CN108403723B

CN108403723B - 一种干预ad用的美洲大蠊提取物及其提取方法和应用

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Publication number: CN108403723B
Application number: CN201810425066.3A
Authority: CN
Inventors: 赖仞; 龙承波; 龙爱琳; 吕秋敏
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2038-05-07
Also published as: CN108403723A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种干预AD用的美洲大蠊提取物及其提取方法和应用。本发明以去离子水为提取溶剂在50～60℃下搅拌提取0.5～2小时，对干燥美洲大蠊粗粉中的活性物质进行提取，水提液除脂，得到美洲大蠊提取物。本发明的美洲大蠊水提取物具体有AD干预效果，能够用于制备干预AD药物或保健品食品。

Description

一种干预AD用的美洲大蠊提取物及其提取方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种美洲大蠊提取物及提取方法，该美洲大蠊提取物能够预防或治疗阿尔兹海默症。

背景技术

老年痴呆是指老年人(≥60岁)出现持续时间较长的智能损害，表现为记忆、语言、思维、计算、定向力和情感障碍及人格改变，并出现社会活动能力和自身生活能力的减退。目前，国际上将老年痴呆分为：老年性痴呆(Alzheimer's disease,AD)、血管性痴呆和混合型痴呆。伴随病情加剧，病人变得呆滞、无欲、长时间卧床、生活无法自理，常因褥疮、骨折、肺炎、泌尿系统感染、营养不良等继发性躯体疾病或因衰竭而死亡。

老年痴呆中AD占大部分，特别是随着年龄升高AD在老年痴呆中占比明显升高。AD的发病机制复杂，至今未有定论。目前有几种假说，包括淀粉样蛋白(Aβ)级联学说、Ca²⁺调节异常学说、自由基与凋亡学说、tau蛋白异常修饰学说、线粒体代谢障碍学说、兴奋性氨基酸毒性学说、基因突变学说及免疫异常学说等。其中，Aβ学说(经典)和免疫异常学说(近年)得到广泛支持。该类学说偏向于简单的个别或少数信号通路。随着研究的深入近年提出了一些新的学说，如DNA损伤学说、神经细胞周期紊乱学说、脱髓鞘学说、系统性功能异常学说等。该类学说的特点是不再把AD的发生简单地归因于个别信号通路异常，而是把AD看着是由于机体衰老而伴随的系统性功能异常导致的。如系统性功能异常学说，该学说认为系统性功能异常导致Aβ体内代谢异常进而影响AD发病病程。其中包括全身免疫系统异常、血液系统异常、代谢异常、肝功能异常、系统性炎症等。

从1998年到2014年，FDA共批准123个治疗AD治疗药物进行临床试验，最终批准上市药物仅仅3个药物(盐酸多奈哌齐、盐酸美金刚胺和氢溴酸加兰他敏)和一种组合药物(盐酸美金刚胺缓释剂和盐酸多奈哌齐)。盐酸多奈哌齐和氢溴酸加兰他敏都为乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂；盐酸美金刚胺则是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂。以上药物仅仅针对单一靶点，仅能轻微减轻或轻微延缓AD的症状或发病病程，并不能起到明显改善或治疗效果。

美洲大蠊(Periplaneta americana)属昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，俗称蟑螂，原产于南美洲，也是地球上起源最早、生命力最顽强的昆虫类群之一。美洲大蠊作为药的记载最早见于《神农本草经》。作为传统中药一般以干燥或鲜成虫入药，用于治血瘀症、寒热、破积聚、喉咽痹、内寒无子等症状。美洲大蠊提取物中含有神经肽、蛋白、环肽、多糖和氨基酸等。通过药理学研究发现美洲大蠊具有抗肿瘤、保肝、促进组织修复、免疫调节、抗菌抗病毒和抗氧化作用等多种功能。

由于美洲大蠊中成分复杂且各个成分发挥的功效各异，而不同的提取工艺决定了提取物在治疗AD中的有效性。现有美洲大蠊的中成药制剂(如，康复新液(抗炎、外伤修复)、心脉龙注射液(治疗心衰)、肝龙胶囊(治疗乙肝))或美洲大蠊药酒(治疗神经退行性疾病)都以乙醇为提取溶剂，而以水为提取溶剂且具有AD干预功能的美洲大蠊制剂没有文献报道。

发明内容

本发明提供了一种美洲大蠊提取物及其提取方法和应用，以水为溶剂提取到的美洲大蠊提取物具有预防和治疗阿尔兹海默症的效果。

本发明的技术方案如下：

一种美洲大蠊提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将干燥美洲大蠊虫体粉碎，得到美洲大蠊粗粉；

(2)将步骤(1)得到的美洲大蠊粗粉以水为溶剂在50～60℃下搅拌提取0.5～2小时，得到水提液；

(3)将所述水提液除脂，得到美洲大蠊提取物。

优选的，步骤(2)所述美洲大蠊粗粉在水中的料液比为1：5～10。

优选的，步骤(3)所述除脂为自然沉淀除脂。

优选的，所述自然沉淀除脂的温度为1～4℃，时间为24～48小时。

优选的，所述除脂前还包括初浓缩的步骤：将所述水提液在50～65℃下减压浓缩至原体积的1/6～1/5。

进一步优选的，步骤(3)所述除脂后还包括再浓缩的步骤：将除脂后的水提液在50～65℃下减压浓缩，至无水蒸出为止。

优选的，所述美洲大蠊粗粉为过8目～10目网筛的筛下部分。

本发明还包括上述任意一项技术方案所述方法制备得到的美洲大蠊提取物。

本发明还提供了上述技术方案所述美洲大蠊提取物在制备干预AD药物或保健品中的应用。

作为优选的，所述美洲大蠊提取物以浸膏计，所述干预AD药物或保健品中美洲大蠊提取物的有效剂量为250～500mg/kg。

现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种干预AD用的美洲大蠊提取物制备方法，该方法中以水为提取溶剂对干燥美洲大蠊粗粉中的活性物质进行提取，与以乙醇为溶剂相比，用水为溶剂能有效提取美洲大蠊中蛋白、多肽、氨基酸、多糖和水溶性小分子化合物，且脂含量较低。

作为一种优选的实施方式，本发明的美洲大蠊提取物制备方法中的除脂方法优选为低温除脂法。粗提样品在1～4℃条件下冷却，最终导致脂大量析出从而达到除脂目的。该方法最大优点是保持提取物活性，且无其他有机溶剂掺入。

本发明提取得到的美洲大蠊提取物具有无异味、适口性好等优点。相比于直接服用美洲大蠊粉末，该提取工艺能有效富集干预AD的特定活性成分，进而实现有效浓度给药。

本发明的美洲大蠊水提取物具有AD干预效果。实验表明，本发明的美洲大蠊提取物能显著提高AD模型鼠空间学习记忆能力，显著降低AD模型鼠脑中老年斑数量，且呈一定的浓度依赖关系。本发明的美洲大蠊提取物能直接作为AD治疗药物或预防性保健食品，或与其他配伍成分、辅料组合使用。

附图说明

图1为美洲大蠊提取物对AD模型鼠空间学习记忆能力的影响；其中，#表示APP/PS1对照组与APP/PS1250mg/kg/day比较p值≦0.05；*表示APP/PS1对照组与APP/PS1500mg/kg/day比较p值≦0.05；**表示APP/PS1对照组与APP/PS1500mg/kg/day比较p值≦0.01；

图2为不同处理组小鼠脑石蜡切片免疫组织荧光染色图；

图3为图2中对应组AD模型鼠脑内老年斑数量的统计结果。

具体实施方式

本发明提供了一种美洲大蠊提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将干燥美洲大蠊虫体粉碎，得到美洲大蠊粗粉；

(3)将所述水提液除脂，得到美洲大蠊提取物。

本发明对美洲大蠊的来源没有特殊限定，采用市售美洲大蠊药材或美洲大蠊鲜虫均可。若为美洲大蠊鲜虫，则需将美洲大蠊虫体干燥后，用于本发明美洲大蠊提取物的制备。在干燥过程中，干燥温度不能高于65℃，以保证美洲大蠊虫体中提取成分的活性，优选干燥温度为50～65℃。干燥至本领域技术人员所熟知的便于粉粹的程度即可。

本发明将干燥美洲大蠊虫体粉碎，得到美洲大蠊粗粉。本发明对粉碎方式没有限定，采用本领域技术人员所熟知的粉碎方式。本发明优选将粉碎后的物料过8～10目网筛，该粒度能够使美洲大蠊粗粉中的活性成分快速充分溶出，提高美洲大蠊提取物的提取率。

本发明将美洲大蠊粗粉在水中进行搅拌提取，得到水提液。所述水优选为去离子水。所述美洲大蠊粗粉在水中的料液比优选为1：5～10，更优选为1:7～9。本发明所述搅拌提取的温度为50～60℃，优选为53～57℃。本发明对美洲大蠊粗粉在水中的提取次数没有特殊限定，优选为3次以下，可以为1次、2次或3次，每次的提取时间为0.5～2小时，优选为1～1.5小时。增加提取次数有利于提高美洲大蠊的提取率，但提取次数超过3次，则提取率没有明显变化且增加生产成本，故本发明最优选为3次水提取，合并每次提取的水提液。

所述提取后，本发明将得到的水提液除脂，优选在所述除脂前将水提液进行初浓缩。初步浓缩过程中也会除掉一部分脂，浓缩后总体积减小，低温除脂的效果达到最佳。本发明所述初浓缩优选为减压浓缩。所述初浓缩的温度优选为50～65℃，更优选为55～60℃。所述初浓缩的真空度优选为-0.05～-0.06MPa。所述初浓缩优选至原水提液体积的1/6～1/5，得到初浓缩水提液。

本发明将水提液或初浓缩水提液除脂。本发明所述除脂优选为自然沉淀除脂，该除脂方法具有除脂率高、无其他溶剂混入等优点，能够保持提取物活性。所述自然沉淀除脂优选为低温自然沉淀除脂，所述除脂的温度优选为1～4℃，除脂时间优选为24～48h。除脂后的水提液为美洲大蠊提取物。

本发明所述除脂后优选还包括再浓缩的步骤。本发明所述再浓缩优选为减压浓缩。所述再浓缩的温度优选为50～65℃，更优选为55～60℃。所述再浓缩的真空度优选为-0.05～-0.06MPa。所述再浓缩优选浓缩至无水蒸出为止，得到浓缩提取浸膏为美洲大蠊提取物。

本发明制备得到的美洲大蠊水提取物具体有AD干预效果。实验表明，本发明的美洲大蠊提取物能显著提高AD模型鼠空间学习记忆能力，显著降低AD模型鼠脑中老年斑数量，且呈一定的浓度依赖关系。本发明的美洲大蠊提取物能直接作为AD治疗或预防药物或预防性保健食品，或与其他配伍成分和/或辅料组合使用。本发明所述美洲大蠊提取物以浸膏计，所述AD药物或保健品中，美洲大蠊提取物的有效剂量优选为250～500mg/kg，更优选为300～400mg/kg。所述配伍成分及辅料组合的具体种类本发明不做限定，本领域技术人员可根据本领域中的操作进行筛选或组合。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

干预AD用的美洲大蠊活性成分提取工艺，具体操作步骤如下：

A.美洲大蠊虫体粉碎：将干燥美洲大蠊虫体粉碎(干燥温度不能高于65℃)，过8目网筛，即为美洲大蠊粗粉；

B.水提取：将步骤A美洲大蠊粗粉于去离子水中60℃搅拌提取2次，每次按料液比为1：5提取时间为1.5小时进行提取，合并提取液；

C.初浓缩：将步骤B所得水提取液在真空度-0.05MPa、温度50℃条件下减压浓缩，至粗提液的1/6，得浓缩液；

D.低温脱脂：将步骤C所得粗提液于4℃放置24小时自然沉淀除脂。

实施例2

A.美洲大蠊虫体粉碎：将干燥美洲大蠊虫体粉碎(干燥温度不能高于65℃)，过10目网筛，即为美洲大蠊粗粉；

B.水提取：将步骤A美洲大蠊粗粉样品于去离子水中50℃搅拌提取3次，每次按料液比为1：10提取时间为1小时进行提取，合并提取液；

C.初浓缩：将步骤B所得水提取液在真空度-0.06MPa、温度65℃条件下减压浓缩，至粗提液的1/5，得浓缩液；

D.低温脱脂：将步骤C所得粗提液于1℃放置48小时自然沉淀除脂；

E.再次浓缩、定量：将步骤D除脂后所得水提取液在真空度-0.06MPa、温度60℃条件下减压浓缩至无水蒸出为止，得浓缩提取浸膏并称重。

采用上述工艺流程生产干预AD的美洲大蠊提取物，提取收率达10-11％。

实施例3

B.水提取：将步骤A美洲大蠊粗粉样品于去离子水中57℃搅拌提取1次，每次按料液比为1：8提取时间为2小时进行提取；

C.初浓缩：将步骤B所得水提取液在真空度-0.06MPa、温度60℃条件下减压浓缩，至粗提液的1/6，得浓缩液；

D.低温脱脂：将步骤C所得粗提液于2℃放置36小时自然沉淀除脂。

实施例4

检测实施例1～3制备得到的美洲大蠊提取物及康复新液(95％乙醇浸膏，国药准字Z51021834)中各成分及含量。其中油脂含量以美洲大蠊提取物的石油醚提取物进行计算；提取物中多肽和蛋白含量测定方法为：首先通过10kDa超滤管超滤，滤过液为多肽、滤膜上方为蛋白，根据2010药典附录中《蛋白含量测定法》中的BCA法分别测定美洲大蠊提取物样品中多肽和蛋白含量；美洲大蠊提取物中多糖含量根据2010药典中石斛多糖检测方法检测；游离氨基酸根据2010药典附录《氨基酸分析》中茚三酮柱后衍生氨基酸分析法进行检测；其他成分则总量减掉多肽、蛋白、多糖、油脂、和游离氨基酸含量。检测结果见表1。

表1实施例1～3美洲大蠊提取物与康复新液中各成分及含量(％)

实施例5

美洲大蠊提取物在AD模型鼠上的治疗：

取实施例2制备得到的美洲大蠊提取物，在小鼠基础饲料中分别按照不添加(1号饲料)、添加0.15％(250mg/kg/天，2号饲料)、添加0.3％(500mg/kg/天，3号饲料)配成三组饲料，并制成小鼠标准颗粒粮；另外添加0.3％药店购买的康复新液95％乙醇浸膏(500mg/kg/天，4号饲料)(下文中所有提到的“康复新液”都指康复新液95％乙醇浸膏)。

实验鼠及分组：模型鼠为APP/PS1AD模型鼠，5月龄雌鼠48只，分成三组每组12只；APP/PS1AD模型鼠同窝野生型对照鼠，5月龄雌鼠12只。

方法：实验鼠在标准饲养条件下饲养6个月，给予标准饮水，四组APP/PS1AD模型鼠分别给予以上四组饲料，APP/PS1AD模型鼠同窝野生型对照鼠以1号饲料饲养。饲养6个月后进行行为学检测和老年斑检测。

行为学检测：

采用Morris水迷宫对各组小鼠进行对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力测试。Morris水迷宫主要由圆形水池和自动录像及分析系统组成。圆形水池直径120cm、高50cm，平台直径为10cm，在整个实验中保持操作者位置及周围环境的相对稳定。

(1)定位航行试验

历时7天，每日分上、下午两个时段，固定时间为每日上午10:00-12:00，下午13:00-17:00进行。每组小鼠在固定时间，将小鼠面向池壁放入水中，记录1min内寻找到平台所用的时间，即逃避潜伏期。

若小鼠入水后1min内未能找到平台，则将其置于平台上并停留10s，记录逃避潜伏期为60s。每次训练时间间隔为10min，每天三次。同时记录各组小鼠的游泳速度，计算其平均游泳速度。

最终统计每组小鼠在1min内找到平台的百分比(任务完成率)和每组小鼠平均游泳速度。

老年斑检测：

给药6个月后，戊巴比妥钠麻醉并生理盐水心脏灌流一段时间，肝脏由红转白后换4％多聚甲醛灌流固定10分钟。取固定好的小鼠脑进行石蜡包埋并用石蜡切片机(LeicaRM2245)制作超薄切片，厚度为5μm，再进行免疫组织荧光染色分析。

其中，样本石蜡制片简要方法如下：

1)脱水：将脑组织块置于一系列浓度逐渐升高的酒精中逐级脱水，如下：30％→50％→70％→90％→100％乙醇，每级停留2h。

2)透明：材料脱水后，材料中全含酒精，酒精与蜡也不能混合，仍须除去，如下：50％乙醇+50％二甲苯→二甲苯(两次)，每级停留1h。

3)浸蜡：浸蜡是把材料封埋在石蜡里面，便于切片，将上一步处理过的组织块放入液态纯净石蜡中浸蜡，中间用纯液态石蜡更换两次，每次半小时。最后将组织块与石蜡倒入包埋盒中，注意用加热的镊子调整组织的切面，再将包埋盒放在冷冻台，使石蜡迅速凝固。

4)切片：用石蜡切片机将脑组织横切成5μm的连续切片。

5)粘片：材料切成薄片后，于50℃水中充分展开，将完全展开的切片粘在准备好的载玻片上，粘片后置于38℃恒温箱烘干。

另外，免疫组织化学染色方法如下：

1、石蜡切片用二甲苯脱蜡10分钟，一共两次；再用乙醇逐级梯度水化。

2、3％H₂O₂室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

3、蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，一共两次。

4、5-10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。滴加一抗(抗β-Amyloid抗体，CST)工作液，4℃孵育过夜。

5、PBS冲洗，5分钟一次，共三次。

6、滴加适量生物素标记的二抗工作液，37℃孵育10-30分钟。

7、PBS冲洗后滴加适量的辣根酶酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10分钟。

8、PBS冲洗后加入二氨基联苯胺(DAB)显色剂显色3-15分钟，以显微镜下观察至特异性染色清晰且无背景染色为标准。

9、自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水，透明，中性树脂封片剂封片。

10、观察：XL Core细胞成像系统(AMEX 1000，life，USA)观察样本荧光数据(采取单层扫描方法)，并用软件(Image J)分析数据。

治疗结果：

(1)本发明中的提取物能显著提高AD模型鼠空间学习记忆能力(即提高模型鼠任务完成率)且呈一定的浓度依赖关系(见附图1)。250mg/kg/天组在第六天时与AD模型鼠组比较达到显著差异(p≤0.05)；500mg/kg/天组在第五天时、第七天时与AD模型鼠组比较达到差异极显著(p≤0.01)，第六天则达到差异显著(p≤0.05)；康复新液组则没有改善效果。

(2)本发明中的提取物能显著降低AD模型鼠脑中老年斑数量且呈一定的浓度依赖关系(见附图2和附图3)。AD模型鼠对照组、250mg/kg/天提取物AD模型鼠组、500mg/kg/天提取物AD模型鼠组和500mg/kg/康复新液AD模型鼠组大脑皮层和海马区中老年斑数分别为113.25、107.33、82.75和108。通过统计学分析，500mg/kg/天提取物组与AD模型鼠组比较达到极显著差异(p≤0.05)；康复新液组老年斑数目基本与模型对照组相当。各组老年斑数变化趋势与空间学习记忆能力结果一致，即老年斑数目减少则空间学习记忆力强。

说明本发明的美洲大蠊水提取物在AD干预中有非常好的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于制备干预老年性痴呆药物或保健品的美洲大蠊提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将干燥美洲大蠊虫体粉碎，得到美洲大蠊粗粉；

(3)将所述水提液除脂，得到美洲大蠊提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述美洲大蠊粗粉在水中的料液比为1：5～10。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述除脂为自然沉淀除脂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述自然沉淀除脂的温度为1～4℃，时间为24～48小时。

5.根据权利要求1或3或4所述的制备方法，其特征在于，所述除脂前还包括初浓缩的步骤：将所述水提液在50～65℃下减压浓缩至原体积的1/6～1/5。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述除脂后还包括再浓缩的步骤：将除脂后的水提液在50～65℃下减压浓缩至无水蒸出为止，得到美洲大蠊提取物的浸膏。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述美洲大蠊粗粉为过8目～10目网筛的筛下部分。

8.权利要求1～7任意一项所述方法制备得到的美洲大蠊提取物。

9.根据权利要求8所述美洲大蠊提取物在制备干预老年痴呆症药物或保健品中的应用，其特征在于，所述美洲大蠊提取物以浸膏计，所述干预老年性痴呆药物或保健品中美洲大蠊提取物的有效剂量为250～500mg/kg。