CN111450124B - 阿克曼粘菌或普氏菌在增加肿瘤微环境γδT细胞积累并增强抗肿瘤免疫功能药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种阿克曼粘细菌或普氏菌以及包含所述阿克曼粘细菌或普氏菌用于制备抗肿瘤及其增加γδT细胞在肿瘤微环境中浸润的药物的应用。本发明所述的阿克曼粘细菌或普氏菌以及包含所述阿克曼粘细菌或普氏菌在用于制备抗肿瘤药物及其增加γδT细胞在肿瘤微环境中，可以显著抑制肿瘤的生长，并且显著增加肿瘤微环境中γδT细胞的浸润。本发明还提供了阿克曼粘细菌或普氏菌在制备抗肿瘤及其增加γδT细胞在肿瘤微环境中的浸润的药物组合物、食品、保健品及食品添加剂中的应用。

Description

阿克曼粘菌或普氏菌在增加肿瘤微环境γδT细胞积累并增强 抗肿瘤免疫功能药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及使用阿克曼粘细菌(或简称阿克曼粘菌)或普氏菌或包含使用阿克曼粘细菌或普氏菌的组合物抗肿瘤及其增加γδT细胞(TCR-γδ阳性T细胞、TCRγδ阳性T细胞或TCR-γδ+T细胞)在肿瘤微环境中的浸润的药物中的应用。

背景技术

迄今为止，恶性肿瘤仍是威胁人类健康的主要杀手。例如，肝癌是一种恶性程度极高、治愈率很低、预后很差的恶性肿瘤，在世界范围内肝癌的发病率在男性中占第5位，死亡率占第2位；在女性中发病率占第9位，死亡率占第6位。中国是肝癌高发国家，死亡例数占全球死亡例数的50％以上。传统治疗手段包括手术切除、放射治疗和化学治疗等，但是预后不佳。乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。最新世界卫生组织的当今肿瘤(CANCERTODAY)流行病统计数据显示，2018年全球新发乳腺癌病例约200万例，死亡人数高达60万人。尽管目前治疗手段包括手术、化疗、放疗、靶向治疗、新辅助化疗相结合等诸多综合治疗方式，但是目前治疗效果有限，肿瘤转移和复发的问题仍难以解决，且化疗和放疗毒副反应严重，严重破坏患者机体免疫系统与生活、生存质量。因此，开发更为有效的、最大限度地杀伤肿瘤细胞而不伤害自身正常细胞的疗法迫在眉睫。

肿瘤免疫治疗是指通过主动或被动方式激发机体产生肿瘤特异性免疫应答，恢复或增强机体免疫系统活性，进而抑制和杀伤肿瘤功能的治疗方法。目前主要包括免疫检测点阻断、过继性细胞输注、肿瘤疫苗等。虽然γδT细胞是机体发挥抗肿瘤功能的关键的免疫细胞亚群之一，但是目前的T细胞免疫治疗效果欠佳，主要原因是肿瘤微环境中γδT细胞的浸润及功能受抑制，表现在肿瘤浸润γδT细胞量少、活性低、靶向性不好，导致相当一部分接受抗肿瘤免疫治疗的患者不能对T细胞抑制性分子阻断抗体治疗等免疫治疗疗法产生有效响应，严重影响抗肿瘤的免疫治疗效果。因此，破解肿瘤微环境中γδT细胞浸润不足难题是解决肿瘤免疫治疗所面临挑战的关键。

阿克曼粘细菌(Akkermansia muciniphila)是一种革兰阴性、椭圆形的肠道细菌，定植在粘液层中，可特异性降解粘蛋白，占肠道微生物总量的1～3％，人体肠道中的最丰富的单一物种之一，具有一定的厌氧能力。目前研究发现阿克曼粘细菌在人体内定植丰度与肥胖和Ⅱ型糖尿病常可能呈负相关，与心脏代谢紊乱可能也有一定的关联，对机体代谢可能有着重要作用。普氏菌(Prevotella copri)是一种革兰阴性厌氧菌，人体肠道共生菌，目前研究发现它与类风湿性关节炎的易感性可能有关，和糖尿病患者胰岛素抵抗也可能具有相关性。

但是，目前尚未有利用包括阿克曼粘细菌和/或普氏菌等肠道细菌增加肿瘤微环境中γδT细胞的浸润进而增强机体抗肿瘤功能的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前肿瘤免疫治疗难题，尤其是肿瘤微环境中γδT细胞的浸润不足的难题，提供一种抗肿瘤及其增加γδT细胞在肿瘤微环境中的浸润的药物的方法，具体是阿克曼粘细菌或普氏菌在增加肿瘤微环境γδT细胞积累并增强抗肿瘤免疫功能药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了阿克曼粘细菌(Akkermansia muciniphila)或普氏菌(Prevotella copri)用于抗肿瘤的用途。该用途通过增加肿瘤微环境中γδT细胞的浸润进而抗肿瘤。所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、灭活、物理处理或化学处理的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物、蛋白提取物、菌体成分、菌体提取物和/或代谢物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。

本发明所述肿瘤可以为各种实体瘤，例如但不限于肝癌、乳腺癌、肺癌、黑色素肿瘤、前列腺癌、纤维肉瘤、胃癌、食管癌、结直肠癌、膀胱肉瘤及神经胶质瘤等实体瘤，特别是肝部和/或乳腺的肿瘤。

在某些实施方案中，将抗肿瘤及增加γδT细胞在肿瘤微环境中的浸润的方法与其他治疗技术进行组合。在某些实施方案中，所述其他治疗方法包括但不限于是免疫治疗技术、外科手术、化学疗法、放射疗法、基因疗法或它们的组合。

为了更好地实现上述目的，本发明还提供了阿克曼粘细菌或普氏菌在制备用于抗肿瘤及其增加γδT细胞在肿瘤微环境中的浸润的药物中的用途。所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、灭活、物理处理或化学处理的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物、蛋白提取物、菌体成分、菌体提取物和/或代谢物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。所述肿瘤是肝和/或乳腺、或关于肺、皮肤、癌、肾、前列腺、神经系统或膀胱的肿瘤，特别是肝部和/或乳腺的肿瘤。

所述肿瘤微环境中γδT细胞浸润增加特征包括：γδT细胞数量相对肿瘤微环境中所有细胞数量的增加。

本发明还提供了一种治疗性和预防性的药物组合物，其包含阿克曼粘细菌或普氏菌作为药物活性成分。在某些实施方案中，所述药物组合物可能还含有其它微生物菌株。在一个方面，所述阿克曼粘细菌或普氏菌可以抑制肿瘤的生长。在一个方面，所述肿瘤是实体瘤，包括但不限于肝癌、乳腺癌、肺癌、黑色素肿瘤、前列腺癌、纤维肉瘤、胃癌、食管癌、结直肠癌、膀胱肉瘤及神经胶质瘤等实体瘤。在某些施方案中，所述肿瘤包括但不限于：肝癌和/或乳腺癌。

根据本发明的一个方面，上述的药物组合物中，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、灭活、物理处理或化学处理的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物、蛋白提取物、菌体成分、菌体提取物和/或代谢物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。

根据本发明的一个方面，本发明的药物组合增加肿瘤微环境中γδT细胞的浸润从而实现抗肿瘤。

根据本发明的一个方面，本发明的药物组合物包括药学有效剂量的阿克曼粘细菌或普氏菌及其在药学上可接受的载体。其中，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为活性成分。

优选地，上述的药物组合物中，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、灭活、物理处理或化学处理的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物、蛋白提取物、菌体成分、菌体提取物和/或代谢物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。

优选地，上述的药物组合物中，所述药物组合物可以是药学上可行的任一种或多种剂型，包括但不限于为片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉剂。

优选地，上述的药物组合物中，所述药学上可接受的载体为脱脂奶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、海藻糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油中的一种或多种的混合物。

为了更好地实现上述目的，本发明还提供了抗肿瘤及其增加肿瘤微环境中γδT细胞的浸润的可食用组合物，其中，所述可食用组合物包括阿克曼粘细菌或普氏菌。该可食用组合物包括但不限于食品、保健品、食品添加剂等。

优选地，上述可食用组合物中，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、灭活、物理处理或化学处理的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物、蛋白提取物、菌体成分、菌体提取物和/或代谢物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。

根据本发明的一个方面，本发明的可食用组合物通过增加肿瘤微环境中γδT细胞的浸润从而实现抗肿瘤功能。

本发明以移植性肿瘤研究法建立小鼠肝癌模型和/或乳腺癌模型，通过在小鼠肝癌模型和/或乳腺癌模型中对阿克曼粘细菌或普氏菌的功能进行分析、检测和鉴定。本发明通过实验证明，阿克曼粘细菌或普氏菌能够显著抑制肝肿瘤和/或乳腺肿瘤的生长，并能有效抑制小鼠体内移植肿瘤的生长，说明阿克曼粘细菌或普氏菌在肿瘤临床治疗中具有重要的开发和应用价值。

附图说明

图1为在小鼠肝癌模型中检测阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌抗肿瘤及增加肿瘤微环境中γδT细胞的浸润的实验流程示意图。施用细菌或移植肿瘤细胞时间用天(Day，d)表示。

图2为在小鼠肝癌模型中检测普氏菌或灭活普氏菌抗肿瘤及增加肿瘤微环境中γδT细胞的浸润的实验流程示意图。施用细菌或移植肿瘤细胞时间用天(Day，d)表示。

图3为在小鼠乳腺癌模型中检测普氏菌或灭活普氏菌抑制肿瘤生长和治疗肿瘤作用的实验流程示意图。施用细菌或移植肿瘤细胞时间用天(Day，d)表示。

图4为阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌治疗后每组4只典型的小鼠肝癌肿瘤大小对比图。

图5为阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌治疗后小鼠肝癌肿瘤大小对比图的统计分析图。

图6为普氏菌或灭活普氏菌治疗后每组4只典型的小鼠肝癌肿瘤大小对比图。

图7为普氏菌或灭活普氏菌治疗后小鼠肝癌肿瘤大小对比图的统计分析图。

图8为普氏菌或灭活普氏菌治疗后每组4只典型的小鼠乳腺癌肿瘤大小对比图。

图9为普氏菌或灭活普氏菌治疗后小鼠乳腺癌肿瘤大小对比图的统计分析图。

图10为肝癌细胞移植的小鼠施用阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌后，每组一只小鼠的典型的γδT细胞的流式细胞分析图，右象限为γδT细胞，右侧象限的数字显示的为γδT细胞占肝肿瘤微环境内总体细胞的百分比。

图11为肝癌细胞移植的小鼠中施用阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌后，γδT细胞占肿瘤微环境内总体细胞的百分比的统计分析图。

图12为肝癌细胞移植的小鼠施用普氏菌或灭活普氏菌后，每组一只小鼠的典型的γδT细胞的流式细胞分析图，右象限为γδT细胞，右侧象限的数字显示的为γδT细胞占肝肿瘤微环境内总体细胞的百分比。

图13为肝癌细胞移植的小鼠中施用普氏菌或灭活普氏菌后，γδT细胞占肿瘤微环境内总体细胞的百分比的统计分析图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需要指出的是，由本发明中的用于抗肿瘤的阿克曼粘细菌或普氏菌或含有本发明的阿克曼粘细菌或普氏菌的药物组合物、食品、保健品和食品添加剂在施用于受试者后，都可以应用于上文所述的适应症并展现出上文所述的功能，在本发明范围内的所有剂型均已测试，下文中，仅仅是为说明，只在实施例中描述了其中一小部分，然而不应将其理解为对本发明的限制。

本发明所指的阿克曼粘细菌或普氏菌包括但不限于以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、灭活、物理处理或化学处理的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物、蛋白提取物、菌体成分、菌体提取物和/或代谢物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。

所述肿瘤是实体瘤，例如但不限于肝癌、乳腺癌、黑色素肿瘤、肺癌、前列腺癌、纤维肉瘤、胃癌、食管癌、膀胱肉瘤及神经胶质瘤等实体瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于：肝癌和/或乳腺癌。

本发明还提供的用于抗肿瘤的药物组合物包括药学有效剂量的阿克曼粘细菌或普氏菌。其中，所称的“药学有效剂量”的范围值为10⁶～10¹⁰CFU，优选为10⁹CFU。

所述药物组合物包括但不限于为片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉剂。所述药学上可接受的载体包括但不限于为脱脂奶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、甘露糖、淀粉、海藻糖、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油中的一种或多种。

本发明的阿克曼粘细菌或普氏菌还可以被制成食品、保健品或食品添加剂等。所述食品、保健品或食品添加剂均含有阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体、基因重组、改造或修饰、减毒、灭活、物理处理或化学处理的阿克曼粘细菌或普氏菌、阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物、蛋白提取物、菌体成分、菌体提取物和/或代谢物，和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液中的任意一种。这些食品、保健品或食品添加剂均可用于抗肿瘤。

实施例1阿克曼粘细菌培养

培养方法

步骤1：取冻干保存阿克曼粘细菌(Akkermansia muciniphila)菌种(购自ATCC)一支，加200μL TSB培养基使其溶解，取200μl血平板划线，厌氧条件下培养箱中37℃培养48小时；

步骤2：挑取单克隆菌落溶解于10毫升TSB培养基，37℃厌氧条件下培养48小时；

步骤3：取500毫升TSB培养基，按1％(v/v)接入菌种，37℃厌氧条件下培养48小时；

步骤4：收集菌液，转速6000rpm离心10分钟。用生理盐水洗2次后复溶菌泥备用并进行活菌计数。

实施例2普氏菌培养

培养方法

步骤1：取冻干保存普氏菌(Prevotella copri)菌种(购自ATCC)一支，加200μLPYG培养基使其溶解，取200μl血平板划线，厌氧条件下培养箱中37℃培养48小时；

步骤2：挑取单克隆菌落溶解于10毫升TSB培养基，37℃厌氧条件下培养48小时；

步骤3：取500毫升PYG培养基，按1％(v/v)接入菌种，37℃厌氧条件下培养48小时；

步骤4：收集菌液，转速6000rpm离心10分钟。用生理盐水洗2次后复溶菌泥备用并进行活菌计数。

实施例3阿克曼粘细菌增强γδT细胞在肿瘤微环境中浸润并治疗肿瘤(肝癌)实验

图1为检测阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌增加γδT细胞在肿瘤微环境中的浸润和治疗的实验流程示意图。

1、培养方法

阿克曼粘细菌培养方法同上述实施例1。

2、样品准备

1)阿克曼粘细菌活菌体的制备

步骤1：取冻干保存阿克曼粘细菌(Akkermansia muciniphila)菌种(购自ATCC)一支，加200μL TSB培养基使其溶解，取200μl血平板划线，厌氧条件下培养箱中37℃培养48小时；

步骤2：挑取单克隆菌落溶解于10毫升TSB培养基，37℃厌氧条件下培养48小时；

步骤3：取500毫升TSB培养基，按1％(v/v)接入菌种，37℃厌氧条件下培养48小时；

步骤4：收集菌液，转速6000rpm离心10分钟。用生理盐水洗2次后复溶菌泥备用并进行活菌计数。

2)阿克曼粘细菌灭活菌体

活菌计数后的阿克曼粘细菌菌液70℃水浴加热30分钟，获得灭活菌液。

3)阿克曼粘细菌裂解液

阿克曼粘细菌培养菌液，采用超声破碎法处理，超声2秒，停5秒，合计持续20分钟，获得阿克曼粘细菌裂解液。

4)阿克曼粘细菌培养上清液

阿克曼粘细菌培养菌液，按6000rpm离心10分钟，离心后上清为阿克曼粘细菌培养上清液。

3、阿克曼粘细菌对肿瘤防治作用的小鼠实验

实验动物：购自中山大学实验动物中心的3～4周C57BL/6小鼠27只，精神状态佳。将小鼠随机分成3组，每组9只，组间性别与周龄匹配，分别是对照组、活菌灌胃组、灭活菌灌胃组，3组小鼠分别给生理盐水、阿克曼粘细菌及灭活阿克曼粘细菌灌胃，连续治疗4次。待小鼠肿瘤(肝癌)细胞HEPA1-6生长到对数期，用胰酶消化细胞，加培养基中和，离心后收集细胞，用DPBS洗两次，去除残留血清，最后用DPBS重悬细胞。肿瘤细胞计数，将10⁶个细胞接种到每只小鼠右腋皮下。小鼠继续分别进行灌胃治疗5次，2周后处死荷瘤小鼠，解剖后测量皮下移植瘤大小，收集肿瘤原位细胞，利用流式细胞术检测分析肿瘤微环境中γδT细胞的含量。

实施例4普氏菌促进肿瘤微环境中γδT细胞浸润并治疗肿瘤(肝癌)实验

图2为检测普氏菌或灭活普氏菌增加γδT细胞在肿瘤微环境中的浸润和治疗肿瘤实验的实验流程示意图。

1、培养方法

普氏菌培养方法同实施例2。

2、样品准备

1)普氏菌活菌体的制备

步骤1：取冻干保存普氏菌(Prevotella copri)菌种(购自ATCC)一支，溶解于200μL PYG培养基，取200μl血平板划线，厌氧条件下培养箱中37℃培养48小时；挑取单克隆菌落溶解于10毫升TSB培养基，37℃厌氧条件下培养48小时；

步骤3：取500毫升PYG培养基，按1％(v/v)接入菌种，37℃厌氧条件下培养48小时；

步骤4：收集菌液，6000rpm离心10分钟。用生理盐水洗2次后复溶菌泥备用并进行活菌计数。

2)普氏菌灭活菌体

活菌计数后的阿克曼粘细菌菌液70℃水浴加热30分钟，获得灭活菌液。

3)普氏菌裂解液

普氏菌培养菌液，采用超声破碎法处理，超声2秒，停5秒，合计持续20分钟，获得普氏菌裂解液。

4)普氏菌培养上清液

普氏菌培养菌液，以6000rpm的转速离心10min，获得普氏菌培养上清液。

3、普氏菌对肿瘤防治作用的小鼠实验

实验动物：购自中山大学实验动物中心的3～4周C57BL/6小鼠27只，精神状态佳。将小鼠随机分成3组，每组9只(组间小鼠性别与周龄匹配)，分别是对照组、活菌灌胃组、灭活菌灌胃组，3组小鼠分别给生理盐水、10⁹CFU的普氏菌及同样CFU的灭活普氏菌灌胃，连续治疗4次。待小鼠肿瘤(肝癌)细胞HEPA1-6生长到对数期，用胰酶消化细胞，加培养基中和，离心后收集细胞，用DPBS洗两次，去除残留血清，最后用DPBS重悬细胞。肿瘤细胞计数，将10⁶个细胞接种到每只小鼠右腋皮下。小鼠继续分别进行灌胃治疗5次，2周后处死荷瘤小鼠，解剖后测量皮下移植瘤大小，收集肿瘤原位细胞，利用流式细胞术检测分析肿瘤微环境中γδT细胞的含量。

实施例5普氏菌抑制肿瘤(乳腺癌)生长实验

图3为检测普氏菌或灭活普氏菌肿瘤生长并治疗肿瘤(乳腺癌)实验的实验流程示意图。

1、培养方法

普氏菌培养方法同实施例2。

2、样品准备

1)普氏菌活菌体的制备

步骤1：取冻干保存普氏菌(Prevotella copri)菌种(购自ATCC)一支，溶解于200μL PYG培养基，取200μl血平板划线，厌氧条件下培养箱中37℃培养48小时；挑取单克隆菌落溶解于10毫升TSB培养基，37℃厌氧条件下培养48小时；

步骤3：取500毫升PYG培养基，按1％(v/v)接入菌种，37℃厌氧条件下培养48小时；

步骤4：收集菌液，转速6000rpm离心10分钟。用生理盐水洗2次后复溶菌泥备用并进行活菌计数。

2)普氏菌灭活菌体

活菌计数后的阿克曼粘细菌菌液70℃水浴加热30分钟，获得灭活菌液。

3)普氏菌裂解液

普氏菌培养菌液，采用超声破碎法处理，超声2秒，停5秒，合计持续20分钟，获得普氏菌裂解液。

4)普氏菌培养上清液

普氏菌培养菌液，以6000rpm的转速离心10min，获得普氏菌培养上清液。

3、普氏菌对肿瘤抑制作用的小鼠实验

实验动物：购自中山大学实验动物中心的3～4周BALB/c小鼠27只，精神状态佳。将小鼠随机分成3组，每组9只(组间小鼠性别与周龄匹配)，分别为对照组、活菌灌胃组、灭活菌灌胃组，分别给与生理盐水、10⁹CFU的普氏菌或同样CFU的灭活普氏菌灌胃，连续灌胃4次。随后待小鼠肿瘤(乳腺癌)细胞4T1生长到对数期，用胰酶消化细胞，然后利用培养基中和，离心后收集细胞，用DPBS洗两次，去除残留血清，最后用DPBS重悬细胞。细胞计数后，将10⁶个细胞接种到每只小鼠右腋皮下。继续对小鼠分别进行灌胃治疗5次，2周后处死荷瘤小鼠，解剖后测量记录皮下移植瘤大小。

结果分析：

给皮下移植肝癌细胞(HEPA1-6)后的小鼠中施用阿克曼粘细菌和灭活的阿克曼粘细菌的实验流程如图1所示，施用普氏菌和灭活的普氏菌的实验流程图如图2所示。图3为给皮下移植乳腺癌细胞(4T1)后的小鼠中施用普氏菌和灭活的普氏菌的实验流程图。图4、图6为施用阿克曼粘细菌、灭活的阿克曼粘细菌、普氏菌及灭活的普氏菌后的小鼠皮下肝癌细胞移植的典型的肝肿瘤照片。图5、图7为施用阿克曼粘细菌、灭活的阿克曼粘细菌、普氏菌及灭活的普氏菌后肝肿瘤的大小体积统计分析结果。图8为施用普氏菌及灭活的普氏菌后的小鼠皮下乳腺癌细胞移植的典型的乳腺肿瘤照片。图9为施用普氏菌及灭活的普氏菌后乳腺肿瘤的大小体积统计分析结果。图4、图5、图6、图7的实验结果可以明确地观察到，施用阿克曼粘细菌、灭活的阿克曼粘细菌、普氏菌及灭活的普氏菌后，肝肿瘤体积大幅度减小约2～4倍，图8、图9的实验结果可见施用普氏菌及灭活的普氏菌后，乳腺肿瘤体积显著减小20％以上，而且减小具有统计学显著性意义。这些实验结果说明，通过施用阿克曼粘细菌、灭活的阿克曼粘细菌、普氏菌或灭活的普氏菌可以显著抑制肿瘤的生长。

图10是每组一只小鼠的典型的肝肿瘤微环境中γδT细胞数量的流式细胞分析图,右象限的数字显示的为γδT细胞占肿瘤微环境中细胞的百分比情况图。从流式细胞分析图可以看出，相较生理盐水对照组，阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌的施用增加了肝肿瘤微环境中γδT细胞相对量达5～8倍。图11是肝癌细胞移植的小鼠中施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌后γδT细胞占肿瘤微环境细胞的百分比的统计分析图。从统计图可以看出，相对比生理盐水对照组，阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌显著增加了肿瘤微环境中γδT细胞的数量，而且这些增加具有统计学显著意义。图12是每组一只小鼠的典型的肝肿瘤微环境中γδT细胞数量的流式细胞分析图,右象限的数字显示的为γδT细胞占肿瘤微环境中细胞的百分比情况图。同样，从流式细胞分析图可以看出，相较生理盐水对照组，普氏菌和灭活普氏菌增加了肝肿瘤微环境中γδT细胞相对量约5～8倍。图13是肝癌细胞移植的小鼠中施用普氏菌和灭活普氏菌后γδT细胞占肿瘤微环境所有细胞的百分比的统计分析图。从统计图可以看出，相对比生理盐水对照组，普氏菌和灭活普氏菌显著增加了肿瘤微环境中γδT细胞的数量，而且这些增加具有统计学显著意义。

上述结果的统计分析图中，*表示student t-test p<0.05，***表示student t-test p<0.001。p<0.05具有统计学差异意义。每种处理组有9只小鼠。

综上所述，阿克曼粘细菌、灭活的阿克曼粘细菌、普氏菌和/或灭活的普氏菌均能对小鼠肿瘤(肝癌、乳腺癌)的形成以及生长有明显的抑制作用(图4、图5、图6、图7、图8、图9)。此外，图10、图11、图12、图13实验结果表明，对照组中小鼠肿瘤(肝癌)，灌胃阿克曼粘细菌、灭活的阿克曼粘细菌、普氏菌和灭活的普氏菌在体内促进肿瘤微环境中γδT细胞的浸润从而增强了抗肿瘤功能，抑制肿瘤生长，对于防治肝癌等肿瘤具有很好的效果。

以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。

Claims (2)

1.普氏菌(Prevotella copri)在制备用于抗肝部和/或乳腺实体瘤的浸润的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述普氏菌为普氏菌活菌体或灭活的普氏菌。

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