CN1330357C - 具有生理活性的复方人参二醇皂苷及其制剂及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有生理活性的复方人参二醇皂苷及其制剂及用途,这种复方人参二醇皂苷含有:人参二醇皂苷组、含天麻素大于10%的天麻提取物以及茶多酚,加辅料可制成医药或食品上可以接受的制剂,也可制备各种新药及功能食品。本发明的复方具有改善睡眠和抗氧化功效,用于对因过氧化或游离基对脑细胞和脑神经细胞损伤或疲劳的修复或恢复作用,也可用于治疗或改善因精神长期紧张导致脑细胞和脑神经细胞损伤或疲劳所引起的失眠、健忘及其后果。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有生理活性的复方人参二醇皂苷及其制剂及用途。
背景技术
人参(高丽参)、西洋参和三七(又名参三七、田七、南方人参)均是五加科人参属植物,其根、叶、花等均具有药用价值,主要含有人参皂苷及其它物质。根据研究资料证实从各种植物中提取的人参皂苷、西洋参皂苷和三七总皂苷主要由以Rb1为主的人参二醇型皂苷和以Rg1为主的人参三醇型皂苷组成。二醇型皂苷和三醇型皂苷既有相似之处,又有区别,在神经系统的作用上甚至相反。两者在改善血液循环的血流动力学,降低血液粘度,降低血脂等方面作用相似。目前,对各单有效提取部分均有一些研究报导,但未见与本发明专利申请相同的复方研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有生理活性的复方人参二醇皂苷及其制剂及用途,其具有改善睡眠和抗氧化功能,可用于制成医药或食品上可以接受的制剂,还可用于制备各种新药及功能食品。
本发明的目的是这样实现的:这种具有生理活性的复方人参二醇皂苷含有以下成分:人参二醇皂苷组、天麻提取物(含天麻素>10%)、茶多酚。
这种具有生理活性的复方人参二醇皂苷,复方中各有效成分的配比(重量)为:
人参二醇皂苷组 16%~68%
天麻提取物(含天麻素>10%) 5%~37%
茶多酚 8%~46%
这种具有生理活性的复方人参二醇皂苷,其复方中还可含有维生素C、维生素E。
这种具有生理活性的复方人参二醇皂苷,复方中各有效成分的配比(重量)为:
人参二醇皂苷组 16%~58%
天麻提取物(含天麻素>10%) 5%~17%
茶多酚 10%~36%
维生素C 18%~38%
维生素E 3%~12%
这种具有生理活性的复方人参二醇皂苷,所述的人参二醇组中人参皂苷Rb1在其中的含量为45%~99%,其余为Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2等。
这种具有生理活性的复方人参二醇皂苷制剂,复方制剂中各成分的配比(重量)为:
方案中所用的复方人参二醇皂苷 5%~85%
辅料 15%~95%
辅料为药用或食用辅料中的一种或几种,制成医药或食品上可以接受的制剂。
本发明所述的药用的辅料为甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、卡波姆934、黄原胶、明胶、Syloid204、氨基酸及其衍生物、NaCl、CaCl2、CaCO3等有机或无机物;食品用的辅料为大豆油、精炼植物油、花生油、聚乙二醇(PEG)、面粉、骨胶、果胶、茶叶、蜂蜜等。
这种具有生理活性的复方人参二醇皂苷的用途,可用于对因过氧化或游离基对脑细胞和脑神经细胞损伤或疲劳的修复或恢复作用。
这种具有生理活性的复方人参二醇皂苷的用途,可用于治疗或改善因精神长期紧张导致脑细胞和脑神经细胞损伤或疲劳所引起的失眠、健忘及其后果。
这种具有生理活性的复方人参二醇皂苷的用途,还用于制成医疗上可接受的各种新药及功能食品,如:粉针剂、滴剂、口服剂的口腔粘膜给药的舌下含片、速溶片、咀嚼片和普通的口服剂及各种食品饼干、糖果、饮料、果冻等。
本发明的复方由人参二醇皂苷组、天麻提取物、茶多酚及维生素组成,其中人参二醇皂苷以人参皂苷Rb1为主;天麻提取物则以测定天麻素为主,天麻素是传统中药天麻中酚苷类化合物,具有改善睡眠、改善心脑血管、抗痴呆等功效;茶多酚是从茶叶中提取的多酚类化合物,具有抗氧化、清除体内自由基的功效;维生素C、E是维生素中有名的抗氧化性维生素。本发明的复方具有改善睡眠和抗氧化作用,属无毒物、亦无致突变作用、安全,有较好的稳定性,可用于对因过氧化或游离基对脑细胞和脑神经细胞损伤或疲劳的修复或恢复作用,还可用于治疗或改善因精神长期紧张导致脑细胞和脑神经细胞损伤或疲劳所引起的失眠、健忘及其后果。可用来制成医药或食品上可以接受的制剂,还可用于制备各种新药及功能食品。
具体实施方式
Rb1、Rb1>45%的生产方法
1、Rb1>45%的生产
取三七总皂苷(>90%)100g,溶于90%的乙醇500ml中,边搅拌边加入2000ml丙酮,充分搅拌后,置于10~15℃下8h以上,过滤,取滤饼。反复数次,将含Rb1较高(>40%)的滤饼,上一短的硅胶柱,用丙酮洗脱人参三醇部分,收集1000ml。用乙醇7000ml洗脱,浓缩乙醇洗脱液,低温干燥或喷雾干燥即得含量在Rb1>45%的成品约25g(收率~25%)。
2、Rb1的生产
取上述Rb1>45%的产品,用硅胶柱层析法,用CHCl3∶CH3OH=7∶3溶剂洗脱,收集Rb1组分。反复数次即得含量在93%以上的Rb1成品。
可以用人参皂苷、西洋参皂苷代替三七总皂苷。
实施例1、复方人参二醇型皂苷颗粒
配方(1000包):
人参二醇皂苷组(Rb1=52.5%) 12.5g
天麻提取物(含天麻素14.0%) 9.5g
茶多酚 20.0g
维生素C 15g
维生素E 3g
蔗糖 3100g
糊精 380g
乙醇 适量
按普通制粒法制粒,分装成1000袋(每袋约3.5g)。每次食用一袋,每日1次(睡前)。
实施例2、复方人参二醇型皂苷胶丸
配方(1000粒):
人参二醇皂苷组(Rb1=82.5%) 22.5g
天麻提取物(含天麻素68.4%) 10.5g
茶多酚 15.0g
维生素C 19g
维生素E 4g
植物精炼油 400g
将活性成分固体部分混均,超细化(>2000目),维生素E加入精炼油中,然后按普通胶丸剂制备方法制备,每粒内容物重约470mg,可得1000粒。
实施例3、复方人参二醇型皂苷滴丸
配方:
人参二醇皂苷组(Rb1=82.5%) 30g
天麻提取物(含天麻素68.4%) 10g
茶多酚 8g
PEG-6000 300g
将活性成分固体部分混均,超细化(>2000目),加入基质PEG-6000中,加热融化成液体状,在保温条件下滴入液体石蜡冷凝液中,控制一定的速度,使其固化成圆整的球型。即得滴丸,测定每丸含量,以每次服用Rb1计应以24mg来确定服用量。
实施例4、复方人参二醇型皂苷冻干粉针
配方(1000支):
人参二醇皂苷组(Rb1=92.4%) 15.5g
天麻提取物(含天麻素90.5%) 12g
茶多酚 17.0g
甘露醇 60g
按普通冻干法制备成冻干制剂,可制得1000支复方人参二醇型皂苷冻干粉针。
实施例5、复方人参二醇型皂苷口服液
配方(1000支):
人参二醇皂苷组(Rb1=45.4%) 38g
天麻提取物(含天麻素90.5%) 30g
茶多酚 47g
维生素C 49g
维生素E 9g
蜂蜜 1000g
蒸馏水 加至10kg
按普通口服液制备方法制备,可得1000支(每支约重11g)的口服液。
实施例6、复方人参二醇型皂苷口含片
配方1(1000粒):
人参二醇皂苷组(Rb1=70.5%) 32.5g
天麻提取物(含天麻素41.7%) 10g
茶多酚 16g
维生素C 22g
维生素E 4g
乳糖 250g
甘露糖 100g
17%淀粉浆 ~50g
十二烷基硫酸钠 ~1g
按常规含片制造方法制造,可得1000片普通的复方人参二醇型皂苷口含片。
配方2(微囊含片)
人参二醇皂苷组(Rb1=70.5%) 32.5g
天麻提取物(含天麻素41.7%) 10g
茶多酚 16g
维生素C 22g
维生素E 4g
PEG600 40g
用过2000目的活性成分超细粉为囊心物,PEG600为囊材,先制成微囊。
乳糖 100g
甘露糖 50g
糊精 5g
十二烷基硫酸钠 1g
PEG-6000 200g
压成异型片1000片,本异型片为骨架型片具有一定的缓释作用。
配方3(胶质骨架含片):
人参二醇皂苷组(Rb1=87.5%) 22.5g
天麻提取物(含天麻素31%) 20g
茶多酚 10g
维生素C 13g
维生素E 7g
乳糖 250g
甘露糖 120g
黄原胶 18g
明胶 10g
甘油 2g
薄荷醇 1g
十二烷基硫酸钠 ~1g
该方制得的含片1000片,细腻润滑,清香。
实施例7、复方人参二醇型皂苷咀嚼片
配方:
人参二醇皂苷组(Rb1=55.5%) 42.5g
天麻提取物(含天麻素70%) 10g
茶多酚 9g
维生素C 10g
维生素E 3g
β-CD 39g
甘露醇 58g
蔗糖 15g
甲基纤维素 8g
阿司巴糖 0.3g
薄荷香精 0.3g
Syloid204 0.7g
硬脂酸镁 1.3g
制法:先将PDG、维生素E和β-CD混合研磨,制成包合物备用。按配方量将蔗糖、甘露醇和阿司巴糖混合后,经40目筛过3次,再加入甲基纤维素和前述备用包合物,过12目筛过3次混匀。用10%阿拉伯胶浆为黏合剂制成湿料,过10目筛。湿颗粒经80℃烘箱干燥8h。干颗粒用12目筛整粒。喷入薄荷香精后加入Syloid204和硬脂酸镁,压片即得1000片复方人参二醇型皂苷咀嚼片。
以上实施例仅为了对本发明做进一步的说明,而本发明的范围不受所举实施例的局限。
本发明的药学及功效研究结果如下:
一、复方人参二醇型皂苷胶丸(七茗牌神安软胶囊)安神镇静作用
改善睡眠检验方法
1实验动物
健康成年小鼠,单一性别,18-22克,每组10-15只。
2剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组和一个空白对照组,以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组,另设二各剂量组,必要时设阳性对照组。受试样品给予时间原则上不少于30天,必要时可适当延长。
3实验方法
3.1直接睡眠实验
3.1.1操作步骤:观察动物给于3个剂量的受试样品,对照组给予同体积溶剂后,是否出现睡眠现象、睡眠以翻正反射消失为指标。当小鼠置于背卧位时,能立即翻正身位如超过30-60秒不能翻正者,即认为翻正反射消失,进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒,翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间,记录空白对照组与受试样品组入睡动物数及睡眠时间。
3.1.2数据处理及结果判定
睡眠时间为计量资料,采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
入睡动物数为计数资料用X2检验,四格表总例数小于40,或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时,应改用确切概率法。
比较对照组与实验组入睡动物数及睡眠时间之间的差异,若入睡动物数或睡眠时间增加有显著性,则实验结果阳性。
3.2延长戊巴比妥钠睡眠时间实验
3.2.1原理
在戊巴比妥纳催眠的基础上,观察受试物是否能延长睡眠时间,若睡眠时间延长,则说明受试物与戊巴比妥纳有协同作用。
3.2.2试剂
戊巴比妥钠(用前新鲜配制)
3.2.3操作步骤
做正式实验前先进行预实验,确定使动物100%入睡,但又不使睡眠时间过长的戊巴比妥钠剂量(30-60mg/kg),用此剂量正式实验。
动物末次给于溶剂对照及不同浓度受试样品后,出现峰作用前10-15分钟,给各组动物腹腔注射戊巴比妥钠,注射量为0.2mL/20g,以翻正反射消失为指标,观察受试样品能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。
3.2.4数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
比较实验组与对照组睡眠时间延长之间的差异,睡眠时间延长有显著性,则实验结果阳性。
3.3戊巴比妥钠(或巴比妥钠)阈下剂量催眠实验
3.3.1原理
观察受试物与戊巴比妥钠的协同作用。由于戊巴比妥钠通过肝酶代谢,而对该酶有抑制作用的药物,也能延长戊巴比妥钠睡眠时间,所以为排除这种影响,应进行阈下剂量实验。
3.3.2试剂
戊巴比妥钠(或巴比妥钠),用前新鲜配制。
3.3.3操作步骤
正式实验前先进行预实验,确定戊巴比妥钠阈下催眠剂量(16-30mg/kg.bw或巴比妥钠100-150mg/kgBW),即80-90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥钠最大阈下剂量。动物末次给予空白对照及不同浓度受试样品后,出现峰作用前10-15分钟,各组动物腹腔注射戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量,记录30分钟内入睡动物数(翻正反射消失达1分钟以上者)。实验宜在24-25℃安静环境下进行。
3.3.4数据处理和结果判定
入睡动物数为计数资料用X2检验,四格表总例数小于40,或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时,应改用确切概率法。
比较对照组与实验组入睡动物数之间的差异,入睡动物发生率增加有显著性,则实验结果阳性。
3.4巴比妥钠睡眠潜伏期实验
3.4.1原理
在巴比妥纳催眠的基础上,观察受试物是否能缩短入睡潜伏期,若睡眠潜伏期缩短,则说明受试物与巴比妥纳有协同作用。
3.4.2试剂
巴比妥钠(用前新鲜配制)
3.4.3操作步骤
做正式实验前先进行预实验,确定使动物100%入睡,但又不使睡眠时间过长的巴比妥钠的剂量(200-300mg/kg),用此剂量正式实验。
动物末次给于溶剂对照及不同浓度受试样品10-20分钟后,给各组动物腹腔注射巴比妥钠,注射量为0.2mL/20g,以翻正反射消失为指标,观察受试样品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。
3.4.4数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
比较实验组与对照组睡眠潜伏期之间的差异,睡眠潜伏期缩短有显著性,则实验结果阳性。
4结果判定
延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠(或巴比妥钠)阈下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验三项实验中二项阳性,且无明显直接睡眠作用,可判定该受试样品具有改善睡眠作用。
5注意事项
5.1实验室环境必须安静、恒温、恒湿,以确保条件的恒定。
5.2由于动物自身固有的生物学特征和习性,对受试样品的反应存在着种属、性别、年龄等方面的差异。一般来说鼠类活动在夜间比白天活跃,雌性比雄性更明显,年龄大的动物中枢神经反应不敏感。这类实验应尽量安排在夜间同一时间进行,室温24-25℃为宜。
5.3实验时应使动物在测定室适应数分钟后再进行正式测试,实验组与对照组交叉进行测试。
结果:经试验“七茗牌神安软胶囊“的各项改善睡眠的指标均很好。
二、复方人参二醇型皂苷抗氧化作用
抗氧化检验方法
1动物实验
1.1动物选择
选用12月龄以上老龄鼠或25-30g健康成年小鼠,单一性别每组10-15只。
1.2剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组和一个空白对照组和一个模型对照组,以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组,另设二各剂量组,必要时设阳性对照组。受试样品给予时间原则上不少于30天,必要时可适当延长。
1.3实验方法
1.3.1老龄动物
选用12月龄大鼠或12月龄小鼠,按血中MDA水平分组,随机分为1个老龄对照组和3个受试样品剂量组,另增设1个少龄对照组(大鼠3月龄,小鼠8周)每组大鼠单一性别8-12只,小鼠单一性别10-15只。3个剂量组给予不同浓度受试样品,对照组给予同体积溶剂,实验结束时处死动物测过氧化脂质含量、抗氧化酶活力。
1.3.2过氧化损伤模型
1.3.2.1 D-半乳糖模型
1.3.2.1.1原理
D-半乳糖供给过量,超常产生活性氧,打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态,引起过氧化效应。
1.3.2.1.2造模方法
选三月龄健康成年小鼠,用D-半乳糖40mg-1.2g/kgBW颈背部皮下注射造模,注射量为0.1mL/10g,每日1次,连续造模6周,取血测MDA,按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组,另设1个空白对照组,3个剂量组经口给予不同浓度受试样品,模型对照组和空白对照组给予同体积溶剂,在给受试样品的同时,除空白对照组外,各组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下注射,空白对照组皮下注射生理盐水,实验结束处死动物测过氧化脂质含量和抗氧化酶活力。
1.3.2.2辐照模型
1.3.2.2.1原理
电离辐射通过直接破坏生物膜中不饱和脂肪酸和间接通过水辐解产生自由基,引发脂类过氧化。
1.3.2.2.2造模方法
选18-22g健康成年小鼠,随机分5个组,1个空白对照组,1个模型对照组和3个受试样品剂量组,3个剂量组给予不同浓度受试样品,对照组给予同体积溶剂,30天后,除空白对照组外,各组给予5-8Gy60C。γ射线全身1次性照射,照射后第3、4天处死动物,取肝组织(或第9、10天处死动物,取睾丸组织)测过氧化脂质含量和抗氧化酶活力。
1.3.2.3溴代苯模型
1.3.2.3.1原理
溴代苯导致小鼠肝中毒,引起肝脂质过氧化。
1.3.2.3.2造模方法
选18-22g健康成年小鼠,随机分5个组,1个空白对照组,1个模型对照组和3个受试样品剂量组,3个剂量组给予不同浓度受试样品,对照组给予同体积溶剂,30天后,动物饥饿过夜,给受试样品0.5-1小时后,除空白对照组外,各组灌胃0.16-0.47mg/kgBW溴代苯油,灌胃量0.2mL/20g,空白对照组灌胃同体积植物油,大约18-22小时后处死动物,取肝组织测过氧化脂质含量和抗氧化酶活力。
1.3.3过氧化脂质(LPO)含量测定
脂质过氧化可以形成丙二醛、乙烷、共轭二烯、荧光产物及能产生化学发光的物质。如果这些产物在体液和组织中的含量增多,则表明体内脂质过氧化反应增强。
1.3.3.1血中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定
血中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量可采用荧光法和比色法测定,方法任选其一。
1.3.3.1.1荧光法
1.3.3.1.1.1荧光法原理
MDA(malondiadehycle)是细胞膜脂质过氧化的终产物之一,测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛(MDA)分子与2个硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性条件下共热,形成粉红色复合物。以波长536nm为激发光,在550nm有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。
1.3.3.1.1.2仪器与试剂
仪器荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管
试剂
10mmol/L四乙氧基丙烷(贮备液,棕色瓶4℃保存12个月),临用前用纯水稀释成1nmol/mL
29mmol/L硫代巴比妥酸工作液
硫代巴比妥酸 0.209g
EDTA.2H2O 25mg
谷胱甘肽(还原型)1mg
用0.02mol/L NaOH 50mL溶解(微温助溶,棕色瓶4℃保存2周)
酸水解液
0.1mol/L H2SO4 125mL
0.1mol/L Na2SO4 125mL
加水150mL用H2SO4调PH 1.5,加水稀释至500mL
正丁醇
以上所用玻璃器皿均需经50%硝酸浸泡24h后,再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥,试剂(选AR级)最好用双蒸水配制。
1.3.3.1.1.3实验步骤
1.3.3.1.1.3.1样品制备
全血样品:取血50μl加入0.5mL生理盐水,2000r/min离心10min,取上清液待测。血清样品:取血0.5mL室温静置10min,2000r/min离心10min,取上清液待测。
1.3.3.1.1.3.2标准曲线制作
将10nmol/mL四乙氧基丙烷,用双蒸水稀释成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分别取0.1mL加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混匀,避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液(正丁醇层)测荧光强度(入射狭缝1.5nm,出射狭缝5nm,激发波长536nm,发射波长550nm)
以四乙氧基丙烷浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标作图。
1.3.1.1.3.3样品测定
试剂 | 空白管 | 样本管 | 标准管 |
10mL具塞离心管 | 0.1mL蒸馏水 | 0.1mL血清* | 0.1mL标准# |
酸水解液 | 2mL | 2mL | 2mL |
TBA工作液 | 0.5mL | 0.5mL | 0.5mL |
混匀,避光沸水浴60min,流水冷却 | |||
正丁醇 | 3mL | 3mL | 3mL |
振荡抽提1min,3000转/分离心5分钟 |
*全血0.5mL(空白管加蒸馏水0.5mL,标准管加标准0.1mL、蒸馏水0.4mL)#1nmol/mL四乙氧基丙烷(标准)
血清0.1mL(或全血上清液0.5mL)→加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混匀,避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液(正丁醇层)测荧光强度(入射狭缝1.5nm,出射狭缝5nm,激发波长536nm,发射波长550nm)
1.3.3.1.1.3.4计算公式:
A:空白管荧光度
B:样品荧光度
F:四乙氧基丙烷荧光度
C:四乙氧基丙烷浓度(1nmol/mL)
K:稀释倍数
1.3.3.1.1.4数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型(或老龄)对照组比较,过氧化脂质含量降低有统计学意义,判定该受试样品有降低脂质过氧化作用,实验结果阳性。若受试样品组过氧化脂质含量降低接近空白(或少龄)对照组,两者统计差异无显著性,则说明该受试样品具有较强的降低脂质过氧化作用。
1.3.3.1.2比色法
1.3.3.1.2.1比色法原理
MDA(malondiadehycle)是细胞膜脂质过氧化的终产物之一,测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛(MDA)分子与2个硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性条件下共热,形成粉红色复合物。该物质在波长532nm有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。
1.3.3.1.2.2仪器与试剂
仪器721分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。
试剂0.2M乙酸盐缓冲液 PH3.5
0.2M乙酸溶液 185mL
0.2M乙酸钠溶液 15mL
1mmol/L四乙氧基丙烷(贮备液,4℃保存3个月),临用前用水稀释成40nmol/mL
8.1%十二烷基硫酸钠SDS
0.8%硫代巴比妥酸TBA
0.2M磷酸盐缓冲液PH7.4
0.2M磷酸氢二钠 1920mL
0.2M磷酸二氢钾 480mL
1.3.3.1.2.3实验步骤
1.3.3.1.2.3.1样品制备
全血样品:取血50μl加入0.5mL0.2M磷酸盐缓冲液,2000r/min离心10min,取上清液待测。
1.3.3.1.2.3.2样品测定
试剂 | 空白管 | 样品管 | 标准管 |
50ul全血上清液 | 0.5mL | ||
40nmol/mL四乙氧基内烷 | 0.1mL | ||
8.1%SDS | 0.2mL | 0.2mL | 0.2mL |
0.2M乙酸盐缓冲液 | 1.5mL | 1.5mL | 1.5mL |
0.8%TBA | 1.5mL | 1.5mL | 1.5mL |
H2O | 0.8mL | 0.3mL | 0.7mL |
混匀,避光沸水浴60min,流水冷却,于532nm比色 |
1.3.3.1.2.3.3计算
A:空白管吸光度
B:样品吸光度
F:四乙氧基丙烷吸光度
C:四乙氧基丙烷浓度(40nmol/mL)
K:稀释倍数
1.3.3.1.2.4数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型(或老龄)对照组比较,过氧化脂质含量降低有统计学意义,判定该受试样品有降低脂质过氧化作用,实验结果阳性。若受试样品组过氧化脂质含量降低接近空白(或少龄)对照组,两者统计差异无显著性,则说明该受试样品具有较强的降低脂质过氧化作用。
1.3.3.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定
1.3.3.2.1原理
见1.3.3.1.2.1
1.3.3.2.2仪器与试剂
仪器721分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器
试剂 见1.3.3.1.2.2
1.3.3.2.3实验步骤
1.3.3.2.3.1样品制备
组织匀浆样品:取一定量的所需脏器,生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎,置匀浆器中,加入0.2M磷酸盐缓冲液,以20000r/min匀浆10s,间歇30s,反复进行3次,制成5%组织匀浆(W/V),3000r/min离心5~10min,取上清液待测。
1.3.3.2.3.2样品测定
6试剂 | 空白管 | 样品管 | 标准管 |
5%组织匀浆 | 0.1mL | ||
40nmol/mL四乙氧基丙烷 | 0.1mL | ||
8.1%SDS | 0.2mL | 0.2mL | 0.2mL |
0.2M乙酸盐缓冲液 | 1.5mL | 1.5mL | 1.5mL |
0.8%TBA | 1.5mL | 1.5mL | 1.5mL |
H2O | 0.8mL | 0.7mL | 0.7mL |
混匀,避光沸水浴60min,流水冷却,于532nm比色 |
1.3.3.2.3.3计算
A:空白管吸光度
B:样品荧吸光度
F:四乙氧基丙烷吸光度
C:四乙氧基丙烷浓度(40nmol/mL)
K:稀释倍数
1.3.3.2.3.4数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型(或老龄)对照组比较,过氧化脂质含量降低有统计学意义,判定该受试样品有降低脂质过氧化作用,实验结果阳性。若受试样品组过氧化脂质含量降低接近空白(或少龄)对照组,两者统计差异无显著性,则说明该受试样品具有较强的降低脂质过氧化作用。
1.3.3.3组织中脂褐质(Lipofasci)含量测定
1.3.3.3.1原理
脂褐素是丙二醛与游离氨基的物质(如磷脂酰乙醇胺、蛋白质及核酸)交联而生成的具有荧光的化合物,即shill碱,可以用氯仿与甲醇的混合液作萃取剂,将其从组织中提取出来进行测定,测定shill碱的含量,可知道细胞被自由基损伤的程度,间接反映体内脂质过氧化水平。
1.3.3.3.2仪器和试剂
仪器荧光分光光度计、组织匀浆器、离心机、紫外灯、恒温水浴锅
试剂氯仿(AR)
甲醇(AR)
氯仿—甲醇混合液(2∶1 v/v)(新鲜配制)
0.1mol/L硫酸
硫酸奎宁标准液(0.1μg/mL 0.1mol/L硫酸)
以上所用玻璃器皿均需经50%硝酸浸泡24h后,再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥。
1.3.3.3.3实验步骤
取组织200mg,加入2∶1(v/v)氯仿甲醇混合液4mL(w/v=1∶20),用匀浆器在45℃水浴中2500r/min匀化1min,制成以氯仿甲醇混合液为介质的5%匀浆。随后加入4mL蒸馏水,以2000r/min(匀浆器)充分混合1min,除去黄素干扰物,3000r/min离心10min后样品分为3层,上层为水相,中层为组织,下层为氯仿甲醇相。小心吸去水层,沿管壁穿过中层,将下层氯仿甲醇液取出,不可将水混入提取液中,若水混入提取液中,应再离心去除水。向氯仿甲醇提取液中加入甲醇0.2mL,轻轻振荡混匀,使之清澈透明,置紫外灯下照射30s,倒入石英杯中,测定荧光强度。
以硫酸奎宁(0.1μg/mL 0.1mol/L硫酸)为标准对照,在狭缝4.4,灵敏度3.6,激发波长360nm,发射波长450nm,其荧光强度为55-60U,在该条件下测定样品荧光强度。氯仿甲醇混合液为空白对照。
计算公式:
1.3.3.3.4数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型(或老龄)对照组比较,脂褐质含量降低有统计学意义,判定该受试样品有降低脂质过氧化作用,实验结果阳性。若受试样品组脂褐质含量降低接近空白(或少龄)对照组,两者统计差异无显著性,则说明该受试样品具有较强的降低脂质过氧化作用。
1.3.3.3.5注意事项:
1.3.3.3.5.1吸取氯仿层时要非常小心,以免带入组织颗粒和水,影响荧光测定。
1.3.3.3.5.2.荧光化合物的全部化学性质与特点不清楚,有些正常生化物质,如视黄醛和黄素类化合物也具有类似荧光产物的荧光光谱,黄素类物质是水溶性物质,水洗氯仿甲醇混合液,便可除去;视黄醛是脂溶性的,在氯仿中经紫外线照射后迅速降解,其它一些共轭多烯化合物,用紫外线照射也可除去。
1.3.3.3.5.3.丙二醛与自由氨基的交联反应较为缓慢,Schiff碱的形成是一个长时间的过程,不能立即反映自由基损伤反应的变化。因此,给予受试样品的时间要长,一般2-3个月,长者可达6个月以上。
1.3.4抗氧化酶活力测定
1.3.4抗氧化酶活力测定
SOD催化超氧阴离子自由基(O2 .-)生成H2O2,再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶作用生成水,这样可以清除O2 .-对细胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化,酶活性与生物年龄的增长成反比。消除自由基的能力与酶活性成正比。
1.3.4.1血/组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
1.3.4.1.1原理
O2 .-氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐,后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色,在波长530nm处有极大吸收峰,可用分光光度法进行测定,当SOD消除O2 .-后形成的亚硝酸盐减少。
1.3.4.1.2仪器与试剂
仪器721分光光度计、离心机、恒温水浴、匀浆器
试剂65mM磷酸盐缓冲液(PBS) pH7.8
10mmol/L盐酸羟胺
盐酸羟胺6.95mg,加PBS至10mL
7.5mmol/L黄嘌呤
黄嘌呤11.41mg,加0.1M NaOH 2.5mL溶解,加PBS至10mL
0.2mg/mL黄嘌呤氧化酶
取10mg/mL黄嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS 9.8mL至10mL
0.1%甲萘胺
取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸馏水,凉至室温加50mL冰醋酸,再加110mL
凉蒸馏水至200mL
0.33%对氧基苯磺酸
取0.66g对氨基苯磺酸溶于150mL温蒸馏水,加50mL冰醋酸至200mL
SOD标准品
三氯甲烷
95%乙醇(v/v)
0.9%生理盐水
1.3.4.1.3实验步骤
红细胞抽提液制备:10μl全血冲入0.5mL生理盐水,2000r/min离心3min,弃上清,加冰冷的双蒸水0.2mL混匀,加入95%乙醇0.1mL,振荡30s,加入三氯甲烷0.1mL,置快速混合器抽提1min,4000r/min离心3min,分层,上层为SOD抽提液,中层为血红蛋白沉淀物,下层为三氯甲烷,记录上清液体积待测。
组织匀浆的制备:剪取一定量的所需脏器,生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎,至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s,间歇30s,反复进行三次,制成1%组织匀浆,(最好用超声波发生器处理30s),使线粒体振破,以中性红—詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎。以4000r/min离心5min,取上清液20μl待测。
SOD标准抑制曲线将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/mL的溶液,再稀释到50倍,即SOD量为15U/mL(1.5μg/mL),用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率,以百分抑制率为纵坐标,以SOD活力单位U/mL为横坐标绘制标准曲线。
计算
每mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位。
也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SODU/mL,乘以稀释倍数(1mL/取样量)。
若样品为组织匀浆液,根据匀浆浓度或组织蛋白质含量,将单位换算为U/g组织或U/mg蛋白。若样品为红细胞抽提液,根据血红蛋白含量,可换算为U/g Hb。
样品测定步骤:
试剂 | 测定管 | 对照管 |
1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH7.8(mL) | 1.0 | 1.0 |
样品 | A* | |
10mmol/L盐酸羟胺(mL) | 0.1 | 0.1 |
7.5mmol/L黄嘌呤(mL) | 0.2 | 0.2 |
0.2mg/mL黄嘌呤氧化酶(mL) | 0.2 | 0.2 |
双蒸水(mL) | 0.49 | 0.49 |
混匀,25℃恒温水浴20min | ||
0.33%对氨基苯磺酸(mL) | 2.0 | 2.0 |
0.1%甲萘胺(mL) | 2.0 | 2.0 |
混匀15min后,倒入1cm光径比色杯,以蒸馏水调零,530nm处比色测定OD值。 | ||
*A所用样品的量 | ||
红细胞抽提液 | 10μl | |
血清(或血浆) | 20μl(溶血样品剔除) | |
1%组织匀浆 | 10-40μl |
1.3.4.1.4数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型(或老龄)对照组比较,SOD活力升高有统计学意义,判定该受试样品有升高SOD作用,实验结果阳性。若受试样品组SOD升高接近空白(或少龄)对照组,两者统计差异无显著性,则说明该受试样品具有较强的升高SOD作用。
1.3.4.2血/或组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定
1.3.4.2.1原理
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要,其活力以催化GSH氧化的反应速度,及单位时间内GSH减少的量来表示,GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸(DTNB)反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子,于423nm波长有最大吸收峰,测定该离子浓度,即可计算出GSH减少的量,由于GSH能进行非酶反应氧化,所以最后计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
1.3.4.2.2试剂和仪器
仪器721分光光度计、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器
试剂叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0
NaN3 16.25mg 终浓度2.5mmol/L
EDTA-Na2 7.44mg 终浓度0.2mmol/L
Na2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/L
NaH2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100mL,用少量HCL、NaOH调pH7.0,4℃保存。
1mmol/L谷胱甘肽(还原型GSH)溶液
GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL,临用前配制,冰冻保存1-2日。
1.25-1.5mmol/LH2O2溶液
取30%H2O20.15-0.17mL,用双蒸水稀释至100mL,作为贮备液,4℃避光保存,临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液
HPO3 16.7g(先用蒸馏水溶解)
EDTA 0.5g
NaCl 280g
加蒸馏水至1000mL,用普通滤纸过滤,室温保存。
0.32mol/LNa2HPO4溶液:
Na2HPO422.7g加蒸馏水至500mL,室温保存。
DTNB显色液
DTNB 40mg
柠檬酸三钠 1.0g
加蒸馏水至100mL,4℃避光保存1个月。
0.2M磷酸缓冲液PH7.4
0.9%生理盐水
1.3.4.2.3实验步骤
1.3.4.2.3.1样品制备
血样稀释液:取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中,充分振摇,使之全部溶血1∶100待测,4h内测定酶活力。若当天来不及测定,将肝素抗凝全血置-20℃冻存,3d内测定,若4℃存放,28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻,
组织上清液:动物禁食过夜,处死后,立即取出所需脏器,放入冷生理盐水中洗去浮血,剔除脂肪及结缔组织,滤纸吸干后,在冰浴上剪成碎块,称取适量组织,加冷0.2M磷酸缓冲液,以20000r/min匀浆10s,间歇30s,反复3次制成5%组织匀浆,操作在冰浴中进行,匀浆以12500×g离心10min(低温高速离心机),以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体,上清液用以测胞液中的酶活力,最好当天测,否则加20%(v/v)甘油分装于塑料管,放置-20~-80℃,可保存数周,而酶活力不减。
1.3.4.2.3.2 GSH标准曲线的制作:
取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分别置于10mL小容器瓶中,各加入偏磷酸沉淀剂8mL,用双蒸水稀释至10mL刻度,即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。
取上述不同浓度标准液各2mL,放入试管中,加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL,比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯,5min内在可见光423nm波长测OD值,以双蒸水调零点。
以GSH含量(μmol/L)为横坐标,OD423值为纵坐标,绘制标准曲线。
1.3.4.2.3.3测定步骤:
试剂 | 样品管(mL) | 非酶管(mL) | 空白管(mL) |
1.0mmol/LGSH | 0.4 | 0.4 | |
样品** | 0.4 | ||
双蒸水* | 0.4 | ||
37℃水浴预温5min | |||
H2O2(37℃预热) | 0.2 | 0.2 | |
37℃水浴准确反应3min(严格控制时间) | |||
偏磷酸沉淀液 | 4 | 4 | |
3000r/min离心10min | |||
离心上清液 | 2 | 2 | |
双蒸水 | 0.4 | ||
偏磷酸沉淀液 | 1.6 | ||
0.32mol/LNa2HPO4 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
DTNB显色液 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
显色反应1min后于423nm波长(1cm光径),读OD值,5min之内读数准确。
*样品为组织上清液时,非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。
**血样稀释液 0.1-0.4mL
组织上清液 1∶20稀释,取稀释液0.4mL
1.3.4.2.3.4计算
鼠全血GSH-Px活力单位规定每1mL全血,每分钟,扣除非酶反应的log[GSH]降低后,使log[GSH]降低1为一个酶活力单位。
组织GSH-Px比活力单位规定每毫克蛋白质,每分钟,扣除非酶反应,使GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。
*Folin法或双缩脲法测样品蛋白质含量
1.3.4.2.4数据处理及结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型(或老龄)对照组比较,GSH-Px活力升高有统计学意义,判定该受试样品有升高GSH-Px作用,实验结果阳性。若受试样品组GSH-Px升高接近空白(或少龄)对照组,两者统计差异无显著性,则说明该受试样品具有较强的升高GSH-Px作用。
1.3.4.2.5注意事项
1.3.4.2.5.1由于H2O2易分解导致浓度改变,临用时取贮备液用分光光度计测其浓度,取贮备液3mL,测定1cm光径的240nm处OD值。
若OD值为0.45,则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
1.3.4.2.5.2 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关,还受反应时间限制。加入显色剂后,反应体系pH为6.5时,11min开始显色,此时比色5min内读数准确。
1.4.数据处理与结果判定
一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值<F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。
受试样品组与模型(或老龄)对照组比较,过氧化脂质含量降低有统计学意义,判定该受试样品有降低脂质过氧化作用,实验结果阳性。
受试样品组与模型(或老龄)对照组比较,抗氧化酶活力升高有统计学意义,判定该受试样品有升高抗氧化酶活力作用,实验结果阳性。
结果判定
过氧化脂质含量中任一指标和抗氧化酶活性中任一指标均为阳性,可判定该受试样品抗氧化动物实验结果阳性。
2人体试食试验
2.1受试者纳入标准
选年龄在45-65岁,身体健康状况良好,无明显脑、心、肝、肺、肾、血液疾患,无长期服药史,志愿受试保证配合的人群。
2.2排除受试者标准
2.2.1妊娠或哺乳期妇女,对保健食品过敏者。
2.2.2合并有心、肝、肾和造血系统等严重全身性疾病患者。
2.2.3短期内服用与受试功能有关的物品,影响到对结果的判断者。
2.2.4不符合纳入标准,未按规定食用受试样品,无法判定功效或资料不全影响功效或安全性判断者。
2.3受试者分组
对受试者按MDA、SOD、GSH-Px水平随机分为试食组和对照组,尽可能考虑影响结果的主要因素如年龄、性别、生活饮食习惯等,进行均衡性检验,以保证组间的可比性。每组受试者不少于50例。
2.4试验方法
采用自身和组间两种对照设计。试验组按推荐服用方法、服用量每日服用受试产品,对照组可用具有同样作用的阳性物,也可用安慰剂或阴性对照。观察时间不少于3个月,必要时可以适当延长。试验期间对照组和试食组原生活、饮食不变。
2.5观察指标
各项指标在试验开始及结束时各检测1次。
2.5.1安全性指标
2.5.1.1一般状况包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等
2.5.1.2血、尿、便常规检查
2.5.1.3肝、肾功能检查
2.5.1.4胸透、心电图、腹部B超检查
2.5.2功效指标
2.5.2.1过氧化脂质含量观察试验前后MDA的变化及MDA下降百分率。(测定方法见1.3.3.1)
2.5.2.2超氧化物歧化酶观察试验前后SOD的变化及SOD升高百分率。(测定方法见1.3.4.1)
2.5.2.3谷胱甘肽过氧化物酶观察试验前后GSH-PX的变化及GSH-PX升高百分率。(测定方法见附1)
2.6数据处理和结果判定
凡自身对照资料可以采用配对t检验,两组均数比较采用成组t检验,后者需进行方差齐性检验,对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态方差齐后,用转换的数据进行t检验;若转换数据仍不能满足正态方差齐要求,改用t’检验或秩和检验;但变异系数太大(如CV>50%)的资料应用秩和检验。在试验前组间比较差异无显著性的前提下,可进行试验后组间比较。
各功效观察指标试验前后自身比较和试食后组间比较均有统计学意义,方可判定该指标阳性。
过氧化脂质含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项实验中二项实验结果阳性,可判定该受试样品具有抗氧化作用。
[附1]血中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定
1原理
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要,其活力以催化GSH氧化的反应速度,及单位时间内GSH减少的量来表示,GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸(DTNB)反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子,于423nm波长有最大吸收峰,测定该离子浓度,即可计算出GSH减少的量,由于GSH能进行非酶反应氧化,所以最后计算酶活力时,必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
2试剂和仪器
仪器721分光光度计、恒温水浴锅、微量加样器、离心机
试剂叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0
NaN3 16.25mg 终浓度2.5mmol/L
EDTA-Na2 7.44mg 终浓度0.2mmol/L
Na2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/L
NaH2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100mL,用少量HCL、NaOH调pH7.0,4℃保存。
1mmol/L谷胱甘肽(还原型GSH)溶液
GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL,临用前配制,冰冻保存1-2日。
1.25-1.5mmol/L H2O2溶液
取30%H2O20.15-0.17mL,用双蒸水稀释至100mL,作为贮备液,4℃避光保存,临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液
HPO3 16.7g(先用蒸馏水溶解)
EDTA 0.5g
NaCl 280g
加蒸馏水至1000mL,用普通滤纸过滤,室温保存。
0.32mol/L Na2HPO4溶液:
Na2HPO422.7g加蒸馏水至500mL,室温保存。
DTNB显色液
DTNB 40mg
柠檬酸三钠 1.0g
加蒸馏水至100mL,4℃避光保存1个月。
3实验步骤
3.1样品制备
血样稀释液取血20μl加入到1mL双蒸水中,充分振摇,使之全部溶血1∶100待测,4h内测定酶活力。若当天来不及测定,将肝素抗凝全血置-20℃冻存,3d内测定,若4℃存放,28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻,
3.2 GSH标准曲线的制作:
取1.0mmol/L GSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分别置于10mL小容器瓶中,各加入偏磷酸沉淀剂8mL,用双蒸水稀释至10mL刻度,即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。
取上述不同浓度标准液各2mL,放入试管中,加入0.32mol/L Na2HPO42.5mL,比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯,5min内在可见光423nm波长测OD值,以双蒸水调零点。
以GSH含量(μmol/L)为横坐标,OD423值为纵坐标,绘制标准曲线。
3.3测定步骤:
试剂 | 样品管(mL) | 非酶管(mL) |
1.0mmol/L GSH | 0.4 | 0.4 |
血样稀释液 | 0.4 | |
双蒸水* | 0.4 | |
37℃水浴预温5min | ||
H2O2(37℃预热) | 0.2 | 0.2 |
37℃水浴准确反应5min(严格控制时间) | ||
偏磷酸沉淀液 | 4 | 4 |
3000r/min离心10min | ||
离心上清液 | 2 | 2 |
双蒸水 | ||
偏磷酸沉淀液 | ||
0.32mol/L Na2HPO4 | 2.5 | 2.5 |
DTNB显色液 | 0.5 | 0.5 |
显色反应1min后于423nm波长(1cm光径),读OD值,5min之内读数准确。
3.4计算
全血GSH-Px活力单位规定每8μl全血,在37℃反应5min,扣除非酶反应后,使GSH浓度降低1μmol/L浓度为一个酶活力单位。
全血GSH-Px活力U/mL血=(非酶管OD-样品管OD)×A*×5**
**5换算成1mL反应液中GSH浓度时,需乘以稀释倍数5
3.5注意事项
3.5.1由于H2O2易分解导致浓度改变,临用时取贮备液用分光光度计测其浓度,取贮备液3mL,测定1cm光径的240nm处OD值。
若OD值为0.45,则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
3.5.2 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关,还受反应时间限制。加入显色剂后,反应体系pH为6.5时,11min开始显色,此时比色5min内读数准确。
结果:经试验实施例制得的样品,对方法中的各项抗氧化的指标均很好。
三、复方人参二醇型皂苷的毒理学研究
经中国疾病预防控制中心营养与食品安全所研究,证明,复方人参二醇型皂苷(七茗牌神安软胶囊)属于无毒物、亦无致突变作用、30天喂养试验未见被检脏器病理变化,表明产品安全。
四、复方人参二醇型皂苷产品的稳定性
经室温留样及加速试验,表明各实施例制得的样品,均具有较好的稳定性,其中七茗牌神安软胶囊,送云南省疾病预防控制中心检验,证明保温3个月后产品各项指标合格。
Claims (7)
1、一种具有生理活性的复方人参二醇皂苷,其特征在于复方中各有效成分的重量配比为:
人参二醇皂苷组 16%~68%
含天麻素>10%的天麻提取物 5%~37%
茶多酚 8%~46%,
人参二醇皂苷组中人参皂苷Rb1在其中的含量为45%~99%,其余为Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2。
2、根据权利要求1所述的具有生理活性的复方人参二醇皂苷,其特征在于:复方中还可含有维生素C、维生素E。
3、根据权利要求3所述的具有生理活性的复方人参二醇皂苷,其特征在于复方中各有效成分的重量配比为:
人参二醇皂苷组 16%~58%
含天麻素>10%的天麻提取物 5%~17%
茶多酚 10%~36%
维生素C 18%~38%
维生素E 3%~12%。
4、一种具有生理活性的复方人参二醇皂苷制剂,其特征在于复方制剂中各成分的重量配比为:
权利要求1所述的复方人参二醇皂苷 5%~85%
辅料 15%~95%,
辅料为药用或食用辅料中的一种或几种,制成医药或食品上可以接受的制剂。
5、权利要求1所述的具有生理活性的复方人参二醇皂苷在制备用于修复或恢复对因过氧化或游离基对脑细胞和脑神经细胞损伤或疲劳的药物中的应用。
6、权利要求1所述的具有生理活性的复方人参二醇皂苷在制备用于治疗或改善因精神长期紧张导致脑细胞和脑神经细胞损伤或疲劳所引起的失眠、健忘及其后果的药物中的应用。
7、根据权利要求1所述的具有生理活性的复方人参二醇皂苷,其特征在于:用于制成医疗上可接受的各种新药及功能食品。
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中草药中皂苷类有效成分药理作用研究现状 樊永蓉 廖庆文,湖南中医药导报,第9卷第11期 2003 * |
天麻素定量方法概况 张金恒 等,中华医学丛刊,第3卷第4期 2003 * |
天麻素定量方法概况 张金恒 等,中华医学丛刊,第3卷第4期 2003;中草药中皂苷类有效成分药理作用研究现状 樊永蓉 廖庆文,湖南中医药导报,第9卷第11期 2003;药品标准中药成方制剂 卫生部药典委员会,5,卫生部药典委员会 1993 * |
药品标准中药成方制剂 卫生部药典委员会,5,卫生部药典委员会 1993 * |
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