CN113274413B - 美洲大蠊有效部位提取物及其提取方法、应用、药物组合物 - Google Patents

美洲大蠊有效部位提取物及其提取方法、应用、药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种美洲大蠊有效部位提取物及其提取方法、应用、药物组合物。提取方法包括以下步骤：制备含有美洲大蠊有效部位提取物的美洲大蠊提取物悬浮液；将含有美洲大蠊有效部位提取物的美洲大蠊提取物悬浮液经大孔树脂进行层析；对吸附完成后的大孔树脂先进行水洗，随后采用含水醇进行洗脱，同时收集含水醇洗脱液；将含水醇洗脱液减压浓缩和干燥，得到美洲大蠊有效部位提取物；其中大孔树脂的平均孔径>165μM且呈极性，含水醇中醇的质量分数为38～45％；该提取方法得到的美洲大蠊有效部位提取物能够用于预防或治疗阿尔茨海默病。

Description

美洲大蠊有效部位提取物及其提取方法、应用、药物组合物
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种美洲大蠊有效部位提取物及其提取方法、应用、药物组合物。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，是造成老龄人口认知能力减退的主要疾病之一，其主要病理特征表现为患者脑组织内β淀粉样蛋白沉积、神经纤维缠结和神经元丢失；其主要临床表现为进行性精神状态衰变，包括记忆力障碍、分析判断能力衰退、情绪改变、行为失常，甚至发生意识模糊等，最终导致患者死亡。自AD被发现以来，有诸多学者基于患者脑组织内β淀粉样蛋白沉积、tau蛋白高度磷酸化、乙酰胆碱缺乏、氧化应激改变、生物医学稳态失调等诸多病理特征提出了相应的各种病因假说，而这些假说的多样性，也正说明了AD是一种病因极为复杂的疾病，事实上，到目前为止，AD的真正致病原因依然不明确，尽管这些年来，有众多学者开展了大量以这些假说为基础的相应治疗药物的开发研究，但收效甚微，目前，我们仍缺乏有效预防和治疗AD的药物和方法。
随着全球人口老龄化的发展，AD已经成为当今世界亟需解快的重大难题，其作为一种常见于老年期的中枢神经系统渐进性退行性疾病，在65～74岁老年人中的发疾率约3％左右，在75～85岁老年人中的发病率为17％，而在85岁以上老年人中的发病率高达32％。据报道，2013年全球有3600多万AD患者，预计至2030年达到6570万，至2050年，AD患者将超过一亿人。而据统计，仅2015年全世界AD患者的治疗费用就高达818亿美元，至2030年预计将达2万亿美元以上，如此昂贵的医疗费用已给患者家属及整个社会带来了沉重的经济负担。因此，研究有效预防或治疗AD的策略及药物开发已经刻不容缓。
到目前为止，美国FDA总共批准过5个用于阿尔茨海默病治疗的药物，包括他克林(1993年)、多奈派齐(1996年)、卡巴拉汀(1998年)、加兰他敏(2001年)、美金刚(2002年)，前四者为乙酰胆碱酯酶抑制剂，美金刚则为NMDA受体非竟争性拮抗剂。其中他克林，因在上市后发现其副作用过大而停止销售。从时间上看，尽管自2002年美金刚获批上市以来有几十个有关DA治疗的药物进入不同阶段的临床试验，但到目前为止，效果均不理想。
美洲大蠊(Periplaneta americana)为昆虫纲，蜚蠊科，大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”。美洲大蠊作为地球上最古老、生命力最强、繁衍最成功的昆虫类群之一，其入药已有悠久的历史，《神农本草经》中载有美洲大蠊为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀症坚、寒热、破积聚、喉咽痹、内寒无子”。此外，《唐本草》、《本草经纲目》等中均有其入药的记载。
美洲大蠊中主要成分类别有脂类、蛋白质、肽、氨基酸、核苷类、糖类、无机盐以及多种类型的小分子物质成分，其所含成分类别的复杂性，决定了其药理作用的多样性。目前，以美洲大蠊为原料药材的制剂，有用于创面修复，主治烧伤烫伤的“康复新”液；具有抗病毒作用，用于治疗肝炎的“肝龙”胶囊；以及具有强心升压作用，用于治疗心衰的“心脉隆”注射液。而其中，尤为引人注目的是“康复新”液，其在这么多年的临床使用过程中，不断发现其有新的药理作用。
目前，其已从过去的纯外用药，发展到了众多医院为数不多的全科用药品种。而恰恰“康复新”液即为美洲大蠊虫体粗提物制剂，这就正明了美洲大蠊中确实存在对多种疾病具有预防或治疗作用的优秀物质。而近年来，又有学者报道从中分离纯化得到了具有抗肿瘤活性的部位和抗肝纤维化活性的部位。由此表明，当采用不同的工艺对美洲大蠊提取物进行分离时，所得的部位样品的药理作用也将随之不同。
发明内容
本发明针对现有治疗阿尔茨海默病的药物，治疗效果均不理想的问题，本发明提供一种美洲大蠊有效部位提取物的提取方法。
本发明采用以下技术方案：一种美洲大蠊有效部位提取物的提取方法，包括以下步骤：
制备含有美洲大蠊有效部位提取物悬浮液；
将含有美洲大蠊有效部位提取物悬浮液经大孔树脂进行层析；
对吸附完成后的大孔树脂先进行水洗，随后采用含水醇进行洗脱，同时收集含水醇洗脱液；
将含水醇洗脱液减压浓缩和干燥，得到美洲大蠊有效部位提取物；
其中大孔树脂的平均孔径>165μM且呈极性，含水醇中醇的质量分数为38-45％，优选地，醇为甲醇或乙醇。
进一步限定，含有美洲大蠊有效部位提取物的悬浮液中美洲大蠊提取物的质量与大孔树脂的质量之比为1:8～1:12。
进一步限定，所述层析时间为6～12小时。
进一步限定，水洗过程中水的体积与装有大孔树脂的柱床体积比为1:1～3:1；优选地，含水醇的体积为装有大孔树脂的柱床体积的2～3倍，优选地，水洗过程中的水为去离子水或纯水。
进一步限定，水洗过程中水的流速为1/60～1/100的装有大孔树脂的柱床体积/分钟，优选地，洗脱过程中醇的流速为1/60～1/100的装有大孔树脂的柱床体积/分钟。
进一步限定，减压浓缩过程中的温度为60～80℃，优选地，所述大孔树脂为S-8型极性大孔吸附树脂。
本发明的有益效果为：本发明通过采用平均孔径>165μM的极性大孔树脂对含有美洲大蠊有效部位提取物的美洲大蠊提取物悬浮液进行富集，且大孔树脂水洗后采用醇的质量分数为38～45％的含水醇进行洗脱，最后经过减压浓缩得到美洲大蠊有效部位提取物，该美洲大蠊有效部位提取物能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性，抑制β淀粉样蛋白(Aβ1-42)聚集和保护Aβ1-42引起的PC-12细胞损伤的作用，调节注射D-半乳糖和东莨菪碱所致AD大鼠模型鼠脑中多个胆碱能系统指标；该美洲大蠊有效部位提取物能够用于预防或治疗阿尔茨海默病，且能够用于预防或治疗阿尔茨海默症药物中或保健品中的制备，也可用于制备药物组合物，药物组合物是片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或注射剂。
本发明公布的美洲大蠊有效部位提取物的提取方法中所使用的大孔树脂易得、价格低廉、性能稳定、使用周期长及可再生重复使用的特点，可大大降低工业化生产成本。
具体实施方式
实施例1
一种美洲大蠊有效部位提取物的提取方法，具体操作步骤如下：
A.称取预先处理好的S-8型极性大孔吸附树脂500g(醇中约0.6L)，用醇进行装柱，随后用去离子水洗至流出液无醇，且当树脂柱床顶部水与柱床顶树脂相切时，关闭树脂柱下口活塞备用(此时树脂柱床体积收缩至约0.5L)；
B.称取50g美洲大蠊提取物(密度：1.3g/mL)，溶解于100mL去离子水中，得含美洲大蠊有效部位提取物的美洲大蠊提取物悬浮液；
C.在开启树脂柱下口活塞情况下，将上述美洲大蠊提取物悬浮液缓慢从树脂柱顶加入，当流至悬浮液与树脂柱床顶部相切时，关闭树脂柱底活塞，并保持室温自然吸附10小时；
D.先用1倍树脂柱床体积的去离子水(0.5L)洗脱柱子，流速每分钟1/80个树脂柱床体积，洗去不被吸附的物质成分；
E.树脂柱继用3倍树脂柱床体积的40％的含水乙醇洗脱(1.5L)，流速每分钟1/80个树脂柱床体积，收集含水醇洗脱液，并于70℃下减压浓缩至约100mL，用冷冻干燥机干燥，得到美洲大蠊有效部位提取物的冻干粉6.21g(得率：12.4％)。
实施例2
一种美洲大蠊有效部位提取物的提取方法，具体操作步骤如下：
A.称取预先处理好的S-8型极性大孔吸附树脂500g(醇中约0.6L)，用醇进行装柱，随后用去离子水洗至流出液无醇，且当树脂柱床顶部水与柱床顶树脂相切时，关闭树脂柱下口活塞备用(此时树脂柱床体积收缩至约0.5L)；
B.称取62.5g美洲大蠊提取物(密度：1.3g/mL)，溶解于100mL去离子水中，得含美洲大蠊有效部位提取物的美洲大蠊提取物悬浮液；
C.在开启树脂柱下口活塞情况下，将上述美洲大蠊提取物悬浮液缓慢从树脂柱顶加入，当流至悬浮液与树脂柱床顶部相切时，关闭树脂柱底活塞，并保持室温自然吸附6小时；
D.先用3倍树脂柱床体积的去离子水(1.5L)洗脱柱子，流速每分钟1/60个树脂柱床体积，洗去不被吸附的物质成分；
E.树脂柱继用2倍树脂柱床体积的38％的含水乙醇洗脱(1.0L)，流速每分钟1/100树脂柱床体积，收集含水醇洗脱液，并于60℃下减压浓缩至约100mL，用冷冻干燥机干燥，得到美洲大蠊有效部位提取物的冻干粉6.31g(得率：10.1％)。
实施例3
一种美洲大蠊有效部位提取物的提取方法，具体操作步骤如下：
A.称取预先处理好的S-8型极性大孔吸附树脂500g(醇中约0.6L)，用醇进行装柱，随后用去离子水洗至流出液无醇，且当树脂柱床顶部水与柱床顶树脂相切时，关闭树脂柱下口活塞备用(此时树脂柱床体积收缩至约0.5L)；
B.称取41.6g美洲大蠊提取物(密度：1.3g/mL)，溶解于100mL去离子水中，得含美洲大蠊有效部位提取物的美洲大蠊提取物悬浮液；
C.在开启树脂柱下口活塞情况下，将上述美洲大蠊提取物悬浮液缓慢从树脂柱顶加入，当流至悬浮液与树脂柱床顶部相切时，关闭树脂柱底活塞，并保持室温自然吸附12小时；
D.先用2倍树脂柱床体积的去离子水(1.0L)洗脱柱子，流速每分钟1/100个树脂柱床体积，洗去不被吸附的物质成分；
E.树脂柱继用2.5倍树脂柱床体积的45％的含水乙醇洗脱(1.25L)，流速每分钟1/60个树脂柱床体积，收集含水醇洗脱液，并于60℃下减压浓缩至约100mL，用冷冻干燥机干燥，得到美洲大蠊有效部位提取物的冻干粉4.87g(得率：11.7％)。
实施例4
乙酰胆碱酯酶抑制活性测试
实验试剂配制：
(1)磷酸缓冲液(PBS)配制：A液：0.1mol/L磷酸二氢钾液配制：称取2.722g的磷酸二氢钾，加双蒸水定溶至200mL；B液：0.1mol/L十二水磷酸氢二钠液配制：称取17.90g的十二水磷酸氢二钠，加双蒸水定溶至500ml，继将A液和B液以1:9混合后调至PH＝7.6即得。
(2)0.85μ/mL的乙酰胆碱酯酶储备液配制：称取15.46mg乙酰胆碱酯酶(AChE，活度：220μ/g)，用4mL上述PBS液溶解，加1mg牛血清白蛋白(BSA)作稳定剂，即得乙酰胆碱酯酶储备液；
(3)15mmoL/L DTNB储备液配制：称取43.38mg 5,5`二硫二硝基苯甲酸(DTNB)，用上述PBS定溶至10mL即得；
(4)15mmoL/L ATCI储备液配制：称取9.45mg碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)，用上述PBS定溶至10mL即得；
(5)1％SDS液配制：称取0.5g十二烷基硫酸钠(SDS)，用PBS定溶至50mL即得；
(6)测试样品配制：称取实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物30mg，用PBS液稀释至浓度分别为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00mg/mL的待测样品液；
(7)测试方法：2.55mL PBS液+50μL AChE液+100μL DTNB液+100μL样品液→37℃预热2min+100μL ATCI液(底物)→37℃保温20min+100μL SDS液→立即于412nm处测吸光度值。
(8)抑制率计算：抑制率(％)＝[OD空白－(OD样品－OD本底)]/OD空白×100％，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003144380060000081
由表1可知，该实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物具有良好的乙酰胆碱酯酶抑制活性且量效关系明显。
实施例5
有效部位对β淀粉样蛋白Aβ1-42单体聚集的影响
(1)100μmol/L Aβ1-42单体制备：
取冻存于-20℃、规格为1mg装的Aβ1-42冻干粉1支，加入220μL冰上预冷的六氟异丙醇(HFIP)，密封，涡旋混匀后，室温下静置60min，直至澄清，得Aβ-HFIP溶液(1mM)，用冷冻干燥机干燥4h，得Aβ1-42肽膜，向该肽膜加入45μL无水二甲基亚砜(DMSO)，于水浴超声(功率300W，频率35Hz)处理5分钟，得到Aβ-DMSO溶液。再向Aβ-DMSO溶液中加入预冷的2155μL的PH＝6.6的磷酸缓冲液，涡旋混匀后，用高速冷冻离心机于4℃、13,000rpm离心10分钟后，吸取上清液，即为100μmol/L Aβ1-42单体液；
20μmol/L硫磺素T(Th-T)液配制：称取31.886mg硫磺素T定溶至100mL(1mmoL/L)，继取该液2mL再定溶至100mL即得；
(2)样品配制：称取实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物30mg，分别稀释至测试终浓度为31.25、62.50、125.00、250.00、500.00μg/mL所需样品溶液；
(3)实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物对单体Aβ1-42聚集荧光强度的影响：
采用96孔板，各组及各浓度样品均设3个复孔，加样完成后，于酶标板振荡器上200r/min混合10min，于37℃，含5％CO2培养箱中孵育48h，在多功能酶标仪上，以450nm为激发光，测定485nm处的荧光发射，结果如表2所示。
加样方法：
(1)实验孔：20μL 100μmol/L的Aβ1-42液+20μL样液(各浓度)+20μL 20μmol/L的Th-T(依顺序快速加入)；
(2)阳性孔：20μL 100μmol/L的Aβ1-42液+20μLPBS+20μL 20μmol/L的Th-T；
(3)空白孔：20μL样液(各浓度)+20μLPBS+20μL 20μmol/L的Th-T
(4)本底孔：20μL实验孔对应浓度的样品液+40μLPBS；
荧光抑制率(％)＝[阳性荧光－空白荧光－实验荧光/(阳性荧光－空白荧光)]×100％
表2
Figure BDA0003144380060000091
Figure BDA0003144380060000101
由表2可知，(1)美洲大蠊有效部位提取物本身在485nm处有荧光发射；(2)美洲大蠊有效部位提取物与硫黄素T几乎没有结合，即Aβ1-42和硫黄素T与美洲大蠊有效部位提取物间不存在竟争性结合；(3)美洲大蠊有效部位提取物对Aβ1-42单体的聚集具有抑制作用。
实施例6
MTT法测试实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物对Aβ1-42寡聚体引起PC-12细胞毒性的保护作用
(1)Aβ寡聚体制备：取1支冻存于-20℃的1mg装Aβ1-42冻干粉，加222μl冰上预冷的六氟异丙醇(HFIP)，密封，涡旋混匀后，室温静置60分钟，至液体澄清，得到Aβ-HFIP溶液(1mM)。冷冻干燥4小时，得Aβ1-42肽膜；向肽膜内加入45μL的DMSO，水浴超声(功率300W，频率35Hz)处理5分钟，得到Aβ-DMSO溶液。再向Aβ-DMSO液中加入预冷的2155μL的PH 6.6的磷酸缓冲液，涡旋混匀后，用高速冷冻离心机于4℃、13,000rpm离心10分钟后，吸取上清液，于4℃冰箱内孵育1周，得100μmol/L Aβ1-42寡聚体液。
(2)细胞培养与测试：取-80℃冻存的高分化型PC-12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞))，于水浴37℃下1分钟内溶解复苏处理，并用该细胞专用培养基液于37℃，含5％CO2培养箱中进行培养传代3次后，以密度为1.2×104个/孔接种于96孔板，于37℃，含5％CO2培养箱中培养24小时后，分别上样；
(3)样品配制：称取50mg实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物，用培养基液溶解完全，用0.22μm滤膜过滤除菌后，分别用培养基液稀释成实验终浓度为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL所需的对应浓度溶液；
MTT液配制：称取MTT 0.5克，溶于100mL的PH6.6的磷酸缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤除菌后，于4℃冰箱内放置避光保存备用。
(4)实验分组与上样：
①实验组:100μL细胞液+30μLAβ1-42液+20μL不同浓度样品液；
②对照组(1):100μL细胞液+30μLAβ1-42液+20μL培养基液；
③对照组(2):100μL细胞液+30μL培养基液+20μL样品液；
④对照组(3):100μL细胞液+30μL培养基液+20μL培养基液；
(5)测试方法：细胞种板后24h上样，各组及不同浓度样品均设置5个复孔，分别于上样后24h、48h、72h，以MTT法进行细胞存活率测试；
Figure BDA0003144380060000111
结果如表3所示。
表3
Figure BDA0003144380060000112
Figure BDA0003144380060000121
由表3可知，实验数据结果表明：①对照组(3)结果与对照组(2)结果比较，表明实施例1得到的美洲大蠊有效部位提取物在所测试浓度范围内对PC-12细胞几乎无毒性；②对照组(1)结果表明，Aβ1-42对PC-12细胞有较强毒性，且毒性不随时间的延长而碱弱，原因可能为实验开始前所制备的Aβ1-42寡聚体中未聚合的单体Aβ1-42随着时间延长而聚集成寡聚体，造成毒性不减的原因；③实验组结果表明，样品在所设浓度范围内均对Aβ1-42寡聚体的毒性具有一定的抑制作用，高浓度时在不同的时间点的抑制率均达90％以上，该结果表明其已具较好的Aβ1-42寡聚体毒性抑制作用。
实施例7
实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物对AD大鼠模型行为认知能力及脑胆碱能系统的影响
分组与给药：实验以60只体重在250g±20g的雄性大鼠为受试对象，随机分为六组，每组10只；即(1)正常对照组(生理盐水)；(2)AD模型组；(3)脑复康组(0.5g/kg)；(4)实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物低剂量组(0.5g/kg)；(5)实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物中剂量组(1.0g/kg)；(6)实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物高剂量组(1.5g/kg)。AD模型组和各试验药物组大鼠采用颈背部皮下注射1％的D-半乳糖(5mL/kg)，连续3周，先造成亚急性衰老，继改用腹腔注射东莨菪碱(2mg/kg)，连续2周，制得AD大鼠模型；正常对照组前3周于颈背部皮下注射1mL生理盐水，后2周给予腹腔注射1mL生理盐水；造模1周后，各组同时灌胃给药，其中正常对照组和AD模型组给予1mL的生理盐水，连续灌胃给药4周；
测试指标：(1)观察大鼠跳台实验的学习和记忆成绩；(2)测试各组大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乙酰胆碱(Ach)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱脂酶(AchE)几个生化指标变化；如表4、表5以及表6所示。
表4各组跳台实验的学习和记忆结果
Figure BDA0003144380060000131
Figure BDA0003144380060000132
表5各组大鼠脑组织内MDA含量及SOD与GSH-Px活力结果
Figure BDA0003144380060000133
Figure BDA0003144380060000134
Figure BDA0003144380060000141
表6各组大鼠脑组织Ach、ChAT和AchE含量比较
Figure BDA0003144380060000142
Figure BDA0003144380060000143
由表4-6可知，表明实施例1制备得到的美洲大蠊有效部位提取物，能有效改善AD模型大鼠的学习认知能力，同时可调节模型大鼠脑内胆碱能系统多个指标恢复，因此对预防或治疗阿尔茨海默病有一定的效果。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种美洲大蠊有效部位提取物在制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物中的应用，其特征在于，所述美洲大蠊有效部位提取物通过以下方法提取得到：
制备含有美洲大蠊有效部位提取物的美洲大蠊提取物悬浮液，所述制备为将美洲大蠊提取物溶解于去离子水中得到美洲大蠊提取物悬浮液；
将含有美洲大蠊有效部位提取物的美洲大蠊提取物悬浮液经大孔树脂进行层析6~12h；
对吸附完成后的大孔树脂先进行水洗，随后采用含水醇进行洗脱，同时收集含水醇洗脱液；
将含水醇洗脱液减压浓缩和干燥，得到美洲大蠊有效部位提取物，所述减压浓缩的温度为60~80℃；
所述大孔树脂为S-8型极性大孔吸附树脂，含水醇中醇的质量分数为38~45%；
其中，含有美洲大蠊有效部位提取物的美洲大蠊提取物悬浮液中美洲大蠊提取物的质量与大孔树脂的质量之比为1:8~1:12；
水洗过程中水的体积与装有大孔树脂的柱床体积比为1:1~3:1；含水醇的体积为装有大孔树脂的柱床体积比的2~3倍；
水洗过程中水的流速为1/60~1/100的装有大孔树脂的柱床体积/分钟，洗脱过程中醇的流速为1/60~1/100的装有大孔树脂的柱床体积/分钟。
2.一种防治阿尔茨海默病的药物组合物，其特征在于，该药物组合物为治疗有效量的权利要求1中所述的美洲大蠊有效部位提取物和可药用载体。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物的药物剂型是片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或注射剂。
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