CN114392356B - 脆弱拟杆菌与免疫检查点抑制剂联用在治疗消化系统肿瘤中的应用 - Google Patents

脆弱拟杆菌与免疫检查点抑制剂联用在治疗消化系统肿瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了脆弱拟杆菌与免疫检查点抑制剂联用在治疗消化系统肿瘤中的应用，特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY‑312及其灭活菌与免疫检查点抑制剂，包括PD‑1抗体或PD‑L1抗体联合应用，在体内可通过增加CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，下调肿瘤内细胞因子IL‑10，或上调INF‑γ的水平，能有效抑制小鼠体内移植肿瘤的生长。还可以与手术、放疗、化疗等治疗手段联合应用，显著提高综合疗效，减轻放化疗对机体的伤害，有效预防肿瘤的发生发展及其复发转移，提高患者的生活质量。

Description

脆弱拟杆菌与免疫检查点抑制剂联用在治疗消化系统肿瘤中 的应用
技术领域
本发明涉及一种脆弱拟杆菌的应用技术，特别是一种脆弱拟杆菌与免疫抑制剂联用在治疗消化系统肿瘤中的应用。
背景技术
消化系统恶性肿瘤已成为全球化的重大公共卫生问题以及死亡的主要原因。在中国，消化系统肿瘤导致了超过50％的癌症相关死亡。虽然外科手术、化疗、放疗等恶性肿瘤治疗方法不断发展，但肿瘤的诊断和预后仍不容乐观。对于无手术根治机会或转移性肿瘤患者，目前多采取以全身药物治疗为主的综合治疗。全身药物治疗主要包括使用化疗药物、分子靶向药物及免疫治疗。免疫治疗是目前最热门的肿瘤治疗手段。肿瘤免疫治疗主要包括免疫疫苗治疗、免疫检查点抑制剂治疗、过继性免疫细胞治疗、细胞因子治疗等，其中免疫检查点抑制剂治疗以其显著的临床疗效而备受瞩目。
免疫检查点本是人体免疫系统中起保护作用的分子，起类似刹车的作用，防止T细胞过度激活导致的炎症损伤等。而肿瘤细胞利用人体免疫系统这一特性，通过过度表达免疫检查点分子，抑制人体免疫系统反应，逃脱人体免疫监视与杀伤，从而促进肿瘤细胞的生长。适度抑制免疫检查点分子及其配体的表达能够增强T细胞对肿瘤的杀伤效应，达到抗肿瘤的目的。已被公布的免疫检查点有CTLA-4、PD-1/PD-L1、LAG-3、TIM-3、VISTA、A2aR等。程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)在多种淋巴细胞上表达，尤其在肿瘤特异性T细胞上表达。在肿瘤微环境中，它通过干扰保护性免疫应答而导致恶性肿瘤细胞的扩张。它具有两个配体，即程序性细胞死亡配体1和2(PD-L1、PD-L2)，其中，PD-L1被肿瘤细胞表达，以逃逸免疫系统对它进行的抗肿瘤反应。阻断PD-1和PD-L1间的作用可以在T细胞进入肿瘤微环境后保持T细胞的应答，保证T细胞的抗肿瘤作用。目前，美国食品与药品管理局已通过6种免疫检查点抑制剂(ICIs)应用于肿瘤治疗：(1)IpilimumabCTLA-4单抗，用于手术不能切除或转移性黑色素瘤；(2)Nivolumab/>(3)Pembrolizumab/>(4)Atezolizumab/>(5)Avelumab/>(6)Durvalumab/>均为PD-1/L1单抗剂，适用于晚期黑色素瘤、非小细胞型肺癌、经典型霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌等肿瘤治疗。
已有报道显示，在PD-1/PD-L1抑制剂的疗效中，双歧杆菌起到了促进作用，联用短双歧杆菌-长双歧杆菌-PD-1抗体可使得黑色素瘤生长几乎完全停止。此外，肠道中高含量的A.mucinophilia和F.prausnitzii与对PD-1治疗的良好反应相关。
脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)为革兰氏染色阴性、杆状、两端钝圆而浓染、有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌，分为产肠毒素型(ETBF)和非产肠毒素型(NTBF)，是人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。研究发现非产肠毒型脆弱拟杆菌(NTBF)具有重要的益生作用。能够调控T细胞扩张和产生阻碍致病性Th17细胞发育的细胞因子IL-10，具有抗炎作用，被认为是具有潜力的新一代益生菌。已有多项研究表明NTBF能够分泌抑炎细胞因子IL-10，促进Th1/Th2细胞的平衡，能够抵抗肠道炎症，对DSS诱导的结肠炎具有治疗作用。
尽管肠道菌群与免疫抑制点间具有良好的相互作用，但还没有出现专为增强免疫检查点抑制剂而开发的微生态制剂。因此，有必要探索脆弱拟杆菌与免疫检查点抑制剂共同用药从而抗癌的应用。
发明内容
为克服现有技术中所存在的上述问题，本发明的目的是提供一种脆弱拟杆菌与免疫检查点抑制剂联用治疗消化系统肿瘤中的应用。本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312与PD-1抗体或PD-L1抗体联合使用增加肿瘤内CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，上调抗肿瘤细胞因子IL-2、INF-γ的水平或下调IL-10的水平，减缓肿瘤生长速度，降低移植瘤的重量，可有效地防治癌症。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种产品组合，包括：
(i)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(a)第一活性成分，所述第一活性成分为脆弱拟杆菌，以及药学上可接受的载体；和
(ii)第二药物组合物，所述第二药物组合物含有(b)第二活性成分，所述第二活性成分为抗免疫检查点的抑制剂，所述免疫检查点选自下组：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、A2aR或其组合；优选的，所述免疫检查点抑制剂为PD-1或PD-L1；
以及药学上可接受的载体；
其中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物为不同的药物组合物，或同一药物组合物。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是活菌、形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌中的一种及以上。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
在其中一些实施例中，所述抗免疫检查点的抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体选自如下中的一种或多种：纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)。
在其中一些实施例中，所述含有脆弱拟杆菌的第一药物组合物与含有所述免疫检查点抑制剂的第二药物组合物同时或分别给药。
在其中一些实施例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、外用药物剂型和口服剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物可以通过皮下注射、静脉注射、肌内注射的方式给药。
在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。
第二方面，本发明提供了一种药物组合物，包括：
(i)药学有效剂量的脆弱拟杆菌；
(ii)抗免疫检查点的抑制剂，所述免疫检查点选自下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA和A2aR；优选的，所述免疫检查点抑制剂为PD-1或PD-L1；和
(iii)药学上可接受的载体。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是活菌、形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌中的一种及以上。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
在另一优选例中，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
在另一优选例中，所述药学效剂量为106-1010CFU。
在其中一些实施例中，所述抗免疫检查点的抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体选自如下中的一种或任意组：纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)。。
在其中一些实施例中，所述药物组合物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、散剂、混悬剂或口服液。
在其中一些实施例中，所述药物组合物中还包含以下药物可接受的辅料中的一种或多种：稀释剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、矫味剂、包衣剂和/或增溶剂。
在其中一些实施例中，所述药物可接受的辅料包括水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、麦芽糊精、微晶纤维素、硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、单脂肪酸甘油酯和二脂肪酸甘油酯、石化脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
第三方面，本发明提供第一方面所述的产品组合、第二方面所述的药物组合物在制备治疗消化系统肿瘤的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述消化系统肿瘤包括肝癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、胆囊癌、结肠癌、直肠癌中的一种或多种。
本发明的有益效果：
本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312及其灭活菌与免疫检查点抑制剂，包括PD-1抗体或PD-L1抗体联合应用，在体内可通过增加CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，下调肿瘤内细胞因子IL-10，或上调TNF-α和INF-γ的水平，能有效抑制小鼠体内移植肿瘤的生长。还可以与手术、放疗、化疗等治疗手段联合应用，显著提高综合疗效，减轻放化疗对机体的伤害，有效预防肿瘤的发生发展及其复发转移，提高患者的生活质量。
本发明采用的脆弱拟杆菌ZY-312不含BFT基因，是非产毒菌株，急性毒性证实，该菌株对正常小鼠和裸鼠均无致病性(Wang Y，Deng H，Li Z，Tan Y，Han Y，Wang X，Du Z，LiuY，Yang R，Bai Y，Bi Y，Zhi F.Safety Evaluation of a Novel Strain of Bacteroidesfragilis.Front Microbiol.2017Mar 17；8:435.)。根据专利ZL201510459408.X和科技文献Xu W，Su P，Zheng L，Fan H，Wang Y，Liu Y，Lin Y，Zhi F.In vivo Imaging of a NovelStrain of Bacteroides fragilis via Metabolic Labeling.Front Microbiol.2018Oct1；9:2298.的报道，该菌株对胃酸、胆盐有着较好的耐性，能够保证其在胃中的存活和有效定植。
附图说明
图1为实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312的菌落特征图；
图2为实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色后的显微镜观察图；
菌种保藏信息：
本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已于2015年4月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏。分类命名：脆弱拟杆菌ZY-312(bacteroides fragilis ZY-312)，保藏编号CGMCC No.10685。脆弱拟杆菌ZY-312由本发明申请单位自行分离获得，并且已经在授权专利保护(专利号201510459408.X)，按照专利审查指南的规定，公众能够从商业渠道买到或已经授权，不用保藏，即不用提供保藏证明。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，所有细胞购自ATCC；所有细胞培养材料购自Gibco；所有实验动物购自浙江维通利华实验动物技术有限公司。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1脆弱拟杆菌活菌液、灭活菌液的制备
将脆弱拟杆菌ZY-312菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。
菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上37℃培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1mm-3mm之间，参见图1。
显微镜下形态：脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。
1)选取单个菌落接种于植物源蛋白胨液体培养基中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，得脆弱拟杆菌ZY-312活菌菌液。
2)常规热灭活所得脆弱拟杆菌ZY-312活菌液，得脆弱拟杆菌灭活菌液。
本实施例获得的脆弱拟杆菌ZY-312活菌菌液或灭活菌液用于以下各实施例中。
实施例2脆弱拟杆菌联合PD-1抗体在治疗肝癌中的应用
一、实验方法
肝癌成瘤造模：本实施例选用5周龄的ICR纯系雄性小鼠110只，体重22g左右。取对数生长期的小鼠肝癌细胞H22(购自ATCC)，用PBS调整细胞数为1×107cell/mL，在小鼠右侧前肢腋窝下接种0.2mL细胞悬液，小鼠接种部位长出小的肿瘤块为造模成功。
实验分组：肿瘤平均体积达到约68mm3时开始分组给药。随机分为11组，即空白组，模型组，PD-1抗体组(CD-0146,BioXcell，15mg/kg)，ZY-312活菌组(1010CFU/只)，ZY-312灭活菌组(1010Cells/只)，ZY-312活菌联用PD-1抗体(低(106CFU/只)、中(108CFU/只)、高(1010CFU/只))组，ZY-312灭活菌联用PD-1抗体低((106Cells/只)、中(108Cells/只)、高(1010Cells/只))组，每组10只。
给药方案：空白组、模型组动物每日口服300μL生理盐水，根据体重每周两次腹腔注射15μL/g PBS；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μL，PD-1抗体给药体积为15μL/g。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每三天测量一次肿瘤体积。给药后第30天(D30)，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤组织、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。所有肿瘤称重和拍照。肿瘤分为三份，一份冻存用于细胞因子检测，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
检测项目与方法：
肿瘤体积与肿瘤生长抑制率：每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100。
相对肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100(TRTV：治疗组RTV；CRTV：同型对照组RTV)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumorvolume，RTV)，计算公式为RTV＝Vt/V0，其中V0是分组给药时(即d0)测量所得平均肿瘤体积，Vt为某一次测量时的平均肿瘤体积，TRTV与CRTV取同一天数据。
肿瘤内T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤内CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。
细胞因子检测：luminex技术检测小鼠肿瘤中IL-10和INF-γ的含量。
数据统计与分析：所有数据均以x±s表示，应用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计意义。
二、实验结果
1.抗肿瘤的药效评价
表1抑制肝癌肿瘤生长的药效评价
注：
a.平均值±SEM。
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式T/C％＝TRTV/CRTV×100％和TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100计算。
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
根据如上表1可知，与模型组相比，PD-1抗体、脆弱拟杆菌ZY-312单独用药时及与PD-1抗体联合用药时，均显示出抑制肿瘤生长的作用，且三者的抑瘤效果强弱依次为：脆弱拟杆菌<anti-PD-1<脆弱拟杆菌+anti-PD-1。说明脆弱拟杆菌具有一定的抑制肝癌细胞肿瘤生长的作用，且将其与PD-1抗体联合使用时，显示出更强的抑瘤生长效果。也就是说，脆弱拟杆菌ZY-312可以在一定程度上与PD-1抗体联合使用抑制肝细胞肿瘤增长。进一步的，由表1还可以看出，无论是脆弱拟杆菌活菌液还是灭活的脆弱拟杆菌，都显示出抑瘤作用，特别是脆弱拟杆菌ZY-312的活菌液组对抑制肿瘤生长效果的增强更显著。由此可见，脆弱拟杆菌ZY-312联用PD-1抗体在治疗肝癌中具有潜力，能够协同增强抑制肝癌肿瘤细胞的增长速度。
2.T细胞亚群
表2免疫细胞亚群在CD45+细胞中比例(％)
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
如表2所示，与模型组相比，各给药组均不同程度地上调了肿瘤内CD4+T细胞占总细胞的比例。脆弱拟杆菌联用PD-1抗体组的上调幅度大于单独给药组，ZY-312联用抗体组具有显著性差异(p＜0.05)。各给药组均不同程度地上调了肿瘤内CD8+T细胞占总细胞的比例。脆弱拟杆菌联用PD-1抗体组的上调幅度大于单独给药组，ZY-312联用抗体组具有显著性差异(p＜0.05)。
可见，说明联用组具有更强的抑制肿瘤生长的作用。
3.细胞因子检测
表3小鼠肿瘤中细胞因子的含量
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
如表3所示，与模型组相比，各给药组均不同程度地下调了肿瘤内IL-10的水平，上调了肿瘤内INF-γ的水平。脆弱拟杆菌ZY-312联用PD-1抗体组的上调幅度大于单独给药组(P<0.05)。可见，脆弱拟杆菌联用PD-1抗体能够更有效地调节小鼠体内的炎症因子水平。原因推测是用脆弱拟杆菌和PD-1联用致使小鼠PD-1的基因表达量显著降低，阻断信号通路，增强了小鼠的自身免疫力，增强了T细胞的活力，T细胞活力的增强会增加IFN-γ的释放和降低了IL-10的释放。
综上所述，通过实验发现给药组的小鼠肿瘤生长缓慢具有明显的抑瘤作用。脆弱拟杆菌与PD-1抗体联用能够协同作用，下调了肿瘤内IL-10的水平或上调了肿瘤内INF-γ的水平，抑制肝癌的肿瘤细胞生长速度，具有一定的抗肿瘤效果。
实施例3脆弱拟杆菌联合PD-1抗体在治疗食管癌中的应用
一、实验方法
本实施例选用7周龄的C57BL/6雌性小鼠进行验证，建立食管癌模型。食管癌建模：将4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)溶于1，2-丙二醇配成浓度为5g/L的液体，稀释成浓度为5mg/mL的溶液。让C57BL/6雌性小鼠饮用含100μg/mL的4-NQO的灭菌水，饮用10周后，改饮用正常水。成功建立C57BL/6食管癌模型。肿瘤体积达到100mm3时(D0)，随机分为11组。即空白组，模型组，PD-1抗体组(CD-0146,BioXcell，15mg/kg)，ZY-312活菌组(1010CFU/只)，ZY-312灭活菌组(1010Cells/只)，ZY-312活菌联用PD-1抗体(低(106CFU/只)、中(108CFU/只)、高(1010CFU/只))组，ZY-312灭活菌联用PD-1抗体低((106Cells/只)、中(108Cells/只)、高(1010Cells/只))组，每组10只。
给药方案：从D0开始，空白组、模型组动物每日口服300μL生理盐水，根据体重每周两次腹腔注射10μL/g PBS；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μL，PD-1抗体给药体积为10μL/g。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每两天测量一次肿瘤体积。给药后第25天(D25)，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。所有肿瘤称重和拍照。肿瘤分为三份，一份冻存用于细胞因子检测，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
检测项目与方法：
肿瘤体积与肿瘤生长抑制率：每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
肿瘤体积与肿瘤生长抑制率：每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100。
相对肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100(TRTV：治疗组RTV；CRTV：同型对照组RTV)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumorvolume，RTV)，计算公式为RTV＝Vt/V0，其中V0是分组给药时(即d0)测量所得平均肿瘤体积，Vt为某一次测量时的平均肿瘤体积，TRTV与CRTV取同一天数据。
肿瘤内T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤内CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。
细胞因子检测：luminex技术检测小鼠血清中IL-10和INF-γ的含量。
数据统计与分析：所有数据均以x±s表示，应用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计意义。
二、试验结果
1.抗肿瘤的药效评价
表4抗食管癌肿瘤的药效评价
注：
a.平均值±SEM。
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式T/C％＝TRTV/CRTV×100％和TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100计算。
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
根据表4可知，与空白组相比，小鼠产生明显肿瘤瘤块，造模成功。与模型组相比，PD-1抗体、脆弱拟杆菌ZY-312单独用药时及与PD-1抗体联合用药时，均显示出抑制肿瘤生长的作用，且三者的抑瘤效果强弱依次为：脆弱拟杆菌<anti-PD-1<脆弱拟杆菌+anti-PD-1(P<0.01)，说明脆弱拟杆菌具有一定的抑制食管癌细胞肿瘤生长的作用，且将其与PD-1抗体联合使用时，显示出更强的抑瘤生长效果。也就是说，脆弱拟杆菌ZY-312可以在一定程度上与PD-1抗体协同抑制食管细胞肿瘤增长。进一步的，由表4还可以看出，无论是脆弱拟杆菌活菌液还是灭活的脆弱拟杆菌，都显示出抑瘤作用，特别是脆弱拟杆菌ZY-312的活菌液组对抑制肿瘤生长效果的增强更显著。由此可见，脆弱拟杆菌ZY-312联用PD-1抗体在治疗食管癌中具有潜力，能够协同增强抑制食管癌肿瘤细胞的增长速度。
2.T细胞亚群
表5免疫细胞亚群在CD45+细胞中比例(％)
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
由表5可以看出，相比于anti-PD-1单药组和ZY-312单药组，低、中、高剂量ZY-312+Anti-PD-1(p<0.05)联合给药组中CD45+TIL的比例有上升的趋势，表明这几个组小鼠经给药后肿瘤内淋巴细胞的浸润有所增加。CD8+T细胞在肿瘤免疫中发挥重要作用，是直接杀伤肿瘤细胞的效应细胞，其比率在低剂量、中剂量、高剂量ZY-312+Anti-PD-1联合给药组中增加。Treg(调节性T细胞)是肿瘤微环境中一群普遍存在的抑制性T细胞，能抑制肿瘤抗原特异性T细胞的功能，CD8+T/Treg ratio值是反映免疫治疗效果和肿瘤微环境变化的一个重要指标，相比于单用药组，CD8+T/Treg ratio值在低、中、高剂量ZY-312+Anti-PD-1联合给药组中增加更明显。可见，联用组具有更强的抑制肿瘤生长的作用。
3.细胞因子检测
表6血清中细胞因子的水平
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
如表6所示，与模型组相比，各给药组均不同程度地下调了肿瘤内IL-10的水平(P<0.05)，上调了肿瘤内INF-γ的水平。脆弱拟杆菌ZY-312联用PD-1抗体组(p<0.05)的上调幅度大于单独给药组。可见，脆弱拟杆菌联用PD-1抗体能够更有效地调节小鼠体内的炎症因子水平。原因推测是用脆弱拟杆菌和PD-1联用致使小鼠组织中的PD-1的基因表达量显著降低，阻断信号通路，增强了小鼠的自身免疫力，增强了T细胞的活力，T细胞活力的增强会增加IFN-γ的释放和降低了IL-10的释放。
综上所述，脆弱拟杆菌联用PD-1抗体能够改善肿瘤组织中的炎症因子的水平、提高免疫细胞的水平，提高提高T细胞的免疫活力，抑制癌症肿瘤的增长。脆弱拟杆菌表现出与抗体PD-1的协同增效作用，增强治疗食管癌肿瘤效果。
实施例4脆弱拟杆菌联合PD-L1抗体在治疗胃癌中的应用
一、实验方法
本实施例选用4周龄的BALB/c裸鼠进行验证，建立胃癌模型。胃癌成瘤造模：将SGC7901胃癌细胞(购自ATCC)消化后，调整细胞浓度为2×107cell/mL，向小鼠皮下注射0.2mL细胞悬液，小鼠接种部位长出小的肿瘤为造模成功。肿瘤体积达到75-100mm3时(D0)随机分为9组，即空白组，模型组，PD-L1抗体(CD-0101,BioXcell，，200μg/只)，ZY-312低(106CFU/只)、中(108CFU/只)、高(1010CFU/只)组，ZY-312活菌联用PD-L1抗体低(106CFU/只)、中(108CFU/只)、高(1010CFU/只)组，每组10只。
给药方式：除空白组外，从D0开始，空白组、模型组动物每日口服300μL生理盐水，每周两次腹腔注射200μL PBS；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μL，PD-L1抗体给药体积为200μL。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每两天测量一次肿瘤体积。给药后第21天(D21)，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。所有肿瘤称重和拍照。肿瘤分为三份，一份冻存用于细胞因子检测，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
检测项目与方法：
肿瘤体积与肿瘤生长抑制率：每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100。
相对肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100(TRTV：治疗组RTV；CRTV：同型对照组RTV)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumorvolume，RTV)，计算公式为RTV＝Vt/V0，其中V0是分组给药时(即d0)测量所得平均肿瘤体积，Vt为某一次测量时的平均肿瘤体积，TRTV与CRTV取同一天数据。
肿瘤内T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤内CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。
细胞因子检测：luminex技术检测小鼠血清中IL-2和INF-γ的含量。
PD-L1相关蛋白检测：使用免疫印迹法检测PD-L1相关蛋白的含量。
数据统计与分析：所有数据均以x±s表示，应用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计意义。
二、试验结果
1.抑瘤药效评价
表7抑制胃癌肿瘤生长的药效评价
注：
a.平均值±SEM。
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式T/C％＝TRTV/CRTV×100％和TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100计算。
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
根据如上表7可知，与空白组相比，移植瘤小鼠产生明显肿瘤瘤块，造模成功。与模型组相比，PD-L1抗体、脆弱拟杆菌ZY-312单独用药时及脆弱拟杆菌ZY-312与PD-L1抗体联合用药时，均显示出抑制肿瘤生长的作用，且三者的抑瘤效果强弱依次为：脆弱拟杆菌<anti-PD-L1<脆弱拟杆菌+anti-PD-L1(p＜0.01)。由此可见，脆弱拟杆菌ZY-312联用PD-L1抗体在治疗胃癌中具有潜力，能够增强抑制肿瘤细胞的增长速度。
2.PD-L1蛋白水平
表8小鼠肿瘤组织中PD-L1蛋白水平的检测
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
如表8所示，使用免疫印迹法对上述各组鼠肿瘤组织中PD-L1蛋白质的表达水平进行检测,与模型组比较,各给药组小鼠肿瘤组织中PD-L1的蛋白质的表达降低。其中PD-L1抗体联合脆弱拟杆菌给药组肿瘤组织中的PD-L1的表达量降低最明显,具有统计学差异(P<0.05)。而PD-L1和脆弱拟杆菌ZY-312单独给药组的肿瘤组织中PD-L1的表达水平不存在显著性差异。
3.细胞因子检测
表9血清中细胞因子的含量
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
如表9所示，与模型组相比，各给药组均不同程度地上调了肿瘤内INF-γ的水平，不同程度地下调了IL-10的水平。脆弱拟杆菌联用PD-L1抗体组的上调幅度大于单独给药组，ZY-312联用PD-L1抗体组具有显著性差异(p＜0.01)。可见，脆弱拟杆菌联用PD-L1抗体能够更有效地调节小鼠体内的炎症因子水平。原因推测是用脆弱拟杆菌和PD-L1联用致使小鼠组织中的PD-L1的基因表达量显著降低，阻断信号通路，增强了小鼠的自身免疫力，增强了T细胞的活力，T细胞活力的增强会增加IFN-γ的释放和降低了IL-10的释放。
实施例5脆弱拟杆菌联合PD-1抗体在治疗结直肠癌中的应用
一、实验方法
本实施例选用8周龄的BALB/c雌性小鼠进行验证，建立结直肠癌模型。造模：取对数生长期CT26细胞(购自ATCC)，制成单细胞悬液2×106cell/mL，在小鼠右前肢腋下皮下注射0.2mL细胞悬液，小鼠接种部位长出小的肿瘤块为造模成功。肿瘤体积达到100mm3时(D0)随机分9组，即空白组，模型组，PD-1抗体组(BE0273，BioXcell，10mg/kg)，ZY-312活菌组(低(106CFU/只)、中(108CFU/只)、高(1010CFU/只))，ZY-312活菌联用PD-1抗体(低(106CFU/只)、中(108CFU/只)、高(1010CFU/只))组，每组10只。
给药方式：从D0开始，空白组、模型组动物每日口服300μL生理盐水，每周两次腹腔注射200μL PBS；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μL，PD-1抗体给药体积为200μL。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每三天测量一次肿瘤体积。给药后第21天(D21)，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。所有肿瘤称重和拍照。肿瘤分为三份，一份冻存用于细胞因子检测，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
检测项目与方法：
肿瘤体积与肿瘤生长抑制率：每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100。
相对肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100(TRTV：治疗组RTV；CRTV：同型对照组RTV)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumorvolume，RTV)，计算公式为RTV＝Vt/V0，其中V0是分组给药时(即d0)测量所得平均肿瘤体积，Vt为某一次测量时的平均肿瘤体积，TRTV与CRTV取同一天数据。
肿瘤内T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤内CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。
细胞因子检测：luminex技术检测小鼠肿瘤中IL-2和INF-γ的含量。
数据统计与分析：所有数据均以x±s表示，应用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计意义。
二、试验结果
1.抑瘤药效评价
表10抑制结直肠癌肿瘤生长的药效评价
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注：
a.平均值±SEM。
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式T/C％＝TRTV/CRTV×100％和TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100计算。
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
根据表10可知，与模型组相比，PD-1抗体、脆弱拟杆菌ZY-312单独用药时及脆弱拟杆菌ZY-312与PD-1抗体联合用药时，均显示出抑制肿瘤生长的作用，且三者的抑瘤效果强弱依次为：脆弱拟杆菌<anti-PD-1<脆弱拟杆菌+anti-PD-1(P＜0.01)。说明脆弱拟杆菌具有一定的抑制肝癌细胞肿瘤生长的作用，且将其与PD-1抗体联合使用时，显示出更强的抑瘤生长效果。可见，脆弱拟杆菌联用PD-1抗体能够有效抑制结直肠癌肿瘤的生长。
2.T细胞亚群
表11免疫细胞亚群在各小鼠肿瘤组织中比例(％)
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
如表11所示，与模型组相比，各给药组均不同程度地上调了肿瘤内CD4+T细胞和CD8+T占总细胞的比例。脆弱拟杆菌联用PD-1抗体组的上调幅度大于单独给药组，ZY-312联用PD-1抗体组具有显著性差异(p＜0.05)。各给药组均不同程度地上调了肿瘤内CD8+T细胞占总细胞的比例。脆弱拟杆菌联用PD-1抗体组的上调幅度大于单独给药组，ZY-312联用抗体组具有显著性差异(p＜0.05)。
可见，脆弱拟杆菌联用PD-1抗体能够上调肿瘤内CD4+和CD8+T细胞的比例。
3.细胞因子检测
表12血清中细胞因子的含量
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
如表12所示，与模型组相比，各给药组均不同程度地下调了肿瘤内IL-10的水平，上调了肿瘤内INF-γ的水平。脆弱拟杆菌ZY-312联用PD-1抗体组(P<0.01)的上调幅度大于单独给药组(P<0.05)。可见，脆弱拟杆菌联用PD-1抗体能够更有效地调节小鼠体内的炎症因子水平。原因推测是用脆弱拟杆菌和PD-1联用致使小鼠组织中的PD-1的基因表达量显著降低，阻断信号通路，增强了小鼠的自身免疫力，增强了T细胞的活力，T细胞活力的增强会增加IFN-γ的释放和降低了IL-10的释放。
综上所述，脆弱拟杆菌联用PD-1抗体能够改善肿瘤组织中的炎症因子的水平、提高免疫细胞的水平，提高提高T细胞的免疫活力，抑制癌症肿瘤的增长。脆弱拟杆菌表现出与抗体PD-1的增效作用，增强治疗结直肠癌肿瘤效果。
实施例6脆弱拟杆菌联合PD-1抗体在治疗胰腺癌中的应用
一、实验方法
本实施例选用8周龄的C57BL/6雌性小鼠进行实验，建立胰腺癌模型。胰腺癌成瘤造模：将Panc02细胞(购自ATCC)用胰酶消化后，调整细胞浓度为1×107cell/mL，向小鼠皮下注射0.2mL细胞悬液，小鼠接种部位长出小的肿瘤为造模成功。肿瘤体积达到80mm3时(D0)开始分组给药。随机分为9组：空白组，模型组，PD-1抗体(BE0273，BioXcell,10mg/kg)，ZY-312组(106CFU/只)、中(108CFU/只)、高(1010CFU/只)，ZY-312活菌联用PD-1抗体低(106CFU/只)、中(108CFU/只)、高(1010CFU/只)，每组10只。
给药方法：从D0开始，空白组、模型组动物每日口服300μL生理盐水，每三天一次腹腔注射200μL PBS；各给药组同频次给予对应药物，其中脆弱拟杆菌菌液给药体积为300μL，PD-L1抗体给药体积为200μL。每天观察动物的健康状况及死亡情况，每三天测量一次肿瘤体积。给药后第15天(D15)，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。所有肿瘤称重和拍照。肿瘤分为三份，一份冻存用于细胞因子检测，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
检测项目与方法：
肿瘤体积与肿瘤生长抑制率：每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100。
相对肿瘤增殖率T/C(％)：计算公式如下：T/C％＝TRTV/CRTV×100(TRTV：治疗组RTV；CRTV：同型对照组RTV)。根据肿瘤测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumorvolume，RTV)，计算公式为RTV＝Vt/V0，其中V0是分组给药时(即d0)测量所得平均肿瘤体积，Vt为某一次测量时的平均肿瘤体积，TRTV与CRTV取同一天数据。
肿瘤内T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤内CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。
细胞因子检测：luminex技术检测小鼠血清中IL-2和INF-γ的含量。
数据统计与分析：所有数据均以x±s表示，应用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计意义。
二、试验结果
1.抑瘤药效评价
表13抑制胰腺癌肿瘤生长的药效评价
注：
a.平均值±SEM。
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式T/C％＝TRTV/CRTV×100％和TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100计算。
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
根据如上表可知，与空白组相比，移植瘤小鼠产生明显肿瘤瘤块，造模成功。与模型组相比，PD-1抗体、脆弱拟杆菌ZY-312单独用药时及脆弱拟杆菌ZY-312与PD-1抗体联合用药时，均显示出抑制肿瘤生长的作用，且三者的抑瘤效果强弱依次为：脆弱拟杆菌<anti-PD-1<脆弱拟杆菌+anti-PD-1(p<0.05)，说明脆弱拟杆菌具有一定的抑制胰腺癌细胞肿瘤生长的作用，且将其与PD-1抗体联合使用时，显示出更强的抑瘤生长效果。也就是说，脆弱拟杆菌ZY-312可以在一定程度上与PD-1抗体协同抑制胰腺细胞肿瘤增长。由此可见，脆弱拟杆菌ZY-312联用PD-1抗体在治疗食管癌中具有潜力，能够协同增强抑制胰腺癌肿瘤细胞的增长速度。
2.T细胞亚群
表14免疫细胞亚群在CD45+细胞中比例(％)
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
如表14所示，与模型组相比，脆弱拟杆菌ZY-312联用PD-1抗体组(p<0.05)。相比于anti-PD-1单药组和ZY-312单药组，低、中、高剂量ZY-312+Anti-PD-1联合给药组中CD45+TIL的比例有上升的趋势，表明这几个组小鼠经给药后肿瘤内淋巴细胞的浸润有所增加。CD8+T细胞在肿瘤免疫中发挥重要作用，是直接杀伤肿瘤细胞的效应细胞，其比率在低剂量和中剂量ZY-312+Anti-PD-1联合给药组中也呈现上升趋势。Treg(调节性T细胞)是肿瘤微环境中一群普遍存在的抑制性T细胞，能抑制肿瘤抗原特异性T细胞的功能，CD8+T/Tregratio值是反映免疫治疗效果和肿瘤微环境变化的一个重要指标，相比于单用药组，CD8+T/Treg ratio值在低、中、高剂量ZY-312+Anti-PD-1联合给药组中也呈现上升趋势。
3.细胞因子检测
表15血清中细胞因子的水平
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
因为IFN-γ、TNF-α与IL-10主要由免疫细胞表达，且与PD-L1/PD-1信号通路密切相关。如表15所示，与模型组相比，各给药组均不同程度地提高了IFN-γ和TNF-α的表达，降低了IL-10的表达。脆弱拟杆菌联用PD-1抗体组(p<0.05)的上调幅度大于单独给药组。不同浓度的ZY-312对PD-1单抗疗效影响并不相同。本次实验中发现高剂量的ZY-312与PD-1单抗联用的抗肿瘤效果更优。
综上所述，脆弱拟杆菌联用PD-1抗体能够改善肿瘤组织中的炎症因子的水平、提高免疫细胞的水平，提高提高T细胞的免疫活力，抑制癌症肿瘤的增长。脆弱拟杆菌表现出与抗体PD-1的增效作用，增强治疗胰腺癌肿瘤效果。
由上述实施例可知，脆弱拟杆菌联用PD-1抗体或PD-L1抗体可以上调肿瘤内CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例和INF-γ或TNF-α的水平，降低IL-10的水平。使用合适剂量的脆弱拟杆菌与PD-1单抗联用效果更显著，起到更好的杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长的作用。因此，脆弱拟杆菌与免疫抑制剂联用在治疗消化系统肿瘤上具有潜力和应用前景。

Claims (13)

1.一种治疗肿瘤的组合产品，其特征在于，包括：
(i)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(a)第一活性成分，所述第一活性成分是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312，以及药学上可接受的载体；和
(ii)第二药物组合物，所述第二药物组合物含有(b)第二活性成分，所述第二活性成分为PD-1和/或PD-L1抗体；
以及药学上可接受的载体；
所述肿瘤为肝癌、食管癌、胰腺癌或胃癌。
2.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述脆弱拟杆菌是活菌、形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌中的一种及以上。
3.根据权利要求2所述的组合产品，其特征在于，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过、减毒或灭活的脆弱拟杆菌。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合产品，其特征在于，所述第一药物组合物与第二药物组合物同时或分别给药。
5.根据权利要求4所述的组合产品，其特征在于，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型和口服剂型。
6.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，所述第一药物组合物或第二药物组合物通过皮下注射、静脉注射、肌内注射的方式给药。
7.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂和颗粒剂。
8.根据权利要求5-7任一项所述的组合产品，其特征在于，所述第一药物组合物或第二药物组合物的剂型包括缓释型剂型或非缓释型剂型。
9.一种治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，包括：
(i)药学有效剂量的保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312；
(ii)PD-1和/或PD-L1抗体；和
(iii)药学上可接受的载体；
所述肿瘤为肝癌、食管癌、胰腺癌或胃癌。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述脆弱拟杆菌是活菌、形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌中的一种及以上。
11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过减毒或灭活的脆弱拟杆菌。
12.根据权利要求9-11任一项所述的组合物，其特征在于，所述脆弱拟杆菌ZY-312的药学效剂量为106-1010CFU。
13.权利要求1-8任一项所述的组合产品、权利要求9-12任一项所述的药物组合物在制备治疗消化系统肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述消化系统肿瘤为肝癌、食管癌、胰腺癌或胃癌中的任一种。
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