CN110638838A - 阿克曼粘细菌或普氏菌在制备用于增强抗肿瘤免疫功能的药物中的应用 - Google Patents
阿克曼粘细菌或普氏菌在制备用于增强抗肿瘤免疫功能的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了阿克曼粘细菌或普氏菌在制备用于增强CD4+T细胞和/或CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能和/或增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的抗肿瘤免疫功能的药物中的应用。阿克曼粘细菌或普氏菌可以显著抑制系统性CD4+T细胞和/或CD8+T细胞表达PD‑1，也可以促进肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润和/或积累，抑制PD‑1分子表达，显著抑制肿瘤的生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及使用阿克曼粘细菌或普氏菌或包含使用阿克曼粘细菌或普氏菌的组合物增强T细胞(包括：CD4+T细胞、CD8+T细胞等)抗肿瘤免疫功能及其在预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是人类的主要死因。世界卫生组织(WHO)发布的《全球癌症报告2014》预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。2015年全球有880万人死于癌症，占全球死亡病例的六分之一。例如，肺癌是中国最常见的肿瘤之一，手术与化疗是目前的主要治疗手段。但是手术和化疗预后效果不佳。尤其是化疗药物在杀死癌细胞的同时，也会破坏人体免疫功能。
2016年2月4日美国临床肿瘤学学会(ASCO)发布了《2016年ASCO癌症研究进展年报》，免疫治疗技术被评为2015年癌症研究的最大进展。正如ASCO主席Julie M.Vose医生所说：“免疫治疗是癌症领域最具革命性的突破，这种新疗法不仅改善了患者的生活，也为未来的研究指明了方向”。目前肿瘤免疫疗法将成为继手术、放疗和化疗之后的第四种癌症主要治疗方法。研究开发更加安全、廉价、高效和低副作用的癌症免疫药物是当前全世界的研究热点。
T细胞是机体发挥抗肿瘤功能的最为关键的免疫细胞亚群之一。肿瘤患者中，因为肿瘤抗原的长期刺激，诱导T细胞表达T细胞功能抑制分子(或又称：T细胞耗竭分子)，例如PD-1，PD-L1，CTLA-4等，从而导致T细胞抗肿瘤免疫功能被显著抑制。因此，如何抑制或者阻断例如PD-1，PD-L1，CTLA-4等这些T细胞抑制分子的表达或其信号传递进而提高T细胞抗肿瘤免疫能力，成为肿瘤免疫治疗亟需解决的关键科学与技术问题。
因此，目前一些企业或机构开发了一系列针对PD-1、PD-L1等T细胞抑制性或者耗竭分子的阻断抗体等技术从而增强T细胞抗肿瘤免疫功能。但是，目前PD-1、PD-L1等T细胞抑制性分子的阻断抗体的抗肿瘤有效性仍然有待提高。有相当比例的肿瘤患者缺乏对PD-1、PD-L1等T细胞抑制性分子的阻断抗体的响应。因此，如何开发更好的抗肿瘤T细胞免疫功能增强技术迫在眉睫。与此同时，目前的免疫治疗技术也存在诱导肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润能力不足的难题，导致大量接受抗肿瘤免疫治疗的病人缺乏对T细胞抑制性分子阻断抗体治疗技术的有效响应，严重影响了抗肿瘤免疫治疗的疗效。
预防结核病的疫苗卡介苗是最早的肿瘤免疫治疗药物之一，卡介苗来源于牛结核分枝杆菌，这说明以细菌为代表的微生物可以为肿瘤免疫治疗提供重要的技术路径。确实，最近，细菌与病毒在肿瘤免疫治疗中的关键作用与临床应用潜能日益凸显。例如，可以靶向杀伤肿瘤细胞的溶瘤病毒最近被美国FDA批准上市。而且，也有试验证据提示溶瘤病毒可能可以显著增强PD-1或PD-L1阻断抗体的抗肿瘤疗效。
虽然阻断或者抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4这些T细胞抑制分子的表达从而增强T细胞的抗肿瘤功能是肿瘤免疫治疗的关键，但是，是否可以利用细菌或者病毒来抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4等T细胞抑制或耗竭分子的表达或信号传递或者利用细菌或者病毒来促进肿瘤微环境中抗肿瘤T细胞(例如，CD8+T细胞)的浸润目前暂时没有文献报道。
阿克曼粘细菌(Akkermansia muciniphila)是一类具有一定的厌氧能力的革兰阴性、椭圆形的肠道细菌。阿克曼粘细菌定植在粘液层中可特异性降解粘蛋白，占肠道微生物总量的1～3％，是人体肠道中的优势菌群之一。目前研究发现阿克曼粘细菌在人体内定植丰度与肥胖和Ⅱ型糖尿病常呈负相关，对机体代谢有着重要作用。普氏菌(Prevotellacopri)是一种革兰阴性厌氧菌，是人体肠道共生菌，目前研究发现它与类风湿性关节炎的易感性有关，和糖尿病患者胰岛素抵抗有一定的相关性。
但是，目前没有关于利用包括阿克曼粘细菌和/或普氏菌等肠道细菌抑制T细胞耗竭分子的表达、增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润以及增强机体T细胞抗肿瘤功能进而实现更好的肿瘤预防和/或治疗的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前肿瘤免疫治疗中系统性CD4+T细胞和/或CD8+T细胞免疫功能抑制和/或肿瘤微环境中CD8阳性杀伤性T细胞(简称：CD8+T细胞或CD8+CTL)浸润和/或积累不足的难题，提供一种能够增强T细胞免疫功能进而预防和/或治疗肿瘤的药物的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了阿克曼粘细菌(Akkermansia muciniphila)或普氏菌(Prevotella copri)用于增强T细胞免疫功能特别是增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润或T细胞抗肿瘤功能从而预防和/或治疗肿瘤的用途。该用途通过抑制系统性CD4+T细胞和/或CD8+T细胞表达PD-1等耗竭分子和/或促进肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润和/或积累而实现预防和/或治疗肿瘤。所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。
本发明所述肿瘤可以为各种实体瘤，例如但不限于肺癌、乳腺癌、黑色素肿瘤、肝癌、前列腺癌、纤维肉瘤、胃癌、食管癌、结直肠癌、膀胱肉瘤及神经胶质瘤等实体瘤，特别是肺部实体瘤。
在某些实施方案中，将增强T细胞免疫功能特别是增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润从而预防和/或治疗肿瘤的方法与其他免疫治疗技术进行组合。在某些实施方案中，所述其他免疫治疗方法包括但不限于是化学疗法、放射疗法、基因疗法、外科手术或它们的组合。
为了更好地实现上述目的，本发明还提供了阿克曼粘细菌或普氏菌在制备用于增强系统性CD4+T细胞和/或CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能和/或肿瘤微环境中CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能从而预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。所述肿瘤是肺、或关于肝、乳腺、皮肤、癌、肾、前列腺、神经系统或膀胱的肿瘤，特别是肺部的肿瘤。
所述CD4+T细胞和/或CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能的增强特征包括：PD-1在CD4+T细胞和/或CD8+T细胞中表达的下降。
所述肿瘤微环境中CD8+T细胞的抗肿瘤免疫功能的增强特征包括：肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润和/或积累的增加。
本发明还提供了一种治疗性和预防性的药物组合物，其包含阿克曼粘细菌或普氏菌作为药物活性成分。在某些实施方案中，所述治疗性和预防性的药物组合物可能还含有其它微生物菌或毒株。在一个方面，所述阿克曼粘细菌或普氏菌可以遏制肿瘤的生长。在一个方面，所述肿瘤是实体瘤，包括但不限于肺癌、乳腺癌、黑色素肿瘤、肝癌、前列腺癌、纤维肉瘤、胃癌、食管癌、结直肠癌、膀胱肉瘤及神经胶质瘤等实体瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于：肺癌。
根据本发明的一个方面，上述的药物组合物中，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。
根据本发明的一个方面，本发明的药物组合物通过抑制PD-1等耗竭分子在CD4+T细胞和/或CD8+T细胞中的表达并且增强CD8+T细胞在肿瘤微环境中的浸润从而实现预防和/或治疗肿瘤。
根据本发明的一个方面，本发明的药物组合物包括药学有效剂量的阿克曼粘细菌或普氏菌及其在药学上可接受的载体。其中，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为活性成分。
优选地，上述的药物组合物中，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。
优选地，上述的药物组合物中，所述药物组合物可以是药学上可行的任一种或多种剂型，包括但不限于为片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉剂。
优选地，上述的药物组合物中，所述药学上可接受的载体为脱脂奶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、海藻糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油中的一种或多种的混合物。
为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于增强系统性CD4+T细胞和/或CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能和/或肿瘤微环境中CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能从而预防和/或治疗肿瘤的可食用组合物，其中，所述可食用组合物包括阿克曼粘细菌或普氏菌。该可食用组合物包括但不限于食品、保健品、食品添加剂等。
优选地，上述可食用组合物中，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。
根据本发明的一个方面，本发明的可食用组合物通过抑制PD-1等耗竭分子在CD4+T细胞和/或CD8+T细胞中的表达和/或增强CD8+T细胞在肿瘤微环境中的浸润从而实现预防和/或治疗肿瘤。
本发明以移植性肿瘤研究法建立小鼠肺癌模型，通过在小鼠肺癌模型中对阿克曼粘细菌或普氏菌的作用进行检测和鉴定，本发明通过实验证明，阿克曼粘细菌或普氏菌能够显著抑制肺肿瘤的生长，并能有效抑制小鼠体内移植肿瘤的生长，提示阿克曼粘细菌或普氏菌在肿瘤临床治疗中具有重要的开发和应用价值。
附图说明
图1为在小鼠肺癌模型中检测阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌增强T细胞的免疫功能及阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌治疗肿瘤的实验流程示意图。细菌施用或肿瘤细胞移植时间(天)用d(缩写自day)表示。
图2为阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌治疗后每组5只典型的小鼠肺癌肿瘤大小对比图。
图3为阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌治疗后小鼠肺癌肿瘤大小对比图的统计分析图。
图4为肺癌细胞移植的小鼠中施用阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌后每组一只小鼠的典型的流式细胞分析图,右上象限为CD4+PD-1+(既表达CD4又表达PD-1)占脾脏总体CD4+T细胞的百分比。
图5为肺癌细胞移植的小鼠中施用阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌后每组一只小鼠的典型的流式细胞分析图,右上象限为CD8+PD-1+(既表达CD8又表达PD-1)占脾脏总体CD8+T细胞的百分比。
图6为肺癌细胞移植的小鼠中施用阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌后脾脏CD4+T细胞中PD-1的表达情况的统计分析图。
图7为肺癌细胞移植的小鼠中施用阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌后脾脏CD8+T细胞中PD-1的表达情况的统计分析图。
图8为肺癌细胞移植的小鼠肺肿瘤中施用阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌后每组一只小鼠的典型的CD8+T细胞流式细胞分析图，右象限为CD8+T细胞，右侧象限的数字显示的为CD8+T细胞占肺肿瘤微环境内总体细胞的百分比。
图9为肺癌细胞移植的小鼠中施用阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌后CD8+T细胞占肿瘤微环境内总体细胞的百分比的统计分析图。
图10为肺癌细胞移植的小鼠中施用灭活阿克曼粘细菌后每组一只小鼠的典型的肿瘤微环境内CD8+T细胞表达PD-1的流式细胞分析图,右上象限为CD8+PD-1+(既表达CD8又表达PD-1)占肿瘤微环境中总体CD8+T细胞的百分比。
图11为肺癌细胞移植的小鼠中施用灭活阿克曼粘细菌后肿瘤微环境中CD8+T细胞中PD-1表达情况的统计分析图。
图12在小鼠肺癌模型中检测普氏菌或灭活普氏菌遏制肿瘤以及普氏菌或灭活普氏菌抑制PD-1表达实验流程示意图。
图13为普氏菌或灭活普氏菌治疗后每组4只典型的小鼠肺癌肿瘤大小对比图。
图14为普氏菌或灭活普氏菌治疗后小鼠肺肿瘤大小对比图的统计分析图。
图15肺癌细胞移植的小鼠中施用灭活普氏菌后每组一只小鼠的典型的脾脏内CD8+T细胞表达PD-1的流式细胞分析图,右上象限为CD8+PD-1+(既表达CD8又表达PD-1)占脾脏中总体CD8+T细胞的百分比。
图16为肺癌细胞移植的小鼠中施用灭活普氏菌后脾脏内CD8+T细胞中PD-1的表达情况的统计分析图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需要指出的是，由本发明中的用于治疗和/或预防肿瘤的阿克曼粘细菌或普氏菌或含有本发明的阿克曼粘细菌或普氏菌的药物组合物、食品、保健品和食品添加剂在施用于受试者后，都可以应用于上文所述的适应症并展现出上文所述的功能，在本发明范围内的所有剂型均已测试，下文中，仅仅是为说明，只在实施例中描述了其中一小部分，然而不应将其理解为对本发明的限制。
本发明所指的阿克曼粘细菌或普氏菌包括但不限于以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。
所述肿瘤是实体瘤，例如但不限于肺癌、乳腺癌、黑色素肿瘤、肝癌、前列腺癌、纤维肉瘤、胃癌、食管癌、膀胱肉瘤及神经胶质瘤等实体瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于：肺癌。
本发明还提供的用于抗肿瘤的药物组合物包括药学有效剂量的阿克曼粘细菌或普氏菌。其中，所称的“药学有效剂量”为106～1010CFU，优选为109CFU。
所述药物组合物包括但不限于为片剂、胶囊剂、口服液或冻干粉剂。所述药学上可接受的载体包括但不限于为脱脂奶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、海藻糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油中的一种或多种。
本发明的阿克曼粘细菌或普氏菌还可以被制成食品、保健品或食品添加剂等。所述食品、保健品或食品添加剂均含有阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼粘细菌或普氏菌、阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液中的任意一种。这些食品、保健品或食品添加剂均可用于治疗和/或预防肿瘤。
实施例1阿克曼粘细菌培养
培养方法
步骤1：取一支冻干保存阿克曼粘细菌(Akkermansia muciniphila)菌种(购自ATCC官网)，加入200μLTSB培养基，溶解，吸200μl血平皿划线，厌氧罐气体控制系统抽气后，生化培养箱中37℃厌氧条件下培养48h；
步骤2：挑取单克隆菌落于10mL TSB培养基，37℃厌氧条件下培养48h；
步骤3：取500mL TSB培养基，按1％(v/v)接入菌种，37℃厌氧条件培养48小时；
步骤4：收菌液，以6000rpm转速离心10min。用生理盐水洗涤2次后复溶菌泥备用并进行活菌计数。
实施例2普氏菌培养
培养方法
步骤1：取一支冻干保存普氏菌(Prevotella copri)菌种(购自ATCC官网)，加入200μL PYG培养基，溶解，吸200μl血平皿划线，厌氧罐气体控制系统抽气后生化培养箱中37℃厌氧培养48h；
步骤2：挑取单克隆菌落于10mL PYG培养基，37℃厌氧条件下培养48h；
步骤3：取500mL PYG培养基，按1％(v/v)接入菌种，37℃厌氧条件下培养48小时；
步骤4：收菌液，6000rpm离心10min。用生理盐水洗涤2次后复溶菌泥备用并进行活菌计数。
实施例3阿克曼粘细菌增强T细胞抗肿瘤免疫功能及阿克曼粘细菌治疗肿瘤实验
图1为检测阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌增强T细胞抗肿瘤免疫功能并且促进肿瘤微环境中CD8+T细胞的积累以及阿克曼粘细菌或灭活阿克曼粘细菌防治肿瘤的实验流程示意图。
1、培养方法
阿克曼粘细菌培养方法同实施例1。
2、样品准备
1)阿克曼粘细菌活菌体的制备
步骤1：取一支冻干保存阿克曼粘细菌(Akkermansia muciniphila)菌种(购自ATCC官网)，加入200μL TSB培养基，溶解，吸200μl血平皿划线，厌氧罐气体控制系统抽气后生化培养箱中37℃厌氧条件下培养48h；
步骤2：挑取单克隆菌落于10mL TSB培养基，37℃厌氧条件培养48h；
步骤3：取500mL TSB培养基，按1％(v/v)接入菌种，37℃厌氧条件培养48小时；
步骤4：收菌液，以6000rpm转速离心10min。用生理盐水洗涤2次后复溶菌泥备用并进行活菌计数。
2)阿克曼粘细菌灭活菌体
70℃水浴加热30min获得灭活菌液。
3)阿克曼粘细菌裂解液
阿克曼粘细菌培养菌液，采用超声破碎法处理，破2秒，停5秒，持续20分钟，获得阿克曼粘细菌裂解液。
4)阿克曼粘细菌培养上清液
阿克曼粘细菌培养菌液，以6000rpm的转速离心10min，获得阿克曼粘细菌培养上清液。
3、阿克曼粘细菌对肿瘤防治作用的小鼠实验
实验动物：27只C57BL/6小鼠3～4周，精神状态良好，购自中山大学实验动物中心。将小鼠随机分成3组，每组9只，3组分别为对照组、活菌灌胃组、灭活菌灌胃组，3组小鼠分别给灌胃生理盐水、109CFU的阿克曼粘细菌及灭活阿克曼粘细菌，连续灌胃4次。随后待小鼠肿瘤(肺癌)细胞LLC生长到对数期，用胰酶消化细胞，然后利用培养基中和，离心后收集细胞，用DPBS洗两次，去除残留血清，最后用DPBS重悬细胞。细胞计数后按106个细胞接种到每只小鼠右腋皮下。继续对小鼠分别进行灌胃治疗，2周后处死荷瘤小鼠，分别收集肿瘤原位细胞和脾脏细胞，利用流式细胞术检测分析肿瘤微环境中CD8+T细胞的含量和PD-1分子表达量。
实施例4普氏菌抑制T细胞中PD-1分子表达及治疗肿瘤作用实验
图12为检测普氏菌或灭活普氏菌通过抑制T细胞中PD-1等耗竭分子表达从而增强T细胞免疫功能以及普氏菌或灭活普氏菌防治肿瘤的实验流程示意图。
1、培养方法
普氏菌培养方法同实施例2。
2、样品准备
1)普氏菌活菌体的制备
步骤1：取一支冻干保存普氏菌(Prevotella copri)菌种(购自ATCC官网)，加入200μLPYG培养基，溶解，吸200μl血平皿划线，厌氧罐气体控制系统抽气后，生化培养箱中37℃厌氧条件下培养48h；
步骤2：挑取单克隆菌落于10mL PYG培养基，37℃厌氧条件下培养48h；
步骤3：取500mL PYG培养基，按1％(v/v)接入菌种，37℃厌氧培养48小时；
步骤4：收菌液，以6000rpm的转速离心10min。用生理盐水洗涤2次后复溶菌泥备用并进行活菌计数。
2)普氏菌灭活菌体
70℃水浴加热30min获得灭活菌液。
3)普氏菌裂解液
普氏菌培养菌液，采用超声破碎法处理，破2秒，停5秒，持续20分钟，获得普氏菌裂解液。
4)普氏菌培养上清液
普氏菌培养菌液，以6000rpm的转速离心10min，获得普氏菌培养上清液。
3、普氏菌对肿瘤防治作用的小鼠实验
实验动物：27只C57BL/6小鼠3～4周，精神状态良好，购自中山大学实验动物中心。将小鼠随机分成3组，每组9只，3组分别为对照组、活菌灌胃组、灭活菌灌胃组，3组小鼠分别给灌胃生理盐水、109CFU的普氏菌及灭活普氏菌，连续灌胃4次。随后待小鼠肿瘤(肺癌)细胞LLC生长到对数期，用胰酶消化细胞，培养基中和，离心后收集细胞，用DPBS洗两次，去除残留血清，最后用DPBS重悬细胞。完成细胞计数定量后，按106个细胞接种到每只小鼠右腋皮下。继续对小鼠分别进行灌胃治疗，2周后处死荷瘤小鼠，分别收集肿瘤原位细胞和脾脏细胞，利用流式细胞术检测分析PD-1分子表达量。
结果分析：
在移植了肺癌细胞(LLC)的小鼠中施用阿克曼粘细菌的实验方案如图1所示。图2是施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌后小鼠中肺癌细胞移植的典型的肺肿瘤照片。图3是施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌后肺肿瘤的体积统计分析结果。从图2、图3的实验结果可以清晰地观察到，施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌后，肺肿瘤体积大幅度减小约2～3倍，而且减小具有统计学显著性差异。这说明，通过施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌可以显著抑制肺肿瘤的生长。
图4、图5分别是施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌后小鼠脾脏内分离的CD4+T细胞(图4)或CD8+T细胞(图5)表达PD-1分子的每个处理组一只小鼠典型的流式细胞分析图。图6、图7分别是施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌后小鼠脾脏内分离的CD4+T细胞(图6)或CD8+T细胞(图7)表达PD-1分子的统计分析结果图。从图4、图5、图6、图7的结果可以观察到，施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌后，机体内CD4+T细胞和/或CD8+T细胞表达PD-1分子显著减少。鉴于脾脏内的T细胞免疫功能体现了系统性的T细胞免疫功能特征，这些结果说明施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌后增强了系统性CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的免疫功能。
图8是每组一只小鼠的典型的肺肿瘤微环境中CD8+T细胞数量的流式细胞分析图,右象限的数字显示的为CD8+T细胞占肿瘤微环境中细胞的百分比情况图。从流式细胞分析象限图可以看出，相对比生理盐水对照组，阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌增加了肺肿瘤微环境中CD8+T细胞相对量约12～15倍。图9是肺癌细胞移植的小鼠中施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌后CD8+T细胞占肿瘤微环境细胞的百分比的统计分析图。从统计图可以看出，相对比生理盐水对照组，阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌显著增加了肿瘤微环境中CD8+T细胞的数量。
图10是施用灭活的阿克曼粘细菌后小鼠肺肿瘤微环境内分离的CD8+T细胞表达PD-1分子的每个处理组一只小鼠典型的流式细胞分析图。图11是施用灭活的阿克曼粘细菌后小鼠肺肿瘤微环境内分离的CD8+T细胞表达PD-1分子的统计分析结果图。从图10、图11的结果分析可以观察到，施用灭活的阿克曼粘细菌显著抑制小鼠肿瘤微环境中PD-1的表达。这些结果说明阿克曼粘细菌显著增强了肿瘤微环境中CD8+T细胞的抗肿瘤免疫功能。
图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11的PD-1表达分析结果说明，施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌不仅可以显著抑制PD-1在系统性CD4+T细胞和/或CD8+T细胞中的表达也可以增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润并且抑制肿瘤微环境中CD8+T细胞中PD-1的表达。鉴于PD-1是肿瘤中重要的T细胞功能耗竭或抑制性分子，PD-1的表达会抑制T细胞的抗肿瘤功能。因此，抑制PD-1的表达是抗肿瘤免疫治疗的关键技术路径。所以，施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌显著抑制PD-1在CD4+T细胞和/或CD8+T细胞中的表达的结果说明，施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌后显著增强了CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的抗肿瘤功能，而且阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌抑制肿瘤生长至少部分是通过抑制PD-1在T细胞中的表达从而增强机体抗肿瘤免疫功能实现的。
鉴于增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润是重要的抗肿瘤免疫治疗策略，本发明的结果也说明施用阿克曼粘细菌或灭活的阿克曼粘细菌不仅可以增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润和/或积累而且可以增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的免疫功能进而实现机体更强的抗肿瘤免疫功能。
在移植了肺癌细胞(LLC)的小鼠中施用普氏菌或灭活普氏菌的实验方案如图12所示。图13是施用普氏菌或灭活普氏菌后小鼠中肺癌细胞移植的典型的肺肿瘤照片。图14是施用普氏菌或灭活普氏菌后肺肿瘤的体积统计分析结果。从图13、图14的实验结果可以清晰地观察到，施用普氏菌或灭活普氏菌后，肺肿瘤体积大幅度减小约2～3倍，而且减小具有统计学显著性差异。这些结果清晰地证明通过施用普氏菌或灭活普氏菌可以显著抑制肺肿瘤的生长。
图15是施用灭活的普氏菌后小鼠脾脏内分离的CD8+T细胞表达PD-1分子的每种处理组一只小鼠典型的流式细胞分析图。图16是施用灭活的普氏菌后小鼠脾脏内分离的CD8+T细胞表达PD-1分子的统计分析结果图。从图15、图16的结果可以观察到，施用灭活的普氏菌后，机体内CD8+T细胞表达PD-1分子显著减少。
以上结果的统计分析图中，*表示student t-test p<0.05，**表示student t-testp<0.01，***表示student t-test p<0.001。p<0.05具有统计学差异意义。每种处理组有9只小鼠。
以上结果表明，施用普氏菌可以显著抑制机体内系统性的CD8+T细胞表达T细胞耗竭分子，例如PD-1，从而增强系统性CD8+T细胞的免疫功能进而抑制机体内肿瘤的生长。
以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。
Claims (10)
1.阿克曼粘细菌(Akkermansia muciniphila)或普氏菌(Prevotella copri)在制备用于增强CD4+T细胞和/或CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能和/或增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的抗肿瘤免疫功能的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体瘤。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺部实体瘤。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CD4+T细胞和/或CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能的增强特征包括：PD-1在CD4+T细胞和/或CD8+T细胞中表达的下降。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤微环境中CD8+T细胞的抗肿瘤免疫功能的增强特征包括：肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润和/或积累的增加。
7.一种用于增强系统性CD4+T细胞和/或CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能和/或肿瘤微环境中CD8+T细胞的抗肿瘤免疫功能从而预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学有效剂量的阿克曼粘细菌或普氏菌及其在药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。
9.一种用于增强系统性CD4+T细胞和/或CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能和/或肿瘤微环境中CD8+T细胞的抗肿瘤免疫功能从而预防和/或治疗肿瘤的可食用组合物，其特征在于，所述可食用组合物包括阿克曼粘细菌或普氏菌。
10.根据权利要求9所述的可食用组合物，其特征在于，所述阿克曼粘细菌或普氏菌为以下中的任意一种：阿克曼粘细菌或普氏菌活菌体；经过基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼粘细菌或普氏菌；阿克曼粘细菌或普氏菌裂解物；和/或阿克曼粘细菌或普氏菌培养上清液。
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