CN114164148B - 一株马乳酒样乳杆菌、菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株马乳酒样乳杆菌、菌剂及其应用，属于微生物菌剂技术领域。本发明的马乳酒样乳杆菌ZW18能够调节肿瘤免疫，刺激CD8细胞浸润，促进白介素‑12(IL‑12)和干扰素γ(IFN‑γ)表达，从而减缓肿瘤生长。其次，马乳酒样乳杆菌ZW18能够优化肠道菌群结构，改善肠道微生态环境：提高肠道中Prevotellaceae_NK3B31_group和Parabacteroides属等有益菌属丰度。这些有益菌可以代谢产生短链脂肪酸等物质，通过血液调节机体免疫，从而减缓肿瘤生长。此外，马乳酒样乳杆菌ZW18还能增强免疫检查点疗法抗肿瘤的效果以及克服免疫检查点疗法抗肿瘤的耐药性。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一株马乳酒样乳杆菌、菌剂及其应用。
背景技术
近年来，以免疫检查点为药物靶点的免疫检查点抑制剂(immune checkpointinhibitors，ICI)成为治疗肿瘤的前景药物。大量研究证实了ICI在临床中的有效性，但仍有较多接受ICI治疗的患者未获益。提高免疫治疗的临床应答率，寻找免疫治疗生物标志物成为免疫治疗能否突破的当务之急。肠道菌群是近年来新兴的免疫生物标志物之一，肠道菌群对PD-1类免疫治疗起决定性作用。将对PD-1疗效的患者粪便移植到抗生素小鼠模型上，能恢复小鼠重新获得ICI免疫治疗的响应。有研究称口服双歧杆菌可增加CD8+肿瘤特异性T细胞的肿瘤浸润和IFN-γ的产生，并通过一种涉及增加脾脏和肿瘤内树突状细胞活化的机制改善基础肿瘤控制和抗PD-L1的疗效(SivanA,Corrales L,Hubert N,etal.Commensal bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitatesanti-PD-L1 efficacy[J].Science,2015,350(6264):1084-1089)。目前，已经公开发表的针对PD-1疗法的微生物有粪拟杆菌、长双歧杆菌和普拉梭菌等。但是现有技术中还没有关于将马乳酒样乳杆菌用于免疫检查点疗法的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种、菌剂及其应用，本发明的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18能够预防或改善肿瘤性疾病以及增强免疫检查点疗法抗肿瘤的效果。
本发明提供了一株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种(Lactobacilluskefiranofaciens subsp.kefiranofacie)ZW18，保藏编号为：CGMCC No.23549。
本发明还提供了一种包括上述方案所述马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种的菌剂。
本发明还提供了上述方案所述的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者所述的菌剂在制备调节动物的机体免疫和/或改善肠道微生态环境的食品、保健品或药品中的应用。
优选的，所述改善肠道微生态包括提高肠道中有益菌属丰度；所述有益菌属包括Prevotellaceae_NK3B31_group和Parabacteroides属。
本发明还提供了上述方案所述的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者所述的菌剂在制备预防和/或治疗肿瘤的药品中的应用。
本发明还提供了上述方案所述的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者所述的菌剂联合免疫检查点抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用。
优选的，所述免疫检查点抑制剂包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂中的一种或几种
优选的，所述肿瘤包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈部鳞癌、食管鳞癌、肝癌、胆管癌、霍奇金淋巴瘤或膀胱癌。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗肿瘤的药品，包括活性成分和食品或药学上可接受的辅料；所述活性成分包括上述方案所述的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者权利要求2所述的菌剂。
优选的，所述活性成分还包括免疫检查点疗法采用的药物。
本发明提供了一株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种(Lactobacilluskefiranofaciens subsp.kefiranofacie)ZW18，保藏编号为：CGMCC No.23549。本发明的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18能够调节肿瘤免疫，刺激CD8细胞浸润，促进白介素-12(IL-12)和干扰素γ(IFN-γ)表达，从而减缓肿瘤生长。其次，马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种能够优化肠道菌群结构，改善肠道微生态环境：提高肠道中Prevotellaceae_NK3B31_group和Parabacteroides属等有益菌属丰度。这些有益菌可以代谢产生短链脂肪酸等物质，通过血液调节机体免疫，从而减缓肿瘤生长。此外，马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18还能增强免疫检查点疗法抗肿瘤的效果以及克服免疫检查点疗法抗肿瘤的耐药性。本发明以有效量的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18活菌及药学上能够接受的辅料制成药物饲喂小鼠，对小鼠肿瘤大小、肿瘤抑制率、肿瘤免疫微环境和小鼠肠道菌群进行检测。结果表明：与肿瘤组相比，ZW18干预能够减缓肿瘤生长，降低肿瘤大小，增加抑制率，促进肿瘤免疫微环境，平衡肠道菌群。说明本发明提供的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18制得的产品能够用于人或动物的各种癌症的预防、改善或辅助治疗。
附图说明
图1为马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18在小鼠肠道存活情况；
图2为马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18或ZW18联合PD-1抑制剂对小鼠肿瘤生长的影响结果：数据是以均值±S.D；**p＜0.01，*p＜0.05；
图3为马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18或ZW18联合PD-1抑制剂对小鼠肿瘤形态的影响结果；
图4为马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18或ZW18联合PD-1抑制剂对小鼠肿瘤中CD8细胞的影响结果：数据是以均值±S.D；**p＜0.01，*p＜0.05；
图5为马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18或ZW18联合PD-1抑制剂对小鼠肿瘤中细胞因子IFN-γ和IL-12的影响结果：数据是以均值±S.D；**p＜0.01，*p＜0.05；
图6为马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18或ZW18联合PD-1抑制剂对小鼠肠道菌群的影响结果；
图7为马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18或ZW18联合PD-1抑制剂对小鼠肠道屏障的影响结果：数据是以均值±S.D；**p＜0.01，*p＜0.05。
生物保藏说明
马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种(Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofacie)ZW18，于2021年10月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.23549。
具体实施方式
本发明提供了一株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种(Lactobacilluskefiranofaciens subsp.kefiranofacie)ZW18，保藏编号为：CGMCC No.23549。
在本发明中，所述马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18分离自开菲尔粒。ZW18是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性杆菌，无运动性，无孢子，厌氧环境中生长。16S rDNA测序进行分子生物学鉴定，确定ZW18的基因序列与乳杆菌属的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种(Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofacie)的同源相似性为99.93％。
本发明还提供了一种包括上述方案所述马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种的菌剂。
在本发明中，所述菌剂优选为液体制剂；所述菌剂中马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种的有效活菌数优选的≥107CFU/mL，更优选为107～109CFU/mL，最优选为108CFU/mL。
在本发明中，所述菌剂的制备方法优选的包括以下步骤：将马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18接种于MRS培养基中进行培养，培养至对数期末期，离心去上清，收集菌泥。在本发明中，所述培养的温度优选为37～38℃；所述离心的转速优选为5000～6000rpm；所述离心的温度优选为4℃；所述离心的时间优选为8～10min。本发明在得到所述菌泥后，优选的还包括将所述菌泥和冷冻保护剂以2:5的质量比混合，进行冷冻干燥，得到菌粉；所述冷冻保护剂优选为12％m/v脱脂乳粉。本发明在得到所述菌粉后，优选的还包括对所述菌粉进行重悬，得到菌剂；所述重悬采用的试剂优选为生理盐水。
本发明还提供了上述方案所述的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者所述的菌剂在制备调节动物的机体免疫和/或改善肠道微生态环境的食品、保健品或药品中的应用。
在本发明中，所述改善肠道微生态优选的包括提高肠道中有益菌属丰度和/或缓解肠道菌群紊乱；所述有益菌属优选的包括Prevotellaceae_NK3B31_group和/或Parabacteroides属。
在本发明中，所述动物包括但不限于人和/或鼠。
本发明还提供了上述方案所述的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者所述的菌剂在制备预防和/或治疗肿瘤的药品中的应用。
本发明还提供了上述方案所述的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者所述的菌剂联合免疫检查点抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用。
在本发明中，所述所述的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者所述的菌剂和免疫检查点抑制剂联用能够增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果，还能够克服免疫检查点抑制剂抗肿瘤的耐药性。
在本发明中，所述增强免疫检查点疗法的抗肿瘤效果优选的包括：减缓肿瘤生长，降低肿瘤大小，促进肿瘤抑制率，调节肿瘤免疫微环境，改善肠道微生态或保护肠道屏障。在本发明中，所述肿瘤免疫微环境优选的包括：CD8细胞阳性率，白介素-12(IL-12)的含量或干扰素γ(IFN-γ)的含量中的一种或几种。在本发明中，所述肠道微生态优选的包括菌群丰度及多样性。
在本发明中，所述免疫检查点抑制剂优选的包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂中的一种或几种。
在本发明中，所述肿瘤优选为恶性肿瘤；所述肿瘤优选的包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈部鳞癌、食管鳞癌、肝癌，胆管癌，霍奇金淋巴瘤或膀胱癌。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗肿瘤的药品，包括活性成分和药学上可接受的辅料；所述活性成分包括上述方案所述的马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者所述的菌剂。
在本发明中，所述药品的剂型包括口服制剂。在本发明中，所述口服制剂优选的包括粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂或饮剂。在本发明中，所述马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18具有耐酸、耐胆盐的特性，能够通过哺乳动物胃肠道，在体内存活。在本发明中，所述马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18以活菌的形式发挥作用。
本发明对所述药学上可接受的辅料没有特殊限制，采用本领域常规的辅料即可。在本发明中，当所述药品的剂型为饮剂时，所述药学上可接受的辅料包括生理盐水。在本发明中，所述生理盐水的质量体积浓度优选为0.6％～0.9％。在本发明具体试试过程中根据施用对象的不同，调整相对应的生理盐水质量体积浓度，当施用对象为人时，生理盐水质量体积浓度优选为0.9％；当施用对象为小鼠时，生理盐水质量体积浓度优选为0.85％；当施用对象为鸟类时，生理盐水质量体积浓度优选为0.75％；当施用对象为两栖类时，生理盐水质量体积浓度优选为0.65％。
在本发明中，所述活性成分优选的还包括免疫检查点疗法采用的药物。
在本发明中，所述免疫检查点疗法采用的药物和所述马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者所述的菌剂独立包装；所述免疫检查点疗法采用的药物的浓度优选为1～3μg/μL，更优选的为2μg/μL。
在本发明中，所述马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种或者所述的菌剂以马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种的有效活菌数计，有效量为107～109CFU/日鼠。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
将马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18接种于MRS培养基中，37℃下培养至对数期末期，离心(6000rpm/min，4℃，8min)去上清，收集菌泥。以12％脱脂乳粉为保护剂进行冷冻干燥，干燥后即制得ZW18菌粉。取马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18菌粉适量，用生理盐水重悬并调整终浓度为2×108CFU/mL，在pH 2.0～3.0培养基中进行培养4h，其活菌数在5×106CFU以上；在0-0.3％胆盐的环境中培养3h，其活菌数在5×106CFU以上。因此，ZW18具有良好的耐酸耐胆盐特性。并且在小鼠动物体内进行验证，可以通过荧光成像方法观察到ZW18的存活。结果如图1所示。图1中A为无荧光小鼠肠道，B为空白对照小鼠肠道。红色荧光信号为ZW18。由图可知，ZW18可以在肠道存活。
实施例2
取马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18菌粉适量，用生理盐水重悬并调整最终浓度为5×109CFU/mL，制得菌剂。该菌剂即为本发明所述预防或改善肿瘤性疾病以及促进免疫检查点疗法抗肿瘤的药物。
实施例3
以小鼠为实验材料，将小鼠分为肿瘤组和实验组。实验组包括：PD-1抑制剂组、ZW18组以及联合干预组(PD-1抑制剂+ZW18)，每组各10只。C57BL/6小鼠皮下注射5×105个B16-F10黑色素瘤细胞，7天后肿瘤大小为100～200mm3视为造模成功。肿瘤组不做任何处理；PD-1抑制剂组每两天腹腔注射200μg PD-1抑制剂，共注射5次；ZW18组每天服用实施例2所述ZW18菌剂，服用量为0.2mL，5×109CFU/mL；联合组每两天腹腔注射200μg PD-1抑制剂同时服用实施例2所述ZW18菌剂，每天一次，每次服用量为0.2mL，5×109CFU/mL。肿瘤生长体积见图2。由图可知，与肿瘤组相比，ZW18减缓了肿瘤的生长。与PD-1抑制剂组相比，联合干预减缓肿瘤生长的效果更好。肿瘤重量及抑制率见表1所示。由表1可知，与肿瘤组相比，PD-1抑制剂干预、ZW18干预和联合干预都有效降低了肿瘤重量。其中，PD-1抑制剂和ZW18对肿瘤的抑制效果相差不多，联合干预对肿瘤的抑制效果较明显，抑制率接近于70％。对肿瘤形态进行切片处理，HE染色，结果如图3显示：实验组的肿瘤坏死面积变大，淋巴细胞浸润增多。
表1各组小鼠肿瘤重量及抑制率
实施例4
以小鼠为实验材料，将小鼠分为肿瘤组和实验组。实验组包括：PD-1抑制剂组、ZW18组以及联合干预组(PD-1抑制剂+ZW18)，每组各10只。C57BL/6小鼠皮下注射5×105个B16-F10黑色素瘤细胞，7天后肿瘤大小为100～200mm3视为造模成功。肿瘤组不做任何处理；PD-1抑制剂组每两天腹腔注射200μg PD-1抑制剂，共注射5次；ZW18组每天服用实施例2所述ZW18菌剂，服用量为0.2mL，5×109CFU/mL；联合组每两天腹腔注射200μg PD-1抑制剂同时服用实施例2所述ZW18菌剂，每天一次，每次服用量为0.2mL，5×109CFU/mL。结果显示，对肿瘤中CD8细胞进行免疫组化染色，并计算平均光密度值，图4显示：与肿瘤小鼠相比，进行干预的肿瘤小鼠的肿瘤中CD8细胞阳性率及平均光密度值增加，其中联合干预增加显著；对肿瘤中细胞因子IFN-γ和IL-12检测，图5显示，与肿瘤小鼠相比，ZW18干预可以增加肿瘤中IFN-γ和IL-12的分泌量；与PD-1抑制剂相比，联合干预可以增加肿瘤中IFN-γ和IL-12的分泌量。
实施例5
以小鼠为实验材料，将小鼠分为肿瘤组和实验组。实验组包括：PD-1抑制剂组、ZW18组以及联合干预组(PD-1抑制剂+ZW18)，每组各10只。C57BL/6小鼠皮下注射5×105个B16-F10黑色素瘤细胞，7天后肿瘤大小为100-200mm3视为造模成功。肿瘤组不做任何处理；PD-1抑制剂组每两天腹腔注射200μg PD-1抑制剂，共注射5次；ZW18组每天服用实施例2所述ZW18菌剂，服用量为0.2mL，5×109CFU/mL；联合组每两天腹腔注射200μg PD-1抑制剂同时服用实施例2所述ZW18菌剂，每天一次，每次服用量为0.2mL，5×109CFU/mL。处死小鼠后，收集小鼠粪便，利用16S rDNA对小鼠粪便进行测序，检测小鼠粪便菌群多样性。结果如图6所示，与肿瘤组相比，ZW18可以增加肠道中Lachnospiraceae_NK4A136_group等微生物的含量；与PD-1抑制剂组相比，联合干预可以通过改善肠道菌群丰度及多样性，提高肠道中Prevotellaceae_NK3B31_group属、Alloprevotella属和Parasutterella属等有益菌属丰度，这些有益菌可以代谢产生短链脂肪酸等物质，通过血液调节机体免疫，从而减缓肿瘤生长，提高PD-1抑制剂抗肿瘤的效果。
实施例6
以小鼠为实验材料，将小鼠分为肿瘤组和实验组。实验组包括：PD-1抑制剂组、ZW18组以及联合干预组(PD-1抑制剂+ZW18)，每组各10只。C57BL/6小鼠皮下注射5×105个B16-F10黑色素瘤细胞，7天后肿瘤大小为100-200mm3视为造模成功。肿瘤组不做任何处理；PD-1抑制剂组每两天腹腔注射200μg PD-1抑制剂，共注射5次；ZW18组每天服用实施例2所述ZW18菌剂，服用量为0.2mL，5×109CFU/mL；联合组每两天腹腔注射200μg PD-1抑制剂同时服用实施例2所述ZW18菌剂，每天一次，每次服用量为0.2mL，5×109CFU/mL。对肠道屏障进行检测，结果如图7所示，ZW18和联合干预均可以有效保护肠道屏障，同时，降低了免疫组织评分。
结论：通过改善肿瘤免疫微环境，调节肠道菌群，马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18可以发挥抗肿瘤的作用。同时有效促进PD-1抑制剂抗肿瘤的效果
注意：本发明使用SPSS分析各实验组间的差异。本文所呈现的所有数据均以平均值±标准差(SD)表示。若p＜0.05，则差异被认为是统计学上显著的。各组间之统计差异若p＜0.05以星号(*)表示，若p＜0.01星号(**)表示。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (5)
1.一种马乳酒样乳杆菌或者包括马乳酒样乳杆菌的菌剂在制备治疗肿瘤的药品中的应用；所述马乳酒样乳杆菌为马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)ZW18，保藏编号为：CGMCC No .23549；所述肿瘤为黑色素瘤。
2.一种马乳酒样乳杆菌或者包括马乳酒样乳杆菌的菌剂联合免疫检查点抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用；所述马乳酒样乳杆菌为马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)ZW18，保藏编号为：CGMCC No .23549；所述肿瘤为黑色素瘤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂中的一种或几种。
4.一种用于治疗肿瘤的药品，包括活性成分和食品或药学上可接受的辅料；所述活性成分包括马乳酒样乳杆菌或者包括马乳酒样乳杆菌的菌剂；所述马乳酒样乳杆菌为马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)ZW18，保藏编号为：CGMCC No .23549；所述肿瘤为黑色素瘤。
5.根据权利要求4所述的药品，其特征在于，所述活性成分还包括免疫检查点疗法采用的药物。
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