CN111728984B - 一种脱脂美洲大蠊提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脱脂美洲大蠊提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)灭活粉碎；(2)脱脂；(3)提取；(4)减压浓缩；(5)脱脂过滤；(6)大孔吸附树脂柱层析；(7)减压浓缩。通过所述的制备方法制备的脱脂美洲大蠊提取物，有效去除了美洲大蠊中的油脂、多糖、大分子蛋白质等无效成分，富集了美洲大蠊中具有良好抗溃疡活性的多肽类成分，其中多肽类成分含量达到85％以上，并且得到的脱脂美洲大蠊提取物色泽浅、无腥臭味。

Description

一种脱脂美洲大蠊提取物的制备方法

技术领域

本发明属于中药材提取领域，具体涉及一种脱脂美洲大蠊提取物的制备方法。

背景技术

美洲大蠊(Periplaneta Americana Linnaeus)，俗名“蟑螂”，为蜚蠊科中体积最大的昆虫，成虫体长29-40毫米，红褐色，翅长于腹部末端。触角很长，前胸背板中间有较大的蝶形褐色斑纹，斑纹的后缘有完整的黄的带纹。美洲大蠊原产于南美洲，食性广泛，喜食糖和淀粉。

美洲大蠊是传统的中药材，首见于《本草纲目拾遗》，也称为石姜、滑虫，以成虫入药。性寒味咸，有毒，有辛辣味、有消瘀、消积、解毒、利水、消肿等功效。现代研究发现，美洲大蠊的有效成分具有保护肝脏修复、抗炎镇痛、抗肿瘤、提高免疫力等功效。美洲大蠊提取物中抗溃疡活性物质为多肽类成分，油脂不仅无防治消化性溃疡作用，还能加重溃疡程度，而且所得提取物色泽深、腥臭味重，使得部分患者在使用过程中有抵触情绪，因此，寻找一种多肽类活性成分含量高、无腥臭味的美洲大蠊提取物的制备工艺具有实在的价值意义。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于克服现有的美洲大蠊提取物所存在的缺陷，提供了一种脱脂美洲大蠊提取物的制备方法。通过所述的方法制备的脱脂美洲大蠊提取物，有效去除了美洲大蠊提取物中的油脂、多糖、大分子蛋白质等无效成分，富集了美洲大蠊提取物中具有良好抗溃疡活性的多肽类成分，其中多肽类成分含量达到85％以上；得到的提取物色泽浅、无腥臭味。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。一种脱脂美洲大蠊提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫经灭火、粉碎、过筛，制得美洲大蠊粗粉；

(2)脱脂：将步骤(1)所得美洲大蠊粗粉，经有机萃取剂亚临界萃取，得脱脂美洲大蠊；

(3)提取：将步骤(2)所得的脱脂美洲大蠊用水提取，得水提取液；

(4)减压浓缩：将步骤(3)所得水提取液减压浓缩，得浓缩液；

(5)脱脂过滤：将步骤(4)所得浓缩液加入水，进行脱脂过滤，得滤液。

(6)大孔吸附树脂柱层析：大孔吸附树脂进行预处理后，将步骤(5)所得滤液上样，依次用水和不同浓度乙醇洗脱，收集洗脱液；

(7)减压浓缩：将步骤(6)所得洗脱液减压浓缩得浸膏，即得脱脂美洲大蠊提取物。

其中，步骤(3)中所述提取的装置没有特殊限定，采用本领域中的常规提取装置即可；所述提取的温度优选为90℃～100℃；所述提取的次数优选为3次；所述提取的水优选去离子水、蒸馏水、纯化水和超纯水中的一种，本发明优选纯化水；所述提取的水的用量可为本领域内的常规用量；第一次提取时，加粗粉重量10～12倍量水；第二次提取时，加粗粉重量7～9倍量水；第三次提取时，加粗粉重量4～6倍量水；所述提取的时间为，第一次的提取时间为12～16小时；第二次的提取时间为8～11小时；第三次的提取时间为5～7小时；每次提取到的液相组分合并，得到提取液。使用水进行提取，相比于其他溶剂，成本低，而且安全。

其中，步骤(4)中所述减压浓缩可为本领域中常规减压浓缩方法，本发明中，减压浓缩的真空度优选小于-0.06MPa，浓缩的温度优选40℃～60℃，进行减压浓缩得浓缩液；优选将所述的提取液浓缩至相对密度为1.05～1.10时停止浓缩。减压浓缩可快速回收溶剂，减少浓缩时间，同时又不影响提取液中有效成分活性。

其中，步骤(5)中所述脱脂过滤的水的用量优选为浓缩液重量的3～10倍量水；所述的水优选去离子水、蒸馏水、纯化水和超纯水中的一种，本发明优选纯化水；所述的脱脂过滤为，加热升温至60℃～70℃下，搅拌10～30分钟，然后保温静置12小时，降温至10℃～20℃，继续静置24小时以上；静置后水层、油脂层和杂质固形物分离度好，易于过滤；将静置后的溶液分离、过滤，过滤孔径为5μm，得滤液。该脱脂方法脱脂率高、无其他溶剂混入，能够保持提取物活性。

其中，步骤(6)中所述大孔吸附树脂柱层析可参照本领域常规的树脂柱层析方法。大孔吸附树脂可将游离氨基酸、单糖及多肽类成分进行了较好的分离。本发明使用的大孔吸附树脂的预处理方法为：取适量大孔吸附树脂加2-3倍量的乙醇使之完全浸泡，放置24h，期间不断搅拌使之充分接触溶剂以便足够溶胀。湿法装柱，径高比为1：5.2，用95％的乙醇洗脱，流速为：2-3BV/h直至洗脱液与蒸馏水混合(洗脱液：水＝1:3)不再变浑浊为止，再用大量纯化水洗，直至无醇味，依次用五倍量2％-5％的HCl水溶液浸泡5h,纯化水洗至中性；再用五倍量2％-5％的NaOH水溶液浸泡5h，蒸馏水洗至中性，备用。所述大孔吸附树脂的型号可以包括D101、AB-8、860021或者HPD，本发明优选使用型号为AB-8的大孔吸附树脂；所述的大孔吸附树脂柱的径高比优选为1∶11，湿法装柱；所述用大孔吸附树脂的上样流速可为本领域内常规流速，优选为1～2BV/h，较优的为1BV/h；所述洗脱树脂的方法和条件可参照本领域常规树脂洗脱的方法和条件。本发明中所述的洗脱优选为依次用水和20～75％乙醇洗脱，较优的为依次用水、20％乙醇、50％乙醇、75％乙醇洗；所述洗脱流速优选为1～2BV/h，较优的为1BV/h；所述洗脱剂用量优选为6BV-10BV体积，较优的为纯化水用量为6BV体积，25％乙醇用量为10BV体积，50％乙醇用量为8BV体积，75％乙醇用量为7BV体积；所述的收集洗脱液优选为收集75％乙醇洗脱液，此时得到乙醇洗脱液多肽类成分含量最高，脱色效果最好。

其中，步骤(7)中，所述浸膏为在温度50℃～60℃的条件下减压浓缩至相对密度1.20～1.30的浸膏；所述脱脂美洲大蠊提取物中多肽类成分含量达到85％以上。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明所述工艺有效去除了脱脂美洲大蠊中的油脂、多糖、大分子蛋白质无效成分，富集了美洲大蠊中具有良好抗溃疡活性物质多肽类成分，其中多肽类成分含量达到85％以上。

2、采用本发明所述工艺制备的脱脂美洲大蠊提取物，可有效去除特殊腥臭气味的美洲大蠊油脂，生产得到的脱脂美洲大蠊提取物微呈淡黄色，无味。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

中国专利CN109820873A公开了脱脂美洲大蠊及其制备方法，在本发明中，以上发明公开的内容均被全文引入本文作为参考。

下述实施例中，多肽类成分含量的检测方法和条件如下：

参照2015版药典通则0731蛋白质含量测定法，依据多肽分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu²⁺形成紫红色络合物，在一定范围内其颜色深浅与多肽浓度呈正比，以牛血清蛋白对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定提取物中多肽类成分的含量。

1试剂及仪器

1.1试剂

1.2仪器

2方法

2.1双缩脲试剂：取硫酸铜1.5g、酒石酸钾钠6.0g和碘化钾5.0g，加水500ml使溶解，边搅拌边加入10％氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混匀，即得。

2.2制作对照品溶液标准曲线：精密量取牛血清蛋白0.1000g，置于10mL容量瓶中，用水稀释至刻度摇匀，即得对照品溶液。

精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置离心管中，各加水至1.0ml，分别加入双缩脲试液4.0ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法(中国药典现行版四部通则0401)，在540nm的波长处测定吸光度，生成标准曲线。

2.3供试品溶液：取实施例制备的脱脂美洲大蠊提取物浓缩液1mL，置于10mL容量瓶中，用水稀释至刻度线，摇匀，精密量取1mL置15mL离心管中，照2.2制作对照品溶液标准曲线项下的方法，自“分别加入双缩脲试液4.0mL”起，依法测定吸光度。根据所测吸光度，结合标准曲线，计算多肽含量。

实施例1：

1.灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用60℃高温杀死，净选，控温在60℃±5℃范围内烘干，粉碎，过12目筛，制得美洲大蠊粗粉；

2.脱脂：将步骤1所得美洲大蠊粗粉，装入滤筐中，投入亚临界萃取釜中，密闭萃取釜，加压至0.4MPa，将有机萃取剂(正丁烷)加压，使之常温下液化，将加压后的液态有机萃取剂加入亚临界萃取罐，调节料液比1：6～12(g/ml)，升温至亚临界萃取釜中有机萃取剂处于亚临界状态，减压回收溶剂，分别收集油脂和药渣，取药渣即得脱脂美洲大蠊；

3.提取：将步骤2所得的脱脂美洲大蠊加入提取罐中，用纯化水在温度95℃下提取3次，第一次提取时，加粗粉重量11倍量纯化水，提取时间为12小时；第二次提取时，加粗粉重量8倍量纯化水，提取时间为10小时；第三次提取时，加粗粉重量5倍量纯化水，提取时间为6小时；提取过程中，纯化水温度均保持在90℃，提取完成后，合并提取液，过300目筛网得水提取液；

4.减压浓缩：将步骤3所得纯化水提取液在真空度小于-0.06MPa,温度50℃的条件下减压浓缩至相对密度1.05～1.10(50℃测)时，得纯化水浓缩液；

5.脱脂过滤：将步骤4所得纯化水浓缩液加入纯化水浓缩液重量4倍量的纯化水，搅拌加热升温至65℃，搅拌25分钟，然后65℃保温静置12小时，降温至10℃，继续静置24小时以上，使油水分层，分离并弃去沉淀、油层，水层用板框过滤器5μm过滤，得滤液。

6.大孔吸附树脂柱柱层析：将AB-8树脂预处理，取取适量大孔吸附树脂加2-3倍量的乙醇使之完全浸泡，放置24h，期间不断搅拌使之充分接触溶剂以便足够溶胀。湿法装柱，径高比为1：5.2，用95％的乙醇洗脱，流速为：2-3BV/h直至洗脱液与蒸馏水混合(洗脱液：水＝1:3)不再变浑浊为止，再用大量纯化水洗，直至无醇味，依次用五倍量2％-5％的HCl水溶液浸泡5h,纯化水洗至中性；再用五倍量2％-5％的NaOH水溶液浸泡5h，蒸馏水洗至中性，备用；将预处理好的筛选出的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，径高比约(1:11)，将步骤5所得滤液上样，上样速度为1BV/h，依次采用6BV的纯化水、10BV的25％乙醇、8BV的50％乙醇、7BV的75％乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1BV/h,收集75％乙醇洗脱液；

7.减压回收乙醇：将步骤6所得75％乙醇洗脱液在真空度小于-0.06MPa条件下，温度50℃～60℃的条件下减压浓缩至相对密度1.20～1.30的浸膏，即得脱脂美洲大蠊提取物。

本实施例制备得到的脱脂美洲大蠊水提取物中含有90％以上的多肽类成分，性状为无味，微呈淡黄色。

实施例2

1.灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用60℃高温杀死，净选，控温在60℃±5℃范围内烘干，粉碎，过12目筛，制得美洲大蠊粗粉；

2脱脂：将步骤1所得美洲大蠊粗粉，装入滤筐中，投入亚临界萃取釜中，密闭萃取釜，加压至0.4MPa，将有机萃取剂(正丁烷)加压，使之常温下液化，将加压后的液态有机萃取剂加入亚临界萃取罐，调节料液比1：6～12(g/mL)，升温至亚临界萃取釜中有机萃取剂处于亚临界状态，减压回收溶剂，分别收集油脂和药渣，取药渣即得脱脂美洲大蠊；

3.提取：将步骤2所得的脱脂美洲大蠊加入提取罐中，用纯化水在温度100℃下提取3次，第一次提取时，加粗粉重量10倍量纯化水，提取时间为12小时；第二次提取时，加粗粉重量7倍量纯化水，提取时间为8小时；第三次提取时，加粗粉重量4倍量纯化水，提取时间为5小时；提取过程中，纯化水温度均保持在100℃，提取完成后，合并提取液，过300目筛网得水提取液；

4.减压浓缩：将步骤3所得纯化水提取液在真空度小于-0.06MPa,温度50℃的条件下减压浓缩至相对密度1.05～1.10时，得纯化水浓缩液；

5.脱脂过滤：将步骤4所得纯化水浓缩液加入纯化水浓缩液重量5倍量的纯化水，搅拌加热升温至65℃，搅拌15分钟，然后65℃保温静置12小时，降温至12℃，继续静置24小时以上，使油水分层，分离并弃去沉淀、油层，水层用板框过滤器5μm过滤，得滤液。

6.大孔吸附树脂柱柱层析：将AB-8树脂预处理，取取适量大孔吸附树脂加2-3倍量的乙醇使之完全浸泡，放置24h，期间不断搅拌使之充分接触溶剂以便足够溶胀。湿法装柱，径高比为1：5.2，用95％的乙醇洗脱，流速为：2-3BV/h直至洗脱液与蒸馏水混合(洗脱液：水＝1:3)不再变浑浊为止，再用大量纯化水洗，直至无醇味，依次用五倍量2％-5％的HCl水溶液浸泡5h,纯化水洗至中性；再用五倍量2％-5％的NaOH水溶液浸泡5h，蒸馏水洗至中性，备用；将预处理好的筛选出的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，径高比约(1:11)，将步骤5所得滤液上样，上样速度为1BV/h，依次采用6BV的纯化水、10BV的25％乙醇、8BV的50％乙醇、7BV的75％乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1BV/h,收集75％乙醇洗脱液；

7.减压回收乙醇：将步骤6所得75％乙醇洗脱液在真空度小于-0.06MPa条件下,温度50℃～60℃的条件下减压浓缩至相对密度1.20～1.30的浸膏，即得脱脂美洲大蠊提取物。

本实施例制备得到的脱脂美洲大蠊水提取物中含有85％以上的多肽类成分，性状为无味，微呈淡黄色。

实施例3

1.灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用60℃高温杀死，净选，控温在60℃±5℃范围内烘干，粉碎，过12目筛，制得美洲大蠊粗粉；

2.脱脂：将步骤1所得美洲大蠊粗粉，装入滤筐中，投入亚临界萃取釜中，密闭萃取釜，加压至0.4MPa，将有机萃取剂(正丁烷)加压，使之常温下液化，将加压后的液态有机萃取剂加入亚临界萃取罐，调节料液比1：6～12(g/ml)，升温至亚临界萃取釜中有机萃取剂处于亚临界状态，减压回收溶剂，分别收集油脂和药渣，取药渣即得脱脂美洲大蠊；

3.提取：将步骤2所得的脱脂美洲大蠊加入提取罐中，用纯化水在温度95℃下提取3次，第一次提取时，加粗粉重量11倍量纯化水，提取时间为13小时；第二次提取时，加粗粉重量8倍量纯化水，提取时间为9小时；第三次提取时，加粗粉重量6倍量纯化水，提取时间为6小时；提取过程中，纯化水温度均保持在100℃，提取完成后，合并提取液，过300目筛网得水提取液；

4.减压浓缩：将步骤3所得纯化水提取液在真空度小于-0.06MPa,温度40℃的条件下减压浓缩至相对密度1.05～1.10时，得纯化水浓缩液；

5.脱脂过滤：将步骤4所得纯化水浓缩液加入纯化水浓缩液重量3～10倍量的纯化水，搅拌加热升温至70℃，搅拌20分钟，然后70℃保温静置12小时，降温至18℃，继续静置24小时以上，使油水分层，分离并弃去沉淀、油层，水层用板框过滤器5μm过滤，得滤液。

6.大孔吸附树脂柱柱层析：将AB-8树脂预处理，取取适量大孔吸附树脂加2-3倍量的乙醇使之完全浸泡，放置24h，期间不断搅拌使之充分接触溶剂以便足够溶胀。湿法装柱，径高比为1：5.2，用95％的乙醇洗脱，流速为：2-3BV/h直至洗脱液与蒸馏水混合(洗脱液：水＝1:3)不再变浑浊为止，再用大量纯化水洗，直至无醇味，依次用五倍量2％-5％的HCl水溶液浸泡5h,纯化水洗至中性；再用五倍量2％-5％的NaOH水溶液浸泡5h，蒸馏水洗至中性，备用；将预处理好的筛选出的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，径高比约(1:11)，将步骤5所得滤液上样，上样速度为1BV/h，依次采用6BV的纯化水、10BV的25％乙醇、8BV的50％乙醇、7BV的75％乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1BV/h,收集75％乙醇洗脱液；

7.减压回收乙醇：将步骤6所得75％乙醇洗脱液在真空度小于-0.06MPa条件下，温度50℃～60℃的条件下减压浓缩至相对密度1.20～1.30的浸膏，即得脱脂美洲大蠊提取物。

本实施例制备得到的脱脂美洲大蠊水提取物中含有87％以上的多肽类成分，性状为无味，微呈淡黄色。

实施例4

1.灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用60℃高温杀死，净选，控温在60℃±5℃范围内烘干，粉碎，过12目筛，制得美洲大蠊粗粉；

2.脱脂：将步骤1所得美洲大蠊粗粉，装入滤筐中，投入亚临界萃取釜中，密闭萃取釜，加压至0.4MPa，将有机萃取剂(正丁烷)加压，使之常温下液化，将加压后的液态有机萃取剂加入亚临界萃取罐，调节料液比1：6～12(g/mL)，升温至亚临界萃取釜中有机萃取剂处于亚临界状态，减压回收溶剂，分别收集油脂和药渣，取药渣即得脱脂美洲大蠊；

3.提取：将步骤2所得的脱脂美洲大蠊加入提取罐中，用纯化水在温度100℃下提取3次，第一次提取时，加粗粉重量12倍量纯化水，提取时间为14小时；第二次提取时，加粗粉重量9倍量纯化水，提取时间为11小时；第三次提取时，加粗粉重量6倍量纯化水，提取时间为7小时；提取过程中，纯化水温度均保持在100℃，提取完成后，合并提取液，过300目筛网得水提取液；

4.减压浓缩：将步骤3所得纯化水提取液在真空度小于-0.06MPa,温度60℃的条件下减压浓缩至相对密度1.05～1.10时，得纯化水浓缩液；

5.脱脂过滤：将步骤4所得纯化水浓缩液加入纯化水浓缩液重量9倍量的纯化水，搅拌加热升温至68℃，搅拌25分钟，然后68℃保温静置12小时，降温至16℃，继续静置24小时以上，使油水分层，分离并弃去沉淀、油层，水层用板框过滤器5μm过滤，得滤液。

6.大孔吸附树脂柱柱层析：将AB-8树脂预处理，取取适量大孔吸附树脂加2-3倍量的乙醇使之完全浸泡，放置24h，期间不断搅拌使之充分接触溶剂以便足够溶胀。湿法装柱，径高比为1：5.2，用95％的乙醇洗脱，流速为：2-3BV/h直至洗脱液与蒸馏水混合(洗脱液：水＝1:3)不再变浑浊为止，再用大量纯化水洗，直至无醇味，依次用五倍量2％-5％的HCl水溶液浸泡5h,纯化水洗至中性；再用五倍量2％-5％的NaOH水溶液浸泡5h，蒸馏水洗至中性，备用；将预处理好的筛选出的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，径高比约(1:11)，将步骤5所得滤液上样，上样速度为1BV/h，依次采用6BV的纯化水、10BV的25％乙醇、8BV的50％乙醇、7BV的75％乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1BV/h,收集75％乙醇洗脱液；

7.减压回收乙醇：将步骤6所得75％乙醇洗脱液在真空度小于-0.06MPa条件下，温度50℃～60℃的条件下减压浓缩至相对密度1.20～1.30的浸膏，即得脱脂美洲大蠊提取物。

本实施例制备得到的脱脂美洲大蠊水提取物中含有89％以上的多肽类成分，性状为无味，微呈淡黄色。

实施例5

1.灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用60℃高温杀死，净选，控温在60℃±5℃范围内烘干，粉碎，过12目筛，制得美洲大蠊粗粉；

2.脱脂：将步骤1所得美洲大蠊粗粉，装入滤筐中，投入亚临界萃取釜中，密闭萃取釜，加压至0.4MPa，将有机萃取剂(正丁烷)加压，使之常温下液化，将加压后的液态有机萃取剂加入亚临界萃取罐，调节料液比1：6～12(g/mL)，升温至亚临界萃取釜中有机萃取剂处于亚临界状态，减压回收溶剂，分别收集油脂和药渣，取药渣即得脱脂美洲大蠊；

3.提取：将步骤2所得的脱脂美洲大蠊加入提取罐中，用纯化水在温度98℃下提取3次，第一次提取时，加粗粉重量11倍量纯化水，提取时间为16小时；第二次提取时，加粗粉重量7倍量纯化水，提取时间为10小时；第三次提取时，加粗粉重量4倍量纯化水，提取时间为5小时；提取过程中，纯化水温度均保持在98℃，提取完成后，合并提取液，过300目筛网得水提取液；

4.减压浓缩：将步骤3所得纯化水提取液在真空度小于-0.06MPa,温度55℃的条件下减压浓缩至相对密度1.05～1.10时，得纯化水浓缩液；

5.脱脂过滤：将步骤4所得纯化水浓缩液加入纯化水浓缩液重量7倍量的纯化水，搅拌加热升温至65℃，搅拌30分钟，然后65℃保温静置12小时，降温至10℃，继续静置24小时以上，使油水分层，分离并弃去沉淀、油层，水层用板框过滤器5μm过滤，得滤液。

6.大孔吸附树脂柱柱层析：将AB-8树脂预处理，取取适量大孔吸附树脂加2-3倍量的乙醇使之完全浸泡，放置24h，期间不断搅拌使之充分接触溶剂以便足够溶胀。湿法装柱，径高比为1：5.2，用95％的乙醇洗脱，流速为：2-3BV/h直至洗脱液与蒸馏水混合(洗脱液：水＝1:3)不再变浑浊为止，再用大量纯化水洗，直至无醇味，依次用五倍量2％-5％的HCl水溶液浸泡5h,纯化水洗至中性；再用五倍量2％-5％的NaOH水溶液浸泡5h，蒸馏水洗至中性，备用；将预处理好的筛选出的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，径高比约(1:11)，将步骤5所得滤液上样，上样速度为1BV/h，依次采用6BV的纯化水、10BV的25％乙醇、8BV的50％乙醇、7BV的75％乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1BV/h,收集75％乙醇洗脱液；

7.减压回收乙醇：将步骤6所得75％乙醇洗脱液在真空度小于-0.06MPa条件下，温度50℃～60℃的条件下减压浓缩至相对密度1.20～1.30的浸膏，即得脱脂美洲大蠊提取物。

本实施例制备得到的脱脂美洲大蠊水提取物中含有91％以上的多肽类成分，性状为无味，微呈淡黄色。

Claims (2)

1.一种脱脂美洲大蠊提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫经灭活、粉碎、过筛，制得美洲大蠊粗粉；

(2)脱脂：将步骤(1)所得美洲大蠊粗粉，经有机萃取剂亚临界萃取，得脱脂美洲大蠊；

(3)提取：将步骤(2)所得的脱脂美洲大蠊用水在98℃下提取三次，第一次提取时加所述脱脂美洲大蠊粗粉重量11倍量的水，提取时间为16h，第二次提取时加所述脱脂美洲大蠊粗粉重量7倍量的水，提取时间为10h，第三次提取时加所述脱脂美洲大蠊粗粉重量4倍量的水，提取时间为5h，合并三次提取液，得水提取液；

(4)减压浓缩：将步骤(3)所得水提取液减压浓缩，真空度小于-0.06MPa，浓缩温度为55℃，浓缩至相对密度为1.05～1.10时停止浓缩，得浓缩液；

(5)脱脂过滤：将步骤(4)所得浓缩液加入所述浓缩液重量7倍量的水，升温至65℃并搅拌30分钟，在65℃下保温静置12h，降温至10℃，继续静置24小时以上，使油水分层，分离并弃去沉淀、油层，水层用板框过滤器5μm过滤，得滤液；

(6)大孔吸附树脂柱层析：大孔吸附树脂进行预处理后，将步骤(5)所得滤液上样，依次用水和不同浓度乙醇洗脱，收集洗脱液；

所述大孔吸附树脂的型号为AB-8的大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂柱的径高比为1∶11，湿法装柱；所述大孔吸附树脂的上样流速为1BV/h；所述的洗脱为依次用6BV的纯化水、10BV的25％乙醇、8BV的50％乙醇、7BV的75％乙醇洗脱，所述的洗脱流速为1BV/h；所述收集洗脱液为收集75％乙醇洗脱液；

(7)减压浓缩：将步骤(6)所得洗脱液在真空度小于-0.06MPa条件下，温度50℃～60℃的条件下减压浓缩至相对密度1.20～1.30的浸膏，即得脱脂美洲大蠊提取物。

2.根据权利要求1所述的脱脂美洲大蠊提取物的制备方法，其特征在于，所述脱脂美洲大蠊提取物中多肽类成分含量达到91％以上。