之功,经临床验证疗效满意。本发明运用先进实验技术手段对中药组合物抗阿尔茨海默病作用及机制进行深入探讨。本发明的提出将为研发出作用机制明确、且安全有效的抗阿尔茨海默病中药新药奠定基础,具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
为了达到上述目的,本发明所采用的技术手段为:
本发明的一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物,其特征在于由以下原料药组成:川穹、丹参、焦山楂、党参、葛根、赤芍、桂枝以及水红花子。其中,川穹辛散温通,能祛风通络,丹参活血调经,祛瘀止痛,凉血消痈,清心除烦,养血安神,焦山楂消食健胃、活血化瘀、收敛止痢,党参补中益气,健脾益肺,葛根解表退热,生津,透疹,升阳止泻,赤芍清热凉血,活血祛瘀,桂枝发汗解肌,温经通脉,助阳化气,散寒止痛,水红花子具散血消症,消积止痛,利水消肿之效,配伍共奏活血祛瘀、益气通经之功。
本发明所述的中药组合物,优选的,由以下重量份的各原料药组成:川穹15-25份,丹参10-15份,焦山楂10-20份,党参15-25份,葛根15-25份,赤芍15-25份,桂枝5-10份,水红花子5-15份。更优选的,该组合物由以下重量份的各原料药组成:川穹20份,丹参12份,焦山楂15份,党参20份,葛根20份,赤芍20份,桂枝8份以及水红花子10份。
所述的原料药粉碎后加入制剂成型所需的辅料,按照药物制剂常规方法做成临床上适宜的各种制剂,所述的制剂包括水煎剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。本发明制剂的制备方法属于常规制剂方法,在此无庸赘述。
本发明的组合物其全方具活血化瘀、益气通络之功,经临床验证疗效满意。同时,本实验通过研究该中药组合物对阿尔茨海默病动物模型的抗阿尔茨海默病作用及作用机制,为进一步研发治疗阿尔茨海默病的中药新药提供了客观依据。
附图说明
图1为中药组合物对AD模型大鼠脑微血管超微结构的影响;
图2为中药组合物对AD模型大鼠海马区COX-2蛋白表达的影响;
图3为中药组合物对AD模型大鼠海马区nN0S蛋白表达的影响;
图4为中药组合物对AD模型大鼠海马区NF-κBp65蛋白表达的影响;
图5为中药组合物对AD模型大鼠海马区IκB-α蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1中药组合物的制备
由以下重量的各原料药组成:川穹20g,丹参12g,焦山楂15g,党参20g,葛根20g,赤芍20g,桂枝8g以及水红花子10g。
实施例2中药组合物的制备
由以下重量的各原料药组成:川穹15g,丹参10g,焦山楂20g,党参25g,葛根15g,赤芍15g,桂枝10g,水红花子15g。
实施例3中药组合物的制备
由以下重量的各原料药组成:川穹25g,丹参15g,焦山楂10g,党参15g,葛根25g,赤芍25g,桂枝5g以及水红花子5g。
实施例4中药组合物的制备
由以下重量的各原料药组成:川穹22g,丹参14g,焦山楂15g,党参22g,葛根20g,赤芍20g,桂枝8g以及水红花子10g。
实施例5在本发明的中药组合物在临床上的应用
所用的中药组合物按照以下方法制备:
按以下重量称取的各原料药:川穹20g,丹参12g,焦山楂15g,党参20g,葛根20g,赤芍20g,桂枝8g以及水红花子10g。原料药用蒸馏水浸泡1h,水煎2次,每次30min,两次煎液混匀,旋转蒸发仪分别浓缩至50mL,4℃保存,制成水煎剂,用于以下研究:
1.资料与方法
1.1入选标准
75例病人均为2012年10月-2014年9月在我院住院和门诊治疗的阿尔茨海默病患者。患者诊断依据《中国精神疾病分类方案与诊断标准(CCMD-2)》中阿尔茨海默病诊断标准。
1.2一般资料
设对照组和治疗组。见表1
表1两组临床资料
1.3治疗方法
治疗组应用本发明的中药组合物1剂/日,20天为一疗程,共3个疗程;对照组未用中药组合物。两组均以12周为1个疗程。用药期间密切观察患者心电图变化,定期检查肝肾功能、血尿常规,比较两组症状缓解情况。
2.观察结果
表2两组患者MMSE、ADL评分比较
经Ridit分析,两组间有显著性差异(P<0.05)。
试验例2药理学实验
所用的中药组合物按照以下方法制备:
按以下重量称取的各原料药:川穹20g,丹参12g,焦山楂15g,党参20g,葛根20g,赤芍20g,桂枝8g以及水红花子10g。原料药用蒸馏水浸泡1h,水煎2次,每次30min,两次煎液混匀,旋转蒸发仪分别浓缩至50mL,4℃保存,制成水煎剂,用于以下研究:
采用Aβ1-40海马区注射诱发大鼠脑内神经元损伤,复制AD模型大鼠。利用Morris水迷宫方法观察AD大鼠行为学变化;采用透射电镜观察AD大鼠脑血管超微结构变化;通过免疫组化法检测对AD大鼠脑组织海马区COX-2、nNOS、NF-κBp65、IκB-α蛋白表达的影响,此外还通过实时荧光定量PCR技术观察NF-κBp65mRNA、IκB-αmRNA和BACE1mRNA基因表达的影响,具体通过以下实验进行:
1.实验动物
12月龄Wistar雄性大鼠,体重350±20g,黑龙江中医药大学实验动物中心提供。Aβ1-40(Amyloidβ-protein,Fragment1-40,Sigma公司),兔抗Aβ、IL-1β、IL-6、TNF-α放免试剂盒购自北京福瑞生物公司。Aβ1-40(Amyloidβ-protein,Fragment1-40,Sigma公司),兔抗nNOS和IκB-α,羊抗COX-2,SP试剂盒及DAB购自北京中山,PBS、4%多聚甲醛。
2.主要仪器设备
大鼠脑立体定位仪SN-2(日本),Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所),Leica-2135切片机(德国Leica),组织脱水机(德国Leica),生物组织包埋机(德国Leica),型展片机(德国Leica),型烤片机(德国Leica),尼康E600型显微镜(日本尼康),透射电镜(荷兰)。
3.实验方法
3.1动物筛选与分组
大鼠在实验室稳定条件下饲养一周后,先将动物进行Morris水迷宫初筛,以测量大鼠对水迷宫学习与记忆的获取能力。按照Morris实验方法进行。实验分为两部分:
3.1.1定位航行实验
用于测量大鼠对水迷宫的学习能力。历时5天,从第1天起,每天分上、下午各训练1次。训练时随机选择一个入水点,将大鼠面向池壁放入水中,记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(潜伏期),每次训练时间为60秒。如果大鼠在60秒内未找到平台,须将其引至平台,这时潜伏期记为60秒,每次训练后让其在平台上停留15秒。
3.1.2空间搜索实验
用于测量大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的能力,即在第6天撤除水下平台,随机选取一入水点,在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中,记录其在60秒内跨过原平台相应位置的次数和第一次通过平台的时间。
通过初筛,去除先天痴呆(潜伏期平均值>50s)和游泳姿势不良者,将合格大鼠98只随机分为正常组、假手术组、模型组,中药组合物组、补气组、活血组和脑复康组,每组各14只。
3.2 AD模型大鼠动物复制
将Aβ1-40用无菌生理盐水稀释成5g/L,放置在37℃恒温箱中7d,形成聚集肽后放入-20℃冰箱中备用。水迷宫测试后48小时,模型组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉,参考包新民《大鼠脑立体定向图谱》,将大鼠的头固定于立体定位仪上,剪去局部毛发,消毒后沿矢状线切开皮肤,切口长约1.5cm,将骨膜向两侧推开暴露颅骨。确定海马区注射点:前囟后3mm,中线向右旁开2mm,DV 3.5mm。用牙科钻在颅骨上打孔,钻薄颅骨而不钻透,用微量注射器稍用力即透颅骨,缓慢注射Aβ1-40溶液2ul(10ug),5min内注射完,留针5min,牙科泥封住颅骨孔,术区滴庆大霉素,缝合皮肤并消毒,肌肉注射青霉素10万单位每日1次,连续7天,防止感染。假手术组注入等量无菌双蒸水,其余同模型组。单笼饲养至大鼠完全清醒。
3.3药物制备及给药
各组大鼠在造模后第7d开始给药治疗如下:
中药组合物高、中、低剂量组:中药组合物原方(川穹、丹参、焦山楂、党参、葛根、赤芍、桂枝、水红花子),按常规方法浓缩煎液成2g/ml的生药浓度灭菌后冷藏备用制备水煎液,每毫升含生药2.2克(2.2g/ml),4℃保存备用。高剂量组灌胃给予5.0g/kg·d,中剂量组灌胃给予2.5g/kg·d,低剂量组灌胃给予1.25g/kg·d,连续21d。
脑复康组:脑复康片剂,400mg/片(由东北制药厂),碾碎加双蒸水配成l0mg/ml混悬液。灌胃给予0.1g/kg·d,日1次,连续21d。
正常对照组、假手术组与模型组大鼠给予等容积生理盐水,日1次,连续21d。
4观察指标
4.1 Morris水迷宫行为学测定
Morris水迷官试验参照有关文献操作,各组大鼠分别在术后第2d与治疗后第2d进行Morris水迷宫行为学检测,共5d。方法同3.1。
4.2神经病理形态学观察
4.2.1脑组织标本的制备
各组大鼠于最后一次行为学检测后腹腔注射10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉,开胸充分暴露心脏并撕去心包,经左心室行主动脉插管,固定插管并剪开右心耳,先以生理盐水200ml冲洗至右心耳流出的液体澄清后,再以4%多聚甲醛PBS(pH值7.2-7.4,4℃)200m1灌注固定,断头取脑。取注射点前后3mm做冠状切面经固定,石蜡包埋,连续冠状组织切片多套,片厚5μm,裱于经多聚赖氨酸处理的清洁玻片上,60℃烤箱内烘烤2小时后放入4℃冰箱保存,以备各种染色。
4.2.2超微结构观察
取海马注射区2mm大小脑组织,用4%戊二醛初固定24h,0.10/锇酸后固定90分钟,常规包埋。修块lmm大小,超薄切片机下切片,每个标本做2个铜网,尽量捞片,铀铅双染色,透射电镜下观察照像。
4.3采用放射免疫法测定大鼠海马组织中Aβ、IL-1β、IL-6、TNF-α水平
4.3.1各组大鼠于最后一次行为学测试后,主动脉快速灌注生理盐水200m1冲洗,取脑沿针道前后各1.5mm脑做冠状切面,剥离出海马组织。用组织匀浆器充分研磨,无菌生理盐水稀释,2500转/分离心5min,取上清液,置-20℃冰箱中备检。
4.3.2免疫组化染色步骤(SP法)
按试剂盒说明书操作步骤进行。
4.3.3免疫组化数据统计
阳性细胞数的计算取每组大鼠脑组织切片7张,每张切片于海马区随机选取5个区域,在400倍显微镜下计算此区域内的免疫组化染色为棕色的Aβ1-40、β-APP阳性细胞数。由两名人员独立观察最后取平均值,结果以均数±标准差(x±s)表示。各组间数据采用社会科学统计程序软件SPSS10.0进行t检验。
4.4 RT-PCR法检测海马中β-APPmRNA、IL-1βmRNA、IL-6mRNA、TNF-αmRNA表达
4.4..1脑组织处理
各组大鼠在规定时间内,经主动脉快速灌注生理盐水200m1,冲洗出脑中血液,冰皿上快速取出大脑,弃去嗅球、小脑和低位脑干,取针道前后各1.5mm脑做冠状切面,剥离右侧海马,放入冻存管中置液氮罐中备检。操作过程中各种液体加入1%DEPC水,手术器械、器皿均经1%DEPC水浸泡,以灭活内源性活性酶。
4.4.2检测方法
4.4.2.1提取总RNA
①海马组织匀浆:于冰上进行。取100mg海马组织,放入玻璃匀浆器中,加入Trizol试剂1ml研磨;
②25℃水浴箱中孵育5分钟;
③将匀浆产物移入1.5ml离心管中,加入氯仿0.2ml,混摇15秒,室温放置5分钟;
④4℃离心(10000r/min)15分钟
⑤将上层无色液体移入1.5ml离心管中,加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟后混匀;
⑥4℃离心(10000r/min)15分钟;
⑦去上清。加入75%乙醇1ml。4℃离心(7500r/min)5分钟。重复该步骤2次;
⑧真空干燥10分钟;
⑨用水溶解后计算所提RNA量,使A260/A280比值保持在1.8以上。-70℃低温冰箱保存。
4.4.2.2 RNA逆转录
①取上述标本RNA2μg,加入总量20μl下述混合液体。
②10000~12000r/m in,离心约1分钟。
③42℃水浴箱中温育45分钟合成cDNA;
④95℃水浴箱中10分钟灭活逆转录酶。
4.4.2.3 DNA聚合酶链反应(PCR)
①每个PCR扩增管中加总量25μl下述混合液。
②震荡,略离心上述混合液。
③PCR扩增仪扩增。
反应条件:变性:94℃30秒
退火:57℃60秒
延伸:68℃60秒
共做36个循环后,72℃延伸5分钟。
4.4.2.4 RT-PCR产物分析
取PCR扩增产物10μl以1.5%琼脂糖凝胶、100V电压电泳60min,GoldView染料染色,在紫外灯下观察结果、拍照。采用Kodak2.0软件对PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行扫描分析及数据处理。计算公式:
相对量=产物电泳条带密度/β-actin电泳条带密度×100%
4.4.3统计学分析
数据以均值±标准差表示,统计分析采用SPSS10.0软件做t检验。
5实验结果
5.1定位航行实验
表1不同时期大鼠Morris水迷宫试验潜伏期()(S)
注:假手术组与正常对照组比较,*P<0.01;与模型组比较,ΔP<0.01;
5.2空间搜索实验
表2不同时期各组大鼠穿越平台的次数()
注:假手术组与正常对照组比较,*P<0.01;与模型组比较,ΔP<0.01,#P>0.05;
5.3神经元透射电镜观察结果
中药组合物对AD模型大鼠脑微血管超微结构的影响如图1所示。从图中可以看出:
正常组和假手术组:超微结构观察海马神经元分布正常,核膜清楚,染色质清晰,线粒体清晰,胞浆内有丰富的核糖颗粒;毛细血管管腔规则,基膜双层结构清晰,内皮细胞内线粒体清晰可见。
模型组:超微结构观察海马神经元分布紊乱,核膜不清楚,线粒体结构紊乱不清晰,膜部分融合内陷;毛细血管管腔不规则,基膜双层结构不清晰,内皮细胞内线粒体脊溶合,毛细血管周围水肿。
本发明中药组合物高、中、低剂量组:透射电镜超微结构观察海马神经元分布基本正常,核膜清楚,染色质清晰,线粒体较清晰,胞浆内的核糖颗粒增多;毛细血管管腔病变基本恢复,周围水肿减轻。
5.4中药组合物对AD模型大鼠海马区COX-2表达的影响
表3中药组合物对AD模型大鼠海马区COX-2表达的影响()
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01
中药组合物对AD模型大鼠海马区COX-2表达的影响如图2所示。
5.5中药组合物对AD模型大鼠海马区nN0S表达的影响
表4中药组合物对AD模型大鼠海马区nN0S表达的影响()
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01中药组合物对AD模型大鼠海马区nN0S表达的影响如图3所示。
5.6中药组合物对AD模型大鼠海马区NF-κBp65表达的影响
表5中药组合物对AD模型大鼠海马区NF-κBp65表达的影响()
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。中药组合物对AD模型大鼠海马区NF-κBp65表达的影响如图4所示。
5.7中药组合物对AD模型大鼠海马区IκB-α表达的影响
表6中药组合物对AD模型大鼠海马区IκB-α表达的影响()
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。
中药组合物对AD模型大鼠海马区IκB-α表达的影响如图5所示。
以上实验通过研究该中药组合物对阿尔茨海默病动物模型的抗阿尔茨海默病作用及作用机制,为进一步研发治疗阿尔茨海默病的中药新药提供了客观依据。
Claims (5)
1.一种用于治疗阿尔茨海默病的中药组合物,其特征在于该组合物由以下重量份的各原料药组成:川穹15-25份,丹参10-15份,焦山楂10-20份,党参15-25份,葛根15-25份,赤芍15-25份,桂枝5-10份以及水红花子5-15份。
2.如权利要求1所述的中药组合物,其特征在于该组合物由以下重量份的各原料药组成:川穹20份,丹参12份,焦山楂15份,党参20份,葛根20份,赤芍20份,桂枝8份以及水红花子10份。
3.如权利要求1或2所述的中药组合物,其特征在于所述的原料药粉碎后加入制剂成型所需的辅料,按照药物制剂常规方法做成临床上适宜的各种制剂。
4.如权利要求3所述的中药组合物,其特征在于所述的制剂包括水煎剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。
5.权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20150429 |