CN116287355A - 上消化道肿瘤化疗疗效及不良反应的肠道菌群预测模型 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了上消化道肿瘤化疗疗效及不良反应的肠道菌群预测模型，其中，预测上消化道肿瘤化疗疗效的微生物标志物选自卵形拟杆菌、普通拟杆菌、细线虫菌或狄氏副拟杆菌中的一种或多种，预测上消化道肿瘤化疗不良反应的肠道菌群标志物选自普通拟杆菌、单形拟杆菌或嗜黏蛋白阿克曼菌中的一种或多种，所述的上消化道肿瘤为食管癌、胃癌或胃食管交界处癌。本发明提供的微生物标志物和肠道菌群标志物可用于预测上消化道肿瘤化疗风险的辅助诊断，检测特异性好，灵敏度高，具有指示患者肠道微生物菌群的状况，指导患者肠道微生物的调整以提高上消化道肿瘤患者的化疗疗效和降低化疗不良反应。

Description

上消化道肿瘤化疗疗效及不良反应的肠道菌群预测模型
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及上消化道肿瘤化疗疗效及不良反应的肠道菌群预测模型。
背景技术
上消化道肿瘤是世界范围内最常见的恶性肿瘤，其包括食管癌、胃癌等。对于食管癌和胃癌，约三分之一的患者在就诊时为可切除病变，60%以上的患者已处于局部晚期或已出现远处转移，预后不佳。对于不可切除的食管癌和胃癌，目前主要治疗方法为化疗、靶向治疗、免疫检查点抑制剂治疗等，但这些治疗手段的疗效均有限。治疗后转移性食管癌及胃癌的中位生存期仅10-13个月左右。
研究发现，消化道肿瘤的发生发展是多因素作用的结果。基因或表观遗传学的改变、免疫状态、饮食和环境因素、病原微生物感染等均可能与消化道肿瘤的发生和进展有关。因此，从消化道肿瘤发生发展的特征出发，探索新的生物标志物，可以对消化道肿瘤的疗效预测、进展风险评估提供可靠的依据。
人体的肠道内有约3.8×1013种微生物，这些微生物共同参与了维持人体正常的生理功能、调节免疫及代谢等生理活动。近年来，越来越多的证据表明，肠道微生物菌群作为环境因素，可能深入参与了消化道肿瘤的发生及发展过程。随着临床及分子生物学等基础研究的深入，肠道菌群通过产生特异性毒素、影响细胞内信号通路、调节免疫反应等机制干预结直肠癌发生发展的理论不断得到证实。研究发现上消化道的消化液及组织内微生物与食管癌、胃癌的发病有关。多项研究通过动物实验发现，部分菌种对于结肠癌、淋巴瘤等小鼠模型的化疗疗效及不良反应有显著影响。有研究应用16S核糖体RNA（ribosomal RNA,rRNA）测序的方法分析粪便菌群，首次发现双歧杆菌与T细胞免疫功能密切相关；细胞程序性死亡受体-1（Programmed cell death protein-1, PD-1）抗体治疗有效的黑色素瘤患者肠道中瘤胃球菌属丰度更高、抗肿瘤免疫功能增强；非小细胞肺癌及肾癌的患者粪便中，艾克曼菌直接与免疫治疗疗效呈正相关。基于肠道菌群与人体代谢和免疫系统的关系及菌群在其他类型肿瘤中的最新研究进展，我们认为肠道菌群可能与上消化道肿瘤的发生发展、疗效及药物不良反应有相关性。
目前，化疗仍然是食管癌、胃癌治疗的基础用药。如何预测化疗方案的疗效，始终是临床的难题。在接受化疗前精准预测治疗有效性和不良反应发生风险，对于上消化道肿瘤的治疗至关重要。目前预测化疗疗效的生物标志物有限，部分疗效预测的标志物需要外周血游离DNA或有创肿瘤活检的方式检测，并且采用昂贵的检测手段，很难实施动态监测，临床应用局限。因此，选择可靠、无创、简便的生物标志物或疗效预测模型具有重要的研究意义。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了上消化道肿瘤化疗疗效预测的标志物及预测模型。我们应用16S rRNA测序法检测食管癌、胃癌患者的粪便菌群差异，分析菌群与抗肿瘤治疗疗效及不良反应的相关性，通过筛选与分析，建立了粪便菌群的疗效预测标志物。
本发明的第一方面，提供了一种检测微生物标志物的试剂在制备预测和/或评估上消化道肿瘤化疗疗效的产品中的应用，所述的微生物标志物选自卵形拟杆菌、普通拟杆菌、细线虫菌或狄氏副拟杆菌中的一种或多种。
进一步地，所述的上消化道肿瘤为食管癌、胃癌或胃食管交界处癌。
优选地，所述的上消化道肿瘤为食管鳞癌、胃腺癌或胃食管交界处腺癌。
进一步地，所述的检测微生物标志物的试剂选自宏基因组测序试剂、16S rRNA扩增子测序试剂、微滴式数字PCR检测试剂、qPCR定量检测试剂、聚合酶链式反应、逆转录-聚合酶链式反应、巢式PCR或核酸杂交用试剂中的一种或多种。
进一步地，所述的检测微生物标志物的试剂用于检测受试者的肠道微生物的样本中所述微生物标志物（如卵形拟杆菌、普通拟杆菌、细线虫菌或狄氏副拟杆菌）的存在和丰度。本发明将所述微生物标志物的丰度作为预测和/或评估上消化道肿瘤化疗疗效的指标（单独或联合指标）。
进一步地，所述的样本为粪便样本。
进一步地，所述的受试者为哺乳动物，特别是人类。
在本发明的一个实施例中，所述的检测微生物标志物的试剂是针对肠道微生物的基因组DNA的检测试剂，所述的检测肠道微生物的基因组DNA的检测引物是针对微生物的16S rRNA V4区段的特异性引物。
进一步地，所述的化疗疗效的评估等级分为非缓解（non-PR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）。其中，将部分缓解和/或疾病稳定评估为化疗达到疾病控制，将非缓解和/或疾病进展评估为化疗无效。本发明经过大量试验研究发现，在患者化疗前的肠道微生物的样本中，卵形拟杆菌、普通拟杆菌的丰度与食管癌化疗疗效正相关（即丰度越高，越易达到部分缓解和/或疾病稳定），细线虫菌、狄氏副拟杆菌的丰度与胃癌化疗疗效负相关（即丰度越低，越易达到部分缓解和/或疾病稳定）。
在本发明的一个实施例中，选择含铂类（顺铂/奥沙利铂）、氟尿嘧啶类、紫杉醇类药物的化疗方案（可单药或多药联合）用于治疗食管鳞癌、胃腺癌或胃食管交界处腺癌。
在本发明的一个实施例中，所述的卵形拟杆菌或普通拟杆菌可作为单独指标用于预测和/或评估食管癌化疗疗效。其中，所述的卵形拟杆菌的丰度越高，所述的食管癌化疗疗效越易达到部分缓解，ROC分析显示曲线下面积为79%；所述的普通拟杆菌的丰度越高，所述的食管癌化疗疗效越易达到部分缓解和/或疾病稳定（疾病控制），ROC分析显示曲线下面积为86.5%。
在本发明的一个实施例中，所述的细线虫菌和/或狄氏副拟杆菌可作为单独或联合指标用于预测和/或评估胃癌化疗疗效。其中，所述的细线虫菌的丰度越低，所述的胃癌化疗疗效越易达到部分缓解，ROC分析显示曲线下面积为84.8%；所述的狄氏副拟杆菌的丰度越低，所述的胃癌化疗疗效越易达到部分缓解，ROC分析显示曲线下面积为76.8%；所述的细线虫菌和狄氏副拟杆菌的丰度越低，所述的胃癌化疗疗效越易达到部分缓解，ROC分析显示曲线下面积为92.0%。
进一步地，所述的预测和/或评估上消化道肿瘤化疗疗效的产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片或仪器平台。
本发明的第二方面，提供了一种预测和/或评估上消化道肿瘤化疗疗效的产品，包括检测第一方面所述微生物标志物的试剂。
进一步地，所述的上消化道肿瘤为食管癌、胃癌或胃食管交界处癌。
优选地，所述的上消化道肿瘤为食管鳞癌、胃腺癌或胃食管交界处腺癌。
进一步地，所述的检测微生物标志物的试剂选自宏基因组测序试剂、16S rRNA扩增子测序试剂、微滴式数字PCR检测试剂、qPCR定量检测试剂、聚合酶链式反应、逆转录-聚合酶链式反应、巢式PCR或核酸杂交用试剂中的一种或多种。
进一步地，所述的检测微生物标志物的试剂用于检测受试者的肠道微生物的样本中所述微生物标志物（如卵形拟杆菌、普通拟杆菌、细线虫菌或狄氏副拟杆菌）的存在和丰度。本发明将所述微生物标志物的丰度作为预测和/或评估上消化道肿瘤化疗疗效的指标（单独或联合指标）。
进一步地，所述的样本为粪便样本。
进一步地，所述的受试者为哺乳动物，特别是人类。
在本发明的一个实施例中，所述的检测微生物标志物的试剂是针对肠道微生物的基因组DNA的检测试剂，所述的检测肠道微生物的基因组DNA的检测引物是针对微生物的16S rRNA V4区段的特异性引物。
进一步地，所述的化疗疗效的评估等级分为非缓解、部分缓解、疾病稳定和疾病进展。其中，将部分缓解和/或疾病稳定评估为化疗达到疾病控制，将非缓解和/或疾病进展评估为化疗无效。
进一步地，所述的预测和/或评估上消化道肿瘤化疗疗效的产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片或仪器平台。
本发明的第三方面，提供了一种上消化道肿瘤化疗疗效的预测模型，所述的预测模型以第一方面所述微生物标志物的丰度作为输入变量。
进一步地，所述的上消化道肿瘤为食管癌、胃癌或胃食管交界处癌。
优选地，所述的上消化道肿瘤为食管鳞癌、胃腺癌或胃食管交界处腺癌。
进一步地，所述的化疗疗效的评估等级分为非缓解、部分缓解、疾病稳定和疾病进展。其中，将部分缓解和/或疾病稳定评估为化疗达到疾病控制，将非缓解和/或疾病进展评估为化疗无效。
进一步地，所述预测的标准为：和参照相比，化疗前受试者的肠道微生物的样本中所述的卵形拟杆菌、普通拟杆菌的丰度与食管癌化疗疗效正相关（即丰度越高，越易达到部分缓解和/或疾病稳定）；所述的细线虫菌、狄氏副拟杆菌的丰度与胃癌化疗疗效负相关（即丰度越低，越易达到部分缓解和/或疾病稳定）。
进一步地，所述参照为化疗前受试者的肠道微生物的样本中所述微生物标志物的最大约登指数所对应的相对丰度值。
进一步地，所述的样本为粪便样本。
进一步地，所述的受试者为哺乳动物，特别是人类。
在本发明的一个实施例中，所述的食管癌化疗疗效的预测模型的输入变量为卵形拟杆菌的丰度或普通拟杆菌的丰度。
在本发明的一个实施例中，所述的胃癌化疗疗效的预测模型的输入变量为细线虫菌的丰度和/或狄氏副拟杆菌的丰度。
本发明的第四方面，提供了一种检测肠道菌群标志物的试剂在制备预测和/或评估上消化道肿瘤化疗不良反应的产品中的应用，所述的肠道菌群标志物选自普通拟杆菌、单形拟杆菌或嗜黏蛋白阿克曼菌中的一种或多种。
进一步地，所述的上消化道肿瘤为食管癌、胃癌或胃食管交界处癌。
优选地，所述的上消化道肿瘤为食管鳞癌、胃腺癌或胃食管交界处腺癌。
进一步地，所述的检测肠道菌群标志物的试剂选自宏基因组测序试剂、16S rRNA扩增子测序试剂、微滴式数字PCR检测试剂、qPCR定量检测试剂、聚合酶链式反应、逆转录-聚合酶链式反应、巢式PCR或核酸杂交用试剂中的一种或多种。
进一步地，所述的检测肠道菌群标志物的试剂用于检测受试者的肠道微生物的样本中所述肠道菌群标志物（如普通拟杆菌、单形拟杆菌或嗜黏蛋白阿克曼菌）的存在和丰度。本发明将所述肠道菌群标志物的丰度作为预测和/或评估上消化道肿瘤化疗不良反应的指标（单独或联合指标）。
进一步地，所述的样本为粪便样本。
进一步地，所述的受试者为哺乳动物，特别是人类。
在本发明的一个实施例中，所述的检测肠道菌群标志物的试剂是针对肠道微生物的基因组DNA的检测试剂，所述的检测肠道微生物的基因组DNA的检测引物是针对微生物的16S rRNA V4区段的特异性引物。
进一步地，所述的化疗不良反应的等级分为1、2、3、4、5级（参照美国卫生及公共服务部颁布的常见不良事件评价表征（CTCAE））。本发明经过大量试验研究发现，在患者化疗前的肠道微生物的样本中，普通拟杆菌、单形拟杆菌的丰度与食管癌化疗不良反应正相关，嗜黏蛋白阿克曼菌的丰度与胃癌化疗不良反应正相关（即丰度越高，越易产生3-4级不良反应）。
在本发明的一个实施例中，所述的普通拟杆菌和/或单形拟杆菌可以作为单独或联合指标用于预测和/或评估食管癌化疗不良反应。其中，所述的普通拟杆菌的丰度越高，所述的食管癌化疗不良反应越易产生3-4级不良反应，ROC分析显示曲线下面积为75%；所述的单形拟杆菌的丰度越高，所述的食管癌化疗不良反应越易产生3-4级不良反应，ROC分析显示曲线下面积为77.9%；所述的普通拟杆菌和单形拟杆菌作为联合指标，预测3-4级不良反应的效能更好，ROC分析显示曲线下面积为82.5%。
在本发明的一个实施例中，所述的嗜黏蛋白阿克曼菌可以作为单独指标用于预测和/或评估胃癌化疗不良反应。其中，所述的嗜黏蛋白阿克曼菌的丰度越高，所述的胃癌化疗不良反应越易产生3-4级不良反应，ROC分析显示曲线下面积为83%。
进一步地，所述的预测和/或评估上消化道肿瘤化疗不良反应的产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片或仪器平台。
本发明的第五方面，提供了一种预测和/或评估上消化道肿瘤化疗不良反应的产品，包括检测第四方面所述肠道菌群标志物的试剂。
进一步地，所述的上消化道肿瘤为食管癌、胃癌或胃食管交界处癌。
优选地，所述的上消化道肿瘤为食管鳞癌、胃腺癌或胃食管交界处腺癌。
进一步地，所述的检测肠道菌群标志物的试剂选自宏基因组测序试剂、16S rRNA扩增子测序试剂、微滴式数字PCR检测试剂、qPCR定量检测试剂、聚合酶链式反应、逆转录-聚合酶链式反应、巢式PCR或核酸杂交用试剂中的一种或多种。
进一步地，所述的检测肠道菌群标志物的试剂用于检测受试者的肠道微生物的样本中所述肠道菌群标志物（如普通拟杆菌、单形拟杆菌或嗜黏蛋白阿克曼菌）的存在和丰度。本发明将所述肠道菌群标志物的丰度作为预测和/或评估上消化道肿瘤化疗不良反应的指标（单独或联合指标）。
进一步地，所述的样本为粪便样本。
进一步地，所述的受试者为哺乳动物，特别是人类。
在本发明的一个实施例中，所述的检测肠道菌群标志物的试剂是针对肠道微生物的基因组DNA的检测试剂，所述的检测肠道微生物的基因组DNA的检测引物是针对微生物的16S rRNA V4区段的特异性引物。
进一步地，所述的化疗不良反应的等级分为1、2、3、4、5级。
进一步地，所述的预测和/或评估上消化道肿瘤化疗不良反应的产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片或仪器平台。
本发明的第六方面，提供了一种上消化道肿瘤化疗不良反应的预测模型，所述的预测模型以第四方面所述肠道菌群标志物的丰度作为输入变量。
进一步地，所述的上消化道肿瘤为食管癌、胃癌或胃食管交界处癌。
优选地，所述的上消化道肿瘤为食管鳞癌、胃腺癌或胃食管交界处腺癌。
进一步地，所述的化疗不良反应的等级分为1、2、3、4、5级。
进一步地，所述预测的标准为：和对照相比，化疗前受试者的肠道微生物的样本中所述的普通拟杆菌、单形拟杆菌的丰度与食管癌化疗不良反应正相关（即丰度越高，越易产生3-4级不良反应）；所述的嗜黏蛋白阿克曼菌的丰度与胃癌化疗不良反应正相关。
进一步地，所述对照为化疗前患者的肠道微生物的样本中所述肠道菌群标志物的最大约登指数所对应的相对丰度值。
进一步地，所述的样本为粪便样本。
进一步地，所述的受试者为哺乳动物，特别是人类。
在本发明的一个实施例中，所述的食管癌化疗不良反应的预测模型的输入变量为普通拟杆菌和/或单形拟杆菌的丰度。
在本发明的一个实施例中，所述的胃癌化疗不良反应的预测模型的输入变量为嗜黏蛋白阿克曼菌的丰度。
本发明的七方面，提供了一种预测和/或评估上消化道肿瘤化疗疗效或化疗不良反应的方法，其包括检测第一方面所述微生物标志物的试剂或检测第四方面所述肠道菌群标志物的试剂的步骤。
进一步地，所述的上消化道肿瘤为食管癌、胃癌或胃食管交界处癌。
优选地，所述的上消化道肿瘤为食管鳞癌、胃腺癌或胃食管交界处腺癌。
进一步地，所述的化疗疗效的评估等级分为非缓解、部分缓解、疾病稳定和疾病进展。其中，将部分缓解和/或疾病稳定评估为化疗达到疾病控制，将非缓解和/或疾病进展评估为化疗无效。
进一步地，所述的化疗不良反应的等级分为1、2、3、4、5级。
进一步地，所述的方法包括如下步骤：
（1）获取受试者的肠道微生物的样本；
（2）检测受试者的肠道微生物的样本中所述微生物标志物或所述肠道菌群标志物的丰度；
（3）将测得的所述微生物标志物或所述肠道菌群标志物的丰度与受试者的上消化道肿瘤化疗疗效或化疗不良反应联系起来。
进一步地，所述的预测和/或评估上消化道肿瘤化疗疗效的标准为：和参照相比，化疗前受试者的肠道微生物的样本中所述的卵形拟杆菌、普通拟杆菌的丰度与食管癌化疗疗效正相关（即丰度越高，越易达到部分缓解和/或疾病稳定）；所述的细线虫菌、狄氏副拟杆菌的丰度与胃癌化疗疗效负相关（即丰度越低，越易达到部分缓解和/或疾病稳定）。
进一步地，所述参照为化疗前患者的肠道微生物的样本中所述微生物标志物的最大约登指数所对应的相对丰度值。
进一步地，所述的预测和/或评估上消化道肿瘤化疗不良反应的标准为：和对照相比，化疗前受试者的肠道微生物的样本中所述的普通拟杆菌、单形拟杆菌的丰度与食管癌化疗不良反应正相关；所述的嗜黏蛋白阿克曼菌的丰度与胃癌化疗不良反应正相关（即丰度越高，越易产生3-4级不良反应）。
进一步地，所述对照为化疗前患者的肠道微生物的样本中所述肠道菌群标志物的最大约登指数所对应的相对丰度值。
进一步地，所述的样本为粪便样本。
进一步地，所述的受试者为哺乳动物，特别是人类。
本发明提供了一种预测上消化道肿瘤（如食管癌、胃癌、胃食管交界处癌）化疗疗效及不良反应的生物标志物，可用于预测上消化道肿瘤化疗风险的辅助诊断，检测特异性好，灵敏度高，具有指示患者肠道微生物菌群的状况，指导患者肠道微生物的调整以提高上消化道肿瘤患者的化疗疗效和降低化疗不良反应。本发明所采用的粪便微生物检测无创，省时，方便临床操作及动态监测，有重要的临床意义及广泛的适用性。菌群预测模型的成功建立，反映了人体内的微生物群落可能通过与机体的免疫微环境、代谢物之间的相互作用，不仅有预测免疫检查点抑制剂疗效的作用，也对化疗药物的疗效、不良反应发生的严重程度有较好的预测价值。这对临床医生在治疗前更好的选择患者的治疗策略，并预先判断患者可能发生的不良反应的严重程度，从而调整化疗药物剂量、更好的进行不良反应的预防，都有积极的临床意义。
附图说明
图1所示为食管癌与胃癌患者粪便菌群比较的PLS-DA图。
图2所示为食管癌与胃癌患者粪便的菌属水平比较的LDA图。
图3所示为食管癌患者粪便中Bacteroides ovatus预测化疗疗效（PR）的ROC曲线。
图4所示为食管癌患者粪便中Bacteroides plebeius预测化疗疗效（PR+SD）的ROC曲线。
图5所示为食管癌患者粪便中Bacteroides plebeius预测化疗不良反应的ROC曲线。
图6所示为食管癌患者粪便中Bacteroides uniformis预测化疗不良反应的ROC曲线。
图7所示为食管癌患者粪便中B.plebeius、B.uniformis及联合模型对于化疗不良反应预测的ROC曲线。
图8所示为胃癌患者粪便中Alistipes indistinctus预测化疗疗效（PR）的ROC曲线。
图9所示为胃癌患者粪便中Parabacteroides distasonis预测化疗疗效（PR）的ROC曲线。
图10所示为胃癌患者粪便中A.indistinctus、P.distasonis的联合模型预测化疗不良反应的ROC曲线。
图11所示为胃癌患者粪便中Akkermansia muciniphila预测化疗不良反应的ROC曲线。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
术语“约登指数”，是评价筛查试验真实性的方法，表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。约登指数是敏感性与特异性之和减去1。最大约登指数处所对应的截断点对应值作为CUT OFF值能够保证试剂盒的准确度最优。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1材料与方法
1、研究对象
本研究前瞻性入组上消化道肿瘤患者共60例（食管癌30例，胃癌30例）；
入组标准：（1）年龄大于18岁；（2）病理组织学或细胞学确定诊断的食管鳞癌、胃或胃食管交界区腺癌；（3）入组时分期为局部晚期或Ⅳ期（AJCC 8.0）；（4）入组前6个月内未接受手术或其他抗肿瘤治疗；（5）脏器功能正常；（6）符合化学药物治疗的要求；（7）1月内未应用益生菌或抗生素；（8）自愿参加本研究。排除标准：（1）肠梗阻；（2）基线粪便标本不合格或无法采集。
2、研究方法
2.1诊治方案
食管鳞癌、胃或胃食管交界区腺癌：选择含铂类（顺铂/奥沙利铂）、氟尿嘧啶类、紫杉醇类药物的化疗方案（可单药或多药联合）。
2.2样品采集
留取患者抗肿瘤治疗前的粪便标本，-80℃冰箱冻存。
2.3临床患者肠道菌群16S rRNA测序分析
应用16S rRNA测序技术，结合生物信息学，探索消化道肿瘤患者肠道微生物组成及丰度，与6周时疗效评估结果进行对比分析，探索与疗效相关的肠道菌种，并进行ROC分析。
16S rRNA测序：
取质量合格的基因组DNA样品30ng，以DNA为模板，应用16S rRNA基因的V4区融合引物（515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）进行PCR扩增。使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化，完成建库。使用Agilent 2100Bioanalyzer 对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库应用Hiseq 2500平台进行PE250测序分析。测序后的原始数据经过滤获得优质洁净数据；应用软件FLASH（FastLength Adjustment of Short reads，v1.2.11），利用重叠关系将成对测序片段拼接成Tags；应用软件USEARCH（v7.0.1090）将拼接好的Tags在97%相似度下进行聚类，得到可操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTUs）；将OTU序列与数据库Greengene_2013_5_99 比对，进行物种注释。根据OTU及注释结果进行菌群成分分析及组间差异分析。
3、统计学分析
统计学分析应用R(v 3.1.1）语言。两组样品的组间菌群比较使用Wilcox秩和检验，三组及以上样品的组间菌群比较使用Kruskal-Wallis秩和检验。应用SPSS 22.0软件分析数据，定量资料采用均数±标准差标示，采用T检验、ANOVA方差分析比较组间的临床信息数据差异，采用ROC分析判断菌群差异作为疗效预测标准的效能。菌群数据分析时，对多重假设检验应用FDR矫正，设定双向P<0.05、FDR<0.05提示差异有统计学意义。应用GraphPadPrism 8.0 软件(San Diego, USA)进行统计学分析及绘图，并采用Mann-Whitney及Kruskal-Wallis 秩和检验比较临床数据差异。
4、结果
如图1和图2所示，食管癌与胃癌患者的基线粪便菌群存在差异。
实施例2筛选与食管癌化疗疗效相关的微生物标志物
我们将疗效评估达到部分缓解（PR）与非缓解（non-PR）的患者分组比较菌群差异，并应用ROC曲线评价其疗效预测效能（图3）。在菌种水平，我们发现，卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus）的丰度越高（cut off=0.4609），越容易达到PR疗效，ROC分析显示曲线下面积为79%，p值0.031，95CI 0.602-0.977；敏感性83.3%，特异性69.6%。
我们将疗效评估达到疾病控制（PR+SD）与疾病进展（PD）的患者分组比较菌群差异，并应用ROC曲线评价其疗效预测效能（图4）。在菌种水平，我们发现，普通拟杆菌（Bacteroides plebeius）的丰度越高（cut off=0.0019），越容易达到疾病控制，ROC分析显示曲线下面积为86.5%，p值0.041，95CI 0.723-1.000；敏感性73.1%，特异性100%。
实施例3筛选与食管癌化疗不良反应相关的微生物标志物
我们将化疗后不良反应不同分级的患者（CTC-NCI毒性分级1-2级；或3-4级）分组比较菌群差异，并应用ROC曲线评价其不良反应预测效能。在菌种水平，我们发现，普通拟杆菌（Bacteroides plebeius）的丰度越高（cut off=1.4995），越容易产生3-4级不良反应，ROC分析(图 5)显示曲线下面积为75.0%，p值0.050，95CI 0.529-0.971。敏感性85.7%，特异性63.6%。
此外，单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）的丰度越高（cut off=1.1428），越容易产生3-4级不良反应，ROC分析(图 6)显示曲线下面积为77.9%，p值0.028，95CI 0.609-0.949。敏感性85.7%，特异性72.7%。
我们将两种菌联合作为预测模型，发现其预测3-4级不良反应的效能更好（图7），AUC曲线下面积为82.5%。
实施例4筛选与胃癌化疗疗效相关的微生物标志物
我们将疗效评估达到部分缓解（PR）与非缓解（non-PR）的患者分组比较菌群差异，并应用ROC曲线评价其疗效预测效能（图8）。在菌种水平，我们发现，另枝菌属的细线虫菌（Alistipes indistinctus）的丰度越低（cut off=0.0053），越容易达到PR疗效，ROC分析显示曲线下面积为84.8%，p值0.010，95CI 0.709-0.986；敏感性100%，特异性69.6%。
此外，狄氏副拟杆菌（Parabacteroides distasonis）的丰度越低（低于0.1814），越容易部分缓解，AUC 0.768，p=0.046；95CI 0.515-1.000，敏感性66.7%，特异性87%（图9）。
我们将两种菌联合作为预测模型，发现其预测化疗越易达到部分缓解疗效的效能更好（图10），AUC曲线下面积为92.0%。
我们将疗效评估达到疾病控制（PR+SD）与疾病进展（PD）的患者分组比较菌群差异，并应用ROC曲线评价其疗效预测效能，未找到与疾病控制相关的特异性菌群。
实施例5筛选与胃癌化疗不良反应相关的微生物标志物
我们将化疗后不良反应不同分级的患者（CTC-NCI毒性分级1-2级；或3-4级）分组比较菌群差异，并应用ROC曲线评价其不良反应预测效能。在菌种水平，我们发现，嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）的丰度越高（cut off=10.6893），越容易产生3-4级不良反应，ROC分析（图11）显示曲线下面积为83.0%，p值0.037，95CI 0.638-1.000。敏感性75%，特异性84%。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种检测微生物标志物的试剂在制备预测和/或评估上消化道肿瘤化疗疗效的产品中的应用，其特征在于，所述的微生物标志物选自卵形拟杆菌、普通拟杆菌、细线虫菌或狄氏副拟杆菌中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的上消化道肿瘤为食管鳞癌、胃腺癌或胃食管交界处腺癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测微生物标志物的试剂选自宏基因组测序试剂、16S rRNA扩增子测序试剂、微滴式数字PCR检测试剂、qPCR定量检测试剂、聚合酶链式反应、逆转录-聚合酶链式反应、巢式PCR或核酸杂交用试剂中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预测和/或评估上消化道肿瘤化疗疗效的产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片或仪器平台。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，
所述的微生物标志物为卵形拟杆菌，所述的上消化道肿瘤为食管癌；或，
所述的微生物标志物为普通拟杆菌，所述的上消化道肿瘤为食管癌；或，
所述的微生物标志物为细线虫菌，所述的上消化道肿瘤为胃癌；或，
所述的微生物标志物为狄氏副拟杆菌，所述的上消化道肿瘤为胃癌；或，
所述的微生物标志物为细线虫菌和狄氏副拟杆菌的组合，所述的上消化道肿瘤为胃癌。
6.一种检测肠道菌群标志物的试剂在制备预测和/或评估上消化道肿瘤化疗不良反应的产品中的应用，其特征在于，所述的肠道菌群标志物选自普通拟杆菌、单形拟杆菌或嗜黏蛋白阿克曼菌中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的上消化道肿瘤为食管鳞癌、胃腺癌或胃食管交界处腺癌。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的检测肠道菌群标志物的试剂选自宏基因组测序试剂、16S rRNA扩增子测序试剂、微滴式数字PCR检测试剂、qPCR定量检测试剂、聚合酶链式反应、逆转录-聚合酶链式反应、巢式PCR或核酸杂交用试剂中的一种或多种。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的预测和/或评估上消化道肿瘤化疗不良反应的产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片或仪器平台。
10.根据权利要求6-9任一项所述的应用，其特征在于，
所述的肠道菌群标志物为普通拟杆菌，所述的上消化道肿瘤为食管癌；或，
所述的肠道菌群标志物为单形拟杆菌，所述的上消化道肿瘤为食管癌；或，
所述的肠道菌群标志物为普通拟杆菌和单形拟杆菌的组合，所述的上消化道肿瘤为食管癌；或，
所述的肠道菌群标志物为嗜黏蛋白阿克曼菌，所述的上消化道肿瘤为胃癌。
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