KR101182358B1 - 근육 퇴화 및 근무력증 치료를 위한 의약 조성물 및 그제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은 운동 신경 질환, 진행성 근육 영양장애, 선천적 근무력증 등에 의한 근육 퇴화 및 근무력증의 의약 조성물과 그 제조 방법을 제공하는 것이다. 상기 의약 조성물은 1~10중량부의 인삼 및 1~10중량부의 삼지구엽초와 같은 전통적 한약으로부터 추출된 활성 성분을 포함한다. 상기 의약 조성물은 근위축성 측부 경화 증세가 있는 환자의 혈청으로부터 유발되는 말초 신경의 재생 능력의 억제를 반감시키고, 손상된 말초신경의 재생 및 회복을 촉진시키며, 실험용 동물의 수영 인내력을 향상시키고, 근력을 대단히 증진시키며, 근육마비 상태인 쥐에서 크레아틴 인산염 키나아제 활성의 증가를 크게 억제하고 골격근 기능을 보호하는 기능을 할 수 있다.

의약 조성물, 인삼, 삼지구엽초, 근무력증, 근육퇴화

Description

근육 퇴화 및 근무력증 치료를 위한 의약 조성물 및 그 제조 방법 {A medicine composition for treating muscular atrophy and myasthenia gravis and method of preparing the same}

본 발명은 근육 퇴화 및 근무력증의 치료용 의약 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다, 이것은 전통 중의약 분야 및 그 제조기술에 해당된다.

근위축성측부경화(ALS), 진행성척추근위축증(PSMA), 진행성연수마비증(PBP) 및 원발성측삭경화증(PLS)을 포함하는 운동신경질환(MNDs)은 중추 신경계 내에 있는 상부 및 하부 운동신경의 큰 퇴화로 야기된다. 상기 증상은 질병이 진행됨에 따라 근육 강도감소 및 근육위축증, 식사중의 질식이나 기침/ 연하곤란/ 호흡곤란 및 사망이다. 만성 진행성 퇴화질병 중의 하나로 잘 알려지지 않은 요소로 인한 병인 ALS는 선택적으로 척수 내의 전각 세포, 뇌간 운동신경 및 추체골계를 손상시키고, 상부 및 하부 운동 신경의 손상징후를 보인다. ALS는 만성 운동신경 질병의 가장 흔한 형태이다. 서양의학에 따르면, ALS의 병인이 명백히 알려지지 않았기 때문에, 환자가 질병과 싸울 수 있도록 하기 위해서 충분한 영양, 증상개선 및 심리적 도움 을 포함하는 유지치료(MAINTENANCE THERAPY)를 제외한 특별한 치료요법이 없다.

전통 중의학(TCM)의 이론에 따르면 근위축증은 ALS에 의해 야기되며 다른 질명은 TCM 이완 증후군의 범주에 속한다. 고대 중국인들은 이완의 치료는 양명경(Yangming Channel)에 주목해야 한다고 믿는 견해를 제안했다. 리 렉시안 교수는 이 질병의 근본적 원인이 내인풍(endopathic wind) 결핍 형태가 우연히 발생하고 혈관 무능 병리 요소가 있을 때, 비장과 신장이 모두 약한 것이라고 생각했다. 그는 치료방법이 비장을 활동적이게 하고 신장을 건강하게 하며, 내인풍(endopathic wind) 증후군을 완화하고 경련과 발작을 없애며, 부수적인 장애를 제거하기 위한 혈액순환 증진에 초점을 두어야한다고 생각했다. 상기 방법은 그가 제형화한 변형된 비장 활성화 및 신장 강화 처방으로 치료효과가 있다. 뎅 티에타오 교수는 ALS 증상이 담 및 울혈이 있는 비장과 신장의 기능부전으로 발생한다고 생각했다. 그는 경구용으로 중간 지아오(Middle jiao)를 증강하고 Qi를 채우기 위해 변형한 달인 약, 정맥주사용으로 황기, ALS 환자에게 활동적 비장과 건강한 신장을 만들어 주기 위한 침술점 주입, 담을 해소하기 위해 상부 림프를 증기 처리 및 세척, 숙변 제거를 위한 관장, 침술, 마사지, 음식 치료 및 심리치료를 포함하는 보조치료를 처방했다. 그의 방법은 일부 효과가 있지만 만족스럽지는 않았다.

본 발명의 목적은 근육 퇴화 및 근무력증의 치료에 좋은 효과가 있는 의약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 의약 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명자는 병상 실무에, 단지 비장 및 위를 조절하기 위한 치료방법을 사용할 때, 명백한 치료 효과가 없다는 것을 발견했다. 그러므로 본 발명자는 상기 전통적인 치료 방법 대신에 경락을 중요시하고 특히, 기경팔맥 중 두맥(Du Channel)을 강조한다. 발명자는 기경팔맥으로 근위축증의 병인을 연구하고, 기경팔맥의 접근을 통한 치료의 새로운 개념 및 근본 에너지를 강화, 이완을 지지, 피에 영양을 공급 및 과립화 증진의 치료 원리를 제안했다. 여분의 양(Yang)의 예열, 생명의 정수 충전 및 기경팔맥의 활성화가 강조되고 두맥(Du Channel)을 예열하고 활력 있게 하며, 많은 전통 중국식물 중에서 기질을 활력 있게 하는 일부 효과적 약초가 선택되고 제형화되었다. 그렇게 상기 의약 조성물이 발명된다.

본 발명에 따른 상기 의약 조성물에 함유되는 활성 성분은 다음과 같다.

1~10 중량부의 인삼 및 1~10 중량부의 삼지구엽초, 바람직하게는 2~10 중량부의 인삼 및 2~8 중량부의 삼지구엽초, 보다 바람직하게 5 중량부의 인삼 및 5 중량부의 삼지구엽초, 혹은 5 중량부의 인삼 및 2 중량부의 삼지구엽초, 혹은 9 중량부의 인삼 및 7 중량부의 삼지구엽초, 혹은 3 중량부의 인삼 및 1 중량부의 삼지구엽초와 같은 전통 중국 허브(Chinese herbs)로부터 추출된다.

본 발명의 의약 조성물에 사용되는 인삼은 건뿌리 및 근경, 오가피나무(Acanthopanax gracilistylu plant)로부터 추출하는데, 전통적 중의약 방식에서 그 약의 특징은 달고, 약간 쓰며 부드럽다. 본 발명의 의약 조성물에 사용되는 삼지구엽초는, Aceranthus Sagittatus S.et Z., Epimedium Sagittatum (Sieb.et Zucc.) Maxim, Epimedium wushanense T.S.Ying 혹은 Korean Epimedium herb, 매자나무의 건조 분말로부터 얻어지며 전통 중국의학에서 그 약의 특징은 쓰고, 달며 따뜻하다.

본 발명의 의약 조성물은 전통적인 제형화 기술에 따라 주사, 캡슐, 약제, 정제 및 경구액과 같이 의학적으로 통용되는 모든 형태로 출시될 수 있다. 주사는 바람직한 투약형태이다.

본 발명의 의약 조성물의 제조 방법은 다음의 단계를 포함한다.

(1) 주어진 처방에 따라 전통 중국 허브의 첨가단계:

(2) 알코올 강도가 60~90%인 알코올로 1~3회 인삼을 추출, 얻어진 추출물을 결합하고, 상기 혼합된 추출물을 여과 및 농축하여 농축액을 형성하고, 정제수를 농축액에 첨가하여 희석하고 균일하게 될 때까지 혼합하고, 상기 혼합물을 냉각 및 여과하고, 희석된 여과물을 거대공극의 흡착성 수지 컬럼에 도입하고, 수용성 용리제와 알코올 강도가 70~90%인 알코올로 차례대로 컬럼을 용리하고, 용리액을 수거하고 불순물을 제거하며, 용리액을 농축시키고, 건조시켜 인삼추출액을 얻는 단계;

(3) 물:삼지구엽초의 무게비가 매번 10~30 : 1인 물로 2~5회 삼지구엽초를 달이고 추출하고, 얻어진 추출물을 결합하고, 상기 결합된 추출물을 여과 및 농축하여 농축물을 형성하고, 용액의 알코올 농도가 60~80%가 될 때까지 알코올을 농축액에 첨가하고, 물을 상기 농축액에 첨가하여 균일하게 될 때 까지 혼합하고, 상기 혼합물을 냉각 및 여과하고, 얻어진 여과액을 거대공극의 흡착성 수지 컬럼에 도입하고, 수용성 용리제와 알코올 강도가 40~60%인 알코올로 차례대로 컬럼을 용리하고, 용리액을 수거하고 불순물을 제거하며, 용리액을 농축하고 건조시켜 삼지구엽초 추출물을 얻는 단계;

(4) 의약 조성물을 얻기 위해 전통적인 의약 보조제와 단계(2) 및 단계(3)에서 얻어진 추출물을 결합한다.

단계(2)에서 상기 수지 컬럼은 pH 8~9인 암모니아수와 알코올 강도가 20%인 알코올로 용리되고, 단계(3)에서 상기 수지 컬럼은 정화된 물과 알코올 강도가 각 20%인 알코올로 용리된다.

단계(2)에서 처리된 불순물을 제거하는 단계는 다음과 같다.

정제수를 얻어진 용리액에 첨가하여 40~60%의 알코올 강도를 가지도록 하는 단계; 얻어진 용액을 중성 알루미나 컬럼에 통과시켜 유출물을 수거하는 단계; 적절한 양의 활성 탄소를 유출물에 첨가한 후에 20분 동안 환류하는 단계; 유출물을 뜨겁게 유지시켜 판형 여과기로 흡입 여과하는 단계; 얻어진 여과물을 수거하고 농축액을 형성하기 위해 농축하는 단계; 농축액을 적어도 24시간, 바람직하게는 24~36시간 냉각하고 여과하는 단계;

단계(3)에서 불순물을 제거하는 단계는 다음과 같다.

적절한 양의 규조토를 용리액에 첨가하고 균일하게 될 때까지 혼합하고, 무수 알코올을 사용하여 2~5회 추출히고, 추출물을 결합하여 농축한다.

단계(3)에서 물로 달이는 동안에, 첨가된 물의 중량이 식물의 10~30배이고 바람직하게 15~25배이며, 첫 번째 추출시간은 30분~2시간이고 다음의 각 추출시간은 30분~1시간이다.

바람직하게는 단계(2)에서 컬럼에 사용되는 거대공극의 흡착성 수지는 AB-8 형태의 수지, D101 형태의 수지 및 DM-130 형태의 수지이다.

바람직하게는 단계(3)에서 컬럼에 사용되는 거대공극의 흡착성 수지는 AB-8 형태의 수지, NKA 형태의 수지 및 S-8 형태의 수지이다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시예는 다음의 단계를 포함한다.

(1) 사용되는 전통적 중국 허브를 먼저 세척하고 분쇄하여 처방전에 따라 칭량하는 단계;

(2) 인삼근을 알코올 강도가 60~90%인 알코올로 3회 추출하고, 첫번째에서 인삼은 1~2시간 동안 인삼의 8~12배 중량 알코올로 추출하고, 두번째로 1~2시간 동안 인삼의 6~10배 중량의 알코올로 추출하는 단계; 세번째로 30분~1시간 동안 인삼의 6~10배 중량의 알코올로 인삼을 추출한다. 얻어진 추출물은 뜨거울 때 결합 및 여과되고, 감압하에서 농축시키고, 동시에 알콜을 회수하면서 농축액을 얻고, 이 농축액은 스테인레스 스틸 용기에 보관한다. 정제수를 농축액에 가하여 균일하게 될 때까지 혼합한다. 혼합물은 24~36시간 동안 냉각되고 실온이 될 때까지 방치한 후, 판형 여과기로 여과하고, 판형 여과기는 바람직하게 적은 양의 물로 세척한다. 여과액은 정화된 물로 희석하고 사용에 준비된다. AB-8형태나 다른 적합한 수지 컬럼과 같은 거대공극의 흡착성 수지에 얻어진 희석된 여과액을 도입하고, pH 8-9의 암모니아수 및 20% 강도의 알코올로 컬럼을 각각 세척한다. 컬럼은 80%강도의 알코 올로 용리되고 용리액은 수거한다. 정제수를 첨가하여 알코올 강도가 50%인 용액을 만든다. 이 용액을 중성 알루미나 컬럼에 통과시켜 결과물을 수거하고 결합한다. 그리고 상기 수지 컬럼은 50%강도의 소량의 알코올로 세척하고, 유출물은 결합하여 사용에 제공하기 위해 보관된다. 적당량의 활성 탄소를 혼합물에 첨가하고 그것을 끓여 20분 동안 환류시킨다. 혼합물은 뜨겁게 유지하고 그것을 판형 여과기를 사용해 흡입 여과시킨다. 얻어진 여과액을 수거하여 농축시켜 농축액을 만든다. 상기 용액은 하룻밤 동안 냉각시킨다. 정화 판형 여과를 상기 용액을 만들기 위해서 수행하고, 여과된 용액은 감압하에서 건조된다. 그리하여 연노랑 흰 무정형의 분말, 즉 인삼 추출물이 얻어진다.

(3) 삼지구엽초는 2~5회, 바람직하게 4회 추출된다. 각 추출물에 첨가되는 물의 중량은 바람직하게 삼지구엽초의 10~30 배이다. 첫번째로 삼지구엽초는 30분~2시간 동안 추출되고 나머지 3번은 각각 30분~1시간 동안 추출된다. 상기 추출물은 뜨거울 때 결합되고 여과되며 감압하에서 농축되어 농축액을 얻고 스테인레스 스틸 용기에 넣는다. 알코올은 용액의 알코올 농도가 70%가 될 때까지 농축액에 첨가된다. 용액은 냉각, 여과되고, 동시에 알콜을 회수한다. 정제수는 농축액에 첨가되며 균일하게 섞일 때까지 혼합된다. 혼합물은 냉각, 여과 및 사용되기 위해 준비된다. 이렇게 하여 얻은 삼지구엽초 용액은 AB-8 형태의 미세공구조 흡착성 수지 컬럼을 통과하며, 정제수 및 알코올 강도 20%인 알코올로 각각 세척한다. 컬럼은 강도가 50%인 알코올로 용리되고 용리액은 수거된다. 적당량의 규조토는 용리액에 첨가되고 균일하게 섞일 때까지 혼합된다. 무수 알코올은 2~5회 추출에 사용된다. 추출물은 결합되고, 감압하에 농축되며 동시에 알코올을 회수하면서 건조된다. 이렇게 얻어진 분말을 삼지구엽초 추출물이다.

(4) 1,2-프로필렌 글리콜, 나트륨 다이하이드로겐 포스페이트 및 다이소디움 하이드로겐 포스페이트와 같은 일부 전통적인 약학 보조제 및 완충염은 단계(2) 및 단계(3)으로부터 얻어지는 추출물의 혼합물에 첨가된다. 주사용 물은 수혼합 용액의 부피가 10~20㎖가 될 때까지 용액에 첨가된다. 얻어진 용액은 열처리 후에 냉각되고, 미세공극막 및 한외여과막으로 차례로 여과된다. 여과액은 주사용 의약 조성물을 얻기 위해 채워지고, 포장되며, 살균된다.

유사하게, 단계(2) 및 단계(3)에서 얻어지는 추출물은 전통적인 제형화 기술에 따라 캡슐, 알약 및 정제 및 경구액과 같은 적합한 투약형태로 출시된다. 약효 실험에 의하면 의약 조성물은 근위축성측삭경화증이 있는 환자의 수지로부터 야기되는 말초신경의 재생력 억제를 반감할 수 있고, 손상된 말초신경의 재생 및 회복을 증진하며, 실험용 동물의 수영 인내력을 향상시키고, 근력을 대단히 향상시켜, 근육마비 상태인 쥐에서 크레아틴 인산염 키나아제 활성의 증가를 크게 억제하고 골격근 기능을 보호하는 기능을 할 수 있다.

부드러운 특성에 기반한 상기 달고 부드러운 인삼은 본 발명에 따른 의약 조성물에서 소량의 달고 따뜻한 삼지구엽초와 혼합되는데 이것은 생명의 정수와 근본적인 에너지의 강화 및 신장-양(kidney-yang)에 영양을 공급해 주는 기능이 가능한 의약 조성물을 만들 뿐 아니라, 너무 따뜻하거나 건조하지 않은 의약 조성물을 만든다. 본 발명에 따른 의약 조성물에 포함되는 활성 성분은 단지 두 가지의 전통 중국 허브로부터 추출되지만, 그 효과는 확증적이고 적합성이 정확하다. 의약 조성물은 새롭고, 효과적이며 운동신경 질환에 의한 근육 퇴화증(근위축성측삭경화증, 진행성척추근위축증, 진행성연수마비증 및 원발성측삭경화증을 포함), 진행성 근육영양장애, 선천적 근질환 및 근무력증의 치료에 안전한 전통 중의약이다.

실시예

본 발명의 실시예는 주사, 캡슐, 정제 및 알약의 투약 형태의 의약 조성물의 제조를 위해 다음의 실시예를 따른다.

실시예 1

본 실시예의 의약 조성물은 2가지의 전통 중국 식물의 비율, 즉 5중량부의 인삼 및 2중량부의 삼지구엽초로부터 만들어진다.

그 준비단계는 다음과 같다:

(1) 상기 2가지의 전통 중국 식물은 세척 및 분쇄되며 처방전에 따라 칭량된다.

(2) 인삼은 알코올 강도가 70%인 알코올로 3회 추출된다. 첫번째에서 인삼의 10배인 알코올이 인삼 분말에 첨가되고 그 혼합물은 끓는 점까지 가열되며 이 온도에서 1시간 동안 추출된다. 두번째에서는 인삼의 8배 중량의 알코올이 첫번째 추출 후 인삼 잔여물에 첨가되고, 그 혼합물은 끓는 점까지 가열되며 이 온도에서 1시간 동안 추출된다. 세번째에서는 인삼의 8배 중량의 알코올이 두번째 추출 후 인삼 잔여물에 첨가되고, 그 혼합물은 끓는 점까지 가열되며 이 온도에서 30분동안 추출된다. 상기 세 개의 결과 추출물은 가열되었을 때 결합되고 여과되며, 감압하에서 농 축시켜 농축액을 얻고, 이를 스테인레스 스틸 용기에 넣는다. 정제수가 농축액에 첨가되고 균일하게 되도록 혼합된다. 상기 혼합물은 24시간 동안 냉각되고 실온이 될 때까지 방치되며, 판형 여과기로 여과된다. 판형 여과기는 바람직하게 소량의 물로 세척된다. 여과액은 정제수로 희석되고 사용되도록 준비된다. 이렇게 얻은 농축 인삼액을 미리 처리된 AB-8형태의 거대공극의 흡착 수지 칼럼을 통과하도록 하고 수지 칼럼은 각각 pH 8-9의 암모니아수 및 20% 강도의 알코올로 컬럼을 각각 세척한다. 수지 컬럼은 강도가 80%인 알코올로 용리되고 용리액은 수거된다. 정제수를 50% 강도의 알코올 용액을 만들기 위해서 용리액에 첨가된다. 이 용액을 중성 알루미나 컬럼에 통과시켜 결과물은 수거된다. 수지 컬럼은 알코올 강도가 50%인 소량의 알코올로 세척되고, 유출물은 결합된다. 적당량의 활성 탄소는 혼합된 유출물에 첨가되고 끓인 후 20분 동안 환류된다. 혼합물이 뜨겁게 유지될 때 판형 여과기를 사용해 흡입 여과가 수행된다. 얻어진 여과액은 수거되고 농축시켜 농축액을 만든다. 상기 용액은 하룻밤 동안 냉각된다. 정화 판형 여과기(clarification plate filter)는 용액을 여과하기 위해 사용되고, 여과된 용액은 감압하에서 건조된다. 그리하여 인삼 추출물이 얻어진다.

(3) 삼지구엽초는 4회 추출된다. 각 추출물에 첨가되는 물의 중량은 삼지구엽초의 20배이다. 첫번째로 삼지구엽초는 1시간 동안 추출되고, 나머지 3번은 각각 30분 동안 추출된다. 상기 결과 추출물은 뜨거울 때 결합되고 여과되며 감압하에서 농축시켜 농축액을 얻고, 스테인레스 스틸 용기에 넣는다. 알코올은 용액의 알코올 농도가 70%가 될 때까지 농축액에 첨가된다. 용액은 냉각, 여과되고, 알코올을 회 수하면서 농축된다. 정제수는 농축액에 첨가되며 균일하게 되도록 혼합된다. 혼합물은 냉각 및 여과된다. 상기 삼지구엽초 용액은 AB-8 형태의 거대공극 흡착성 수지 컬럼을 통과하고, 정제수와 알코올 강도가 20%인 알코올로 세척된다. 컬럼은 강도가 50%인 알코올로 용리되고 용리액은 수거된다. 적당량의 규조토는 용리액에 첨가되고 균일하게 되도록 혼합된다. 무수 알코올은 3회 혼합물의 추출에 사용된다. 추출물은 결합되고, 알코올을 회수하면서 감압하에 농축되고, 건조된다. 이렇게 삼지구엽초 추출물이 얻어진다.

(4) 1,2-프로필렌 글리콜, 소디움 다이하이드로겐 포스페이트 및 다이소디움 하이드로겐 포스페이트와 같은 일부 전통적인 의약 보조제는 단계(2) 및 단계(3)으로부터 얻어지는 혼합추출물에 첨가된다. 주사용 물은 용액의 부피가 16㎖가 될 때까지 혼합물에 첨가된다. 얻어진 용액은 가열되고 30분 동안 끓이며, 실온이 될 때까지 방치되고 냉각된다. 그리고 용액은 미세공극막 및 한외여과막으로 차례로 여과된다. 여과물은 주사용 의약 조성물을 얻기 위해 채워지고, 포장되며, 살균된다.

실시예 2

본 실시예의 의약 조성물은 2가지의 전통 중국 허브로부터 하기와같은 중량비 즉, 5중량부의 인삼 및 5중량부의 삼지구엽초로부터 만들어진다.

자세한 의약 조성물의 제조 단계는 기본적으로 실시예 1의 단계(1)~(3)에서와 같다. 일부 의약 보조제가 첨가되고 캡슐 형태의 의약 조성물은 전통적인 제형화 기술에 따라 얻어진다.

실시예 3

본 실시예의 의약 조성물은 2가지의 전통 중국 허브, 즉 9중량부의 인삼 및 7중량부의 삼지구엽초로부터 만들어진다.

자세한 의약 조성물의 제조 단계는 기본적으로 실시예 1의 단계(1)~(3)에서와 같다. 일부 전통적인 의약 보조제가 첨가되고 정제 형태의 의약 조성물은 전통적인 제형화 기술에 따라 얻어진다.

본 발명에 따른 생체 밖에서 배양된 운동 에 관한 의약 조성물의 보호효과는 다음과 같은 동물실험에 따라 더 설명될 것이다.

목적: 본 발명에 따른 의약 조성물(JWL)의 운동신경에 대한 보호효과를 관찰하기 위해 생체 밖에서 배양되었다.

방법: 쥐의 배아척수 운동신경은 밀도 원심분리로 분리되고 1차 배양된다. 흥분독성이 수립된 흥분성 아미노산 모델을 얻기 위해 글루타민산이 첨가되고, 본 발명에 따른 주사용 의약 조성물(JWL)의 보호효과를 운동신경에 대하여 평가하였다. 세포 생존능력은 MTT방법으로 알 수 있었다. NF-200 면역조직화학적 착색 및 이미지 분석은 신경돌기의 줄기 길이측정에 사용되었다. 배양상청액 내의 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)는 생화학분석기로 감지되었다. 터널(TUNEL) 양성 신경 계수가 세포의 아포토시스 관찰에 사용되었다.

1. 재료 및 방법

1.1 실험재료

1.1.1 약제

주사 형태의 상기 의약 조성물은 본 발명의 방법에 따라 8㎖/앰플(천연 약제 0.94g/㎖와)이 준비된다. 리루텍^® 리루졸은 수입 약제 등록 번호 H20020006 및 일련 번호 28097을 가진 아벤티스 사에 의해 제조되었다. 0.9%염화나트륨-0.01 N HCl로 사용 전에 용해되어야 한다.

1.1.2 시약

L15배양 배지, 중합개시제, 파렌자임(1:250),폴리라이신, 토끼 항-NF-200 항체, 인슐린, DAB 현상제, MTT 및 DMSO 는 시그마 사로부터 구입하였다. 말혈청과 라미닌은 깁코 BRL 사에 의해 제공되었다. 소혈청 알부민은 하이클론에 의해 제공되고 터널 장비는 로체 분자 생화학에서 생산되었다. 디플로-항(diplo-anti) 표지 비오틴 및 트리 항(tri-anti) 표지 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제는 베이징 종산 생물학품사로부터 생산된 것이다. 다른 시약들은 중국에서 분석적 순도를 가지는 것으로 시장에서 얻을 수 있는 것들이다.

1.1.3 동물

새끼를 가진 기간이 10~14일인 청결 등급 SD 암컷 쥐는 중국, 충칭 제 삼 군약대, 대핑 병원, 수술연구소, 동물센터로부터 제공되었다.

1.1.4 장비

효소표지 장비(상하이, DG3022A), 이미지 분석 시스템(미국, 이미지 프로 플러스 4.5), 자동화된 생화학 분석기(미국, 베크만 CX7)

1.2 방법

1.2.1 쥐의 배아 척수 운동신경의 1차 배양

임신기간이 14일인 배아 쥐가 선택되고 뇌간면 아래의 척수를 뽑아, 뇌척수막 및 혈관이 마멸된 후에 1~2㎣로 자른다. 그리고 작은 조각은 37℃에서 0.125%의 췌장효소로 소화시켜서 부드럽게 되며 200 메쉬 강체를 통과한다. 여과된 용액은 미리 넣어둔 1㎖의 4% BSA(숫소 혈청 알부민)를 함유한 원심관에 넣으며 10분(300g)동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, L15의 배양 배지로 용해 및 침전시키고, 미리 넣어둔 1㎖의 6.8% 메트리자마이드를 함유한 5㎖의 원심분리 튜브에 넣고, 15분(500g)동안 원심분리하였다. 액체의 두 층 사이의 밝은 색 용액은 흡입되고 10분(300g)동안 원심분리하였다. 상청액을 분리하고, L15의 배양 배지에 용해 되고, 척수의 전각에 있는 신경세포의 단일 세포 현탁물이 얻어졌다. 상기 현탁물의 농도는 4.5×10⁵/㎖이었다. 상기 현탁물은 24-홀 및 96-홀 배양 판형에 착상되고, 이산화탄소 배양기에서 배양되었다. 24시간 후에 유지 배양배지가 사용되어진다. 48시간 후에, 12.5㎍/㎖ 5-Fu가 첨가되고 24시간 후에 흡입되며, 신선한 유지 배지가 배양에 사용되었다.

1.2.2 실험 조건 조절

운동신경이 72시간 동안 배양된 후에, 신선한 배양 배지에 의해 희석된 본 발명에 따른 주사용 0.5%, 1% 및 5%의 상기 액체 의약 조성물은 각각 실험군에 첨가되고, 리루졸은 리루텍 군(최종 농도는 10μ몰/L)에 첨가되며, 같은 양의 배양 배지가 대조군에 첨가되었다. 상기 세 그룹은 24시간 동안 동시에 배양되었다. 글루타민산이 흥분성 아미노산 흥분독성을 위해 첨가되고(최종 농도는 0.5m몰/L) 24 시간 후에 모든 지수는 검출되었다.

MTT 방법으로 세포 생존력 결정:

흡입관을 가진 96-홀 접시의 배양액을 조심스럽게 제거한 후에 10μL 5㎎/mL MTT 용액이 각 홀에 첨가되었다. 37℃에서 4시간 동안 5% 이산화탄소 증습 반응(humidification reaction)을 한 후에 상청액을 제거하고, 각 홀에 100μL의 다이메틸 설폭시드(DMSO)가 첨가되었다. 플레이트는 실온에서 5분간 진동을 위해 소형 발진기 위에 놓여졌다. 유색 물질이 완전히 용해된 후에 자동화 효소 표지 기구로 측정되었으며, 파장 λ=570㎚, 참조 파장 λ=630㎚이 측정에 사용되고, 광학 밀도값(OD)이 측정되었다.

NF -200 면역조직화학 염색 :

배양 세포는 일반적 방법으로 고정되고 6일째 되는 날에 봉인되었으며, 토끼 항- NF-200 단일클론 항체(1:100)가 첨가되었고, 24시간 후에(4℃) 다이-항- IgG(1:300) 표지 비오틴이 첨가되었다. 60분 후에(37℃) 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제로 표지된 스트렙타비딘 퍼옥시다아제(1:300)가 60분간 반응(37℃)에 첨가되었다. 0.01 몰/LPBS는 총 3회에 걸쳐 상기 단계 사이에서 5분동안 세정을 위해 사용되었다. DAB 용액은 5분간의 착색에 사용되고, 알코올은 경사 탈수(gradient dehydration)에, 크실렌은 투명성에, 중성 껌은 봉인에 사용되었다. 음성대조군에서, NF-200 항혈청을 대체하는 PBS가 면역조직화학적 반응에 사용되었다. 두개의 커버슬립이 각각 선택되고, 50 NF-200 양성 신경은 각 커버상에 무작위로 선택되었다. 신경돌기 줄기의 길이는 Quantimet-상분석장치로 측정되었다.

LDH 검출:

배양된 세포는 24-홀 플레이트에서 꺼내졌다. 상청액은 조심스럽게 흡입되고, 분류하고 번호를 부여하였다. 상청액 속의 락테이트 디하이드로게나아제(LDH)의 활성은 자동 생화학 분석기로 검출되었다.

터널 검출:

배양된 세포는 일반적 방법으로 고정되고 0.3% 과산화수소/메탄올로 30분 동안 봉인되었다. 0.1% 트리톤-0.1% 시트르산염 용액이 첨가되고 얼음에 2분 동안 놓여졌다. 말단 데옥시뉴클레오타이드 전이효소(TdT) 및 플루오레신이 표지된 dUTP가 37℃에서 2시간 배양을 위해 첨가되었다. 항플루오레신 항체와 결합한 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제가 37℃에서 2시간 배양을 위해 첨가되었다. NBT/BCIP가 착색에 사용되었다. 0.01몰/LPBS가 총 3번에 걸쳐 상기 단계 사이에서 5분간의 세척을 위해 사용되었다. 상기 용액은 탈수되고 투명해지 후에 봉인되었다. TdT 효소는 음성대조군에는 첨가되지 않았다. 상기 실험은 각 실험군에 대하여 3번씩 반복되었다. 터널로 염색된 양성 신경의 수는 5개의 무작위 시계에서 계수되어졌다.

통계적 분석:

데이터는 평균 및 표준 편차(

± s)로 표현되었다. t-테스트는 각 평균을 비교하는데 사용되었다. 분산분석은 군간 차이의 유의성을 비교하는데 사용되었다.

2. 결과

2.1 척수 운동신경의 모폴로지

뉴로이 접종 된 후 4시간 후에 세포는 벽에 흡착되기 시작하였다. 세포는 단일이고 둥글거나 타원형이다. 신경돌기는 24시간 후에 운동신경에서 발견되며 운동 신경 속 신경돌기의 길이는 1% JWL 군보다 유의적으로 길었다. 48~72시간 동안 배양된 후에 벽에서 자란 세포는 뚜렷하게 커지고, 세포내에서 과립상 물질이 점차 나타나기 시작하며, 주위는 깨끗해지고, 신경돌기는 양과 길이가 증가하였다. 96시간 후에, 신경돌기는 십자형으로 시계에 가득 찼다. 운동신경 세포는 5~6일 자란 후에 우수한 굴절율을 가진 가장 풍부한 상태였다. 핵은 중앙 혹은 세포의 일측에 위치하였다. 핵은 연한 색상으로 밝고, 신경세포체로부터 쉽게 구별되었다. 핵과 인은 뚜렷하였다. 5일째에 배양된 대조군의 운동신경 내의 신경돌기는 글루타민산의 첨가후 24시간에 수축하기 시작하였다. 1%JWL 주사액의 배양된 신경은 적당한 밀도로 잘 자랐다. 신경돌기는 크고 두꺼우며 서로 교차되었다. 글루타민산 대조군에서 운동신경의 아포토시스 및 아포토시스체들은 상기 1%JWL 주사액에 있는 동안 터널착색에 의해 발견되고, 아포토시스체가 유의적으로 감소하였다.

2.2 정상 운동신경에의 본 발명에 따른 상기 주사용 의약 조성물의 영향: 표 1 참조 (

± s)

0.5%, 1% 및 5%의 JWL 군 및 대조군 사이에 운동신경의 세포 생존력에는 통계학적으로 차이가 있었다(p〈0.05). 1%의 JWL 군의 세포 생존력은 리루텍 군보다 명백히 우수하였다(p〈0.05). 0.5% 및 1% JWL 군에서의 척수 운동신경의 신경돌기의 성장은 리루텍 군과 비교해 다른 대조군에서보다 유의적으로 우수하였다(p〈 0.05).

그룹	농도	OD 값	신경돌기(L, ㎛)
대조군		0.230±0.130	159.71±48.95
리루텍 군	10umol/L	0.266±0.141	192.08±89.07
0.5%JWL 군	4.5㎍/L	0.317±0.054 1	315.96±32.32 1,2
1%JWL 군	9㎍/L	0.396±0.087 1,2	373.46±80.24 1,2
5%JWL 군	45㎍/L	0.329±0.097 1	151.46±69.97

주의 1. 대조군과 비교: P〈 0.05

2. 리루텍 군과 비교: P〈 0.05

2.3 운동신경에 대한 흥분성 아미노산 흥분독성에 의해 유도된, LDH 누설에 대한 주사형태로 주입한 상기 의약 조성물의 영향: 표 2 참조 (

± s)

검출결과는 0.5% JWL 및 리루텍 군의 배양상청액에 있는 LDH는 유의적인 차이가 없이(p〉0.05), 대조군(p〈0.05)보다 적다는 것을 명확하게 보여주며, 이는 0.5%의 JWL 및 리루텍군이 글루타민 산의 손상으로 인한 운동신경의 LDH 누설을 감소시킨다는 것을 시사한다.

그룹	농축	LDH*
글루타민산 대조군		67.75±5.12
리루텍 +글루타민산 군	10umol/L	58.50±4.20 1
0.5%JWL+ 글루타민산 군	4.5㎍/L	59.00±4.97 1
1%JWL +글루타민산 군	9㎍/L	61.50±3.11
5%JWL +글루타민산 군	45㎍/L	69.00±5.35 2

주의 1. 대조군과 비교: P〈 0.05

2. 리루텍 군과 비교: P〈 0.05

^*젖산 탈수소효소

2.4 흥분성 아미노산 흥분독성으로 야기된 운동신경의 아포토시스에 대한 주사형태의 상기 의약 조성물의 영향: 표 3 참조 (

± s)

1% JWL 군과 리루텍군의 터널 양성 세포의 수는 대조군(p〈0.05)보다 적었다. 0.5% JWL 및 5% JWL의 터널 양성 세포의 수는 대조군(p〉0.05)과 비교해서 유의적인 차이 없이 감소하지만 리루텍 군(p〈0.05)과 비교해서는 유의적인 차이가 있다.

그룹	농축	터널 양성세포의 수
글루타민산 대조군		19.8±5.63
리루텍 +글루타민산 군	10umol/L	11.2±2.84 1
0.5%JWL + 글루타민산 군	4.5㎍/L	16.2±2.08 2
1%JWL +글루타민산 군	9㎍/L	9.8 ±4.34 1
5%JWL +글루타민산 군	45㎍/L	16.4±3.65 2

주의 1. 대조군과 비교: P〈 0.05

2. 리루텍 군과 비교: P〈 0.05

상기 실험은 본 발명에 따른 상기 의약 조성물이 일반 운동신경 및 흥분성 아미노산 흥분독성으로 손상된 운동신경 모두에 보호 효과를 가지고 있다는 것을 증명한다.

본 발명에 따른 의약 조성물은 근위축성 측부 경화 증세가 있는 환자의 혈청으로부터 유발되는 말초 신경의 재생 능력 억제를 중화하고, 손상된 신경 말단의 재생 및 회복의 촉진시키며, 실험용 동물의 수영 인내력을 향상시키고, 근력에 큰 향상을 주며, 근육마비 상태인 쥐에서 크레아틴 인산염 키나아제 활성의 증가를 크게 억제하고 골격근 기능을 보호하는 효과가 있다.

Claims (11)

1~10 중량부의 인삼으로부터 추출된 인삼 추출물 및 1~10 중량부의 삼지구엽초로부터 추출된 삼지구엽초 추출물로 이루어진 근육퇴화 및 근무력증 치료를 위한 의약 조성물.

제 1항에 있어서, 2~10 중량부의 인삼으로부터 추출된 인삼 추출물 및 2~8 중량부의 삼지구엽초로부터 추출된 삼지구엽초 추출물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

제 2항에 있어서,

5 중량부의 인삼으로부터 추출된 인삼 추출물 및 5 중량부의 삼지구엽초로부터 추출된 삼지구엽초 추출물; 또는

5 중량부의 인삼으로부터 추출된 인삼 추출물 및 2 중량부의 삼지구엽초로부터 추출된 삼지구엽초 추출물; 또는

9 중량부의 인삼으로부터 추출된 인삼 추출물 및 7 중량부의 삼지구엽초로부터 추출된 삼지구엽초 추출물; 또는

3 중량부의 인삼으로부터 추출된 인삼 추출물 및 1 중량부의 삼지구엽초로부터 추출된 삼지구엽초 추출물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 의약 조성물은 일반적인 의약물 보조제를 더욱 포함하고 주사, 캡슐, 알약, 정제 또는 경구액의 투약 형태로 제형화되어지는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

제 4항에 있어서, 상기 의약 조성물은 주사용 투약형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

(1) 주어진 처방에 따라 전통 중국 허브를 첨가하는 단계:

(2) 알코올 강도가 60~90%인 알코올로 1~3회 인삼을 추출, 얻어진 추출물을 결합하고, 상기 결합된 추출물을 여과 및 농축하여 농축액을 형성하고, 정제수를 농축액에 첨가하여 희석하고 균일하게 될 때까지 혼합하고, 상기 혼합물을 냉각 및 여과하고, 희석된 여과물을 거대공극의 흡착성 수지 컬럼에 도입하고, 수용성 용리제와 알코올 강도가 70~90%인 알코올로 차례대로 컬럼을 용리하고, 용리액을 수거하고 불순물을 제거하며, 용리액을 농축시키고, 건조시켜 인삼추출액을 얻는 단계;

(3) 물:삼지구엽초의 무게비가 매번 10~30 : 1인 물로 2~5회 삼지구엽초를 달이고 추출하고, 얻어진 추출물을 결합하고, 상기 결합된 추출물을 여과 및 농축하여 농축물을 형성하고, 용액의 알코올 농도가 60~80%가 될 때까지 알코올을 농축액에 첨가하고, 물을 상기 농축액에 첨가하여 균일하게 될 때 까지 혼합하고, 상기 혼합물을 냉각 및 여과하고, 얻어진 여과액을 거대공극의 흡착성 수지 컬럼에 도입하고, 수용성 용리제와 알코올 강도가 40~60%인 알코올로 차례대로 컬럼을 용리하고, 용리액을 수거하고 불순물을 제거하며, 용리액을 농축하고 건조시켜 삼지구엽초 추출물을 얻는 단계;

(4) 의약 조성물을 얻기 위해 전통적인 의약 보조제와 단계(2) 및 단계(3)에서 얻어진 추출물을 결합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물의 제조방법.

제 6항에 있어서, 상기 단계(2)에서 상기 수지 컬럼은 pH 8~9인 암모니아수와 알코올 강도가 20%인 알코올로 각각 용리되고; 단계(3)에서 상기 수지 컬럼은 정제수와 알코올 강도가 20%인 알코올로 각각 용리되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 7항에 있어서, 상기 단계(2)에서 불순물의 제거단계는,

정제수를 얻어진 용리액에 첨가하여 40~60%의 알코올 강도를 가지도록 하는 단계; 얻어진 용액을 중성 알루미나 컬럼에 통과시켜 유출물을 수거하는 단계; 활성 탄소를 유출물에 첨가한 후에 20분 동안 환류하는 단계; 유출물을 뜨겁게 유지시켜 판형 여과기로 흡입 여과하는 단계; 얻어진 여과물을 수거하고 농축액을 형성하기 위해 농축하는 단계; 농축액을 적어도 24시간 냉각하고, 여과하는 단계;

단계(3)에서 불순물을 제거하는 단계,

적당량의 규조토를 용리액에 첨가하고 균일하게 될 때까지 혼합하는 단계; 무수 알코올을 사용하여 2~5회 추출하는 단계; 추출물을 결합하여 혼합하고, 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 6항에 있어서, 상기 단계(3)에서 물로 달이는 동안에 물 중량이 허브 중량의 15~25배이고, 첫 번째 추출시간은 30분~2시간이며 다음 추출은 30분~1시간인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 9항에 있어서, 상기 단계(2)에서 컬럼용 거대공극의 흡착성 수지가 AB-8 형태의 수지, D101 형태의 수지 및 DM-130 형태의 수지로부터 선택되고, 상기 단계(3)에서 컬럼용 거대공극의 흡착성 수지가 AB-8 형태의 수지, NKA 형태의 수지 및 S-8 형태의 수지로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 10항에 있어서, 상기 단계(1)에 사용된 전통 중국 허브는 먼저 세척하고 분쇄하여 소정 처방에 따라 칭량하는 단계;

단계 2에서, 인삼근을 알코올 강도가 60~90%인 알코올로 3회 추출하고, 첫번째에서 인삼은 1~2시간 동안 인삼의 8~12배 중량 알코올로 추출하는 단계; 두번째로 1~2시간 동안 인삼의 6~10배 중량의 알코올로 추출하는 단계; 세번째로 30분~1시간 동안 인삼의 6~10배 중량의 알코올로 인삼을 추출하는 단계; 얻어진 추출물은 뜨거울 때 결합 및 여과되고, 감압하에서 농축시켜 농축액을 얻는 단계; 정제수를 농축액에 가하여 균일하게 될 때까지 혼합하는 단계; 혼합물은 24~36시간 동안 냉각되고 실온이 될 때까지 방치한 후, 판형 여과기로 여과하는 단계; 여과물을 정제수로 희석하는 단계; 상기 거대공극의 흡착수지 칼럼은 AB-8형태이고, 상기 수지컬럼은 80%강도의 알코올로 용리하는 단계;

단계 3에서, 삼지구엽초를 4회 추출하는 단계; 첫번째로 삼지구엽초는 30 분~2시간 동안 추출되고 나머지 3번은 각각 30분~1시간 동안 추출되는 단계; 얻어진 추출물을 뜨거울때 결합, 여과하고 감압농축하여 농축물을 얻는 단계; 농축액에 알코올 농도가 70%가 될 때까지 알코올을 첨가하는 단계; 상기 거대공극의 흡착 수지컬럼은 AB-8 형태이고, 수지 컬럼은 강도가 50%인 알코올로 용리하는 단계;

단계 4에서, 1,2-프로필렌 글리콜, 소디움 다이하이드로겐 포스페이트 및 다이소디움 하이드로겐 포스페이트를 단계(2) 및 단계(3)으로부터 얻어지는 추출물의 혼합물에 첨가하는 단계; 주사용 물을 수혼합 용액의 부피가 10~20㎖가 될 때까지 용액에 첨가하는 단계; 얻어진 용액은 열처리 후에 냉각하고, 미세공극막 및 한외여과막으로 차례로 여과하는 단계; 여과물을 충전, 포장 및 살균하여 주사용 의약 조성물을 얻는 단계를 포함함을 특징으로 하는 제조방법.