CN110680802A - 汉防己甲素注射液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种汉防己甲素注射液的原料配比与制备方法，原料包括汉防已甲素15.0g，半胱氨酸0.5g，焦亚硫酸钠0.5g，氯化钠5.0g，稀盐酸适量，EDTA－2Na 0.3g，活性炭0.02%（g/ml），注射用水适量，制成1000ml；汉防己甲素注射液制备方法包括浓配、稀配和过滤工艺。此工艺制得的汉防已甲素注射剂因汉防己甲素高纯度，且半胱氨酸与焦亚硫酸钠混配溶液联合使用，不仅减少了焦亚硫酸钠带来的危险，而且减少了注射时产生的疼痛感；能够减轻患者注射疼痛感，患者顺应性好。

Description

汉防己甲素注射液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种医药配制品及其制备方法，具体地说是汉防已甲素注射剂及其制备方法。
背景技术
目前上市销售的有汉防已甲素糖衣片和薄膜衣片，临床用于风湿痛、关节 痛、神经痛，与小剂量放射合并用于肺癌；亦用于单纯硅肺I、II、III期及 各期煤硅肺。汉防已甲素不溶于水、无臭，味微甜。汉防已甲素片崩解时间长，溶出度和溶出速率低，辅料用量比例大，儿童、老年人、卧床病人和吞咽困难患者服用不方便，依从性差，影响了汉防已甲素治疗作用的发挥。汉防己甲素是从中药防己中提取分离而出的一种生物碱。近年来的药理研究表明汉防己甲素具有抗心肌缺血、抗心率失常、降压、抗炎、抗矽肺、 抗癌及镇痛等作用，目前以之为原料生产的注射液、粉针、片剂已广泛用于临床。但汉防己甲素作为药用时，尤其是作为注射液使用时，必须具有较高的纯度，一般要求达到99％以上，并且不能含有苯、氯仿等其它杂质，这就使得高纯度汉防己甲素原料非常紧俏，远远不能满足制剂生产需要。
如申请号为CN200610046438.9公开了一种不含苯的汉防己甲素及其制备方法，将80～95%乙醇溶剂与原料以重量比为1∶2～4进行回流提取，提取温度80～95℃，提取次数2～3，每次2～4小时；将乙醇提取液减压回收溶剂得浓缩干膏；用原料1/3至2倍重量的0.5～5%酸水溶解浓缩干膏至沉淀完全；过滤，滤液加入氨水调至PH=8～10；向上述液体中加入是其体积1/5至等体积氯仿萃取2～5次，合并提取液，回收氯仿得浓缩物；用原料量1%至2倍量的丙酮溶解浓缩物，过滤，放置0.1～6小时析出结晶物，即得纯度≥80%汉防己甲素；重复上述操作，重结晶一次，可得纯度≥90%汉防己甲素；再次重结晶，可得纯度≥95～99%汉防己甲素。该方法选择加入其体积1/5至等体积氯仿萃取2～5次，再用1%至2倍量的丙酮溶解回收，这些有机溶剂一旦没有去除干净，就会存在威胁人体健康的风险。
如申请号为CN201610032546.4公开了一种汉防己甲素提取物及其制备方法和应用，先用水浸泡，加乙醇提取，过滤得到滤渣和第一滤液；滤渣中加入水加入纤维素酶提取，过滤，得到第二滤液；第一滤液与第二滤液混合，得到混合液，将混合液烘干，得到糖浆状物。虽然该方法步骤简便，易于操作，但是汉防己甲素的提取收率达0.8％以上，纯度达95％以上，无法达到临床应用要求。
而目前，成熟应用于大规模工业化生产制备汉防己总生物碱的方法仍以溶剂萃取为主，主要步骤包括原药材粉粹后经醇提、浓缩、调酸、氯仿脱脂、调碱、氯仿、苯等有机溶剂萃取、活性炭脱色、过滤、乙醚、苯、丙酮等重结晶、回收溶剂等步骤分离得到粗总碱。这些有机溶剂不仅增加了生产过程的环境污染，而且存在危害人体健康的风险。常规的离子交换树脂，需要在每个工艺流程完成后均需用酸碱反复处理，使其再生后，才能用于下一个使用周期，会带来工艺操作的复杂，特别是大量含酸、含碱废水的产生，使得树脂的优势有所丧失。更为重要的是，由于离子交换树脂结构特点的限制，如聚苯乙烯的强疏水性骨架、功能基含量较低、树脂比表面积较小等，都会带来树脂处理量的降低和吸附选择性的变差，所以，在经过树脂提取后，得到汉防己粗碱，仍需丙酮、冷苯等萃取、重结晶，才能得到高纯度的汉防己总生物碱。
汉防已甲素作为药品原料的管理规定，需要满足纯度为98%的要求，但是在汉防已甲素作为注射剂剂型存在的时候，根据少数患者的描述，在注射时候有一定的疼痛感。一般来说，非常纯净的药品在做毒副作用实验的时候，都有较好的合规性，但是汉防已甲素原料中含有的2%的杂质含量是引起注射时疼痛的潜在的关键因素，容易引发患者的恐惧感和抗拒感，患者顺应性很差。随着国内医疗水平和医疗质量的提升，有必要提升汉防己甲素注射液药品质量和照顾患者的感受度。
本发明能提高汉防己甲素的纯度，达到降低疼痛感、增强抗氧耐受力的效果，而且稳定性得到提高，抗溶血和凝聚效果加强，提高了提高药品的安全性。
发明内容
发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种汉防己甲素注射液及其制备方法，降低汉防己甲素的杂质含量，使汉防己甲素的纯度提高到99%以上，另一目的在于提供一种汉防己提取方法及分离方法，使分离操作不需要酸碱反复处理，经树脂分离后不再需溶剂萃取就能得到，并且达到降低疼痛感、增强抗氧耐受力的效果，而且稳定性得到提高，抗溶血和凝聚加强，提高药品的安全性。
一种汉防己甲素注射液的制备方法，其中，由下列原料药提取制备而成：汉防已甲素15.0g，半胱氨酸0.5g，焦亚硫酸钠0.5g，氯化钠5.0g，稀盐酸水溶液适量，EDTA－2Na0.3g，活性炭0.02%（g/ml），注射用水适量，制成1000ml；
汉防己甲素注射液制备方法为：
（一）浓配：在60℃下在浓配罐中加入20%配制量注射用水，加稀盐酸水溶液适量，搅拌均匀，加入配制量的汉防已甲素，边加边搅拌使之完全溶解；在稀配罐中加入50%配制量注射用水并保持在60℃，加入配制量的半胱氨酸、焦亚硫酸钠、氯化钠、EDTA－2Na，边加边搅拌使之完全溶解；并搅拌均匀；
（二）稀配：把浓配罐中的溶液用泵打到稀配罐中，在稀配罐中加入注射用水至配制量，搅拌均匀，加活性炭0.02%（g/ml），搅拌均匀，60℃保温15分钟；
（三）过滤：打小循环15分钟，药液经钛棒过滤器脱炭；打大循环30分钟，药液经钛棒过滤器、0.45μm精密过滤器、0.22μm除菌过滤器过滤，加入pH值调节剂适量，调节pH值至3.5～5.0；药液经0.22μm 的微孔滤芯精滤至药液澄清，药液过滤时钛棒过滤器前后的压差为0.01～0.02MPa 之间、0.45μm精密过滤器前后的压差为0.01～0.02MPa之间、0.22μm除菌过滤器前后的压差为0.01～0.02MPa之间；灌装，灭菌，即得。
上述汉防己甲素注射剂的制备方法中，汉防己甲素的提取方法如下：
（1）浸泡酶解：汉己粉粉碎过筛40～60目筛，得汉己粉末，先用重量为汉己粉末0.5～1倍量的0.1～2%的氨水溶液进行溶胀，溶胀时间为1～3h，然后添加酶制剂的水溶液作为酶提取液，所述酶制剂的添加量为汉己粉末重量的0.5‰～3‰，加入pH值调节剂适量，调节pH值在4.0～4.5之间，酶解时间为1～2小时，酶解温度为25～40℃；
（2）一次提取：将经步骤(1)处理后的物料按一定料液比加入70%～90%甲醇，料液比为1∶6～8（kg/L）；提取完全后，过滤，收集滤液1，得残渣；
（3）二次提取：将残渣放入匀浆机中, 加入残渣量0.2～0.5倍量的醋酸乙酯：乙醇1:2溶液, 匀浆2～5min之后过滤, 收集滤液2，合并滤液1和滤液2，得混合液；
(4)过滤：将混合液溶于质量分数为70％～80％的甲醇中，在室温20～25℃冷浸48～72小时后，取上清液经过超滤截留分子量，温度控制在40～60℃，压力控制在0.6～2.2MPa，得滤液3；
（5）浓缩：将滤液3蒸发浓缩至体积比的20%～50%，得浓缩液A；
（6）吸附富集：将浓缩液A用pH值调节剂调节pH值为4～6，用填料为ODS-C 18反向硅胶与XAD-16N填料2:3 的混合物进行吸附，吸附完成后进行解析，先以水洗除杂，再以甲醇：二氯甲烷20～10:3～8溶液洗脱，洗脱速度为4ml/min，收集洗脱液，得分离液B；
（7）高效液相色谱分离：将分离液B上制备型高效液相色谱硅胶柱，所用色谱柱为SuplexTM pKb 100，有机相为甲醇 ：乙醚 ：0.1%三乙胺 (75∶8∶17 )溶液，水相为10～20mmol/L的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的比例为30～80∶70～20，洗脱速度为1～3ml/min，根据的汉防己甲素检测图谱相应谱带收集溶液C；收集浓缩至干，得高纯度汉防己甲素。
上述汉防己甲素注射液的制备方法和汉防己甲素的提取方法中，pH值调节剂为10%氢氧化钠水溶液、10%盐酸水溶液，需要10%氢氧化钠水溶液调节为碱性或中性、10%盐酸水溶液调节为酸性或中性。
上述汉防己甲素的提取方法，其中：所述的酶制剂为果胶酶与纤维素酶、半纤维素酶的重量比例为1～3∶2∶0.5。
上述汉防己甲素的提取方法，其中：步骤（6）洗脱时，先用pH值调节剂至pH值为4～6酸性条件下进行甲醇：二氯甲烷体积比为10:8溶液洗脱，再用pH值调节剂至中性条件下进行甲醇：二氯甲烷体积比为20:3溶液洗脱。
用本发明方法制备的高纯度汉防己甲素和半胱氨酸与焦亚硫酸钠混配溶液联合使用，不仅减少了焦亚硫酸钠带来的危险，而且减少了注射时产生的疼痛感；增强抗氧耐受力的效果，而且稳定性得到提高，抗溶血和凝聚加强，提高药品的安全性，患者顺应性好，且本发明方法提取的汉防己甲素的纯度提高到99%以上。
本发明通过对汉防己浸泡酶解，破坏其细胞壁，再配以二次提取，使提取率增加，再用硅胶色谱柱、高效液相色谱柱联用分离，使汉防己甲素的纯度提高到99%以上，且不需再后续有机溶剂萃取。
本发明提供的汉防己甲素提取物的制备方法，提取过程，操作简便，所用时间短，有利于缩短生产周期。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：
汉防己甲素的提取方法如下：
（1）浸泡酶解：汉己粉粉碎过筛40目筛，得汉己粉末，先用重量为汉己粉末0.5倍量的0.1%的氨水溶液进行溶胀，溶胀时间为1h，然后添加酶制剂的水溶液作为酶提取液，所述酶制剂的添加量为汉己粉末重量的0.5‰，加入pH值调节剂适量，调节pH值在4.0，酶解时间为1小时，酶解温度为25℃；
（2）一次提取：将经步骤(1)处理后的物料按一定料液比加入70%甲醇，料液比为1∶6（kg/L）；提取完全后，过滤，收集滤液1，得残渣；
（3）二次提取：将残渣放入匀浆机中, 加入残渣量0.2倍量的醋酸乙酯：乙醇1:2溶液,匀浆2min之后过滤, 收集滤液2，合并滤液1和滤液2，得混合液；
(4)过滤：将混合液溶于质量分数为70％的甲醇中，在室温20℃冷浸48小时后，取上清液经过超滤截留分子量，温度控制在40℃，压力控制在0.6MPa，得滤液3；
（5）浓缩：将滤液3蒸发浓缩至体积比的20%，得浓缩液A；
（6）吸附富集：将浓缩液A用pH值调节剂调节pH值为4，用填料为ODS-C 18反向硅胶与XAD-16N填料2:3 的混合物进行吸附，吸附完成后进行解析，先以水洗除杂，再以甲醇：二氯甲烷20:3溶液洗脱，洗脱速度为4ml/min，收集洗脱液，得分离液B；
（7）高效液相色谱分离：将分离液B上制备型高效液相色谱硅胶柱，所用色谱柱为SuplexTM pKb 100，有机相为甲醇 ：乙醚 ：0.1%三乙胺 (75∶8∶17 )溶液，水相为10mmol/L的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的比例为30∶70，洗脱速度为1ml/min，根据的汉防己甲素检测图谱相应谱带收集溶液C；收集浓缩至干，得高纯度汉防己甲素。
汉防己甲素的提取方法，其中：所述的酶制剂为果胶酶与纤维素酶、半纤维素酶的重量比例为1∶2∶0.5。
pH值调节剂为10%氢氧化钠水溶液、10%盐酸水溶液。
汉防己甲素注射液的制备方法，由下列原料药提取制备而成：上述汉防已甲素15.0g，半胱氨酸0.5g，焦亚硫酸钠0.5g，氯化钠5.0g，稀盐酸水溶液适量，EDTA－2Na0.3g，活性炭0.02%（g/ml），注射用水适量，制成1000ml；
汉防己甲素注射液制备方法为：
（一）浓配：在60℃下在浓配罐中加入20%配制量注射用水，加稀盐酸水溶液适量，搅拌均匀，加入配制量的汉防已甲素，边加边搅拌使之完全溶解；在稀配罐中加入50%配制量注射用水并保持在60℃，加入配制量的半胱氨酸、焦亚硫酸钠、氯化钠、EDTA－2Na，边加边搅拌使之完全溶解；并搅拌均匀；
（二）稀配：把浓配罐中的溶液用泵打到稀配罐中，在稀配罐中加入注射用水至配制量，搅拌均匀，加活性炭0.02%（g/ml），搅拌均匀，60℃保温15分钟；
（三）过滤：打小循环15分钟，药液经钛棒过滤器脱炭；打大循环30分钟，药液经钛棒过滤器、0.45μm精密过滤器、0.22μm除菌过滤器过滤，加入pH值调节剂适量，调节pH值3.5；药液经0.22μm 的微孔滤芯精滤至药液澄清，药液过滤时钛棒过滤器前后的压差为0.01MPa、0.45μm精密过滤器前后的压差为0.01MPa、0.22μm除菌过滤器前后的压差为0.01MPa；灌装，灭菌，即得。
实施例2：
汉防己甲素的提取方法如下：
（1）浸泡酶解：汉己粉粉碎过筛50目筛，得汉己粉末，先用重量为汉己粉末0.7倍量的1%的氨水溶液进行溶胀，溶胀时间为2h，然后添加酶制剂的水溶液作为酶提取液，所述酶制剂的添加量为汉己粉末重量的1.5‰，加入pH值调节剂适量，调节pH值在4.3，酶解时间为1.5小时，酶解温度为30℃；
（2）一次提取：将经步骤(1)处理后的物料按一定料液比加入80%甲醇，料液比为1∶7（kg/L）；提取完全后，过滤，收集滤液1，得残渣；
（3）二次提取：将残渣放入匀浆机中, 加入残渣量0.4倍量的醋酸乙酯：乙醇1:2溶液,匀浆4min之后过滤, 收集滤液2，合并滤液1和滤液2，得混合液；
(4)过滤：将混合液溶于质量分数为75％的甲醇中，在室温23℃冷浸60小时后，取上清液经过超滤截留分子量，温度控制在50℃，压力控制在1.5MPa，得滤液3；
（5）浓缩：将滤液3蒸发浓缩至体积比的35%，得浓缩液A；
（6）吸附富集：将浓缩液A用pH值调节剂调节pH值为5，用填料为ODS-C 18反向硅胶与XAD-16N填料2:3 的混合物进行吸附，吸附完成后进行解析，先以水洗除杂，再以甲醇：二氯甲烷15:5溶液洗脱，洗脱速度为4ml/min，收集洗脱液，得分离液B；
（7）高效液相色谱分离：将分离液B上制备型高效液相色谱硅胶柱，所用色谱柱为SuplexTM pKb 100，有机相为甲醇 ：乙醚 ：0.1%三乙胺 (75∶8∶17 )溶液，水相为15mmol/L的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的比例为50∶40，洗脱速度为2ml/min，根据的汉防己甲素检测图谱相应谱带收集溶液C；收集浓缩至干，得高纯度汉防己甲素。
汉防己甲素的提取方法，其中：所述的酶制剂为果胶酶与纤维素酶、半纤维素酶的重量比例为2∶2∶0.5。
pH值调节剂为10%氢氧化钠水溶液、10%盐酸水溶液。
汉防己甲素注射液的制备方法，由下列原料药提取制备而成：上述汉防已甲素15.0g，半胱氨酸0.5g，焦亚硫酸钠0.5g，氯化钠5.0g，稀盐酸水溶液适量，EDTA－2Na0.3g，活性炭0.02%（g/ml），注射用水适量，制成1000ml；
汉防己甲素注射液制备方法为：
（一）浓配：在60℃下在浓配罐中加入20%配制量注射用水，加稀盐酸水溶液适量，搅拌均匀，加入配制量的汉防已甲素，边加边搅拌使之完全溶解；在稀配罐中加入50%配制量注射用水并保持在60℃，加入配制量的半胱氨酸、焦亚硫酸钠、氯化钠、EDTA－2Na，边加边搅拌使之完全溶解；并搅拌均匀；
（二）稀配：把浓配罐中的溶液用泵打到稀配罐中，在稀配罐中加入注射用水至配制量，搅拌均匀，加活性炭0.02%（g/ml），搅拌均匀，60℃保温15分钟；
（三）过滤：打小循环15分钟，药液经钛棒过滤器脱炭；打大循环30分钟，药液经钛棒过滤器、0.45μm精密过滤器、0.22μm除菌过滤器过滤，加入pH值调节剂适量，调节pH值4.0；药液经0.22μm 的微孔滤芯精滤至药液澄清，药液过滤时钛棒过滤器前后的压差为0.015MPa、0.45μm精密过滤器前后的压差为0.015MPa、0.22μm除菌过滤器前后的压差为0.015MPa；灌装，灭菌，即得。
实施例3：汉防己甲素的提取方法如下：
（1）浸泡酶解：汉己粉粉碎过筛60目筛，得汉己粉末，先用重量为汉己粉末1倍量的2%的氨水溶液进行溶胀，溶胀时间为3h，然后添加酶制剂的水溶液作为酶提取液，所述酶制剂的添加量为汉己粉末重量的3‰，加入pH值调节剂适量，调节pH值在4.5，酶解时间为2小时，酶解温度为40℃；
（2）一次提取：将经步骤(1)处理后的物料按一定料液比加入90%甲醇，料液比为1∶8（kg/L）；提取完全后，过滤，收集滤液1，得残渣；
（3）二次提取：将残渣放入匀浆机中, 加入残渣量0.5倍量的醋酸乙酯：乙醇1:2溶液,匀浆5min之后过滤, 收集滤液2，合并滤液1和滤液2，得混合液；
(4)过滤：将混合液溶于质量分数为80％的甲醇中，在室温25℃冷浸72小时后，取上清液经过超滤截留分子量，温度控制在60℃，压力控制在2.2MPa，得滤液3；
（5）浓缩：将滤液3蒸发浓缩至体积比的50%，得浓缩液A；
（6）吸附富集：将浓缩液A用pH值调节剂调节pH值为6，用填料为ODS-C 18反向硅胶与XAD-16N填料2:3 的混合物进行吸附，吸附完成后进行解析，先以水洗除杂，再以甲醇：二氯甲烷10:8溶液洗脱，洗脱速度为4ml/min，收集洗脱液，得分离液B；
（7）高效液相色谱分离：将分离液B上制备型高效液相色谱硅胶柱，所用色谱柱为SuplexTM pKb 100，有机相为甲醇 ：乙醚 ：0.1%三乙胺 (75∶8∶17 )溶液，水相为20mmol/L的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的比例为80∶20，洗脱速度为3ml/min，根据的汉防己甲素检测图谱相应谱带收集溶液C；收集浓缩至干，得高纯度汉防己甲素。
汉防己甲素的提取方法，其中：所述的酶制剂为果胶酶与纤维素酶、半纤维素酶的重量比例为3∶2∶0.5。
pH值调节剂为10%氢氧化钠水溶液、10%盐酸水溶液。
汉防己甲素注射液的制备方法，由下列原料药提取制备而成：上述汉防已甲素15.0g，半胱氨酸0.5g，焦亚硫酸钠0.5g，氯化钠5.0g，稀盐酸水溶液适量，EDTA－2Na0.3g，活性炭0.02%（g/ml），注射用水适量，制成1000ml；
汉防己甲素注射液制备方法为：
（一）浓配：在60℃下在浓配罐中加入20%配制量注射用水，加稀盐酸水溶液适量，搅拌均匀，加入配制量的汉防已甲素，边加边搅拌使之完全溶解；在稀配罐中加入50%配制量注射用水并保持在60℃，加入配制量的半胱氨酸、焦亚硫酸钠、氯化钠、EDTA－2Na，边加边搅拌使之完全溶解；并搅拌均匀；
（二）稀配：把浓配罐中的溶液用泵打到稀配罐中，在稀配罐中加入注射用水至配制量，搅拌均匀，加活性炭0.02%（g/ml），搅拌均匀，60℃保温15分钟；
（三）过滤：打小循环15分钟，药液经钛棒过滤器脱炭；打大循环30分钟，药液经钛棒过滤器、0.45μm精密过滤器、0.22μm除菌过滤器过滤，加入pH值调节剂适量，调节pH值5.0；药液经0.22μm 的微孔滤芯精滤至药液澄清，药液过滤时钛棒过滤器前后的压差为0.02MPa、0.45μm精密过滤器前后的压差为0.02MPa、0.22μm除菌过滤器前后的压差为0.02MPa；灌装，灭菌，即得。
实施例4
汉防己甲素的提取方法如下：
（1）浸泡酶解：汉己粉粉碎过筛50目筛，得汉己粉末，先用重量为汉己粉末0.7倍量的1%的氨水溶液进行溶胀，溶胀时间为2h，然后添加酶制剂的水溶液作为酶提取液，所述酶制剂的添加量为汉己粉末重量的1.5‰，加入pH值调节剂适量，调节pH值在4.3，酶解时间为1.5小时，酶解温度为30℃；
（2）一次提取：将经步骤(1)处理后的物料按一定料液比加入80%甲醇，料液比为1∶7（kg/L）；提取完全后，过滤，收集滤液1，得残渣；
（3）二次提取：将残渣放入匀浆机中, 加入残渣量0.4倍量的醋酸乙酯：乙醇1:2溶液,匀浆4min之后过滤, 收集滤液2，合并滤液1和滤液2，得混合液；
(4)过滤：将混合液溶于质量分数为75％的甲醇中，在室温23℃冷浸60小时后，取上清液经过超滤截留分子量，温度控制在50℃，压力控制在1.5MPa，得滤液3；
（5）浓缩：将滤液3蒸发浓缩至体积比的35%，得浓缩液A；
（6）吸附富集：将浓缩液A用pH值调节剂调节pH值为5，用填料为ODS-C 18反向硅胶与XAD-16N填料2:3 的混合物进行吸附，吸附完成后进行解析，先以水洗除杂，再用pH值调节剂至pH值为5酸性条件下进行甲醇：二氯甲烷体积比为10:8溶液洗脱，再用pH值调节剂至中性条件下进行甲醇：二氯甲烷体积比为20:3溶液洗脱，洗脱速度为4ml/min，收集洗脱液，得分离液B；
（7）高效液相色谱分离：将分离液B上制备型高效液相色谱硅胶柱，所用色谱柱为SuplexTM pKb 100，有机相为甲醇 ：乙醚 ：0.1%三乙胺 (75∶8∶17 )溶液，水相为15mmol/L的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的比例为50∶40，洗脱速度为2ml/min，根据的汉防己甲素检测图谱相应谱带收集溶液C；收集浓缩至干，得高纯度汉防己甲素。
汉防己甲素注射液的制备方法如实施例2.
实施例5
汉防己甲素的提取方法如下：
（1）浸泡酶解：汉己粉粉碎过筛80目筛，得汉己粉末，先用重量为汉己粉末2倍量的0.05%的氨水溶液进行溶胀，溶胀时间为5h，然后添加酶制剂的水溶液作为酶提取液，所述酶制剂的添加量为汉己粉末重量的5‰，加入pH值调节剂适量，调节pH值在6.0，酶解时间为3小时，酶解温度为45℃；
（2）一次提取：将经步骤(1)处理后的物料按一定料液比加入95%甲醇，料液比为1∶5（kg/L）；提取完全后，过滤，收集滤液1，得残渣；
（3）二次提取：将残渣放入匀浆机中, 加入残渣量1倍量的醋酸乙酯：乙醇1:2溶液, 匀浆10min之后过滤, 收集滤液2，合并滤液1和滤液2，得混合液；
(4)过滤：将混合液溶于质量分数为90％的甲醇中，在室温35℃冷浸30小时后，取上清液经过超滤截留分子量，温度控制在35℃，压力控制在0.4MPa，得滤液3；
（5）浓缩：将滤液3蒸发浓缩至体积比的60%，得浓缩液A；
（6）吸附富集：将浓缩液A用pH值调节剂调节pH值为2，用填料为ODS-C 18反向硅胶与XAD-16N填料2:3 的混合物进行吸附，吸附完成后进行解析，先以水洗除杂，再以甲醇：二氯甲烷20:1溶液洗脱，洗脱速度为6ml/min，收集洗脱液，得分离液B；
（7）高效液相色谱分离：将分离液B上制备型高效液相色谱硅胶柱，所用色谱柱为SuplexTM pKb 100，有机相为甲醇 ：乙醚 ：0.1%三乙胺 (75∶8∶17 )溶液，水相为40mmol/L的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的比例为95∶5，洗脱速度为6ml/min，根据的汉防己甲素检测图谱相应谱带收集溶液C；收集浓缩至干，得高纯度汉防己甲素。
汉防己甲素注射剂的制备方法，其中：所述的酶制剂为果胶酶与纤维素酶、半纤维素酶的重量比例为5∶2∶0.5。
pH值调节剂为10%氢氧化钠水溶液、10%盐酸水溶液。
汉防己甲素注射液的制备方法，由下列原料药提取制备而成：上述汉防已甲素15.0g，半胱氨酸0.5g，焦亚硫酸钠0.5g，氯化钠5.0g，稀盐酸水溶液适量，EDTA－2Na0.3g，活性炭0.02%（g/ml），注射用水适量，制成1000ml；
汉防己甲素注射液制备方法为：
（一）浓配：在40℃下在浓配罐中加入30%配制量注射用水，加稀盐酸水溶液适量，搅拌均匀，加入配制量的汉防已甲素，边加边搅拌使之完全溶解；在稀配罐中加入60%配制量注射用水并保持在50℃，加入配制量的半胱氨酸、焦亚硫酸钠、氯化钠、EDTA－2Na，边加边搅拌使之完全溶解；并搅拌均匀；
（二）稀配：把浓配罐中的溶液用泵打到稀配罐中，在稀配罐中加入注射用水至配制量，搅拌均匀，加活性炭0.05%（g/ml），搅拌均匀，50℃保温60分钟；
（三）过滤：打小循环30分钟，药液经钛棒过滤器脱炭；打大循环30分钟，药液经钛棒过滤器、0.45μm精密过滤器、0.22μm除菌过滤器过滤，加入pH值调节剂适量，调节pH值6.0；药液经0.22μm 的微孔滤芯精滤至药液澄清，药液过滤时钛棒过滤器前后的压差为0.2MPa、0.45μm精密过滤器前后的压差为0.2MPa、0.22μm除菌过滤器前后的压差为0.2MPa；灌装，灭菌，即得。
对比例1:汉防己甲素的提取方法中省略步骤（1）浸泡酶解，其余同实施例2。
对比例2:汉防己甲素的提取方法中步骤（1）浸泡酶解中酶制剂改为纤维素酶和果胶酶的复合酶用量为2%,酶解pH为5.0,酶解温度为50℃,酶解1h，其余同实施例2。
对比例3: 汉防己甲素的提取方法中步骤（2）和步骤（3）的二次提取改为用65%的甲醇回流提取5小时的一次提取，其余同实施例2。
对比例4：汉防己甲素的提取方法中步骤（4）的溶解用的甲醇改为用90%的甲醇，其余同实施例2。
对比例5:汉防己甲素的提取方法中（1）浸泡酶解：汉己粉粉碎过筛40目筛，得汉己粉末，先用重量为汉己粉药材2倍量的3%的氨水溶液进行溶胀，溶胀时间为2h，然后添加酶制剂的水溶液作为酶提取液，所述酶制剂的添加量为药材重量的8‰，调节pH值在5.0，酶解时间为2小时，酶解温度为26℃，过滤,得滤渣；
（2）一次提取：将经步骤(1)处理后的物料按一定料液比加入95%甲醇，料液比为1∶5（kg/L）；提取完全后，过滤，收集滤液1，得残渣；其余同实施例2。
对比例6：汉防己甲素的提取方法中步骤（6）吸附富集：将浓缩液A用pH值调节剂调节pH值为1.5，用填料为ODS-C 18反向硅胶进行吸附，吸附完成后进行解析，先以水洗除杂，再以甲醇：二氯甲烷溶液9∶1洗脱，洗脱速度为4ml/min，收集洗脱液，得分离液B；
（7）高效液相色谱分离：将分离液B上制备型高效液相色谱硅胶柱，有机相为乙腈，水相为25mmol/L的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的比例为60∶40，洗脱速度为2ml/min，根据的汉防己甲素检测图谱相应谱带收集溶液C；收集浓缩至干，得高纯度汉防己甲素，其余同实施例2。
对比例7: 汉防己甲素的提取方法中步骤(7)纯化工艺改为:采用D001阳离子树脂,上样药液浓度为0.2g/mL,酸度为2%盐酸水溶液,体积为5BV,洗脱液为5BV的7%氨水-90%乙醇进行洗脱，其余同实施例2。
对比例8：用CN200610046438.9方法制备汉防己甲素提取物。
测试对比：
一、汉防己甲素测定：
供试品溶液的制备：准确称取干燥的粉防己粉末(过3号筛)1 g, 置于100 mL的具塞锥形瓶中，密塞,加入50 mL 85%甲醇超声30 min,过滤，滤渣超声30min,合并滤液减压蒸干，加入适量85%甲醇溶解,定容至50mL的容量瓶中。用0.45μm的有机微孔滤膜过滤，弃去初滤液，即为供试品。
色谱柱：ODS C185微米4.6×250毫米，流动相：甲醇∶0.08％三乙胺溶液 80∶20(V/V)，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，检测波长：280nm。
序号 汉防己甲素纯度% 汉防己甲素提取率（%）
实施例1 99.7 2.641
实施例2 99.9 2.894
实施例3 99.6 2.721
实施例4 99.9 2.886
实施例5 99.5 2.341
对比例1 95.9 2.073
对比例2 96.8 2.146
对比例3 95.5 2.055
对比例4 95.0 2.151
对比例5 96.1 2.289
对比例6 98.2 2.214
对比例7 94.6 2.356
对比例8 96.2 2.158
实施例1-4汉防己甲素的纯度均在99.5%以上，实施例1-4优于实施例5（工艺参数不在范围内）。实施例1-4相对于对比例1-8纯度有明显提高，本发明的方法有效，通过对汉防己浸泡酶解，破坏其细胞壁，再配以二次提取，使提取率增加，再用硅胶吸附富集、高效液相色谱柱联用分离的方法能有效提高汉防己甲素的纯度，同时提高其提取率，避免原材料的浪费损失。对比例1-8汉防己甲素的纯度无法达到临床应用要求。
二、疼痛感对比试验：
取小白鼠，皮下注射汉防己甲素注射液，观察小白鼠是否会发生扭体反应，根据小鼠发生扭体反应的几率来判断注射过程中疼痛感的强弱，实施例1-4和对比例1-8的注射液样品各重复30次试验；结果如下：
实验样本(小鼠) 发生扭体反应个体数 扭体反应发生率
序号 实验总数 反应个体数 扭体反应发生率 （%）
实施例1 30 5 16.7
实施例2 30 4 13.3
实施例3 30 4 13.3
实施例4 30 3 10
实施例5 30 12 40
对比例1 30 20 67
对比例2 30 17 56.6
对比例3 30 21 70
对比例4 30 20 67
对比例5 30 19 63.3
对比例6 30 17 56.6
对比例7 30 18 60
对比例8 30 19 63.3
由疼痛感对比试验结果可知，实施例1-4的汉防己甲素注射液注射过程中的疼痛感明显弱于对比例1-8，可知提高了汉防己甲素的纯度带来相应的注射时疼痛感减少。同时实施例1-4也优于实施例5（工艺参数不在范围内）。
三、长期试验考察：
将实施例1-5和对比例1-8制得的汉防己甲素注射液按上市包装，置 长期留样箱中，一定时间取样，对考察项目进行检验。
长期试验温度：20±2℃，湿度：RH60％±10％，考察时间：0、12、24月，考察指标：外观性状、可见异物、pH、含量变化率。
含量变化率=1-老化实验后汉防己甲素浓度/初始汉防己甲素浓度
长期试验稳定性记录：
Figure 19848DEST_PATH_IMAGE002
由长期试验考察得知，实施例1-4比对比例1-8的稳定性更高，包括pH值变化更小、产品含量更高，同时实施例1-4也优于实施例5（工艺参数不在范围内）。
四、抗氧耐受力：
小鼠游泳实验10天，10天后分别将小鼠放入90×45cm2的水槽中,水深30cm,室温28C，水温22C，观察小鼠游泳至死亡时间。
Figure 405830DEST_PATH_IMAGE003
由试验数据可知，实施例1-4比对比例1-8更能提高小鼠的抗氧耐受力。实施例1-4也优于实施例5（工艺参数不在范围内）。
五、溶血与凝聚试验：
方法：取家兔1只，自颈动脉取血约20ml，置三角瓶中，用竹签搅拌去除纤维蛋白，然后将血移入刻度离心管内，加入生理盐水5-10ml，混合后离心10分钟(2000-2500r/分)，去除上清液，再加生理盐水混合离心，反复洗3-4次，至上清液呈无色透明方可用于试验。将所得红细胞按其容积，用生理盐水稀释成2％的混悬液。取试管11支，编号排列于试管架上，分别加入0.5mL氨基酸和2.0mL生理盐水，再加入2.5mL的2%红细胞混悬液。轻轻摇匀后，分别加入0.3mL浓度为15mg/mL的由实施例1-5和对比例1-8得到的汉防己甲素配制的水溶液，混匀后置37℃恒温水浴中观察，1小时内每隔15分钟观察一次，1小时后，每隔1小时观察一次，连续观察3小时。
结果判断标准 若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留,表明有溶血发生,记为“+”;如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明,表明无溶血发生，记为“-”。若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀,振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生,记为“+”。如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚:若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散,或将凝聚物放在载玻片上,在盖玻片边缘滴加2滴生理氯化钠溶液，置显微镜下观察,凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚,记为“一”;若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚,记为“+”。
Figure 277578DEST_PATH_IMAGE004
（-）表示未发生溶血抗凝，（+）表示发生溶血抗凝
由此可知，注射15mg/ml,体积为0.3ml的汉防己甲素注射液后，实施例1-4在0.8h内均未发生溶血凝聚，由此可知，本发明方法制备的汉防己甲素注射液在抗溶血凝聚方面，应用于临床的风险更低。同时实施例1-4也优于实施例5（工艺参数不在范围内）。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种汉防己甲素注射液的制备方法，其特征在于：由下列原料药提取制备而成：汉防已甲素15.0g，半胱氨酸0.5g，焦亚硫酸钠0.5g，氯化钠5.0g，稀盐酸水溶液适量，EDTA－2Na0.3g，活性炭0.02%（g/ml），注射用水适量，制成1000ml；
汉防己甲素注射液制备方法为：
（一）浓配：在60℃下在浓配罐中加入20%配制量注射用水，加稀盐酸水溶液适量，搅拌均匀，加入配制量的汉防已甲素，边加边搅拌使之完全溶解；在稀配罐中加入50%配制量注射用水并保持在60℃，加入配制量的半胱氨酸、焦亚硫酸钠、氯化钠、EDTA－2Na，边加边搅拌使之完全溶解；并搅拌均匀；
（二）稀配：把浓配罐中的溶液用泵打到稀配罐中，在稀配罐中加入注射用水至配制量，搅拌均匀，加活性炭0.02%（g/ml），搅拌均匀，60℃保温15分钟；
（三）过滤：打小循环15分钟，药液经钛棒过滤器脱炭；打大循环30分钟，药液经钛棒过滤器、0.45μm精密过滤器、0.22μm除菌过滤器过滤，加入pH值调节剂适量，调节pH值至3.5～5.0；药液经0.22μm 的微孔滤芯精滤至药液澄清，药液过滤时钛棒过滤器前后的压差为0.01～0.02MPa 之间、0.45μm精密过滤器前后的压差为0.01～0.02MPa之间、0.22μm除菌过滤器前后的压差为0.01～0.02MPa之间；灌装，灭菌，即得。
2.权利要求1所述的汉防己甲素注射液的制备方法，其特征在于：汉防己甲素的提取方法如下：
（1）浸泡酶解：汉己粉粉碎过筛40～60目筛，得汉己粉末，先用重量为汉己粉末0.5～1倍量的0.1～2%的氨水溶液进行溶胀，溶胀时间为1～3h，然后添加酶制剂的水溶液作为酶提取液，所述酶制剂的添加量为汉己粉末重量的0.5‰～3‰，加入pH值调节剂适量，调节pH值在4.0～4.5之间，酶解时间为1～2小时，酶解温度为25～40℃；
（2）一次提取：将经步骤(1)处理后的物料按一定料液比加入70%～90%甲醇，料液比为1∶6～8（kg/L）；提取完全后，过滤，收集滤液1，得残渣；
（3）二次提取：将残渣放入匀浆机中, 加入残渣量0.2～0.5倍量的醋酸乙酯：乙醇1:2溶液, 匀浆2～5min之后过滤, 收集滤液2，合并滤液1和滤液2，得混合液；
(4)过滤：将混合液溶于质量分数为70％～80％的甲醇中，在室温20～25℃冷浸48～72小时后，取上清液经过超滤截留分子量，温度控制在40～60℃，压力控制在0.6～2.2MPa，得滤液3；
（5）浓缩：将滤液3蒸发浓缩至体积比的20%～50%，得浓缩液A；
（6）吸附富集：将浓缩液A用pH值调节剂调节pH值为4～6，用填料为ODS-C 18反向硅胶与XAD-16N填料2:3 的混合物进行吸附，吸附完成后进行解析，先以水洗除杂，再以甲醇：二氯甲烷20～10:3～8溶液洗脱，洗脱速度为4ml/min，收集洗脱液，得分离液B；
（7）高效液相色谱分离：将分离液B上制备型高效液相色谱硅胶柱，所用色谱柱为SuplexTM pKb 100，有机相为甲醇 ：乙醚 ：0.1%三乙胺 (75∶8∶17 )溶液，水相为10～20mmol/L的磷酸盐缓冲液，有机相与水相的比例为30～80∶70～20，洗脱速度为1～3ml/min，根据的汉防己甲素检测图谱相应谱带收集溶液C；收集浓缩至干，得高纯度汉防己甲素。
3.根据权利要求1-2所述的汉防己甲素注射液的制备方法，其特征在于：pH值调节剂为10%氢氧化钠水溶液、10%盐酸水溶液。
4.根据权利要求2所述的汉防己甲素注射液的制备方法，其特征在于：所述的酶制剂为果胶酶与纤维素酶、半纤维素酶的重量比例为1～3∶2∶0.5。
5.根据权利要求4所述的汉防己甲素注射液的制备方法，其特征在于：步骤（6）洗脱时，先用pH值调节剂至pH值为4～6酸性条件下进行甲醇：二氯甲烷体积比为10:8溶液洗脱，再用pH值调节剂至中性条件下进行甲醇：二氯甲烷体积比为20:3溶液洗脱。
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