CN114404598A - 脆弱拟杆菌荚膜多糖a联合pd-1抑制剂在制备治疗皮肤肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了脆弱拟杆菌荚膜多糖A联合PD‑1抑制剂在制备治疗皮肤肿瘤的药物中的应用，特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY‑312的荚膜多糖A与PD‑1抗体能够协同作用，调节免疫因子，改善免疫细胞状态，增强机体抗肿瘤免疫反应，能够显著的抑制皮肤肿瘤的生长和增值速度，包括黑色素瘤和鳞状细胞癌等；所用荚膜多糖A为主要活性成分，可制成药物制剂、药物组合物等生物制剂，给药形式多样，具有较好的应用前景。

Description

脆弱拟杆菌荚膜多糖A联合PD-1抑制剂在制备治疗皮肤肿瘤 的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖A联合PD-1抑制剂在制备治疗皮肤肿瘤的药物中的应用。
背景技术
皮肤肿瘤是起源于皮肤组织的一组肿瘤性疾病，是来自表皮细胞外胚叶及其附属器官的肿瘤，其中非黑色素瘤占98％，黑色素瘤为2％。临床上常见类型包括鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)、黑色素瘤(malignant melanoma，MM)、基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)。
黑色素瘤是黑色素细胞的一种侵袭性、治疗抵抗性的恶性肿瘤。黑色素瘤的发病率在世界范围内稳步上升，造成越来越多的公共卫生问题。目前恶性黑色素瘤包括两个临床极端的谱系。在光谱的一端，薄型原发性皮肤黑色素瘤的特点是相对统一的治疗和高治愈率；在另一端，转移性黑色素瘤的特征是没有被证明有效的治疗和不良的结果。
鳞状细胞癌(SCC)起源于表皮角质形成细胞和附件结构(如汗腺或毛皮脂腺单位)，皮肤鳞状细胞癌(cSCC)是白种人中第二大常见的皮肤癌，约占所有非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)的20％，在此之前出现的是基底细胞癌(BCC)。梅奥诊所最新的研究，从2000至2010年间，鳞状细胞癌诊断增加了263％，基底细胞癌增加了145％。引起非黑色素瘤的主要原因是紫外线(UV)，90％的皮肤癌都是由紫外线引起的，同时还有如遗传，HPV，免疫抑制药物和电离辐射等因素。
目前治疗皮肤肿瘤首选方法仍为手术切除，但术后仍将面临肿瘤清除不完全、术后复发等风险。因此，开发对该疾病更有效的治疗方法是一个迫切的需求。在过去的十年中，免疫检查点阻断(ICB)疗法改变了癌症生物疗法的调色板。与许多仅在细胞或动物模型中证明治疗效果的癌症研究不同，ICB研究在临床应用中取得了前所未有的成功。与干扰素和癌症疫苗等其他免疫疗法相比，靶向CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte-AssociatedAntigen 4，细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4)和PD-1/PD-L1(PD-1，Programmed Death 1,程序性死亡受体，PD-L1，Programmed Cell Death-Ligand 1,程序性死亡受体-配体1)检查点的ICB治疗效果更强、更持久。FDA(Food and Drug Administration，美国食品药品监督管理局)已经批准了基于抗体的ICB药物的临床应用，如Opdivo、 Keytruda和Tecentriq通过阻断细胞表面的PD-L1发挥作用。然而，低应答率、适应性/获得性耐药和不良反应仍然使大多数癌症患者无法获得持续的临床获益。为了克服这些局限，有必要提高我们对免疫检查点在生理和病理环境下的调节的理解，未来的检查点监管研究有很大的发展空间。
有研究表明，免疫检查点抑制剂可削弱肠屏障功能，使假长双歧杆菌产生的关键代谢物肌苷进入血液，并促进了抗肿瘤T细胞免疫。脆弱拟杆菌 (Bacteroides fragilis)为革兰氏染色阴性、杆状、两端钝圆而浓染、有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌，分为产肠毒素型(ETBF)和非产肠毒素型 (NTBF)，是人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。研究发现非产肠毒型脆弱拟杆菌 (NTBF)具有重要的益生作用。脆弱拟杆菌与宿主的关系在很大程度上取决于其高度复杂和动态的荚膜结构，B.fragilis两性离子荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是首个公认的调节宿主免疫系统的发育，逆转无菌动物的形态、细胞和功能缺陷的共生因子。但是目前没有关于利用脆弱拟杆菌的两性离子荚膜多糖与PD-1抑制剂协同治疗皮肤肿瘤的文献记载。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种脆弱拟杆菌荚膜多糖A联合 PD-1抑制剂在制备治疗皮肤肿瘤的药物中的应用，包括在治疗黑色素瘤和鳞状细胞癌药物中的应用。本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312的荚膜多糖A在体内可通过增加 CD8+T/Treg的比值，改善肿瘤微环境，有效地增强免疫检查点抑制剂的治疗效果，特别是PD-1抗体的治疗效果，降低副作用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，提供一种产品组合，包括：
(i)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(a)第一活性成分，所述第一活性成分为脆弱拟杆菌提取物，以及药学上可接受的载体；和
(ii)第二药物组合物，所述第二药物组合物含有(b)第二活性成分，所述第二活性成分为抗免疫检查点的抑制剂，所述免疫检查点选自下组中的一种及一种以上：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4；
以及药学上可接受的载体；
其中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物为不同的药物组合物，或同一药物组合物。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物为脆弱拟杆菌荚膜多糖A。
在其中的一些实施例中，所述是脆弱拟杆菌是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
优选地，所述荚膜多糖A分子量为50～90kDa，优选80-90kDa，Mw分布于70-100KD的部分占总量的70-80％，重均分子量/数均分子量(Mw/Mn)的比值为1.0-1.3，其中，所述荚膜多糖A的结构如下所示：
Figure BDA0003467624420000031
优选地，所述荚膜多糖A的含量超过95wt％，结合脂质含量低于0.02％或不含脂质。
进一步优选地，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法包括以下步骤：
(1)脆弱拟杆菌发酵液经过离心，收集细菌沉淀(菌泥)；
(2)按料液比(m:V)1:3～10，往菌泥中加入纯化水，使细菌重悬；
(3)调节细菌重悬液的pH至2.5～4.0；
(4)细菌重悬液转移至提取容器中，90～110℃提取1.0～2.5h，冷却，离心取上清；
(5)超滤除小分子杂质；
(6)阴离子交换柱层析，20mM Tris-HCl(pH8.5，含0.2mol/L NaCl)梯度洗脱，所用填料可以为DEAE Sepharose Fast Flow等阴离子交换层析填料；
(7)柱层析收集液经超滤除盐、浓缩后，冷冻干燥，密封保存；
在上述的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法中，步骤(3)调节细菌重悬液的pH至2.5～4.0，调节pH用的溶液可以是盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸缓冲盐等无机酸、有机酸或酸性缓冲液中的任意一种；
在上述的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法中，步骤(4)提取温度为 90～110℃，其加热方式可以是但不限于水浴、气浴、蒸汽加热，可以增加但不限于超声、加压等辅助方式；
在上述的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法中，步骤(4)提取时间为 1.0～2.5h；
在上述的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法中，步骤(5)采用10KD超滤膜超滤浓缩。
在其中一些实施例中，所述抗免疫检查点的抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体选自如下中的一种或多种：纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗 (Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维单抗 (avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)。
在其中一些实施例中，所述含有脆弱拟杆菌的第一药物组合物与含有所述免疫检查点抑制剂的第二药物组合物同时或分别给药。
在其中一些实施例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、外用药物剂型和口服剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物可以通过皮下注射、静脉注射、肌内注射的方式给药。
在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。
第二方面，本发明提供了一种药物组合物，包括：
(i)药学有效剂量的脆弱拟杆菌提取物；
(ii)抗免疫检查点的抑制剂，所述免疫检查点抑制剂包括CTLA-4、PD-1、 PD-L1、PD-L2的抗体中的一种或多种；和
(iii)药学上可接受的载体。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌提取物为脆弱拟杆菌荚膜多糖A。
在其中的一些实施例中，所述是脆弱拟杆菌是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
优选地，所述荚膜多糖A分子量为50～90kDa，优选80-90kDa，Mw分布于70-100KD的部分占总量的70-80％，重均分子量/数均分子量(Mw/Mn)的比值为1.0-1.3，其中，所述荚膜多糖A的结构如下所示：
Figure BDA0003467624420000051
优选地，所述荚膜多糖A的含量超过95wt％，结合脂质含量低于0.02％或不含脂质。
进一步优选地，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法包括以下步骤：
(1)脆弱拟杆菌发酵液经过离心，收集细菌沉淀(菌泥)；
(2)按料液比(m:V)1:3～10，往菌泥中加入纯化水，使细菌重悬；
(3)调节细菌重悬液的pH至2.5～4.0；
(4)细菌重悬液转移至提取容器中，90～110℃提取1.0～2.5h，冷却，离心取上清；
(5)超滤除小分子杂质；
(6)阴离子交换柱层析，20mM Tris-HCl(pH8.5，含0.2mol/L NaCl)梯度洗脱，所用填料可以为DEAE Sepharose Fast Flow等阴离子交换层析填料；
(7)柱层析收集液经超滤除盐、浓缩后，冷冻干燥，密封保存；
在上述的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法中，步骤(3)调节细菌重悬液的pH至2.5～4.0，调节pH用的溶液可以是盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸缓冲盐等无机酸、有机酸或酸性缓冲液中的任意一种；
在上述的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法中，步骤(4)提取温度为 90～110℃，其加热方式可以是但不限于水浴、气浴、蒸汽加热，可以增加但不限于超声、加压等辅助方式；
在上述的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法中，步骤(4)提取时间为 1.0～2.5h；
在上述的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法中，步骤(5)采用10KD超滤膜超滤浓缩。
进一步优选地，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A药学有效剂量为1-10mg/kg。
在其中一些实施例中，所述抗免疫检查点的抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体选自如下中的一种或多种：纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗 (Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维单抗 (avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)。
在其中一些实施例中，所述药物组合物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、散剂、混悬剂或口服液。
在其中一些实施例中，所述药物组合物中还包含以下药物可接受的辅料中的一种或多种：稀释剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、矫味剂、包衣剂和/或增溶剂。
在其中一些实施例中，所述药物可接受的辅料包括水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、麦芽糊精、微晶纤维素、硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、单脂肪酸甘油酯和二脂肪酸甘油酯、石化脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
第三方面，本发明提供第一方面所述的产品组合、第二方面所述的药物组合物在制备治疗皮肤肿瘤的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述皮肤肿瘤包括黑色素瘤、鳞状细胞癌和基底细胞癌；优选的，皮肤肿瘤为黑色素瘤。
本发明的技术效果在于：
本发明提取自脆弱拟杆菌的荚膜多糖A能够有效地增强免疫检查点抑制剂，特别是PD-1抗体的治疗效果，降低副作用。该荚膜多糖A与PD-1抗体能够协同作用，调节免疫因子，改善免疫细胞状态，增强机体抗肿瘤免疫反应，能够显著的抑制皮肤肿瘤的生长和增值速度，包括黑色素瘤和鳞状细胞癌等。所用荚膜多糖A为主要活性成分，可制成药物制剂、药物组合物等生物制剂，给药形式多样，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312的菌落特征图；
图2为实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色后的显微镜观察图；
图3A-E分别为实施例2制备得到的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的1H 谱、13C谱、COSY谱、HSQC谱、HMBC谱图；
图4为实施例2制备得到的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的化学结构式；
图5为实施例3中黑色素瘤模型各时间点肿瘤体积生长曲线图；
图6为实施例3中黑色素瘤模型肿瘤中流式分析结果CD8+T细胞与Treg 细胞比率；
注：数据点代表组内每只小鼠的CD8T细胞与Treg细胞的比率，误差线代表标准误(SEM)；
图7为实施例4中鳞状细胞癌模型各时间点肿瘤体积生长曲线图；
图8为实施例4中鳞状细胞癌模型肿瘤中流式分析结果CD8+T细胞与Treg 细胞比率。
注：数据点代表组内每只小鼠的CD8T细胞与Treg细胞的比率，误差线代表标准误(SEM)；
菌种保藏信息：
本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已于2015年4月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏。分类命名：脆弱拟杆菌ZY-312(bacteroides fragilis ZY- 312)，保藏编号CGMCC No.10685。脆弱拟杆菌ZY-312由本发明申请单位自行分离获得，并且已经在授权专利保护(专利号201510459408.X)，按照专利审查指南的规定，公众能够从商业渠道买到或已经授权，不用保藏，即不用提供保藏证明。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下文中，仅仅是为说明，只在实施例中描述了其中一少部分，然而不应将其理解为对本发明的限制。除非特殊说明，否则本发明中所使用的试剂都是市售可购买的。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，所有细胞购自ATCC；所有细胞培养材料及胰酶购自Gibco；所有实验动物购自浙江维通利华实验动物技术有限公司；或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1脆弱拟杆菌活菌液的制备
将脆弱拟杆菌ZY-312菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。
菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上37℃培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1mm-3mm之间，参见图 1。
显微镜下形态：脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。
选取单个菌落接种于植物源蛋白胨液体培养基中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，得脆弱拟杆菌ZY-312活菌菌液。
实施例2脆弱拟杆菌ZY-312提取物荚膜多糖A的制备
1)脆弱拟杆菌发酵液离心，收集菌泥。取50g菌泥，加入300g纯化水使菌体重悬，用1mol/L盐酸溶液调节其pH至3.5，100℃提取1.5h，冷却至室温， 12000g常温离心10min，取上清，得到粗糖溶液。
2)粗糖溶液经10KD超滤膜超滤浓缩、除小分子杂质，至电导率稳定，收集回流液；
3)回流液中加入等体积40mmol/L Tris-HCl(pH＝8.5)转盐；DEAE SepharoseFast Flow离子交换柱层析(16mm×200mm)，流速20mL/min，用含0.2mol/L氯化钠的20mmol/L Tris-HCl(pH＝8.5)线性梯度洗脱25个柱体积(25个柱体积内，流动相中氯化钠浓度由0mol/L升至0.2mol/L)，分段收集，100mL/瓶(组分)， SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，10KD超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干；
4)得到脆弱拟杆菌荚膜多糖A命名为“PSA-ZY-312”。
测试分析：
测试方法：称量30mg步骤(3)所述的脆弱拟杆菌提取物，溶于0.5mL D2O，加入1μl丙酮(1H，2.22；13C，30.89)定标。采用500MHz Bruker核磁共振波谱仪分析1H、13C、COSY、HSQC、HMBC谱(参见附图3A-E)。
测试结果：确证步骤(3)收集的脆弱拟杆菌提取物为荚膜多糖A，结合脂质含量低于0.02％，蛋白残留低于1％，核酸残留低于0.05％。通过GPC(凝胶渗透色谱)分析，制得的荚膜多糖A重均分子量为80-90kDa，Mw/Mn为1.0- 1.2，化学结构参见附图4。
实施例3荚膜多糖A联合PD-1抗体在治疗黑色素瘤中的应用
一.实验设计
为了验证实施例2提供的荚膜多糖A联合PD-1抗体对黑色素瘤的治疗作用。本实施例选用雄性C57BL/6鼠进行实验，并采用移植瘤模型的方法建立小鼠黑色素瘤模型。取对数生长期的黑色素瘤B16F10-luc细胞(以下简称： B16)，调整细胞浓度为约5×106个/mL。C57BL/6鼠背部脱毛，碘伏消毒背部皮肤，皮下注射100μL细胞悬液，然后将接种后的C57BL/6鼠继续饲养，每周观察2-3次。接种细胞悬液约10天后，肿瘤体积约80mm3，选择肿瘤生长大小均匀的动物，随机分为模型组、PD-1抗体(BE-0146,BioXcell)组、中剂量 PSA-ZY-312组、低剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组、中剂量PSA-ZY-312+PD-1 抗体组和高剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组，每组10只小鼠。并以分组当日作为day 0，按表1进行给药，共给药21天。
表1实验动物分组及给药方案
Figure BDA0003467624420000111
给药方法：给药时间点为给药日的上午10点，联合用药组先给药PD-1抗体，再给药活菌/灭活菌。
二.肿瘤测量和实验指标
从day 0开始，每3天用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为： V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
抑瘤疗效用TGI(％)评价，TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
在实验终点，小鼠安乐死。采集6组小鼠肿瘤。所有肿瘤进行称重。肿瘤分为三份，一份速冻，一份于福尔马林中固定，一份用于病理切片。
三.流式上机检测
收集新鲜采集的肿瘤样本剪碎成小块，制备肿瘤组织单细胞悬液，之后抽取1×106个活细胞进行抗体染色。抗体染色固定后，重悬细胞，并转移至流式管中，进行上机检测，每个样本收集至少10,000个活细胞。
四.统计分析
基于实验结束时获得的数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用 T-test(one tailed)进行统计分析。使用GraphPad Prism软件进行所有数据分析，p<0.05认为有显著性差异。
五.实验结果
1.肿瘤体积
给予B16F10-luc细胞皮下荷瘤雄性C57BL/6小鼠受试物治疗后各组肿瘤体积变化如表2所示。
表2.各组不同时间点的瘤体积
Figure BDA0003467624420000121
注：a.平均值±SEM
2.肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图5所示。
3.抗肿瘤药效评价指标
统计基于分组给药后第21天肿瘤体积及瘤重，计算得出受试药物对B16皮下接种模型的生长抑制率。
表3.受试物对B16F10-luc模型的抑瘤药效评价 (基于分组给药后第21天肿瘤体积计算得出)
Figure BDA0003467624420000131
注：a.平均值±SEM；
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％；
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
4.流式实验结果
流式实验结果如图6所示。
六.结果分析
给药期间各组荷瘤小鼠的瘤块体积如表2和图5所示，可见PD-1抗体可以抑制肿瘤体积生长，而PD-1抗体与脆弱拟杆菌荚膜多糖A联合给药可显著降低瘤块体积(p<0.001)。
如表3所示，给药结束后，PD-1抗体组、中剂量PSA-ZY-312、低剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组、中剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组以及高剂量PSA- ZY-312+PD-1抗体组的抑瘤率分别为14.01％、13.53％、64.50％、61.55％和 63.40％。
CD8+T细胞在肿瘤免疫中发挥重要作用，是直接杀伤肿瘤细胞的效应细胞，Treg(调节性T细胞)是肿瘤微环境中一群普遍存在的抑制性T细胞，能抑制肿瘤抗原特异性T细胞的功能。CD8+T/Treg的比值是反映免疫治疗效果和肿瘤微环境变化的一个重要指标，如图6所示，相比模型组和PD-1抗体组， CD8+T/Treg的比值在低剂量、中剂量、高剂量PSA-ZY-312与PD-1抗体联合给药组中显著上升(p<0.05)。
上述数据说明PSA-ZY-312与PD-1抗体联合给药对结黑色素瘤的抑制作用明显优于PD-1抗体单独使用(p<0.01)，且低、中、高剂量的荚膜多糖A联合 PD-1抗体给药的效果之间不存在剂量依赖性(p>0.05)。
由以上实施例的结果可见，本发明方法提取的荚膜多糖A能够有效地增加 PD-1抗体对黑色素瘤的治疗效果。
此外，本发明脆弱拟杆菌夹膜多糖A与PD-1抗体联用在制备黑色素瘤药物中的应用，脆弱拟杆菌夹膜多糖A还在制备PD-1抗体增敏剂中的应用，以脆弱拟杆菌荚膜多糖A为主要活性成分，制成药物制剂、药物组合物等生物制剂，并联合PD-1抗体治疗黑色素瘤，能增加PD-1抗体应答率和治疗效果。
实施例4荚膜多糖A联合PD-1抗体在治疗鳞状细胞癌中的应用
一.实验设计
为了验证实施例2提供的荚膜多糖A联合PD-1抗体对鳞状细胞癌的治疗作用。本实施例选用免疫缺陷小鼠BALB/c裸鼠进行实验，并采用移植瘤模型的方法建立小鼠鳞状细胞癌模型。取对数生长期的人鳞状细胞癌A431细胞，胰酶消化计数后，制成107个/mL的细胞悬液。取100μL细胞悬液，注射到小鼠后腿侧面的皮下。移植后，待肿瘤长出后，体积达到62mm3，选择肿瘤生长大小均匀的动物，随机分为模型组、PD-1抗体(BE-0146,BioXcell)组、中剂量PSA-ZY-312组、低剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组、中剂量PSA-ZY- 312+PD-1抗体组和高剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组，每组10只小鼠。并以分组当日作为day 0，按表4进行给药，共给药27天。开始分组给药，每周测量小鼠肿瘤的体积和小鼠的体重。
表4实验动物分组及给药方案
Figure BDA0003467624420000151
二.肿瘤测量和实验指标
从day 0开始，每3天用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为： V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
抑瘤疗效用TGI(％)评价，TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
在实验终点，小鼠安乐死。采集6组小鼠肿瘤。所有肿瘤进行称重。肿瘤分为三份，一份速冻，一份于福尔马林中固定，一份用于病理切片。
三.流式上机检测
收集新鲜采集的肿瘤样本剪碎成小块，制备肿瘤组织单细胞悬液，之后抽取1×106个活细胞进行抗体染色。抗体染色固定后，重悬细胞，并转移至流式管中，进行上机检测，每个样本收集至少10,000个活细胞。
四.统计分析
基于实验结束时获得的数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用 T-test(two-tailed)进行统计分析。使用GraphPad Prism软件进行所有数据分析，p<0.05认为有显著性差异。
五.实验结果
1.肿瘤体积
给予A431细胞皮下荷瘤雄性BALB/c裸鼠受试药物治疗后各组肿瘤体积变化如表5所示。
表5各组不同时间点的瘤体积
Figure BDA0003467624420000161
注：a.平均值±SEM
2.肿瘤生长曲线
肿瘤生长曲线如图7所示。
3.抗肿瘤药效评价指标
统计基于分组给药后第27天肿瘤体积及瘤重，计算得出受试药物对A431 皮下接种模型的生长抑制率。
表6.受试物对A431模型的抑瘤药效评价(基于分组给药后第27天肿瘤体积计算得出)
Figure BDA0003467624420000171
注：a.平均值±SEM；
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％；
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(two-tailed)方法计算。
4.流式实验结果
流式实验结果如图8所示。
五.结果分析
给药期间各组荷瘤小鼠的瘤块体积如表5和图7所示，可见PD-1抗体可降低肿瘤的体积，而PD-1抗体与脆弱杆菌荚膜多糖A联合给药可显著降低瘤块体积(p<0.001)。
通过表6可得到，给药结束后，PD-1抗体组、中剂量PSA-ZY-312、低剂量 PSA-ZY-312+PD-1抗体组、中剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组以及高剂量PSA- ZY-312+PD-1抗体组的抑瘤率分别为24.99％、23.80％、71.55％、73.11％和71.95％。
CD8+T细胞在肿瘤免疫中发挥重要作用，是直接杀伤肿瘤细胞的效应细胞，Treg(调节性T细胞)是肿瘤微环境中一群普遍存在的抑制性T细胞，能抑制肿瘤抗原特异性T细胞的功能。CD8+T/Treg的比值是反映免疫治疗效果和肿瘤微环境变化的一个重要指标，如图8所示，相比模型组和PD-1抗体组， CD8+T/Treg的比值在低剂量、中剂量、高剂量PSA-ZY-312与PD-1抗体联合给药组中显著上升(p<0.05)。
上述数据说明PSA-ZY-312与PD-1抗体联合给药对鳞状细胞癌的抑制作用明显优于PD-1抗体单独使用(p<0.01)，且低、中、高剂量的荚膜多糖A联合 PD-1抗体给药的效果之间不存在剂量依赖性(p>0.05)。
由以上实施例的结果可见，本发明方法提取的荚膜多糖A能够有效地增加 PD-1抗体对鳞状细胞癌的治疗效果。
本发明脆弱拟杆菌夹膜多糖A与PD-1抗体联用在制备鳞状细胞癌药物中的应用，及脆弱拟杆菌夹膜多糖A在制备PD-1抗体增敏剂中的应用，以脆弱拟杆菌荚膜多糖A为主要活性成分，制成药物制剂、药物组合物等生物制剂，并联合PD-1抗体治疗鳞状细胞癌，能增加PD-1抗体应答率和治疗效果。
因此，本发明提供的脆弱拟杆菌荚膜多糖A与免疫检查点抑制剂可以协同治疗皮肤肿瘤，显著增强免疫抑制剂的应答率和治疗效果，具有较好的应用前景和潜在开发价值。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

Claims (10)

1.一种产品组合，其特征在于，包括：
(i)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(a)第一活性成分，所述第一活性成分为脆弱拟杆菌提取物，以及药学上可接受的载体；和
(ii)第二药物组合物，所述第二药物组合物含有(b)第二活性成分，所述第二活性成分为抗免疫检查点的抑制剂，所述免疫检查点选自下组中的一种及一种以上：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4；
以及药学上可接受的载体；
其中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物为不同的药物组合物，或同一药物组合物。
2.根据权利要求1所述的产品组合，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物为脆弱拟杆菌荚膜多糖A。
3.根据权利要求2所述的产品组合，其特征在于，所述是脆弱拟杆菌是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312；
优选地，所述荚膜多糖A分子量为50～90kDa，优选80-90kDa，Mw分布于70-100KD的部分占总量的70-80％，重均分子量/数均分子量(Mw/Mn)的比值为1.0-1.3，其中，所述荚膜多糖A的结构如下所示：
Figure FDA0003467624410000011
优选地，所述荚膜多糖A的含量超过95wt％，结合脂质含量低于0.02％或不含脂质；
进一步优选地，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法包括以下步骤：
(1)脆弱拟杆菌发酵液经过离心，收集细菌沉淀(菌泥)；
(2)按料液比(m:V)1:3～10，往菌泥中加入纯化水，使细菌重悬；
(3)调节细菌重悬液的pH至2.5～4.0；
(4)细菌重悬液转移至提取容器中，90～110℃提取1.0～2.5h，冷却，离心取上清；
(5)超滤除小分子杂质；
(6)阴离子交换柱层析，20mM Tris-HCl(pH8.5，含0.2mol/L NaCl)梯度洗脱，所用填料可以为DEAE Sepharose Fast Flow等阴离子交换层析填料；
(7)柱层析收集液经超滤除盐、浓缩后，冷冻干燥，密封保存；
优选地，步骤(3)调节细菌重悬液的pH至2.5～4.0，调节pH用的溶液可以是盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸缓冲盐等无机酸、有机酸或酸性缓冲液中的任意一种；
优选地，步骤(4)提取温度为90～110℃，其加热方式可以是但不限于水浴、气浴、蒸汽加热，可以增加但不限于超声、加压等辅助方式；
优选地，步骤(4)提取时间为1.0～2.5h；
优选地，步骤(5)采用10KD超滤膜超滤浓缩。
4.根据权利要求1-3任一项所述的产品组合，其特征在于，所述抗免疫检查点的抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、或其组合；
优选地，所述抗体选自如下中的一种或多种：纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、阿特朱单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗。
5.根据权利要求1-4任一项所述的产品组合，其特征在于，所述含有脆弱拟杆菌的第一药物组合物与含有所述免疫检查点抑制剂的第二药物组合物同时或分别给药；
优选地，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、外用药物剂型和口服剂型；
进一步优选地，所述药物组合物可以通过皮下注射、静脉注射、肌内注射的方式给药；
进一步优选地，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂；
优选地，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。
6.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(i)药学有效剂量的脆弱拟杆菌提取物；
(ii)抗免疫检查点的抑制剂，所述免疫检查点抑制剂包括CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2的抗体中的一种或多种；和
(iii)药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述脆弱拟杆菌提取物为脆弱拟杆菌荚膜多糖A。
8.根据权利要求7所述的产品组合，其特征在于，所述是脆弱拟杆菌是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312；
优选地，所述荚膜多糖A分子量为50～90kDa，优选80-90kDa，Mw分布于70-100KD的部分占总量的70-80％，重均分子量/数均分子量(Mw/Mn)的比值为1.0-1.3，其中，所述荚膜多糖A的结构如下所示：
Figure FDA0003467624410000031
优选地，所述荚膜多糖A的含量超过95wt％，结合脂质含量低于0.02％或不含脂质；
进一步优选地，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A的制备方法包括以下步骤：
(1)脆弱拟杆菌发酵液经过离心，收集细菌沉淀(菌泥)；
(2)按料液比(m:V)1:3～10，往菌泥中加入纯化水，使细菌重悬；
(3)调节细菌重悬液的pH至2.5～4.0；
(4)细菌重悬液转移至提取容器中，90～110℃提取1.0～2.5h，冷却，离心取上清；
(5)超滤除小分子杂质；
(6)阴离子交换柱层析，20mM Tris-HCl(pH8.5，含0.2mol/L NaCl)梯度洗脱，所用填料可以为DEAE Sepharose Fast Flow等阴离子交换层析填料；
(7)柱层析收集液经超滤除盐、浓缩后，冷冻干燥，密封保存；
优选地，步骤(3)调节细菌重悬液的pH至2.5～4.0，调节pH用的溶液可以是盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸缓冲盐等无机酸、有机酸或酸性缓冲液中的任意一种；
优选地，步骤(4)提取温度为90～110℃，其加热方式可以是但不限于水浴、气浴、蒸汽加热，可以增加但不限于超声、加压等辅助方式；
优选地，步骤(4)提取时间为1.0～2.5h；
优选地，步骤(5)采用10KD超滤膜超滤浓缩；
进一步优选地，所述脆弱拟杆菌荚膜多糖A药学有效剂量为1-10mg/kg。
9.根据权利要求6-8任一项所述的组合物，其特征在于，所述抗免疫检查点的抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、或其组合；
优选地，所述抗体选自如下中的一种或多种：纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、阿特朱单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗。
10.权利要求1-5任一项所述的产品组合、权利要求6-9任一项所述的药物组合物在制备治疗皮肤肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述皮肤肿瘤包括黑色素瘤、鳞状细胞癌和基底细胞癌。
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