CN115806893B

CN115806893B - 普通拟杆菌及其组合物在辅助癌症免疫治疗中的应用

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Publication number: CN115806893B
Application number: CN202111068204.5A
Authority: CN
Inventors: 朱书; 郭梦; 陶万银
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2021-09-13
Filing date: 2021-09-13
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2041-09-13
Also published as: CN115806893A

Abstract

本发明提供一种肠道菌，具体为普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)菌株，保藏号CGMCC No.22924及其在预防肿瘤和辅助肿瘤免疫治疗中的应用。所述菌能够与基于抗PD‑1的肿瘤治疗联合使用而增加抗肿瘤效果，以及与治疗肿瘤的其他抗体药物联合使用。所述菌可在受试者体内定植，并抑制荷瘤小鼠肿瘤生长。所述普通拟杆菌及其组合物能够用于抗肿瘤免疫治疗，尤其是在抗PD1相关的免疫检查点阻断治疗中提高受试者的治疗响应率。

Description

普通拟杆菌及其组合物在辅助癌症免疫治疗中的应用

技术领域

本发明涉及具有提高免疫应答作用的普通拟杆菌，及其在癌症的免疫治疗领域的应用。具体而言，涉及该菌、含有其的药物组合物在抗PD1相关的癌症免疫治疗中的应用及提高群体肿瘤免疫治疗响应率的方法。

背景技术

已知程序性死亡受体1(PD-1)是一种主要表达于活化的CD4和CD8T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞和树突状细胞表面的免疫抑制分子，通过抑制T细胞炎症活动促进免疫耐受。肿瘤细胞通过上调PD-1的配体PD-L1，促进T细胞耗竭，进而实现免疫逃逸。

近年来，针对程序性死亡1(PD-1)及其配体(PD-L1)的抑制剂由于在晚期恶性肿瘤中具有显著的临床效果而受到了广泛关注，并获得2018年诺贝尔生理学及医学奖。通过阻断CTLA-4和PD-1这样的治疗方法称为免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade，ICB)。然而，对ICB的治疗而言其抗癌效果目前仅局限于15％-30％的癌症患者，也就是说仍有很大比例的患者对ICB治疗是不响应的。

菌的存在与ICB的疗效具有联系。在利用小鼠的临床前研究中发现，与无特定病原体(SFP)小鼠相比，在无菌(GF)荷瘤小鼠中使用ICB对肿瘤无显著疗效。与此类似，对SPF小鼠进行抗生素处理时ICB的疗效被显著抑制，此外，Matson等人通过对42名转移性黑色素瘤患者的ICB前的粪便进行了16sRNA测序分析发现，在PD-1响应患者体内长双歧杆菌为富集。这些结果表明，某些特定的肠道微生物类群可以通过与宿主免疫系统的相互作用调节(特别是协同，增强)抗PD1治疗的效果。

因此，特定的能增强抗PD1治疗疗效的菌株对在更广泛的人群中实施癌症的ICB治疗可能是至关重要的，并在肿瘤的治疗的领域具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肠道菌，其能够通过增强CD8T细胞的效应因子分泌能力，从而增加免疫检查点阻断疗法(ICB)的疗效，达到改善肿瘤患者生存期的目的。

因此，发明人首先建立包含了人肠道微生物的主要类群的肠道菌库，通过培养上清液的IFN-γ+CD8T细胞刺激试验的体外筛选，筛选到了能提高机体免疫应答的拟杆菌(Bacteroides vulgatus)(在本发明中为编号347)，该菌株于2021年7月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为22924。该菌株能在GAM肉汤中厌氧培养，在BBE平板上长出灰白色菌落。其16sRNA序列示于SEQ ID No:1中。

在体外筛选中，该菌株来源的代谢物能够显著增强CD8T细胞IFN-g分泌情况。在体外杀伤实验中，该菌株来源代谢物能提高CD8T细胞IFN-γ分泌能力以及IFN-γ阳性的CD8T细胞中，PD-1阳性和TNF-α阳性细胞占的比例。

所述普通拟杆菌能够减少荷瘤小鼠的肿瘤体积，提高抗肿瘤免疫治疗响应率，在受试者体内定植，有望增强基于抗-PD-1的肿瘤治疗效果。

本发明提供普通拟杆菌，所述菌株的保藏号为(CGMCC:22924)。

本发明包括以下内容。

1.普通拟杆菌，其为自人肠道微生物分离的普通拟杆菌，保藏号为CGMCC:22924，保藏日期为2021年07月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，或

普通拟杆菌，其与普通拟杆菌CGMCC22924相比，在基因组或16SRNA的核苷酸序列中具有至少90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，或具有与所述核苷酸序列编码的氨基酸序列相比有一个或多个(优选2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。

2.项1所述的普通拟杆菌在制备用于预防肿瘤产生或治疗肿瘤的药物中的用途，其中，当所述药物用于治疗肿瘤时优选与其他抗癌治疗联合施用而增强抗癌效果。

3.根据项2所述的用途，其中所述其他抗癌治疗为包括抗PD-1治疗剂(优选为抗PD-1的抗体和/或PD-L1抑制剂)，或除了抗PD-1抗体以外的其他抗体药物。

4.根据项3或4所述的用途，其中，所述肿瘤为实体瘤(优选为选自由胃癌、食管癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤组成的组中的一种或多种，更优选为结肠癌)。

5.项1所述的普通拟杆菌在制备提高生物体(优选为哺乳动物，更优选为人)的免疫应答(优选为提高T细胞中CD8阳性T细胞的比率)的药物中的用途。

6.药物组合物，其特征在于，包含根据项1所述的普通拟杆菌、或所述普通拟杆菌的培养物或其加工物，和/或药学上可接受的载体。

7.根据项6所述的药物组合物，其中，还包括抗PD-1治疗剂(优选为抗PD-1的抗体或PD-L1抑制剂)，或除了抗PD-1抗体以外的其他抗体药物。

8.根据项6或7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自由片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬液、冻干制剂组成的组。

9.提高生物体免疫应答的方法，包括对生物体施用项1所述的普通拟杆菌，或所述普通拟杆菌的培养物或其加工物，或项6所述的药物组合物。

10.检查普通拟杆菌是否在生物体中定植的方法，包括从生物体的粪便或肠道提取物中提取细菌16sRNA，并以其为模板，使用具有如SEQ ID No:4所示的序列的上游引物和具有如SEQ ID No:5所示的序列的下游引物进行PCR。

作为本发明的普通拟杆菌能够应用的肿瘤包括实体瘤，可列举但不限于胃癌、食管癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤。

本发明所述抗PD-1治疗剂指通过阻止或抑制PD-1工作而发挥作用，使PD-1下游的信号阻止或抑制的物质，可以为抗PD-1的抗体或PD-L1抑制剂等。

在本发明的药物组合物中，可以包含本领域通常使用的药学上可接受的溶剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、润滑剂等，但不限于此。

本发明的药物组合物可以制备为常用的剂型，例如片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬液、冻干制剂等。

“包含本发明的普通拟杆菌”不仅指包含所述普通拟杆菌的活菌形式，也包括死菌，菌体分解物，培养上清液，以及分离的所述菌的代谢产物。

受试者为哺乳动物，可以为啮齿类例如大鼠小鼠等，也可以为灵长类，优选为灵长类动物，例如人。

本发明的菌株或含有其的药物组合物的用量没有特别限定，只要普通拟杆菌CGMCC:22924能够在受试者的肠道定植即可。当受试者为人时，以每次给予1ml计，可以以例如10⁶～10¹⁰CFU/ml，优选为10⁹～10¹⁰CFU/ml的浓度进行施用。接种频率或施用频率可以为每1～3天一次，优选2～3天一次。为了成功地在受试者肠道定植，连续施用时间例如为两周，一个月，需要时可以进行延长。施用方式可以为胃肠道方式给予，例如口服。可以通过在施用后检查受试者的粪便确认菌株的定植情况。

有益效果

本发明提供的普通拟杆菌CGMCC:22924具有提高受试者的免疫应答的效果，具有提高受试者对肿瘤免疫治疗的响应率的功能，特别适合与针对PD1的抗体、抑制剂、疗法等联合使用。通过制备含有所述普通拟杆菌的制剂、药物组合物并施用于受试者，能够抑制体内肿瘤生长，增强免疫检查点阻断疗法的效果。所述菌株能够以单一的作用菌株形式用于科研，临床的抗PD1相关的癌症免疫治疗中。进一步，也可以通过本领域常用的其他途径使该菌在体内定植，从而起到增强机体免疫应答的作用。

本发明的普通拟杆菌菌株于2021年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路)，保藏号为CGMCC:22924。生物材料分类命名：普通拟杆菌Bacteroides vulgatus。

附图说明

图1示出分离的多种菌株对CD8 T细胞IFN-γ分泌的影响。

图2示出用菌株313，343，347上清液刺激后的小鼠CD8 T细胞中，流式检测的体外杀伤实验中分泌IFN-γ，TNF-α，PD-1的细胞占比改变的统计结果。

图3A-3F示出了菌株347(普通拟杆菌CGMCC:22924)上清液刺激后的小鼠CD8 T细胞的体外杀伤实验中，分泌IFN-γ，TNF-α，PD-1的细胞占比改变的流式点图。

其中，图3A和3B分别为对照组和菌株347(普通拟杆菌CGMCC:22924)上清刺激组的PD-1阳性细胞占IFN-γ阳性的CD8T细胞的比例；图3C和图3D分别为对照组和菌株347上清刺激组的TNF-α阳性细胞占IFN-γ阳性的CD8T细胞的比例；图3E和图3F分别为对照组和菌株347上清刺激组的CD8T细胞中I FN-γ阳性细胞的占比。

图4示出了菌株347(普通拟杆菌CGMCC:22924)上清液在体外对CD8T细胞IFN-γ分泌的影响。图4A为使用了与培养细菌时相同的培养基的CD8T细胞IFN-γ分泌空白对照，图4B为使用了培养菌株347 36h后的培养上清液的CD8T细胞IFN-γ分泌。

图5为确认菌株347(普通拟杆菌CGMCC:22924)在小鼠体内定殖的图。图5A示出了灌胃了菌株347的小鼠粪便中的菌的16sRNA测序图，条带下方的数字为试验小鼠的编号。图5B示出灌胃了菌株347的小鼠粪便中，通过特异PCR测定的菌株347的含量。

图6为菌株347(普通拟杆菌CGMCC:22924)定植对小鼠小肠上皮内淋巴细胞中CD8T细胞的IFN-γ分泌的影响。图6A为体内实验中检测CD8 IFN-γ分泌情况流式的划门策略示意图，分离小鼠肠道上皮细胞后，先圈出活细胞，进一步圈出CD45+的淋巴细胞，之后圈出CD3+的T细胞，进一步区分CD4和CD8，最后检测CD8 IFN-γ分泌情况。图6B为利用图6A的策略检测的，菌株347定植对小鼠的CD8T细胞的IFN-γ分泌的影响的流式统计图。

图7示出菌株347(普通拟杆菌CGMCC:22924)对荷瘤小鼠模型中肿瘤生长的影响。具体地，示出了肿瘤的体积的变化曲线。ABX对照指灌胃无菌磷酸盐缓冲液的对照组。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例并参照附图对本发明作进一步的详细说明。

在无特别指明情况下，菌株在固体培养基，液体培养基中培养的温度均为37℃。如无特别指明，收集细菌培养上清液的离心条件均为室温，3000rpm离心10min。

在一个实施方式中，当受试者为人时，以每次给予普通拟杆菌CGMCC:22924 1ml计，可以以例如10⁶～10¹⁰CFU/ml，优选为10⁹～10¹⁰CFU/ml的浓度进行施用。接种频率或施用频率可以为每1～3天一次，优选2～3天一次。

实施例1：菌库建立

1.建立健康志愿者及PD-1阻断治疗响应患者肠道菌库：

从10名健康志愿者及1名PD-1阻断治疗响应患者粪便中分离培养单菌落：志愿者粪便样品用20％的甘油磷酸盐缓冲液保存，分别梯度稀释至10^-5，10^-6，10^-7倍，将各浓度涂布于GAM肉汤(Solarbio LA4450)、BBE(拟胆汁七叶苷固体培养基，Solarbio LA7310)，RCM(梭菌增菌培养基，青岛海博HB0316)，MRS肉汤、TSA(胰蛋白胨大豆琼脂，OXOID，CM1065)、BHI(脑心浸出液培养基，OXOID，CM1136)、哥伦比亚血平板(比克曼生物)。挑单克隆至相应的液体培养基，通过16sRNA通用引物(上游引物序列示于SEQ ID No：2，下游引物序列示于SEQ ID No：3)测序确定种属，用甘油于-80℃保存。将细菌利用37℃摇床培养至OD600＝0.8(OD OD600＝1时，约为普通拟杆菌10⁹CFU^/mL)，3000rpm离心10min，收集细菌培养上清液，-40℃冻存备用。共建立包含5个门，12个纲，15个目，30个科1000株菌的菌库，包含了人肠道微生物的主要类群。

2.体外筛选目的菌株

IFN-γ是一种通常由NK细胞、NKT细胞、CD4以及CD8T细胞表达的细胞因子，具有广泛的刺激和调节免疫系统的能力。IFN-γ+CD8 T细胞在抗肿瘤免疫中也起着至关重要的作用，并被报道能够影响免疫检查点抑制剂(ICI)疗法的疗效。Honda实验室的研究发现，从健康人体内分离的11种肠道菌的混合物能够通过上调CD8T细胞分泌IFN-γ的能力，在小鼠实验中，达到显著抑制肿瘤生长的作用。因此，能够刺激CD8T细胞IFN-γ分泌的肠道菌，可作为筛选潜在的抗肿瘤功能菌的指标。

然而，先前的研究采用的是用抗生素富集的方法，11种肠道菌的混合物具有氨苄青霉素抗性，有在服用抗生素情况下大量增殖的可能，在安全性方面具有风险。此外，由于先前的研究尚未确定具体的菌株，并且混合物中的梭杆菌对肿瘤的影响仍有争议，因此，寻找具体的，单一的作用菌株，具有重要意义。

从6-8周的IFN-γ荧光报告小鼠(在IFN-γ蛋白转录序列后插入IRES序列和katushka荧光蛋白序列，使IFN-γ表达的同时细胞表达katushka荧光，构建方法可参考Villegas-Mendez,A.et al.Parasite-Specific CD4+IFN-γ+IL-10+T Cells Distributewithin Both Lymphoid and Nonlymphoid Compartments and Are ControlledSystemically by Interleukin-27and ICOS during Blood-Stage MalariaInfection.Infection and immunity 84,34-46,doi:10.1128/iai.01100-15(2016).)的脾脏中分离了CD8T细胞。

具体地，从脾脏组织去除表面脂肪，加入磷酸缓冲盐溶液，研磨成细胞悬液，用钢网过滤残余组织。通过500g，4℃离心5min，将细胞收集于管底，加入红细胞裂解液去除红细胞。剩余细胞通过CD8T细胞磁珠分选试剂盒(Biolegend 480035)分离得到CD8T细胞。

向上述得到的3x 10⁵CD8T细胞中加入anti-CD3抗体(终浓度5ug/ml)、anti-CD28(终浓度2ug/ml)抗体(分别为Biolegend 100223，Biolegend102112)体外活化CD8T细胞，按3x10⁵每孔铺板96孔板。向孔中分别加入体外培养所得的同一个人的不同菌株的培养上清液20ul进行刺激，继续培养36h(即，刺激时间36h)，具体使用的菌株编号见图1。

收集上述细胞(约1×10⁶/管)，每孔加入60μl含有特异性表面标记荧光抗体的混合液(FITC-CD3 Biolegend 100204 0.2ul/孔，APC-Cy7 CD8Biolegend 100714 0.2ug/孔)，4℃避光放置15-20min。加满1×PBS洗一遍(6000rpm×2min)。

用200～300μl 1×PBS重悬细胞，上样浓度在3～5×10⁶/mL。细胞悬液经200目尼龙网过滤去除杂质，转至Ep管中，加DAPI瞬染(20倍稀释，博士德AR1177)上机检测，用Flowjo软件分析。以IFN-γ为例，先以FSC-H与FSC-A为横纵轴圈出单细胞，在单细胞门中圈出DAPI阴性的活细胞，之后圈出CD3阳性，CD8阳性的CD8T细胞，检测CD8T细胞IFN-γ分泌情况，将各组结果示于图1。

其中，菌株347为从健康志愿者来源，BBE平板上分离得到的，能在GAM肉汤中厌氧培养，在BBE平板上长出灰白色菌落。

结果显示，从图1可以看到，在该志愿者来源的不同菌株中，图中标识为Bacteroides vulgatus的347#号菌株(以下也称为普通拟杆菌CGMCC:22924)为普通拟杆菌，其产生的代谢物促进CD8T细胞IFN-γ的分泌能力最强。选择菌株313，343，347进行后续试验。

3.体外杀伤、筛选实验

首先，通过小鼠黑色素瘤细胞系与CD8T在体外共培养的实验，在体外模拟了肿瘤细胞与CD8T细胞的相互作用，用以上三种菌株的培养上清液刺激CD8T细胞，由此进一步筛选出分泌特性优秀的菌株。试验设置了四组：菌株313，343，347上清刺激组，对照组：平行培养基刺激。

将携带OVA抗原的黑色素瘤细胞B16-OVA(B16黑色素瘤细胞稳转OVA抗原，即携带OVA抗原的黑色素瘤细胞，例如购自BioVector NTCC Inc.)铺于96孔板。从能识别OVA抗原的OT-1小鼠(Jackson Laboratory)脾脏中，通过常法进行磁珠分选，而分离了CD8T细胞。将得到的CD8T细胞加入接种有细胞B16-OVA的孔与B16-OVA共培养，两种细胞的数目比约为1:1。向上述孔中加入上述试验的筛选中IFN-γ分泌较高的菌株313，343，347的培养上清液，各组在每孔中加入20ul上清液，刺激时间为36小时。同时准备了加入等体积的与菌株培养时使用的相同的培养基组，作为对照组(空白对照)。

流式细胞仪的检测条件与操作与上述相同，检测了促进IFN-γ分泌情况，以及IFN-γ阳性的CD8T细胞中，PD-1阳性和TNF-α阳性细胞占的比例，将结果示于图2，具体地将菌株347的结果示于图3。

图2示出了B16-OVA与CD8-OT1共培养的体外杀伤实验结果的流式检测结果。可以看出，菌株347各项指标均优于菌株313，343及对照组。

与对照组相比，在菌株347上清液刺激组中，CD8T细胞中的IFN-γ+细胞比例由51.3％上升至61.6％。确认菌株347具有能够在体外刺激CD8T细胞效应因子分泌的能力。此外，在菌株347刺激组的IFN-γ+CD8T细胞中，PD-1的阳性比例也由27.8％上升至44.8％，

表1菌株347上清液刺激后CD8T细胞中的IFN-γ+细胞比例

	对照组	菌株347刺激组
			IFN-γ	51.3％	61.6％
TNF-α	50.2％	75.1％
			PD-1	27.8％	44.8％

图3A-3F示出了在菌株347上清液刺激后的B16-OVA与CD8-OT1共培养的体外杀伤实验中，分泌IFN-γ，TNF-α，PD-1的细胞占比改变的流式点图。

其中，图3A和图3B分别为对照组和菌株347上清刺激组的PD-1阳性细胞占IFN-γ阳性的CD8T细胞的比例，相较于对照组，347上清刺激组中，PD-1表达阳性的细胞更多。

图3C和图3D分别为对照组和菌株347上清刺激组的TNF-α阳性细胞占IFN-γ阳性的CD8T细胞的比例。可知与对照组相比，347上清刺激组TNF-α阳性的细胞的比例明显增多。在这群IFN-γ+的CD8T细胞中，菌株347刺激组的TNF-α+百分比由50.2％上升至75.1％。图3E和图3F分别为对照组和菌株347上清刺激组的CD8T细胞中IFN-γ阳性细胞的占比，可知与对照组相比，菌株347上清刺激组IFN-γ表达更高。

图4A-B示出了细菌培养基空白对照组、菌株347上清液共培养后CD8T细胞IFN-γ的分泌情况。图4A图为细菌培养基空白对照，图4B为菌株347培养36h后的培养上清液。可以看到与对照组(3.99％)相比，菌株347能显著增加CD8T细胞IFN-γ的分泌(15％)。

以上结果表明，普通拟杆菌CGMCC:22924的培养上清液在体外杀伤中具有促进CD8T细胞增殖活化和杀伤能力的功能，并且，证实该菌上清液能够刺激上调CD8T细胞PD-1的表达，而PD-1作为CD8T细胞的重要免疫抑制分子，是ICB治疗成功的关键作用点，提示该菌具有协同抗-PD-1肿瘤治疗的潜力。

实施例2：普通拟杆菌CGMCC:22924的体内定植，安全性

发明人利用C57/B6J小鼠对普通拟杆菌CGMCC:22924在小鼠体内的定植情况进行了测试。试验设置了三组，细菌定殖组(提前清菌7天，8只)，磷酸盐缓冲液组(提前清菌7天，8只)，磷酸盐缓冲液+未清菌对照组(未提前清菌，8只)。

取实施例一中保存的347号普通拟杆菌甘油菌(普通拟杆菌CGMCC:22924)，涂板于含维生素K1(100ml中添加两支0.1mg的维生素K1溶液)和氯化血红素(100ml培养基中添加2支0.5mg的氯化血红素溶液)的拟杆菌胆汁七叶苷琼脂平板(BBE，Solarbio LA7310)，厌氧培养48h。将单个菌落挑菌到GAM肉汤培养基(Solarbio LA4450)中，摇床液体培养36h后，离心弃去培养上清。用磷酸盐缓冲液将沉菌稀释至OD600＝0.8。

取SPF级别C57/B6J小鼠(雌雄，6-8周龄，例如购自集萃药康)，在细菌定殖组中，用上述稀释得到的液体进行灌胃，在磷酸盐缓冲液组和磷酸盐缓冲液+未清菌对照组中，换成用同样操作而稀释的磷

酸盐缓冲液进行灌胃。各组均为每只灌胃200ul体积，每周三次(例如，一周中，在周一，三，五进行灌胃)，持续两周。

需要说明的是，磷酸盐缓冲液组，细菌定殖组提前进行了四联抗生素清菌7天，这指的是两组小鼠均在灌胃前的7天中，将饮用水换为清菌用水(250ml小鼠饮水中分别加入0.25g氨苄青霉素、0.25g新霉素、0.25g甲硝唑，以及0.125g万古霉素盐酸盐)，任其自行饮用，开始灌胃试验后换成普通灭菌自来水。

每日记录小鼠体重，牺牲小鼠时对小鼠各脏器进行称重，评估各候选菌株的安全性。在第8天收集小鼠粪便。在第17天，牺牲小鼠，分离肠道上皮内淋巴细胞和固有层淋巴细胞，同上地使用流式细胞仪检测这些组织中CD8T细胞IFN-γ的分泌情况(详情见下文)。牺牲小鼠后，对小鼠各脏器进行称重，评估普通拟杆菌CGMCC:22924的安全性。

通过对小鼠各脏器的重量进行比较，各组无明显差异，未观察到肝，肾，肠的肿大增重等，证实菌株347的安全性较好。

将第8天收集的小鼠粪便抽提DNA。在小鼠粪便中分别加入200ul SDS，200ul破碎珠，400ul DNA结合溶液PCR-A(AxyPrep_AP-PCR-250)，400ul酚氯仿，用组织破碎仪充分混匀，12000rpm离心5min，转移上清液到制备管(AxyPrep试剂盒内提供)中，将制备管置于2ml离心管(AxyPrep试剂盒内提供)中，12,000×g离心1min，弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2(去盐液，试剂盒内提供)，12000×g离心1min，弃滤液。将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA，稀释至2ng/ul，获得各组的粪便菌群DNA。取一部分进行了16sDNA测序(委托金唯智公司测序)，将测序结果示于图5A。

图5A中浅灰色为普通拟杆菌，每一竖列代表一只小鼠，浅灰色占比例越高，则普通拟杆菌占粪便中总菌的比例越高。左边7只为磷酸盐缓冲液组，右边6只小鼠为细菌定殖组。结果显示，灌胃7天时，与经过清菌的磷酸盐缓冲液组小鼠相比，经过清菌的细菌上定殖组的肠道拟杆菌比例明显上升。

进一步，发明人根据实施例1中测序所得的16s RNA序列设计了针对普通拟杆菌的特异性引物(上游引物序列示于SEQ ID No：4，下游引物序列示于SEQ ID No：5)，在NCBIprimer blast中比对，避开了16sRNA序列在不同细菌中的保守区域。

以细菌上清液组小鼠(8只)的菌群DNA为模板，采用上述菌株普通拟杆菌特异性PCR引物，以同上所述的16sRNA通用引物为内参进行了qPCR，通过菌株347特异DNA片段的表达水平检测了菌株347在小鼠肠道的定殖情况。将PCR结果(第0天作为灌菌前，第8天为灌菌后)示于表2、图5B。

表2菌株347在细菌上清液灌胃小鼠粪便总菌中的占比水平(％)

结果表明，与第0天相比，经过普通拟杆菌CGMCC:22924的定时灌胃7天后，细菌上清液组小鼠肠道内拟杆菌类水平出现显著增加，证实该菌株能够在小鼠体内定殖。

肠道上皮内淋巴细胞和固有层淋巴细胞的分离及流式检测

在第17天，将各组小鼠安乐死，用PBS冲洗肠道内容物并剖开肠管，肠子剪成1-2cm小段投入25ml预消化液(RPMI 65ml，赛维尔G4530-500ML；胎牛血清1.2ml，Clark，FB15011；EDTA 120ul，生工，B540625-0500)中，37℃，220rpm摇20min。将所得的培养基通过200目钢网过滤，肠段加入预消化液供后续处理，过滤后的培养基离心可得肠上皮细胞及上皮内淋巴细胞。重复上述步骤2次，剩余组织加入含胶原酶和DNA酶的消化液(RPMI 10ml，赛维尔G4530-500ML；DNA酶I 20ul Roche11284932001；二型胶原酶5mg sigma SCR103；胎牛血清0.2ml，Clark FB15011)中，过滤后所得为肠道固有层淋巴细胞。

对上皮内淋巴细胞和固有层淋巴细胞用Biolegend特异性荧光抗体标记(FITCCD3(100204)，APC-Cy7 CD45.2(109824)，PE-Cy7 CD8(100722)，PC5.5 CD4(100434))，正常刺激封闭标外标，离心后吸去上清，留取20μl上清，重悬后，每管加入250μl Fixation/Permeabilization solution，混匀后，4℃标记20min。每管加入500μl 1xPerm/WashTMbuffer，10000rpm x 3min，共洗两次最后一次吸去上清，重悬细胞后加入30μl用1xperm buffer配置的内标抗体(PE IFN-γBiolegend 505808)，混匀后4℃避光标记30min。用500μl 1x perm buffer，10000rpm x 3min离心，洗去多余抗体，用适当体积PBS重悬后过滤，转到管中上机检测。流式细胞仪上机检测IFN-γ分泌情况。流式的划门策略示于图6A，流式结果示于图6B，表3。

表3

图6A指流式策略。在分离小鼠肠道上皮细胞后，先圈出活细胞，进一步圈出CD45+的淋巴细胞，之后圈出CD3+的T细胞，进一步区分CD4和CD8，最后检测CD8 IFN-γ分泌情况。

结果表明，从图6B，表3可知，磷酸盐缓冲液组CD8T细胞的IFN-γ分泌低于磷酸盐缓冲液+未清菌对照组，这确认了肠道菌群在CD8T细胞的IFN-γ分泌中的作用。而磷酸盐缓冲液+未清菌对照组相比，以普通拟杆菌CGMCC:22924灌胃并定植的细菌上清液组的小肠上皮内淋巴细胞中，CD8T细胞的IFN-γ分泌增多。这证实通过使普通拟杆菌CGMCC:22924定植，能够提高小鼠的免疫应答能力，尤其是在CD8T细胞起效的方面。

实施例3：普通拟杆菌CGMCC:22924的定植对荷瘤小鼠模型的肿瘤生长的影响

在本实施例中，使用小鼠结肠癌细胞MC38细胞系(购自ATCC)建立了荷瘤小鼠模型。

将MC38细胞体外培养，使用了培养基(DMEM+10％FBS+1/1000青链霉素混合双抗)，传代2-3次后，用胰酶(Thermo 25200056)消化细胞，用磷酸盐缓冲液洗一遍，计数待用。

对于SPFC57/B6j小鼠(SPF级，6-8周龄，例如购自集萃药康)，分为347实验组(7只)，ABX对照组(4只)。

将四联抗生素放入347实验组和ABX对照组的小鼠饮水中。比例为250ml饮水加0.25g氨苄青霉素、0.25g新霉素、0.25g甲硝唑，以及0.125g万古霉素盐酸盐，允许小鼠自由饮水作为抗生素预处理，预处理时间为一周，开始诱导肿瘤试验后换成普通水。

在诱导肿瘤实验开始前一天剃毛。在实验当天，向小鼠皮下接种3x10⁵的MC38细胞。从第2天起，对347实验组灌胃200ul的OD600＝0.8的普通拟杆菌CGMCC:22924，同时对ABX对照组灌胃了200ul的无菌磷酸盐缓冲液，灌胃频率为7天3次(例如，一周中，在周一，三，五进行灌胃)，持续给药直到第21天牺牲小鼠。分别在实验第7、9、13、16、21天通过用游标卡尺测量肿瘤长宽，记录肿瘤体积。在实验的第21天将小鼠安乐死，通过手术方法从小鼠皮下剥离肿瘤，对肿瘤进行称重，拍照将结果示于图7中。

图7为肿瘤的体积的变化曲线。ABX对照指灌胃无菌磷酸盐缓冲液的对照组。

结果表明，与对照组相比，在有普通拟杆菌CGMCC:22924定植的实验组中，肿瘤随时间的增长较慢，第21天平均肿瘤体积更小，具有一定的抑制肿瘤生长的作用。

通过以上所述的具体实施例对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明。应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

工业实用性

本发明的普通拟杆菌CGMCC:22924能够协同基于抗-PD-1的肿瘤治疗。所述菌可在受试者体内定植，并抑制荷瘤小鼠肿瘤生长。所述普通拟杆菌及含有其的药物组合物，含有其代谢产物的组合物等能够用于抗PD1相关的癌症、抗肿瘤免疫治疗中，提高受试者的抗肿瘤免疫治疗响应率。从减少社会治疗成本而言，特定的能增强抗PD1治疗疗效的菌株对在更广泛的人群中实施癌症的ICB治疗可能是至关重要的，因此其在肿瘤的临床治疗，动物模型，免疫机理研究等领域具有广泛的应用前景。

序列表

SEQ ID No：1普通拟杆菌CGMCC:22924的16sDNA序列：

GATGCGTTCCATTAGATAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTAGTCTTCGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAAAGGAATAAAGTCGGGTATGCATACCCGTTTGCATGTACTTTATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGATGGATGTTTAAGTCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTCAACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGGATATCTTGAGTGCAGTTGAGGCAGGCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCGATTGCGAAGGCAGCCTGCTAAGCTGCAACTGACATTGAGGCTCGAAAGTGTGGGTATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACGGTAAACGATGAATACTCGCTGTTTGCGATATACAGCAAGCGGCCAAGCGAAAGCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTGCAGATGAATTACGGTGAAAGCCGTAAGCCGCAAGGCATCTGTGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTGTTGTCAGTTACTAACAGGTCATGCTGAGGACTCTGACAAGACTGCCATCGTAAGATGTGAGGAAGGTGGGGATGACG。

SEQ ID No：2 16s通用引物上游引物：27F：

AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG

SEQ ID No：3 16s通用引物下游引物：1492R：

GGTTA CCTTGTTACGACTT

SEQ ID No：4普通拟杆菌CGMCC:22924特异性引物上游引物：347F：

CCGTTTGCATGTACTTTATGAAT

SEQ ID No：5普通拟杆菌CGMCC:22924菌株特异性引物下游引物：347R：

CACAACTGACTTAAACATCCATC

Claims

1.普通拟杆菌，其为自人肠道微生物分离的普通拟杆菌，保藏号为CGMCC:22924，保藏日期为2021年07月19日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的普通拟杆菌在制备用于预防肿瘤产生或治疗肿瘤的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，当所述药物用于治疗肿瘤时与其他抗癌治疗联合施用而增强抗癌效果。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述其他抗癌治疗包括抗PD-1治疗剂，或除了抗PD-1抗体以外的其他抗体药物。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述抗PD-1治疗剂为抗PD-1的抗体和/或PD-L1抑制剂。

6.根据权利要求2或3所述的用途，其中，所述肿瘤为实体瘤。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述实体瘤为选自由胃癌、食管癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤组成的组中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述实体瘤为结肠癌。

9.权利要求1所述的普通拟杆菌在制备提高生物体的免疫应答的药物中的用途。

10.权利要求1所述的普通拟杆菌在制备提高生物体T细胞中CD8阳性T细胞的比率的药物中的用途。

11.根据权利要求9或10所述的用途，其中，所述生物体为哺乳动物。

12.根据权利要求9或10所述的用途，其中，所述生物体为人。

13.药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1所述的普通拟杆菌、或所述普通拟杆菌的培养物或其加工物，和药学上可接受的载体。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，还包括抗PD-1治疗剂，或除了抗PD-1抗体以外的其他抗体药物。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述抗PD-1治疗剂为抗PD-1的抗体或PD-L1抑制剂。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自由片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬液、冻干制剂组成的组。