CN105726622A - 一种抗疲劳的中药组合提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗疲劳的中药组合提取物，所述的中药组合提取物由以下重量份的原料药制备而得：刺五加、黄芪和明党参的比例为5：5：1。本发明还提供该中药组合提取物的制备方法及应用。本发明的中药组合提取物的主要组成成分为木脂素类、皂苷类和黄酮类化合物，经药理实验证明该提取物对疲劳及特殊环境下疲劳损伤具有显著缓解作用，安全性高，能用于制备抗疲劳的药物或食品。

Description

一种抗疲劳的中药组合提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种中药组合及其提取物，具体地说，一种抗疲劳尤其是特殊环境疲劳损伤的中药组合提取物及其制备方法和应用。

背景技术

疲劳是受多因素影响引起的机体内许多生理生化变化的综合反应。分为躯体性疲劳和心理性疲劳，躯体性疲劳主要表现为运动能力的下降，心理性疲劳主要表现为行为与意志的消极改变。疲劳在一定的范围内是一种正常的生理现象，随着社会工作与生活节奏也越来越快，来自工作、家庭、住房、医疗、人际关系等的压力使人长期处于紧张状态，易于引发躯体性疲劳和心理性疲劳，若长期得不到缓解就会转变为病理性的疲劳，危害人的身心健康，使生活质量严重下降，因而寻找有效并且安全的抗疲劳药物已成为现代医学的一个研究重点。在军事领域，军事作业常需在特殊环境下进行，如高原低氧地区、寒冷地区和炎热地区等自然环境和密闭舱室、地下掩蔽工程等特殊环境，大多数环境恶劣，受高温、高湿、噪音、振动、电离辐射、有害气体等多种复合因素影响，官兵的体力消耗和精神负担加重，长期处于该环境中将对作业人员的身体和心理健康产生危害，可能出现精神不集中、焦虑、疲劳、机体内分泌紊乱、免疫力下降等疲劳症状，该状态会严重影响军事人员的作业效率和战斗力。因此，抗特殊环境下疲劳损伤药物的研究对军事医学也具有重要的意义。

目前市面上的抗疲劳药物多是一些化学药物，这些药物在发挥治疗效果的同时也带来了不同程度的副作用。中药具有活性成分多、作用缓和、副作用小等特点，作为抗疲劳药物的研究和开发具有广阔的前景。刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)Harms的干燥根和根茎或茎[1]，其主要药效成分为三萜皂苷类、木脂素类和紫锥菊多酚(丁香苷和刺五加苷E)，药理实验证实刺五加具有抗溃疡、抗肿瘤、抗炎、抗辐射和保护肝脏等作用。黄芪药材为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[2]，药理研究表明黄芪具有增强机体免疫力、耐缺氧、抗应激、调节血压、降血糖、抗衰老、抗癌、强心、保护肝脏和肾脏的作用。明党参药材为伞形科植物明党参ChangiumsmyrnioidesWolff的干燥根[3]，其含有挥发油、不饱和脂肪油、多糖、氨基酸、磷脂、胆碱、微量元素等成分。

发明人研制的含刺五加、黄芪和明党参的复方刺五加制剂曾作为院内制剂用于缓解疲劳。中医理论认为疲劳的病位主要在肝、脾、肾三脏，其病机主要为脾肾亏虚，肝实致气滞血瘀，脏腑功能失调，机体气血阴阳正气不足等。刺五加味辛、微苦，温，归脾、肾、心经，具有益气健脾，补肾安神的功效；黄芪味甘、微温，归脾肺经，既能补益脾气，又能升提中气；明党参味甘、微苦，微寒，归肺、脾、肝经，能够养阴和胃，平肝解毒。发明人据此将上述三味药组方温凉共济，调补肝肾，兼顾脾胃，达到抗疲劳作用。

发明人通过前期研究，并通过小鼠负重游泳建立持续运动所致疲劳模型，对由刺五加、黄芪和明党参配伍组成的复方进行组方优化并验证，在此基础上对大孔树脂分离得到的不同浓度乙醇洗脱部位进行抗疲劳筛选，并探讨其作用机制。采用UHPLC-Q-TOF-MS联用技术对有效部位中的化学成分进行分析，明确其主要成分。并通过模拟密闭舱室动物模型证实其对抗特殊环境下产生的疲劳具有显著作用。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典.一部.2010版.北京：中国医药科技出版社，2010：192

[1]国家药典委员会.中国药典.一部.2010版.北京：中国医药科技出版社，2010：283

[1]国家药典委员会.中国药典.一部.2010版.北京：中国医药科技出版社，2010：195

发明内容

本发明的目的是针对现有抗疲劳药物的不足，缺少安全有效的特殊环境疲劳损伤的防治药物，研制一种抗疲劳尤其是特殊环境下疲劳损伤的中药组合及其浓缩液或提取物。

本发明的再一的目的是，提供上述中药组合提取物的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供上述中药组合提取物的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种抗疲劳的中药组合提取物，所述中药组合由下列重量份的原料药制成：刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1。

以下制备方法制备的中药组合提取物。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种抗疲劳的中药组合提取物的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：按刺五加、黄芪和明党参的重量份比例为5∶5∶1称取各原料药，将所述原料药加水进行煎煮、浓缩，加入乙醇进行醇沉，醇沉后取上清液浓缩得浓缩液。

所述的制备方法包括以下步骤：按刺五加、黄芪和明党参的重量份比例为5∶5∶1称取各原料药，将所述原料药加水进行煎煮、浓缩，加入乙醇行醇沉，醇沉后取上清液浓缩过大孔树脂柱，收集30-75％乙醇洗脱部位，减压浓缩干燥得提取物。

所述的制备方法包括以下步骤：按刺五加、黄芪和明党参的重量份比例为5∶5∶1称取各原料药，将所述原料药粉碎，以30-95％乙醇回流，滤液浓缩，过大孔树脂柱，收集30-75％乙醇洗脱部位，洗脱液减压浓缩干燥得提取物。

所述的制备方法包括以下步骤：按刺五加、黄芪和明党参的重量份比例为5∶5∶1称取各原料药，将所述原料药洗净、粉碎，以提取溶剂30-95％乙醇，以2-3ml/min的速度渗漉，收集15-20倍量乙醇体积的渗漉液，浓缩，用蒸馏水调节比重至1.02～1.05g/ml，pH5-6，滤液通过大孔树脂柱，并弃去流出液，用水洗脱大孔树脂柱，弃去洗脱液，继续用30-75％乙醇洗脱大孔树脂柱，收集30-75％部位洗脱液，洗脱液减压浓缩干燥得到提取物。

所述的大孔树脂选自D-101、AB-8、ZTC-1或SP905。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的中药组合提取物在制备治疗或预防抗疲劳及特殊环境下疲劳损伤的药物或食物中的应用。

所述的疲劳为特殊环境下的疲劳损伤，所述的特殊环境为包括有害气体、噪音、高温、高湿或核辐射的密闭环境。

所述的药物的剂型是口服液、片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、丸剂、口嚼片、含片、口香糖、膏剂、合剂、贴剂或凝胶剂。

本发明优点在于：

本发明以刺五加、黄芪和明党参三味药组方，达到温凉共济，五脏共补，调补肝肾，兼顾脾胃，达到对单一药物或其他药物难以达效的复合疲劳的防治作用，本发明以刺五加、黄芪和明党参为主要原料制备的提取物，药理实验证明其对疲劳及特殊环境下疲劳损伤具有显著的预防作用，无毒副作用，能够用于制备抗疲劳的药物或食品。

附图说明

附图1是大孔树脂不同浓度乙醇洗脱物对小鼠血清TG的影响(n＝10)，其中，*P＜0.05vscontrol。

附图2是大孔树脂不同浓度乙醇洗脱部位对小鼠血清LDH的影响(n＝10)，其中，*P＜0.05，**P＜0.01vscontrol。

附图3是大孔树脂不同浓度乙醇洗脱部位对小鼠血清CK的影响(n＝10)，其中，*P＜0.05，**P＜0.01vscontrol。

附图4是复方刺五加对小鼠体重的影响(n＝10)。

附图5是复方刺五加对小鼠海马神经元细胞超微结构的影响，其中，A：ModelB：ControlC：C2HDD：C2MDE：C3HDF：C3MD；上列A-F为细胞结构(×5000，标尺＝2μm)，下列A-F为突触泡结构(×6000，标尺＝1.67μm)。

附图6是复方刺五加对小鼠胸腺内淋巴细胞超微结构的影响，其中，A：ModelB：ControlC：C2HDD：C2MDE：C3HDF：C3MD；(×4000，标尺＝2.5μm)。

附图7是复方刺五加对小鼠睾丸内精细胞和精子超微结构的影响，其中，A：ModelB：ControlC：C2HDD：C2MDE：C3HDF：C3MD；上列A-F为细胞结构(×5000，标尺＝2μm)，下列A-F为精子形态(×6000，标尺＝1.67μm)。

附图8是复方刺五加对小鼠小肠绒毛和上皮细胞超微结构的影响，其中，A：ModelB：ControlC：C2HDD：C2MDE：C3HDF：C3MD；上列A-F为小肠绒毛结构(×8000，标尺＝1.25μm)，下列A-F为小肠上皮细胞结构(×10000，标尺＝1μm)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1中药提取物的制备(一)

取刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1洗净，置入提取容器内，加8-10倍蒸馏水，煎煮2次，每次煎煮的时间为1.5小时。将数次提取的药液合并，浓缩，加入乙醇进行醇沉，醇沉后的上清液减压浓缩干燥得提取物C1。

实施例2中药提取物的制备(二)

取刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1洗净，置提取容器内加8-10倍蒸馏水煎煮2次，每次煎煮的时间为1.5小时。将数次提取的药液合并，浓缩至比重为1.01～1.05，加入乙醇至含醇70-80％进行醇沉，醇沉后的上清液浓缩至比重1.01～1.04，将提取液过AB-8大孔树脂柱。流速1.5-1.8BV/h，收集30-75％乙醇洗脱部位，减压浓缩干燥得提取物。

实施例3中药提取物的制备(三)

取刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1洗净，置提取容器内加8-10倍蒸馏水煎煮2次，每次煎煮的时间为1.5小时。将数次提取的药液合并，浓缩至比重为1.01～1.05，加入乙醇至含醇70-80％进行醇沉，醇沉后的上清液浓缩至比重1.01～1.04，将提取液过ZTC-1大孔树脂柱。流速1.5-1.8BV/h，收集30-75％乙醇洗脱部位，洗脱液减压浓缩干燥得提取物。

其中收集30％乙醇洗脱部位减压浓缩干燥得提取物C2，收集50％-70％乙醇洗脱部位减压浓缩干燥得提取物C3。

实施例4中药提取物的制备(四)

按刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1粉碎，以8-10倍量的70-95％乙醇回流3次，每次2小时，提取液浓缩，减压浓缩干燥得提取物。

实施例5中药提取物的制备(五)

按刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1粉碎，以8-10倍量的95％乙醇回流3次，每次2小时，滤液浓缩，过D-101大孔树脂柱，收集30-75％乙醇洗脱部位，减压浓缩干燥得提取物。

实施例6中药提取物的制备(六)

按比例取刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1粉碎，加入提取溶剂70-95％乙醇浸泡24小时后，进行渗漉，收集15-20倍体积的渗漉液，得提取液；将上述提取液浓缩，蒸馏水调节比重至1.03-1.05g/ml，上D-101大孔树脂柱，收集30-75％乙醇洗脱部位，洗脱液减压浓缩干燥得到提取物。

实施例7中药提取物的制备(七)

按刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1粉碎，加入提取溶剂85％乙醇，渗漉至总黄酮类检定反应呈阴性为止，收集渗漉液，得提取液；将上述提取液浓缩，蒸馏水调节比重至1.05g/ml，上AB-8大孔树脂柱，收集30-75％乙醇洗脱部位，洗脱液减压浓缩干燥得到提取物。

实施例8中药提取物的制备(八)

按刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1粉碎，加入提取溶剂55％乙醇，渗漉至总黄酮类检定反应呈阴性为止，收集渗漉液，得提取液；将上述提取液浓缩，蒸馏水调节比重至1.05g/ml，滤液通过AB-8大孔树脂柱，并弃去流出液；用水洗脱大孔树脂柱，弃去洗脱液；继续用30％乙醇洗脱大孔树脂柱，收集30-75％部位洗脱液，洗脱液减压浓缩干燥得到提取物。

实施例9中药提取物的制备(九)

取刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1洗净，置入提取容器内加8倍量超纯水，浸泡4小时后，煎煮3次，每次煎煮的时间为0.5小时。将数次提取的药液合并，浓缩成浸膏，加入提取溶剂乙醇至含醇量为70-80％进行醇沉，醇沉后的上清液浓缩，得浓缩液。

实施例10中药提取物的制备(十)

按刺五加、黄芪和明党参的比例为5∶5∶1粉碎，加入提取溶剂30％乙醇，渗漉至总黄酮类检定反应呈阴性为止，收集渗漉液，得提取液；将上述提取液浓缩，蒸馏水调节比重至1.05g/ml，上AB-8大孔树脂柱，收集30-75％乙醇洗脱部位，洗脱液减压浓缩干燥得到提取物。

实施例11复方刺五加抗疲劳的最佳比例研究

均匀设计是在正交设计的基础上共同提出的一种多因素多水平的实验设计方法。该法只考虑正交设计中“均匀分散”的原理，去除了“整齐可比”因而实验次数大为减少，且具有均匀性好、实验范围可调和计算机可模拟性，在多组分中药复方最佳剂量配比确定方面具有显著优势。本中药提取物由刺五加、黄芪和明党参三味中药组成，结合用药和发明人的研究基础，使用剂量分为7个水平(见表1-1)，2因素7水平均匀设计实验，采用设计表U₇(7⁶)，根据使用表，选择第1、3实验，安排如表1-2所示。

(一)实验材料与仪器

ICR小鼠100只，雄性，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXK(沪)2012-0002。按体重随机分为10组，每组10只。实验期间，动物饲养的环境保持在室温25±2℃，相对湿度50-70％，小鼠可自由摄取食物和水。

复方刺五加中三味中药设置为考察因素，药典中规定其使用剂量分别为刺五加9-27g，黄芪9-30g，明党参6-12g，结合临床常用剂量确定各药的取量范围，按每药的不同剂量分为8个水平(见表1-1)，即为3因素8水平均匀设计实验。实验安排如表1-2所示。

表1-1均匀设计因素水平表

表1-2三因素八水平均匀设计

根据表1-1和表1-2实验安排依次称取不同量的刺五加、黄芪和明党参，得到8个配比不同的复方。将8个不同的复方分别加8倍量水浸泡0.5h，置冷凝回流装置提取3次，每次2h，合并提取液，旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩液烘干得浸膏。不同配比复方水提取结果见表1-3。

表1-3均匀设计实验提取药材结果

(二)实验用药的配制

实验设计小鼠给药剂量为500mg/kg。8个不同配比的复方刺五加提取物干浸膏分别用少量蒸馏水和3滴吐温-80研磨混匀，继续加蒸馏水配制成50mg/ml的混悬液备用。

阳性药：阳性药给药剂量为200mg/kg。用10倍量75％乙醇回流提取红参饮片3次/1h，合并3次提取液，旋转蒸发仪减压浓缩得到红参提取物。称取红参干浸膏适量用少量蒸馏水和3滴吐温-80研磨混匀，继续加蒸馏水配制成20mg/ml的混悬液备用。

空白对照组：以等量吐温-80的蒸馏水作为空白对照组，等容量给药。

(三)小鼠负重游泳实验

将小鼠适应性喂养3天，之后按体重随机分为10组，分别为空白组、阳性药组、复方3∶6∶4配比组、6∶15∶5配比组、15∶15∶8配比组、6∶9∶2配比组、6∶9∶2配比组、21∶12∶13配比组、24∶24∶11配比组、3∶1∶1配比组、30∶21∶7配比组。所有药物均用蒸馏水混悬，加少量吐温-80助溶，按0.2ml/20g体重灌胃给药，每天给药1次，连续14天。第1天和第14天小鼠灌胃前称量各只小鼠体重并记录。

适应性训练：在小鼠饲养第1、3、5、7、9和11天时，给药30min后，各给药组小鼠(空白组除外)置于直径为60cm、水深50cm、水温30±1℃的游泳桶中进行10min的无负重游泳训练。游泳结束后捞出小鼠，用毛巾擦干皮毛，放回鼠笼继续饲养。

小鼠负重游泳实验：实验第14天，灌胃之前称量小鼠体重并记录，根据体重剪取小鼠体重5％左右的铅片。小鼠分批进行负重游泳，每组中随机抽取小鼠一只，灌胃给药30min后，将剪取好的铅片对应的缚于每只小鼠尾根部，放入水深50cm、直径为60cm、水温30±1℃的游泳桶中游泳至力竭。用秒表记录从游泳开始至小鼠头全部入水持续7s不能浮出水面的时间为力竭时间。将记录的游泳时间进行统计分析。

实验结果

(一)数据分析

均匀设计实验结果应用UniformDesignU3.00软件进行统计处理，采用全回归法进行回归分析，显著性水平α＝0.05。小鼠负重游泳实验结果应用SPSS18.0软件进行统计处理，所有数据以表示，力竭游泳时间采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，组间差异性采用LSD-t法进行比较，显著性水平α＝0.05。

(二)不同配比复方刺五加对小鼠体重的影响

实验过程中各组小鼠状态良好，皮毛光滑，未出现任何不良反应。不同配比的复方刺五加浸膏对小鼠体重的影响结果如表1-4所示，由表可见实验开始时小鼠的体重和实验结束时的体重以及实验过程中增加的体重均无显著性差异，表明不同配比的复方对于小鼠体重的增长没有显著性的影响。

表1-4不同配比复方刺五加对小鼠体重的影响(n＝10)

(三)不同配比复方刺五加对小鼠力竭游泳时间的影响

负重游泳实验结果表明，与空白组相比，不同配比的复方刺五加均不同程度的延长了小鼠的力竭游泳时间，但统计分析其不具有显著性差异(P＞0.05)。将实验数据运用UniformDesignU3.00软件处理，进行全回归分析，得出回归方程：Y＝8.46+0.184X₁+0.739X₂-0.194X₃，复相关系数R＝0.9136，剩余标准差S＝0.769，检验值F_t＝6.728，临界值F(0.05，3，4)＝6.591，F_t＞F(0.05，3，4)，检验通过，方程具有显著性。软件根据上述结果在规定的范围内进行优化，结果最优配比为刺五加30g，黄芪30g，明党参9g，预期游泳时间为15.6±2.13min。实验结果见表1-5。

表1-5不同配比复方刺五加对小鼠力竭游泳时间的影响(n＝10)

刺五加、黄芪和明党参三者配伍，调和五脏、温凉共济，具有较好的抗疲劳作用。本节实验选用均匀设计法安排实验，以耐力实验中力竭游泳时间为评价指标来考察复方最佳剂量配比关系。对实验结果进行直观分析发现配比为30∶21∶7和3∶1∶1两组小鼠的力竭游泳时间最长。由回归方程Y＝8.46+0.184X₁+0.739X₂-0.194X₃可知，X₁和X₂的系数为正，表明力竭游泳时间随刺五加和黄芪的量增加而增加，而X₃的系数为负，表明力竭游泳时间随明党参的量增加而降低。偏回归系数的绝对值X₂＞X₃＞X₁，可见三味药对游泳时间影响的主次顺序是黄芪＞刺五加＞明党参。因此在确定最优值方案为在规定的剂量范围内刺五加和黄芪的量应取上限，明党参的量应取下限，即刺五加30g、黄芪30g、明党参6g，这与直观分析表现的趋势基本一致。同时均匀设计优化结果也显示当刺五加30g、黄芪30g、明党参6g时，即配比为5∶5∶1时延缓疲劳效果最好。

实验例12复方刺五加最优配比验证实验

实验材料

实验试剂、实验仪器同实施例11

实验动物

ICR雄性小鼠40只，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXK(沪)2012-0002。按体重随机分为4组，每组10只。实验期间，动物饲养的环境保持在室温25±2℃，相对湿度50-70％，小鼠可以自由摄取食物和水。

实验方法

(一)实验用药配制

刺五加：黄芪：明党参(5∶5∶1，最优配比)和(3∶2∶1，原配比)按配比称取药材，分别加8倍量水浸泡0.5h，置冷凝回流装置提取3次，每次2h，合并提取液，旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩液烘干得浸膏。分别称取适量用少量蒸馏水和3滴吐温-80研磨混匀，继续加蒸馏水配制成50mg/ml的混悬液备用。阳性对照药取制备的红参干浸膏用少量蒸馏水和3滴吐温-80研磨混匀，继续加蒸馏水配制成200mg/kg的混悬液备用。

空白对照组：以等量吐温-80的蒸馏水作为空白对照组，等容量给药。

(二)小鼠负重游泳实验

将小鼠适应性喂养3天，之后按体重随机分为4组，分别为空白组、阳性药组、复方5∶5∶1配比组和3∶2∶1配比组。所有药物均用蒸馏水混悬，加少量吐温-80助溶，按0.2ml/20g体重灌胃给药，每天给药1次，连续14天。第1天和第14天小鼠灌胃前分别称量体重并记录。小鼠负重游泳实验具体操作过程同实施例11。

实验结果

(一)数据分析

小鼠负重游泳实验的数据统计处理应用SPSS18.0软件进行，所有数据以表示，力竭游泳时间采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，组间差异性采用LSD-t法进行比较，显著性差异检验水准α＝0.05。

(二)不同配比复方刺五加对小鼠体重的影响

实验过程中各组小鼠状态良好，皮毛光滑，未出现任何不良反应。不同组别小鼠体重变化如表1-6所示，由表可知实验开始时小鼠的体重和实验结束时的体重以及实验过程中增加的体重均无显著性差异，表明不同药物对于小鼠体重的增长没有显著性的影响。

表1-6不同配比复方刺五加对小鼠体重的影响(n＝10)

(三)不同配比复方刺五加对小鼠力竭游泳时间的影响

由表1-7小鼠负重游泳实验结果可知，与空白组相比，阳性药组、配比为5∶5∶1组均不同程度的延长了小鼠的力竭游泳时间，具有显著性差异(P＜0.05)。效果优于原院内制剂经验方(配比为3∶2∶1)。

表1-7不同配比复方刺五加对小鼠力竭游泳时间的影响(n＝10)

*P＜0.05vscontrol

实施例13复方刺五加提取方法考察

ICR小鼠40只，雄性，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXK(沪)2012-0002。按体重随机分为5组，每组8只。实验期间，动物饲养环境保持在室温25±2℃，相对湿度50-70％，小鼠可自由摄取食物和水。

实验方法

(一)不同方法提取药材

复方刺五加(刺五加∶黄芪∶明党参5∶5∶1)依次采用水提取、醇提取和水提醇沉三种方法进行提取。

水提取：刺五加100g，黄芪100g，明党参20g混合均匀，加8倍量水浸泡0.5h，微沸状态回流提取3次，每次2h，冷却后过滤，将3次滤液合并，减压浓缩得到浸膏。

醇提取：刺五加100g，黄芪100g，明党参20g混合均匀，加8倍量80％乙醇浸泡0.5h，微沸状态回流提取3次，每次2h，冷却后过滤，合并3次滤液，减压浓缩得到浸膏。

水提醇沉：刺五加10g，黄芪10g，明党参20g混合均匀，加8倍量水浸泡0.5h，微沸状态回流提取3次，每次2h，冷却后过滤，合并3次滤液，减压浓缩至400ml，加乙醇使醇含量达80％，静置24h后取上清液，减压浓缩得到浸膏。

(二)实验用药配制

0.5％CMC-Na溶液的配制：双蒸水120ml置于烧杯中，煮沸至80℃后冷却至60℃，将称取好的CMC-Na0.6g缓慢倒入烧杯中，边加入边搅拌，待全部加入后静置，直至得到均匀的粘稠状的透明溶液。

复方刺五加给药剂量为500mg/kg，阳性药给药剂量为200mg/kg。三种不同提取方法得到的复方刺五加干浸膏分别用已配制好的0.5％CMC-Na配制成50mg/ml的混悬液备用。阳性对照药红参浸膏加0.5％CMC-Na溶液配制成20mg/ml的混悬液备用。

空白对照组：以等量吐温-80的蒸馏水作为空白对照组，等容量给药。

(三)小鼠负重游泳实验

小鼠适应性喂养3天后，按体重随机分为5组，分别为空白组、阳性药组、水提取组、醇提取组、水提醇沉组。所有药物均用0.5％CMC-Na混悬，按0.2ml/20g体重灌胃给药，每天灌胃1次，连续9天。第1天和第9天给药前分别称量各组小鼠体重并记录。小鼠负重游泳实验具体操作过程同实施例11。

实验结果

(一)数据分析

小鼠负重游泳实验的数据统计处理应用SPSS18.0软件进行，所有数据以表示，采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，组间差异性采用LSD-t法进行比较，显著性差异检验水准α＝0.05。

(二)不同提取方法提取的复方刺五加对小鼠体重的影响

实验过程中各组小鼠状态良好，皮毛光滑，未出现任何不良反应。不同提取方法得到的浸膏对小鼠体重的影响见表2-1，由表可知实验开始时小鼠的体重和实验结束时的体重以及实验过程中增加的体重均无显著性差异，表明不同提取方法得到的浸膏对于小鼠体重的增长没有显著性的影响。

表2-1不同提取方法提取的复方刺五加对小鼠体重的影响(n＝8)

(三)不同提取方法提取的复方刺五加对小鼠力竭游泳时间的影响

小鼠负重游泳时间结果如表2-2，与空白组相比，阳性药红参和三种不同提取方法得到的浸膏均不同程度的延长了小鼠的力竭游泳时间，其中阳性药组和水提醇沉组时间最长，且统计分析显示具有显著性的差异(P＜0.01)，表明水提醇沉法提取得到的浸膏有较好的延长小鼠游泳时间的作用。

表2-2不同提取方法提取的复方刺五加对小鼠力竭游泳时间的影响(n＝8)

*P＜0.05，**P＜0.01vscontrol

传统中药复方常用水煎煮法得到汤剂直接服用，剂量一般较大，该法由于选择性差在将药材中生物碱类、皂苷类等有效成分提取出的同时也将大量的鞣质、蛋白质、色素和树胶等杂质成分浸出，且提取液易腐败、变质。选用该法提取复方刺五加浸膏得率高，但是延缓疲劳的效果并不明显。醇提取法中常用乙醇作为溶剂，多数有效成分可溶于其中，但可减少水提取中大量的蛋白、多糖、色素等杂质，该法提取得到的复方刺五加浸膏粘稠度下降，得率降低，没有显著的抗疲劳作用。水提醇沉法是在水提取的基础上将浸膏浓缩到一定程度，缓慢加入乙醇，多次沉降除去色素、有机酸盐、鞣质、果胶、粘液质和蛋白等高分子杂质，使水提液得到精制。该法得到的复方刺五加浸膏在实验中表现出明显的抗疲劳作用，提示复方中缓解疲劳的药效成分可能是一类能被水提取且可溶于乙醇的成分，采用水提醇沉浸膏。

实施例14复方刺五加抗疲劳有效部位筛选

一、实验材料

(一)实验药材

根据实施例1制备提取物C1。

ICR雄性小鼠120只，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXK(沪)2012-0002。实验过程中，动物饲养环境保持在室温25±2℃，相对湿度50-70％，小鼠可自由摄取食物和水。

二、实验方法

(一)大孔树脂预处理及不同浓度乙醇洗脱分离

D101型大孔吸附树脂是一种球状的、不含交换基团的非极性聚合物吸附剂，具有比表面积大、选择性好、再生处理方便、吸附速度快等优点。D101型大孔吸附树脂再生处理：95％乙醇浸泡的树脂滤除乙醇，加入2倍树脂床体积(BV)的新鲜的95％乙醇浸泡24h，滤除乙醇并回收。用水洗脱至无醇味，加入2BV的3～4％HCl溶液浸泡4～5h，用水洗脱至pH值为中性，再加入2BV的3～4％NaOH溶液浸泡4～5h，用水洗脱至pH值为中性，然后加入2BV的95％乙醇浸泡，备用。

将处理好的D101大孔树脂装柱至柱体积为6L，用水冲洗至无醇味。取C1400g，充分溶于蒸馏水约1L，然后慢慢注入已装好的大孔树脂，控制流速为1.5BV/h，注入完全后静置2h。依次用水、40％乙醇、75％乙醇和100％乙醇洗脱，洗脱过程采用TLC控制，色谱溶剂系统选用CH₂Cl₂-MeOH-H₂O(7-3-0.5)，TLC中出现小极性成分更换洗脱溶剂，收集不同部位洗脱液，减压浓缩得到H1、E1、E2和E3。

(二)实验用药配制

0.5％CMC-Na溶液配制同实施例13。复方刺五加浸膏用0.5％CMC-Na溶液配制成对应剂量的混悬液备用，分高低剂量组(350mg/kg.150mg/kg)。

阳性对照药物：红参醇提物浸膏用0.5％CMC-Na溶液配成剂量为20mg/ml的混悬液。

空白对照组：以0.5％CMC-Na溶液作为空白对照，等容量给药。

将小鼠适应性喂养3天，之后按体重随机分为12组，即空白对照组、阳性对照组、C1HD组、C1LD组、H1-HD组、H1-LD组、E1-HD组、E1-LD组、E2-HD组、E2-LD组、E3-HD组和E3-LD组。高剂量用0.5％CMC-Na配制成35mg/ml的混悬液，低剂量用0.5％CMC-Na配制成15mg/ml的混悬液，按0.2ml/20g体重灌胃给药，每天1次，连续14天。第一天和最后一天灌胃前称量每只小鼠体重并记录。

适应性训练：小鼠饲养第1、3、5、7、9和11天进行无负重游泳训练。小鼠灌胃给药30min后，各给药组小鼠(空白组除外)置于直径为60cm、水深50cm、水温30±1℃的静水中进行10min的游泳训练。游泳结束后捞出小鼠，用毛巾擦干皮毛，放回鼠笼继续饲养。

负重游泳实验：实验最后一天，给药前称量小鼠体重并记录，按每只小鼠体重的5％称取铅片。小鼠分批进行负重游泳，每组中随机抽取小鼠一只，灌胃给药30min后，将已剪取好的铅片缚于对应的小鼠尾根部，放入水深50cm、直径为60cm、水温30±1℃的游泳桶中游泳至力竭。用秒表记录从游泳开始至小鼠头全部入水持续7s不能浮出水面的时间为力竭时间。捞出小鼠将眼周围擦干并迅速摘除眼球取血，脱臼处死小鼠。取好的血液在4℃下静置1h后3000r/min离心15min，取上层血清冻存于-80℃，待测。

血清生化指标的测定：全自动生化分析仪测定各组小鼠力竭游泳后血清中乳酸脱氢酶(LDH)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)和肌酸磷酸激酶(CK)的含量。

三、实验结果

(一)数据分析

小鼠负重游泳实验的数据统计处理应用SPSS18.0软件进行，所有数据以表示，力竭游泳时间及生化指标采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，组间差异性采用LSD-t法进行比较，显著性差异检验水准α＝0.05。

(二)对小鼠体重的影响

实验过程中各组小鼠状态良好，皮毛光滑，未出现任何不良反应。复方总提物及大孔树脂不同浓度乙醇洗脱部位对于小鼠体重的增长没有显著性的影响。

(三)对小鼠力竭游泳时间的影响

各组别小鼠力竭游泳时间见表2-4，由表可知阳性药、复方总提取物及大孔树脂不同浓度乙醇洗脱部位均延长小鼠的力竭游泳时间，其中阳性药和C1组的游泳时间最长，与空白组相比存在显著性差异(P＜0.01)，E2和E3HD组也显著性的延长了小鼠的力竭游泳时间(P＜0.05)。该实验表明复方总提物具有抗疲劳的作用，E2和E3在高剂量时也具有较好的抗疲劳作用。

表2-4复方刺五加提取物对小鼠游泳时间的影响(n＝10)

*P＜0.05，**P＜0.01vscontrol

(三)对血清生化指标的影响

生化指标测定结果见表2-5和图1、2、3，由此可知力竭游泳后小鼠血清中的BUN的值在阳性药、C1及40％和75％乙醇洗脱部位组有所下降，但与空白组相比并无显著性差异。与空白组相比，大部分给药组血清中TG的含量有所下降，其中阳性药组、总提物高低剂量组和40％乙醇洗脱部位HD组含量较低，具有显著性差异(P＜0.05)。LDH数据显示，与空白组相比阳性药、C1HD组(P＜0.01)和75％乙醇部位(P＜0.05)均能显著升高小鼠血清中LDH水平。CK数据显示阳性药组、总提取高低剂量组及40％乙醇HD组均能显著升高血清中CK水平(P＜0.05)，其中以C1HD组和40％乙醇HD组效果最显著(P＜0.01)。生化指标数据表明C1具有显著的抗疲劳作用，而40％和75％乙醇洗脱部位也具有不同程度的缓解疲劳的作用。

表2-5刺五加提取物对血清甘油三酯、尿素氮、乳酸脱氢酶和肌酸磷酸激影响(n＝10)

*P＜0.05，**P＜0.01vscontrol

实施例15提取物组分的UHPLC-Q-TOF-MS分析

一、实验材料

(一)实验试剂

乙腈(C₂H₃N)、甲酸购自美国默克公司，均为色谱级；蒸馏水购自广州屈臣氏食品饮料有限公司。

(三)实验仪器

MettlerToledo分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；FRESCO17离心机(Thermo)；超声仪(科导超声)；Agilent1290Infinity型超高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；四级杆串联飞行时间质谱仪Agilent6538UHDandAccurate-MassQ-TOF/MS(美国安捷伦科技有限公司)；色谱柱WatersHSST31.7um100*2.1mm。

二、实验方法

(一)供试品溶液的配制

精密称取实施例2，例3所得提取物C2、C3各10mg，用50％乙腈定容至10ml容量瓶中，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

(二)UHPLC色谱条件

流动相：A-0.1％甲酸-水溶液，B-0.1％甲酸-乙腈溶液；流速：0.35mL/min；柱温：40℃进样量：3μl；PostTime：5min；洗脱梯度见下表：

表3-4流动相洗脱程序

(三)Q-TOF/MS质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，在正离子模式和负离子模式下分别采集数据，具体质谱条件如下表：

表3-5质谱参数

三、实验结果

(一)C2部位化合物的归属

正离子模式含有[M+H]⁺或[M+Ha]⁺，负离子模式含有[M-H]^-，[M+Cl]^-或[M+COOH]^-离子。根据各质谱峰的离子信息，从总离子流图中提取色谱峰，并与已建立的化合物数据库进行匹配，共匹配确认化合物83个(表3-6)。确认刺五加中化合物23个，包括木脂素类化合物11个，三萜皂苷类化合物3个，香豆素类化合物2个以及其它化合物7个；黄芪中化合物个31个，包括黄酮和异黄酮类化合物14个，异黄烷类化合物8个，紫檀烷类化合物4个及其它类化合物6个；明党参中化合物29个，以发挥发油类成分为主共有25个，香豆素类化合物1个，甾体类1个和2个其它类化合物。

表3-6C2部位中化合物的质谱信息主初步归属

(二)提取物C3化合物的归属

C3分析匹配方法同C2，最终匹配确认C3化合物163个(表3-7)。指认刺五加中化合物34个，其中三萜皂苷类化合物18个，木脂素类化合物5个，香豆素类化合物1个及其它类化合物10个；黄芪中化合物68个，其中皂苷类化合物22个，黄酮和异黄酮类化合物28个，异黄烷类化合物9个，紫檀烷类化合物6个及其它类化合物3个；明党参中化合物61个，主要以挥发油为主共41个，还包括脂肪酸类9个，香豆素类5个和其它类化合物6个。

表3-7提取物C3中化合物的质谱信息及初步归属

UHPLC-Q-TOF-MS技术具有分析速度快、样品要求小、灵敏度高等优势，现已广泛应用于中药多组分复杂体系活性成分的研究。通过该技术对提取物C2、C3的化学成分进行分析，结果显示C2中主要含木脂素类化合物，其次为黄酮类化合物，C3主要含皂苷类化合物，其次为黄酮类化合物。木脂素类化合物是刺五加的主要药效成分，皂苷类成分是黄芪中重要的药效成分，该实验表明C2抗疲劳物质基础为木脂素类和黄酮类化合物群，而C3部位抗疲劳物质基础为皂苷类和黄酮类化合物群。

UHPLC-Q-TOF-MS分析结果表明，采用本发明工艺提取得到的提取物C2，C3较好地保持了活性组分群。

实施例16复方刺五加有效部位抗特殊环境下疲劳作用研究

一、实验材料

(一)实验试剂

95％乙醇购自上海禾汽化工科技有限公司，分析级(AR)；0.5％CMC-Na溶液(自制)；蒸馏水；Mouse5-HTELISAkit(南京建成)；4％多聚甲醛-0.1M磷酸缓冲液(pH7.3～7.4)、1％锇酸-0.1M磷酸缓冲液、丙酮、环氧树脂(Epon-812)；100％乙醇、醋酸双氧铀、枸橼酸铅等包埋液和染色剂均有海军医学研究所提供。

(二)实验仪器

特殊环境模拟动物实验舱(705)舱(烟台宏远氧业有限公司改装)，由动物舱、环境控制系统、配气系统、钴源升降系统组成；螺杆式空气压缩机(上海斯可络压缩机有限公司)；恒温恒湿机(合肥天鹅制冷科技有限公司)；RMS5120区域剂量率监测仪；空气储罐(烟台宏远氧业有限公司)；日立H-7000型透射电镜(日立高新技术公司)；台式离心机、纯水仪、微型漩涡混合器、水浴锅、10μl枪、100μl枪、1000μl枪、酶标仪均由武汉谷歌生物有限公司提供；LKB超薄切片机。

(三)实验动物

ICR雄性小鼠100只，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXK(沪)2012-0002。按体重随机分为10组，每组10只。实验期间，动物饲养环境保持在室温25±2℃，相对湿度50-70％，小鼠可自由摄取食物和水。

二、实验方法

(一)实验用药配制

0.5％CMC-Na溶液配制同实施例13。

取实施例1提取物C1，根据实施例3制备提取物C2，C3，根据剂量换算将高、中、低剂量依次设为600mg/kg、400mg/kg和200mg/kg。然后用0.5％CMC-Na溶液配制成60mg/ml，40mg/ml和200mg/ml的混悬液备用。

阳性对照药物：红参醇提物浸膏用0.5％CMC-Na配成剂量为20mg/ml的混悬液。

空白对照组：以0.5％CMC-Na溶液作为空白对照，等容量给药。

(二)特殊环境下的疲劳实验

小鼠在室温25±2℃，相对湿度50-70％环境下适应性饲养5天后按体重随机分为10组，即模型组、空白组、阳性对照组、总提物C1组、C2HD组、C2MD组、C2LD组、C3HD组、C3MD组和C3LD组。所有药物均用配制好的0.5％CMC-Na溶液混悬，按0.2ml/20g体重灌胃给药，每天1次，连续30天。第一天和最后一天给药前分别称量各组小鼠体重并记录，喂养期间每隔3天称量一次体重并记录。

特殊环境下的疲劳实验：各组小鼠每天7：30开始灌胃，灌胃结束后放入特殊环境模拟动物实验舱中进行实验，实验时间为2h，实验期间小鼠在密闭舱室中可自由活动，自由摄取食物和水。实验结束后，清洗舱室30min，待压力降至0Pa，打开舱门，取出小鼠放回动物房继续饲养。特殊环境模拟动物实验舱为密闭舱室，在舱室内加入有害气体、噪音、高温、高湿、核辐射等因素模拟特殊的密闭环境，长期处于该环境下小鼠精神和体力消耗受到影响易产生疲劳。舱内环境参数设置如表4-1。实验最后一天，从舱内取出小鼠后，摘除眼球取血，取好的血置于4℃冰箱中静置1h，然后离心机3000r/min离心15min，取上层血清冻存于-80℃，待测。取过血的小鼠脱臼处死，解剖依次取脾、胸腺、睾丸、海马和小肠5个组织，取好的胸腺、脾和海马在冰盒中称取质量，其他组织置于液氮中保存，其中海马、胸腺、睾丸、小肠经过处理后用于电镜观察。取适量海马组织，用9倍生理盐水研磨，研磨液3000-4000r离心10min，取上清液置于4℃冰箱保存，用于5-HT含量测定。

表4-1特殊环境模拟动物实验舱环境参数

三、实验结果

(一)数据分析

实验所得数据统计处理应用SPSS18.0软件进行，所有数据以表示，检测指标采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，组间差异性采用LSD-t法进行比较，显著性差异检验水准α＝0.05。电镜切片各个组织在同一放大倍数、同一光强度下观察。

(二)对小鼠行为活动和体重的影响

实验过程中对各组小鼠进行观察，实验前两周各组小鼠饮食、饮水情况正常，皮毛顺滑，活动正常，未见明显异常，各组小鼠未见明显区别；但是模型组小鼠体重增长较其它组缓慢，实验第12天开始模型组小鼠体重显著低于其它组(P＜0.05)，随时间增加，模型组体重增加与其它组体重增加差异性有所波动，最后体重与空白组体重存在显著性差异(P＜0.01)，其他给药组体重与空白组接近，不同药物对小鼠体重的影响见表4-2和图4。实验第18天开始，模型组小鼠活动减少，反应迟缓，实验第24天开始模型组小鼠皮毛不及其他组小鼠光滑，其它组小鼠较空白对照组兴奋，活动增多，其它行为正常。对实验过程中小鼠体重分析表明，与模型组相比C2与C3高剂量组可显著改善小鼠体重的状况。

表4-2复方总提物及有效部位对小鼠体重的影响(n＝10)

*P＜0.05，**P＜0.01vsmodel

(三)对小鼠主要脏器指数的影响

对小鼠海马指数、胸腺指数和脾指数进行观察，脏器指数计算公式为脏器指数＝脏器重量(mg)×10/小鼠体重(g)，计算结果见表4-3。由结果可知模型组小鼠的海马指数和脾指数有不同降低，而红参与复方刺五加提取物组则对小鼠海马指数、胸腺指数和脾指数有一定的提高作用，但差异不显著。

表4-3复方刺五加及有效部位对海马指数、胸腺指数和脾指数的影响(n＝10)

(四)对小鼠海马内5-HT的影响

对海马内5-HT含量的影响如表4-4所示，模型组小鼠海马内5-HT含量显著高于空白对照组，说明密闭环境可促使其含量升高；各给药组均不同程度降低5-HT含量，其中阳性药和总提物C1作用最明显(P＜0.01)，与模型组相比具有显著性差异，C2和C3高剂量组与模型组相比也具有显著性差异，但是中剂量和低剂量作用不显著。实验结果表明C2和C3可通过降低海马内5-HT含量，缓解密闭环境下机体产生的不适感，从而延缓精神疲劳的发生。

表4-4复方刺五加及有效部位对海马5-HT含量的影响(n＝10)

*P＜0.05，**P＜0.01vsmodel

(五)对小鼠海马组织的影响

透射电镜下观察可见，空白对照组小鼠神经元细胞结构正常，细胞核和突触泡形态规则，未见异常，染色质分布均匀。模型组大部分神经元细胞凋亡，细胞核固缩，部分裂解，染色质分布不均凝集呈块状，突触泡扩张，突触泡内的小泡消失，与模型组相比各给药组均不同程度的减少了细胞凋亡数目及细胞形态变化。其中C3HD组细胞形态接近正常，少量突触泡轻微扩张，未见凋亡细胞。结果表明C2和C3组凋亡细胞数目及凋亡程度均不成程度减小，其中C3组对神经元细胞的保护和修复效果更显著，高剂量组细胞形态趋于正常。

(六)对小鼠胸腺组织的影响

透射电镜观察可见，空白对照组小鼠胸腺内淋巴细胞排列紧密，细胞边界清晰，细胞核较大，核仁清晰，染色质分布均匀，细胞浆较少，细胞形态正常。与此相比，模型组大部分淋巴细胞核固缩成半月形或不规则形，染色质凝集成块状，部分细胞核裂解，呈完全凋亡形态；胞浆里有大量空泡，部分细胞可见胞浆脱落。C2HD组偶见凋亡细胞，大部分细胞形态正常，少数细胞胞浆里面有空泡。C2MD组少量淋巴细胞核固缩，染色质聚集呈凋亡形态，部分细胞浆空泡化。C3HD组淋巴细胞界限清晰，细胞形态正常，染色质分布均匀，未见凋亡细胞，胞浆内未见空泡，整体形态接近空白对照组。C3MD组淋巴细胞形态基本正常，偶见凋亡细胞，细胞浆内未见空泡。由此可知，C2和C3均能不同程度的抑制淋巴细胞凋亡的发生，并具有修复作用，其中C3效果更好，C3HD细胞形态完全正常。

(七)对小鼠睾丸组织的影响

透射电镜下观察可见，空白对照组精细胞形态正常，曲精管上皮细胞形态规则，未见凋亡细胞；精子形态正常，数目较多。与此相比，模型组可见部分凋亡的精细胞，部分精细胞核内染色质聚集，出现胞浆空泡化；少量曲精管上皮细胞出现凋亡，部分胞浆内有空泡，少量细胞胞浆已脱落；精子数目较少，偶见异常。C2HD组部分区域少量精细胞凋亡，胞浆出现空泡，其他区域偶见精细胞出现凋亡；少量曲精管上皮细胞可见胞浆脱落，胞浆内有少量空泡；精子形态基本正常，数目偏少。C2MD组精细胞分散，泡浆内大量空泡，部分精细胞核内染色质聚集；曲精管上皮细胞部分凋亡，核固缩，核内染色质聚集；精子形态偶见异常，数目基本正常。C3HD组可见少量精细胞凋亡，部分胞浆内可见空泡；曲精管上皮细胞未见凋亡，少量胞浆内可见空泡；精子数目正常，少量精子出现畸形。C3MD组可见有少量精细胞凋亡，部分精细胞染色质聚集，胞浆空泡化；曲精管上皮细胞胞浆内可见空泡，少量上皮细胞可见胞浆脱落；精子数目正常，少量精子出现畸形。研究结果表明，C2和C3均能轻度缓解睾丸中精细胞和曲精管上皮细胞的凋亡。

(八)对小鼠小肠组织的影响

透射电镜下观察可见，空白对照组小肠绒毛排列紧密整齐，细胞界限清晰可见，细胞器正常。与此相比，模型组小鼠小肠绒毛排列稀疏紊乱，部分区域绒毛脱落缺失，部分区域绒毛变短；大部分上皮细胞核内染色质聚集，出现胞浆空泡化甚至脱落。C2HD组小肠绒毛排列整齐，部分区域绒毛较正常略短且排列稀疏；少数上皮细胞内偶见空泡。C2MD组小肠绒毛偏短，部分区域排列松散；部分上皮细胞内可见少量空泡。C3HD组小肠绒毛排列紧密整齐，长度接近正常；上皮细胞形态正常，界限清晰可见，核内染色质分布均匀，未见明显空泡。C3MD组小肠绒毛排列紧密整齐，长度较正常略短；上皮细胞形态基本正常，少数细胞胞浆内偶见空泡。由此结果可知，C2和C3均能减少小肠绒毛受损伤程度，减少上皮细胞凋亡的出现，其中C3效果相对较好，高剂量细胞形态完全正常。

(九)讨论

某些特殊领域，由于作业任务的特殊性常需在恶劣环境下进行，如矿井、密闭舱等，这些环境大多为密闭的，里面常具有高温、高湿、噪音、有害气体、辐射等有害因素。机体长期处于上述环境中可导致内环境紊乱，机体功能失调，引起疲劳甚至产生病变。上述特殊环境下疲劳的产生涉及多个器官及系统，其中神经系统、免疫系统、消化系统、生殖系统对此反应较为敏感，尤其是神经系统，但是上述有害因素对于机体的影响也是一个慢性应激过程，短期内一些宏观观察指标改变并不明显，而细胞凋亡发生在这些指标改变之前，因此除了对海马内神经递质进行检测外，可以利用透射电镜技术观察不同组织内细胞超微结构的变化及凋亡形态。

长期处于密闭环境中的作业人员，由于精神紧张、体力消耗加重、注意力集中等原因极易引起精神疲劳，从而导致认知功能下降、记忆力减退、精神不佳等现象，而海马是调控认知、学习能力和记忆力的神经中枢，其内神经递质含量的高低、神经元结构的正常与否以及海马的大小直接影响着学习能力、记忆力和精神状态的好坏。5-HT是在海马组织内合成的重要的中枢神经抑制性递质，对于睡眠、感知、情绪等精神行为具有重要的调节作用，其含量的增加可抑制多巴能神经元系统而产生疲劳，也可能减弱唤醒能力和动力而引起疲劳。对神经元细胞超微结构观察可见，与模型组相比C2和C3组显著减少神经元细胞凋亡数目，改善细胞形态，后者神经元细胞形态正常，未出现凋亡。由此表明C3可通过降低海马内5-HT含量，抑制神经元细胞凋亡，维持神经系统的正常功能起到缓解疲劳的作用。

环境变化直接影响机体的免疫力，存在多种有害因素的密闭环境可导致机体免疫功能下降。胸腺作为中枢淋巴器官，是体内重要的免疫器官，对于多种刺激反应敏感，其内的淋巴细胞对于辐射、噪音等有害因素的损伤更为敏感。电镜观察可见，与模型组相比C2和C3组显著减少淋巴细胞凋亡数目，改善细胞形态，后者细胞形态完全正常，未有任何异常，提示C3可保护淋巴细胞免受有害因素损伤，抑制细胞凋亡，维持免疫系统的正常功能而起到缓解疲劳的作用。

密闭环境中，噪音、辐射等有害因素易于引起疲劳，长时间的积累可影响机体的生殖功能，损伤生殖系统，生殖系统对于辐射的反应尤为敏感。电镜观察可见C2和C3组精细胞形态和精子形态与模型组相比有一定程度的改善。

高温、高湿等有害因素可引起食欲不振、精神萎靡，导致消化系统功能紊乱，加重疲乏感。小肠是食物消化和吸收的重要部位，其内整齐有序的绒毛结构是小肠正常消化和吸收的重要保障。电镜观察可见，与模型组相比C2和C3组小肠绒毛形态和上皮细胞形态明显改善，其中C3组小肠绒毛及上皮细胞形态完全正常，表明C3可保护小肠绒毛结构，并修复损伤结构，抑制上皮细胞凋亡，保护小肠结构，维持消化系统的正常功能而起到抗疲劳作用。

实验表明，C2和C3对于特殊环境下的疲劳损伤均具有缓解作用，尤其以C3的缓解效果较好。能够显著减低海马内5-HT含量，抑制神经元细胞、淋巴细胞和小肠绒毛细胞的凋亡，维持细胞的正常形态，保护海马、胸腺和小肠组织免受损害，促进损伤后修复，维持机体神经系统、免疫系统和消化系统的正常功能而起到抗疲劳的作用。

实施例17急性毒性实验

ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18-22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号SCXK(沪)2012-0002。实验期间，动物饲养环境保持在室温25+2℃，相对湿度50-70％，小鼠可自由摄取食物和水。

取实施例1，例3的提取物，分别加入0.5％CMC-Na溶液中，边加边搅拌直至达到饱和，得到最大浓度混悬液，该过程中记录加入的量，计算其最大浓度。

小鼠在动物实验中心适应性喂养3天后，随机抽取18只小鼠，雌雄各半，按体重随机分为3组，每组6只。实验前禁食12h，分别将已配置好的混悬液按最大浓度最大体积(0.8ml/只)一次性灌胃给药，给药后2h禁食，24h内及时观察小鼠行为活动、呼吸情况、口鼻分泌物、有无呕吐、有无中毒和死亡等现象，发现部分小鼠活动减少，闭目不动，12h后恢复正常，持续观察7天，小鼠无异常情况和死亡现象，由此可知上述三种药物无法计算LD₅₀，根据实验情况可测其MTD。

实验结果表明，上述三种复方刺五加提取物均无明显急性毒性。其最大浓度最大体积时的给药剂量均超过人(60kg)临床常用剂量的300倍以上，因此是安全的。

实施例18提取物制剂的制备

本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂，辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等，按常规技术制备。

一、颗粒剂的制备

取实施例1-8任一所述的提取物加入辅料制粒，干燥，过300目筛。包装成10g/袋，成品颗粒。所述的辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等。

取实施例1-8任一所述的提取物的浸膏粉适量，加入乳糖混匀，浸膏粉∶乳糖＝8∶1，然后喷入乙醇并搅拌混合，用12目筛网制成湿颗粒，于60℃干燥，再过12目筛1次，并用60目筛分出细粉，收集不能通过12目筛、能通过60目筛的颗粒和粉末，包装。

二、片剂/胶囊的制备

取实施例1-8任一所述的提取物100g，加淀粉，乳糖，微晶纤维素，淀粉浆适量，硬脂酸镁1％，分别过80目筛，混匀，再过40目筛3次，将上述混合粉用7％淀粉浆制软材，过24目筛粒，50℃干燥2小时，干燥颗粒过30目筛整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片，得片剂1000片。

三、袋泡茶的制备

取实施例1-8任一所述的提取物100-300g，加鸡骨草1350g，荷叶500克，加白砂糖及其他辅料适量，以袋泡茶包装材料分装成1000包即可。

或以提取物500g，加茶叶1500克，白砂糖或其他辅料适量，以袋泡茶包装材料分装成1000包即可。

四、口服液/合剂的制备

取实施例1-8任一所述的提取物，加2倍量酒精，搅拌沉淀过夜。取上清液，浓缩至稠浸膏；加适当制药辅料，制成口服液、合剂。制药辅料可根据需要选择添加矫味剂和防腐剂，常用的矫味剂有蜂蜜、单糖浆、甘草酸和甜菊苷等；防腐剂有山梨酸、苯甲酸和丙酸等。

五、口服液/饮料的制备

取实施例9所述的醇沉后的上清液，过滤回收乙醇至无醇味后配液，过滤，灌封，灭菌，制得口服液或饮料成品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗疲劳的中药组合提取物，其特征在于，所述的中药组合提取物由以下重量份的原料药制备而得：刺五加、黄芪和明党参的比例为5：5：1。

2.根据权利要求1所述的中药组合提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：按权利要求1所述的重量份称取各原料药，将所述原料药进行煎煮、浓缩，加入提取溶剂乙醇行醇沉，醇沉后取上清液浓缩得浓缩液。

3.根据权利要求1所述的中药组合提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：按权利要求1所述的重量份称取各原料药，将所述原料药进行煎煮、浓缩，加入提取溶剂乙醇行醇沉，醇沉后取上清液浓缩过大孔树脂柱，以30-75％乙醇收集洗脱部位，减压浓缩干燥得提取物。

4.根据权利要求1所述的中药组合提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：按权利要求1所述的重量份称取各原料药，将所述原料药粉碎，以30-95％乙醇回流，提取液浓缩，过大孔树脂柱，收集30-75％乙醇洗脱部位，减压浓缩干燥得提取物。

5.根据权利要求1所述的中药组合提取物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：按权利要求1所述的重量份称取各原料药，将所述原料药洗净、粉碎，以30-95％乙醇，以2-3ml/min的速度渗漉，收集15-20倍量乙醇体积的渗漉液，浓缩，用蒸馏水调节比重至1.02～1.05g/ml，pH5-6，滤液过大孔树脂柱，收集30-75％乙醇洗脱部位，洗脱液减压浓缩干燥得到提取物。

6.根据权利要求3-5任一所述的制备方法，其特征在于，所述的大孔树脂选自D-101、AB-8、ZTC-1或SP905。

7.根据权利要求2-6任一所述的制备方法制备的中药组合提取物。

8.根据权利要求1或7任一所述的中药组合提取物在制备治疗或预防疲劳及特殊环境下疲劳损伤的药物或食物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的疲劳为特殊环境下的疲劳损伤，所述的特殊环境为包括有害气体、噪音、高温、高湿或核辐射的密闭环境。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物的剂型是口服液、片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、丸剂、口嚼片、含片、口香糖、膏剂、合剂、贴剂或凝胶剂。