CN117503814A - 西兰花提取物的保健抗病用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了萝卜硫素的用途，涉及医药技术领域。本发明通过实验证明，西兰花提取物能够降低荷瘤小鼠的肿瘤体积、增强T细胞的抗肿瘤功能、抑制具有促肿瘤作用的免疫细胞生长，对癌症的治疗存在积极意义，在与PD1和多西他赛(DTX)联用，通过实验证明，能够明显增强T细胞的功能，更好地发挥抗肿瘤作用，并且，西兰花提取物能够改变小鼠的肠道菌群，具有调节肠道菌群的作用。因此，本发明提供了西兰花提取物在制备抗肿瘤的药物中的应用，并提供了一种含有西兰花提取物的抗肿瘤药物。研究表明，对于荷瘤动物而言，从药物干预后的第14天开始直至21天，西兰花提取物组的肺部转移瘤体积明显小于对照组，从药物干预后的第7天开始，西兰花提取物+DTX+PD1组的肺部转移瘤明显变小，抗肿瘤效果明显。

Description

西兰花提取物的保健抗病用途
技术领域
本发明属于医药及食品保健技术领域，涉及西兰花提取物用于抗肿瘤的用途。
背景技术
肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。恶性肿瘤可分为癌和肉瘤，其中癌是指来源于上皮组织的恶性肿瘤，而肉瘤是指间叶组织(包括纤维结缔组织、脂肪、肌肉、脉管、骨和软骨组织等)发生的恶性肿瘤；如由大肠黏膜上皮形成的恶性肿瘤称为大肠黏膜上皮癌，简称大肠癌，由皮肤上皮形成的称皮肤上皮癌，简称皮肤癌。恶性肿瘤的特点为不正常细胞失控分裂、无限增殖、侵入并破坏周围正常组织。肿瘤细胞经血液和淋巴液转移，也可直接蔓延。恶性肿瘤的病因复杂，主要诱发因素有化学致癌物、特殊的病毒、射线、激素、自由基等；遗传、饮食、心理状态是重要的促进因素。
肠道菌群为人体肠道的正常微生物，如双歧杆菌，乳酸杆菌等能合成多种人体生长发育必须的维生素，如B族维生素(维生素B1、B2、B6、B12)，维生素K，烟酸、泛酸等，还能利用蛋白质残渣合成必需氨基酸，如天门冬氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和苏氨酸等，并参与糖类和蛋白质的代谢，同时还能促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收。这些营养物质对人类的健康有着重要作用，一旦缺少会引起多种疾病，人体肠道内寄生着10万亿个细菌，它们能影响体重和消化能力、抵御感染和自体免疫疾病的患病风险，还能控制人体对癌症治疗药物的反应，因此人体的健康与肠道内的益生菌群结构息息相关。肠道菌群在长期的进化过程中，通过个体的适应和自然选择，菌群中不同种类之间，菌群与宿主之间，菌群、宿主与环境之间，始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依存，相互制约的系统，因此，人体在正常情况下，菌群结构相对稳定，对宿主表现为不致病，有研究指出，体魄强健的人肠道内有益菌的比例达到70％，普通人则是25％，便秘人群减少到15％，而癌症病人肠道内的益生菌的比例只有10％。
萝卜硫素(1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷)(Sulforaphane，SFN)，又称“莱蔽硫烷”，为异硫氰酸盐衍生物，由硫代葡萄糖苷(Glucosinlates,Glu)，简称硫苷，经植物体内黑芥子酶(Myrosinase enzyme)水解所得。目前发现从西兰花芽苗能够提取SFN。黑芥子硫酸苷酶学名为0-硫代葡萄糖苷酶，又被称为0-硫代葡萄糖苷水解酶，是迄今为止大自然中唯一发现的硫葡萄糖苷水解酶。目前针对萝卜硫素已开展相关的研究，研究结果表明服用萝卜硫素，可以促使苯(致癌物)体外排除率提高61％，还有研究结果证实SFN可以降低脂质过氧化，但未见报道证明含萝卜硫素的西兰花提取物可以用于调节肠道功能和治疗肺部疾病。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了西兰花提取物用于抗肿瘤的用途。
进一步地，所述抗肿瘤包括：抑制肿瘤生长从而控制肿瘤体积，和/或提高具有抗肿瘤作用的T细胞活化水平或促进CD8+T细胞生长从而增强T细胞的抗肿瘤功能，和/或抑制具有促肿瘤作用的免疫细胞生长。
免疫细胞大致可以分为促肿瘤(对药物发挥抗肿瘤作用起刹车作用)以及抑肿瘤(对药物发挥抗肿瘤作用起油门)两部分，T细胞为具有抗肿瘤作用的免疫细胞，T细胞活化后才可发挥杀伤功能，T细胞主要分为两大群：CD4+T细胞以及CD8+T细胞。其中，CD8+T细胞是发挥杀伤肿瘤、受感染细胞的主要杀伤细胞，CD4+T细胞发挥辅助CD8+T细胞杀伤的作用。
进一步地，所述T细胞活化水平通过检测所述T细胞表达的PD1、CD69、CD107a和干扰素r(IFNr)中的任意一种或多种而测得。
PD1是T细胞表面的抑制性分子，表达量高则意味着T细胞的功能会受到抑制；CD69和CD107a代表T细胞的活化水平，表达水平越高，表明T细胞活化水平越高；T细胞发挥杀伤作用时会分泌干扰素r，具有抑制肿瘤细胞的作用，IFNr增多，表明T细胞功能增强。
进一步地，所述具有促肿瘤作用的免疫细胞为MDSC和M2型巨噬细胞。
T细胞、MDSC(髓源抑制性细胞)和巨噬细胞都属于CD45阳性的细胞(CD45是免疫细胞共有的分子)，巨噬细胞分为M1型及M2型，M1型发挥抗肿瘤作用，M2型发挥促肿瘤作用。
进一步地，所述肿瘤为皮下移植瘤和/或转移瘤。
进一步地，所述转移瘤为肺部转移瘤。
进一步地，用于抑制皮下移植瘤生长时，所述西兰花提取物的剂量为25μmol/kg，用于抑制转移瘤生长时，所述西兰花提取物的剂量为88μmol/kg。
进一步地，所述西兰花提取物与PD1单抗和DTX(多西他赛)联用，通过实验证明，上述三药联用后，脾脏T细胞明显活化，能明显增强外周血T细胞的功能，更好地发挥抗肿瘤作用。
本发明提供了西兰花提取物在制备调节肠道菌群的制剂中的应用。
进一步地，所述调节肠道菌群包括：使有益菌水平升高和/或有害菌水平降低，有益菌也称之为益生菌，主要是各种双歧杆菌、乳酸杆菌等，是人体健康不可缺少的要素，可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害、有毒物质等；有害菌，数量一旦失控大量生长，就会引发多种疾病，产生致癌物等有害物质，或者影响免疫系统的功能。
进一步地，所述有益菌为Akkermansia菌和g__Clostridiales_unclassified，所述有害菌为g__Rikenellaceae_RC9_gut_group和/或g__Desulfovibrio。
Akkermansia菌(Akk菌)是疣微菌门的下属菌，有研究发现Akk菌可通过调节CD8+T细胞改善结肠炎，并预防相关肠癌的发生，g__Clostridiales_unclassified为梭菌属，其代谢产物TMAO可以有效抑制肿瘤生长，并且增强小鼠对PD1单抗的应答，g__Rikenellaceae_RC9_gut_group有研究显示该菌群与高脂饮食诱导的有害指标成正相关，g__Desulfovibrio为有害菌。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括西兰花提取物。
进一步地，所述抗肿瘤药物还包括PD1单抗和DTX。
进一步地，所述药物中还包括药学上可接受的辅料，药学上可接受的辅料为矫味剂、渗透压调节剂、填充剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、食用色素、稀释剂、乳化剂、崩解剂或增塑剂中的一种或两者以上的混合物。
优选的，所述药物为口服制剂或注射用剂。其中口服制剂的剂型为片剂、丸剂、口服液剂、胶囊剂、糖浆剂、滴丸剂或颗粒剂。优选的，胶囊剂为硬胶囊剂或软胶囊剂。所述片剂为口服片剂或口腔片剂。所述口服片剂指供口服的片剂，多数此类片剂中的药物是经胃肠道吸收而发挥作用，也有的片剂中的药物是在胃肠道局部发挥作用。所述口服片剂为普通压制片、分散片、泡腾片、咀嚼片、包衣片或缓控释片。所述注射用剂包括注射粉针剂或注射液。
本发明还提供了一种抗肿瘤方法，包括给予西兰花提取物。
进一步地，所述抗肿瘤方法还包括给予PD1单抗和/或DTX。
进一步地，所述PD1单抗的剂量为10mg/kg，所述DTX的剂量为10mg/kg，腹腔注射，每周一次。
其中，SFN、PD1单抗和DTX联合使用，所述联合使用包括SFN与PD1单抗和DTX一起施用，或者依次施用。例如，所述PD1单抗和DTX可在施用SFN之前、期间或之后施用。施用的方式可相同也可不同，例如SFN与PD1单抗和DTX可皆以注射形式给予，也可皆通过口服形式给予，也可一者通过注射形式给予另一者通过口服形式给予。
本发明还提供了一种调节肠道菌群的制剂，包括西兰花提取物。
进一步地，所述制剂还包括药学上可接受的辅料，药学上可接受的辅料为矫味剂、渗透压调节剂、填充剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、食用色素、稀释剂、乳化剂、崩解剂或增塑剂中的一种或两者以上的混合物。
优选的，所述制剂为口服制剂或注射用剂。其中口服制剂的剂型为片剂、丸剂、口服液剂、胶囊剂、糖浆剂、滴丸剂或颗粒剂。优选的，胶囊剂为硬胶囊剂或软胶囊剂。所述片剂为口服片剂或口腔片剂。所述口服片剂指供口服的片剂，多数此类片剂中的药物是经胃肠道吸收而发挥作用，也有的片剂中的药物是在胃肠道局部发挥作用。所述口服片剂为普通压制片、分散片、泡腾片、咀嚼片、包衣片或缓控释片。所述注射用剂包括注射粉针剂或注射液。
本发明还提供了一种调节肠道菌群的方法，包括给予西兰花提取物，给予的方式可相同也可不同，例如SFN与其它药剂可皆以注射形式给予，也可皆通过口服形式给予，也可一者通过注射形式给予另一者通过口服形式给予。
进一步地，所述西兰花提取物的剂量为80-200μmol/kg。
本发明通过实验证明，SFN能够降低荷瘤小鼠的肿瘤体积、增强T细胞的抗肿瘤功能、抑制具有促肿瘤作用的免疫细胞生长，对癌症的治疗存在积极意义，在与PD1单抗和DTX(多西他赛)联用时，通过实验证明，能够明显增强T细胞的功能，更好地发挥抗肿瘤作用，并且，SFN能够改变小鼠的肠道菌群，具有调节肠道菌群的作用。因此，本发明提供了SFN在制备抗肿瘤的药物中的应用，并提供了一种含有SFN的抗肿瘤药物。研究表明，对于荷瘤动物而言，从药物干预后的第14天开始直至21天，SFN组的肺部转移瘤体积明显小于对照组，从药物干预后的第7天开始，SFN+DTX+PD1单抗组的肺部转移瘤明显变小，抗肿瘤效果明显。本发明还提供了SFN在制备调节肠道菌群的制剂中的应用，并提供了一种含有SFN的调节肠道菌群的制剂。
附图说明
图1为实施例1中实验小鼠对照组和西兰花提取物组的体重变化对比图；
图2为实施例1中实验小鼠对照组和西兰花提取物组的外周血流式细胞学检测结果；
图3为实施例1中实验小鼠对照组和西兰花提取物组的脾脏组织流式细胞学检测结果；
图4为实施例2中各组在门水平上的肠道菌群检测结果；
图5为实施例2各组实验小鼠在属水平上的肠道菌群检测结果；
图6-7为小鼠实验中菌群检测结果；
图8为小鼠实验中CD8检测结果；
图9为实施例3中检测实验小鼠服用西兰花提取物组和对照组试剂之后肿瘤大小结果图；
图10为实施例3中实验小鼠服用西兰花提取物组和对照组试剂之后的PD1、IFNr、髓源抑制性细胞(MDSC)和CD206+的巨噬细胞的流式细胞学分析结果对比图；
图11a为实施例3中PD1单抗组小鼠和西兰花提取物+PD1单抗组小鼠的PD1、IFNr、MDSC和CD206+的巨噬细胞的流式细胞学分析结果对比图，图11b为实施例3中DTX组小鼠和西兰花提取物+DTX组小鼠的PD1、IFNr、MDSC和CD206+的巨噬细胞的流式细胞学分析结果对比图，图11c为实施例3中PD1单抗+DTX组小鼠和西兰花提取物+PD1+DTX组小鼠的PD1、IFNr、MDSC和CD206+的巨噬细胞的流式细胞学分析结果对比图；
图12-14为小鼠肿瘤实验的实验结果；
图15-20为小鼠实验中菌群变化统计结果；
图21为实施例3中西兰花提取物组和对照组小鼠在属水平上的肠道菌群的丰度差异结果对比图；
图22为实施例3中西兰花提取物组和对照组小鼠的活体成像结果对比图；
图23为实施例3中西兰花提取物组和PD1单抗组小鼠的活体成像结果对比图；
图24为实施例5中PD1单抗组和西兰花提取物+PD1单抗组小鼠的活体成像结果对比图；
图25为实施例5中西兰花提取物组小鼠和西兰花提取物+PD1单抗组小鼠的活体成像结果对比图；
图26为实施例5中DTX组小鼠和西兰花提取物+DTX组小鼠的活体成像结果对比图；
图27为实施例5中西兰花提取物+DTX组小鼠和西兰花提取物+PD1单抗组小鼠的活体成像结果对比图；
图28为实施例5中PD1单抗+DTX组小鼠和西兰花提取物+PD1单抗+DTX组小鼠的活体成像结果对比图；
图29a为实施例5中对照组小鼠和西兰花提取物组小鼠活体成像实验中肺部的平均荧光强度对比图，图29b为实施例5中NC组和西兰花提取物组小鼠活体成像实验中肺部的平均荧光强度对比图，图29c为实施例5中PD1单抗组和西兰花提取物组小鼠活体成像实验中肺部的平均荧光强度对比图，图29d为实施例5中PD1单抗组和西兰花提取物组小鼠活体成像实验中肺部的平均荧光强度对比图，图29e为实施例5中西兰花提取物组和西兰花提取物+PD1单抗组小鼠活体成像实验中肺部的平均荧光强度对比图，图29f为实施例5中DTX组和西兰花提取物+DTX组小鼠活体成像实验中肺部的平均荧光强度对比图，图29g为实施例5中西兰花提取物组和西兰花提取物+DTX组小鼠活体成像实验中肺部的平均荧光强度对比图，图29h为实施例5中西兰花提取物+PD1单抗组和西兰花提取物+DTX组小鼠活体成像实验中肺部的平均荧光强度对比图，图29i为实施例5中PD1单抗+西兰花提取物组和西兰花提取物+DTX+PD1单抗组小鼠活体成像实验中肺部的平均荧光强度对比图；
图30为采用流式细胞分析实施例5中PD1单抗+DTX组与西兰花提取物+PD1单抗+DTX组小鼠脾脏免疫细胞的比例及功能对比图；
图31为小鼠实验结果照片视图；
图32-34为小鼠实验菌群结果统计图；
图35a为实施例5中各组小鼠在门水平上的肠道菌群丰度热图，图35b为实施例5中各组小鼠在属水平上的肠道菌群丰度热图；
图36为实施例5中PD1单抗+DTX组和西兰花提取物+PD1单抗+DTX组小鼠在门水平上的肠道菌群的结果对比图；
图37为实施例5中PD1单抗+DTX组和西兰花提取物+PD1单抗+DTX组小鼠在属水平上的肠道菌群的结果对比图；
图38为实施例5中PD1单抗+DTX组和西兰花提取物+PD1单抗+DTX组小鼠在种水平上的肠道菌群的结果对比图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了西兰花提取物的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明通过试验证明，本发明提供的西兰花提取物具有以下用途：
1.西兰花提取物能对人体免疫进行双向调节，具体地，可以双向调节免疫异常人群的免疫13项指标，实现免疫稳态，降低自身免疫性疾病的发生，为生命健康运行提供根本的支撑；
2.a西兰花提取物能有效抑制肿瘤细胞的生长，抑制效果高于化疗DTX和PD1单抗分别使用及组合使用的效果，在抗肿瘤过程中西兰花提取物在免疫调控、避免免疫逃逸等方面均优于PD-1单抗；b西兰花提取物可以联合化疗及PD1单抗，用于治疗恶性肿瘤，实验证明抗肿瘤过程中在免疫调节、避免免疫逃逸、肿瘤微环境免疫调节等方面具有良好的治疗效果；c西兰花提取物配合化疗使用，能有效避免化疗导致的免疫崩溃，为进一步诊疗争取机会，并且可以修复调节受损的免疫功能，为生命健康提供根本的支撑；
3.西兰花提取物可以双向调节肠道菌群，即能增加益生菌丰度，又能降低有害菌丰度。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明实施例的富含萝卜硫素的西兰花提取物，通过如下方法制得：
S1取西兰花种子或西兰花芽苗，冻干后80～300目研磨，得第一组分，取山葵或辣根，低温冻干80～800目研磨，得第二组分，取柠檬，冻干研磨得第三组分。
S2将第一组分，第二组分和第三组分在密封容器中或者在氮气保护下在水中混合得混合溶液，其中所述第一组分和第二组分为首次混合。
优选地，在步骤S1中，第二组分优选为成长周期18个月以上的新鲜山葵主茎段，切片于超低温(优选零下196℃)冻干，300至800目均匀研磨为超细粉，然后避光防潮封装或称量分装置于密闭容器内保存。上述第二组分和第一组分分别单独封装保存，避免提前发生化合反应。
优选地，在步骤S1中，第三组分为新鲜柠檬切片冻干(优选零下196℃超低温冻干)，均匀研磨避光防潮单独封装或称量分装密闭容器内保存。第三组分可以与第一组分混合，不影响彼此的活性。
优选地，步骤S2中的水的PH值为6.5至6.8，可以为天然矿泉水，优选的水温为53±3℃。
优选地，本申请的制备方法还包括步骤S3：对所述混合溶液进行超声波处理。
进一步优选地，本申请的制备方法还包括三次过滤：粗滤、精滤和离心处理。通过三次过滤可以有效的去除萝卜硫素提取后液体中的杂质，获得的产品澄清透亮，提升饮用时的口感。
上述方法制备的提取物，成分检测结果如下：
本发明实施例通过动物饲养、活体成像技术、免疫细胞检测技术、16S RNA测序技术，对西兰花提取物的作用及其与PD1单抗及多西他赛(DTX)联合应用的作用进行验证。本发明实施例中使用的PD1单抗是T细胞表面的抑制性分子，DTX是一种化疗药物，PD1单抗和DTX直接购得，西兰花提取物按国际公布号为WO 2022/037675 A1的专利公开文件提供的制备方法制备而得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明，本发明实施例中所有动物实验均得到动物伦理委员会批准。
实施例1西兰花提取物的毒性实验和免疫调节实验
西兰花提取物的毒性实验：
小鼠体重可以初步反映西兰花提取物的毒性，以4-5周龄C57BL/6N雌鼠为研究对象。将健康小鼠分为两组，一组为空白对照组(CON)，另一组为西兰花提取物组，对空白对照组的健康小鼠给予250ul生理盐水灌胃，每天1次，对西兰花提取物组的健康小鼠给予250μL的西兰花提取物(经检测其中SFN对应0.9μmol当量，注：其中的活性物质不止SFN一种，只是选取SFN作为浓度的参照)，每天1次，共用药28天。对两组小鼠的体重进行测量，结果如图1所示。
由图1可以看出，即使使用较大剂量的西兰花提取物灌胃，小鼠体重仍未有下降，初步表明西兰花提取物对健康小鼠整体毒性较轻甚至无毒无害。心脏、肝脏等组织器官毒性还需进一步检测。
免疫调节实验：
将小鼠分为五组，每组4只，其中一组为空白对照组(CON)，对空白对照组的健康小鼠给予250ul生理盐水灌胃，每天1次，另外四组为实验组，分别施加250μL(对应的SFN浓度分别为0、0.8mM、1.6mM、3.6mM)/只/天的西兰花提取物。
实验结束后采用颈椎脱臼法处死小鼠，采集小鼠外周血，并对外周血进行流式细胞学检测，结果如图2所示；快速取出小鼠脾脏，去除脾脏组织上的结缔组织或脂肪，将脾脏置于70um的滤筛上，用无菌注射器芯充分研磨脾脏，获得细胞悬液后进行流式细胞学检测，结果如图3所示，其中，流式细胞学分析主要检测了CD4+T细胞以及CD8+T细胞的比例及功能，并检测了T细胞表面PD1、CD69、CD107a的表达水平。
从图2可以看出，施加不同剂量的西兰花提取物后，小鼠体内外周血CD8+T细胞的比例增加，CD69和CD107a表达水平增高，说明T细胞有不同程度的活化，说明西兰花提取物可以增强机体的免疫(虽然免疫抑制性分析PD1表达也增加，但是鉴于是健康小鼠，此处PD1可代表一种T细胞活化后表达增高的表现)。从图3显示了小鼠的脾脏组织的检测结果及外周血的检测结果。
实施例2西兰花提取物的肠道菌群的检测实验
同实施例1中免疫调节实验中对小鼠的分组和处理，采集各组小鼠治疗前以及处死前粪便，进行肠道菌群16S RNA测序分析。具体方法如下：准备无菌镊子，固定小鼠后，轻轻按压小鼠下腹部，收集新鲜粪便于无菌EP管中，每管2-3粒，-80℃冻存，干冰运输。16SRNA测序部分由“BIOTREE”进行检测分析，菌群可分为界门纲目科属种等7个水平，16S RNA测序对于门水平以及属水平菌群检测具有较高准确性，门水平的分析结果如图4，属水平的分析结果如图5所示，其中S125、S250、S500分别代表施加0.2、0.4和0.9μmol的西兰花提取物的实验组。
从图4可以看出，疣微菌门(Verrucomicrobiota)丰度增加，从图5可以看出，各组中益生菌Akkermansia菌(Akk菌)丰度明显增加，Akk菌是疣微菌门的下属菌，有研究发现Akk菌可通过调节CD8+T细胞改善结肠炎，并预防相关肠癌的发生。
进一步地，对小鼠肠道菌群及外周血CD8+T细胞的调节作用进行进一步分析，将C57BL/6N小鼠随机分为空白对照组、阴性对照组以及萝卜硫素组，经灌胃分别给予蒸馏水、不含萝卜硫素的西兰花提取物、富含萝卜硫素的西兰花提取物，每天1次，分别施加250μL/只/天的对应目标物(对照和西兰花提取物实验组，对应的SFN浓度为0.8mM))连续4周。实验结束前采集小鼠外周血检测CD8+T细胞的比例及功能。收集粪便，通过16S rRNA测序进行菌群鉴定及分析。
实验结果如图6-8所示，结果表明：长期连续饮用富含萝卜硫素的西兰花提取物能改变小鼠的肠道菌群，增加肠道中阿克曼菌属等有益菌的丰度，同时增强外周血CD8+T细胞的功能。
实施例3西兰花提取物以及与PD1单抗和DTX联用对皮下移植瘤的抑制作用实验
购买小鼠并适应环境7天后，剔去小鼠右腹部毛发，每只小鼠于右腹部皮下接种1×106个Lewis肺癌细胞。1周后观察到明显皮下成瘤，将小鼠随机分组，分为9组，每组4只，处理方案如表1，处理后，进行如下检测：(1)测量肿瘤大小，直观地监测各组治疗效果；(2)用颈椎脱臼法处死小鼠，快速取出小鼠肿瘤组织，对肿瘤组织研磨后进行流式细胞学检测，目的在于探究各治疗措施对小鼠肿瘤微环境中免疫细胞的影响。
其中，流式细胞学分析主要检测了T细胞表达的PD1和干扰素r(IFNr)、MDSC(髓源抑制性细胞)以及M2型巨噬细胞(即CD206+的巨噬细胞)。T细胞发挥杀伤作用时会分泌IFNr，具有抑制肿瘤细胞的作用，IFNr增多，表明T细胞功能增强。T细胞、MDSC和巨噬细胞都属于CD45阳性的细胞(CD45是免疫细胞共有的分子)，故在统计MDSC时，纵轴中代表MDSC占CD45+细胞的比例。巨噬细胞分为M1型及M2型，M1型发挥抗肿瘤作用，M2型发挥促肿瘤作用，CD11b+F4/80+可以定义为巨噬细胞，CD206+的巨噬细胞(即CD11b+F4/80+CD206+)可以认为是M2型巨噬细胞，本实验只检测了小鼠CD206+的巨噬细胞的比例，在统计巨噬细胞时，纵轴代表M2型巨噬细胞占总巨噬细胞的比例。
表1实验设置组别及处理方法
检测西兰花提取物组和对照组肿瘤大小，结果如图9所示，从图9可以看出，西兰花提取物组的肿瘤体积的增长速度小于对照组，西兰花提取物组的肿瘤体积在第9天测量时明显小于对照组的肿瘤体积，说明西兰花提取物具有显著的抗肿瘤作用。
图10为采用流式细胞学分析西兰花提取物组和对照组的PD1、IFNr、髓源抑制性细胞(MDSC)和CD206+的巨噬细胞的结果对比图，其中DTX组用了两次，用药后第1天，第7天，第十天处死。从图10可以看出，相比于对照组，西兰花提取物组发挥抑制T细胞的功能的PD1的含量减少，发挥抑制肿瘤作用的IFNr含量增多，说明西兰花提取物对具有抗肿瘤作用的T细胞具有促进作用，而西兰花提取物组的MDSC和CD206+的巨噬细胞比例下降，说明西兰花提取物对促肿瘤作用的免疫细胞如MDSC和M2型巨噬细胞具有抑制作用。
图11a为采用流式细胞学分析PD1单抗组和西兰花提取物+PD1单抗组的PD1、IFNr、MDSC和CD206+的巨噬细胞的结果对比图，从图11a可以看出，PD1单抗与西兰花提取物联合应用后，肿瘤微环境中CD8+T细胞表面PD1表达明显下降，发挥抑制肿瘤作用的IFNr含量增多，T细胞抗肿瘤功能明显增强，免疫抑制性细胞MDSC比例下降。
图11b为采用流式细胞学分析DTX组和西兰花提取物+DTX组的PD1、IFNr、MDSC和CD206+的巨噬细胞的结果对比图，从图11b可以看出，单独应用化疗药物多西他赛(DTX)会升高CD8+T细胞表面PD1的表达，加用西兰花提取物后会逆转化疗药物引起的PD1的表达升高，化疗药联合西兰花提取物(西兰花提取物+DTX组)后会降低肿瘤微环境中MDSC的比例，但是会增加M2型巨噬细胞的比例。
图11c为采用流式细胞学分析PD1+DTX组和西兰花提取物+PD1+DTX组的PD1、IFNr、MDSC和CD206+的巨噬细胞的结果对比图，从图11c可以看出，三药联用后会明显降低CD8+T细胞表面PD1的表达，增强CD8+T细胞的功能，抑制MDSC的表达，对M2型巨噬细胞的抑制作用虽无统计学意义，但是有抑制趋势。
发明人还补充了进一步的实验，用于证实富含萝卜硫素的西兰花提取物提高化疗及PD-1单抗的疗效。
具体地，1)构建皮下荷瘤小鼠模型，分别给予皮下荷瘤小鼠富含萝卜硫素的西兰花提取物用量同上：每天1次，分别施加250μL/只/天的对应目标物(西兰花提取物实验组对应的SFN浓度为0.8mM)、PD-1单抗(常规用量)以及化疗药物等单独或联合应用；
2)采用16S rRNA测序探究应用富含萝卜硫素的西兰花提取物后，荷瘤小鼠肠道菌群的改变；
3)通过血清代谢组学测序，探究PD-1单抗、化疗联合应用富含萝卜硫素的西兰花提取物后，对荷瘤小鼠血清代谢谱的影响。
实验结果如图12-20所示，结果表明：
1)富含萝卜硫素的西兰花提取物明显抑制荷瘤小鼠体内肿瘤生长，且增加肿瘤浸润性CD8+T细胞的比例，增强其功能，增强化疗及PD-1单抗的抗肿瘤效果。
2)联用富含萝卜硫素的西兰花提取物改变荷瘤小鼠的肠道菌群，增加了肠道中瘤胃菌科的丰度，且瘤胃菌科的丰度与CD8+T细胞的比例呈正相关，与肿瘤大小呈负相关。
3)在化疗及PD-1单抗的基础上联用富含萝卜硫素的西兰花提取物改变了荷瘤小鼠的血清代谢谱，差异代谢物在脂代谢通路存在不同程度的富集。
由此可见：富含SFN的西兰花提取物可以增加荷瘤小鼠肠道中瘤胃菌科的丰度，改变了外周血脂代谢通路，促进肿瘤组织内的CD8+T细胞浸润，增强肿瘤组织浸润性CD8+T细胞的功能，从而提高了化疗及PD-1单抗的抗肿瘤效果。
实施例4皮下移植瘤模型中西兰花提取物以及与PD1单抗和DTX联用的肠道菌群的检测实验
采集实施例3中西兰花提取物组和对照组小鼠治疗前以及处死前粪便，进行肠道菌群16S RNA测序分析。具体方法同实施例2。结果如图21所示。
从图21可以看出，在属水平其丰度差异较高的前四组变化如下：g__Rikenellaceae_RC9_gut_group在西兰花提取物组水平降低，有研究显示该菌群与高脂饮食诱导的有害指标成正相关，g__Clostridiales_unclassified(梭菌属，其代谢产物TMAO可以有效抑制肿瘤生长，并且增强小鼠对PD1单抗的应答)在西兰花提取物组水平升高，g__Desulfovibrio(有害菌)在西兰花提取物组水平降低，g__Lachnospiraceae_unclassified(潜在有益菌)在西兰花提取物组水平升高。
实施例5西兰花提取物以及与PD1单抗和DTX对转移瘤的抑制作用实验
购买小鼠并适应环境7天后，以4-5周龄C57BL/6N雌鼠为研究对象，通过小鼠尾静脉注射Lewis-Luciferase-GFP细胞构建肿瘤肺转移模型。待出现肺部转移灶后将成瘤小鼠分为9组，其中，对照组和NC组为4只小鼠，其余组为5只小鼠，处理如表1，与表1不同之处为：转移瘤小鼠的西兰花提取物果蔬茶灌胃剂量为88μmol/kg，处理后，进行如下检测：(1)进行活体成像实验；(2)测量肺部的平均荧光强度对比，可反映肿瘤负荷的大小；(3)采用颈椎脱臼法处死小鼠，快速取出小鼠脾脏，去除脾脏组织上的结缔组织或脂肪，将脾脏置于70um的滤筛上，用无菌注射器芯充分研磨脾脏，获得细胞悬液后进行流式细胞学分析，目的在于探究各治疗措施对小鼠肿瘤微环境中免疫细胞的影响，其中IL2的代表意义与IFNr相同，均为T细胞发挥作用所产生的因子，其余CD107a、CD69水平可以反应T细胞活化水平。
图22为西兰花提取物组和对照组的活体成像结果对比图，从图22可以看到，与对照组相比，西兰花提取物组对肿瘤具有明显的控制作用；图23为西兰花提取物组和PD1单抗组的活体成像结果对比图，从图23可以看到，与PD1组相比，西兰花提取物组对肿瘤具有明显的控制作用；图24为PD1单抗组和西兰花提取物+PD1单抗组的活体成像结果对比图，从图24可以看到，西兰花提取物与PD1单抗联合的抗肿瘤效果要强于PD1单独使用，因此西兰花提取物对PD1单抗具有明显的增效作用；图25为西兰花提取物组和西兰花提取物+PD1组的活体成像结果对比图，从图25可以看到，西兰花提取物与PD1单抗联合的作用与西兰花提取物单独应用相比作用增加不明显，表明PD1单抗对西兰花提取物的增效作用不明显；图26为DTX组和西兰花提取物+DTX组的活体成像结果对比图，从图26可以看到，西兰花提取物与DTX联用未见明显增强的抗肿瘤作用；图27为西兰花提取物+DTX组和西兰花提取物+PD1组的活体成像结果对比图，从图27可以看到，西兰花提取物联合PD1单抗的效果要强于西兰花提取物联合DTX的效果；图28为PD1单抗+DTX组和西兰花提取物+PD1单抗+DTX组的活体成像结果对比图，从图28可以看到，三药联用的抗肿瘤效果要强于PD1单抗与DTX联用。
图29a～图29i为各组活体成像实验中肺部的平均荧光强度对比图，可反应肿瘤负荷大小，其中，从图29a可以看出，与空白对照组(CON)相比，含萝卜硫素的果蔬茶(西兰花提取物组)能明显控制小鼠肺部肿瘤生长；从图29b可以看出，与不含萝卜硫素的果蔬茶(NC组)相比，含萝卜硫素的果蔬茶(西兰花提取物组)能明显控制肺部肿瘤生长，说明是萝卜硫素在发挥抗肿瘤作用；从图29c可以看出，与PD1单抗(PD1组)相比，含萝卜硫素的果蔬茶(西兰花提取物组)具有更强的抗肿瘤作用；从图29d可以看出，与PD1组相比，西兰花提取物+PD1组的平均荧光强度下降更多，说明加用含萝卜硫素的果蔬茶后，PD1单抗的抗肿瘤作用增强；从图29e可以看出，西兰花提取物组的平均荧光强度与西兰花提取物+PD1组的平均荧光强度在统计学上无明显差异(P值＞0.05)，说明加用PD1单抗后，含萝卜硫素的果蔬茶的抗肿瘤作用增强不明显；从图29f可以看出，DTX组的平均荧光强度与西兰花提取物+DTX组的平均荧光强度在统计学上无明显差异(P值＞0.05)，说明与含萝卜硫素的果蔬茶连用后，并未增强多西他赛(DTX)的抗肿瘤作用；从图29g可以看出，西兰花提取物组的平均荧光强度与西兰花提取物+DTX组的平均荧光强度在统计学上无明显差异(P值＞0.05)，说明与DTX连用后，含萝卜硫素的果蔬茶的抗肿瘤作用增强不明显；从图29h可以看出，含萝卜硫素的果蔬茶与PD1单抗联用(西兰花提取物+PD1组)的抗肿瘤效果要强于与DTX联用(西兰花提取物+DTX组)；从图29i可以看出，含萝卜硫素的果蔬茶与PD1单抗及DTX三药联合使用(西兰花提取物+DTX+PD1组)的抗肿瘤效果最强，明显强于PD1单抗与DTX联合应用(PD1+DTX组)。
图30为采用流式细胞学分析PD1+DTX组与西兰花提取物+PD1+DTX组的脾脏免疫细胞的比例及功能对比图，从图30中可以看出，与PD1+DTX组相比，西兰花提取物+PD1+DTX组脾脏T细胞明显活化，功能明显增强，说明加用西兰花提取物后，能明显增强外周血T细胞的功能，更好地发挥抗肿瘤作用。
发明人进一步对肺肿瘤小鼠进行了实验，采用SFN浓度为0.8mM的西兰花提取物进行实验。
实验步骤：
1)通过给小鼠尾静脉注射肿瘤细胞，构建肿瘤肺转移动物模型。通过规律给予富含萝卜硫素的西兰花提取物(浓度0.8mM，用量如上)、化疗药物、PD-1单抗，通过小动物活体成像，探究在PD-1单抗及化疗药联合应用的基础上加用富含萝卜硫素的西兰花提取物对肺转移灶的影响。
2)通过采用16S rRNA测序探究应用富含萝卜硫素的西兰花提取物后，荷瘤小鼠肠道菌群的改变。
3)通过PICRUSt2功能预测分析，预测联用富含萝卜硫素的西兰花提取物后转移瘤小鼠肠道菌群功能改变。
4)使用BugBase工具对联用富含萝卜硫素的西兰花提取物前后转移瘤小鼠肠道菌群表型进行预测分析。
结果如图31-34所示，结果表明：
富含萝卜硫素的西兰花提取物联合化疗及PD-1单抗治疗抑制肿瘤肺转移；富含萝卜硫素的西兰花提取物明显增加小鼠肠道中阿克曼菌的丰度；联用富含萝卜硫素的西兰花提取物后转移瘤小鼠肠道菌群在多个代谢通路上发生改变；联用富含萝卜硫素的西兰花提取物后转移瘤小鼠肠道菌群表型发生以下改变：兼性厌氧菌减少、生物膜形成增多、革兰阳性菌减少、革兰阴性菌增多、耐应激性增强。
由此可以证明：
富含萝卜硫素的西兰花提取物可能通过改变肠道菌群的结构和表型协助PD-1单抗及化疗药物发挥抑制肿瘤肺转移的作用。
实施例6转移瘤模型中萝卜硫素以及与PD1单抗和DTX联用的肠道菌群的检测实验
采集实施例5中各组小鼠治疗前以及处死前粪便，进行肠道菌群16S RNA测序分析。具体方法同实施例2。
图35a为各组在门水平上的肠道菌群丰度热图，图35b为各组在属水平的肠道菌群丰度热图，从图35a和图35b中可以看出各组菌群水平存在明显差异：属水平上西兰花提取物+PD1+DTX组Prevotellaceae_UCG-001、Alistipes、Lachnospiraceae_NK4A136_group与其他组相比均明显升高，Anaerotignum、Ruminococcus、Escherichia-Shigella、Klebsiella等菌与其他组相比均明显降低。
图36为PD1+DTX组和西兰花提取物+PD1+DTX组在门水平上的肠道菌群的结果对比图，从图36中可以看出，在门水平上，三药联用组(西兰花提取物+PD1+DTX组)，p_Patescibacteria菌水平明显升高(但该菌占肠道总菌群的比例，即相对丰度较低)，目前该菌研究较少，未查询到较多信息；图37为PD1单抗+DTX组和西兰花提取物+PD1+DTX组在属水平上的肠道菌群的结果对比图，从图37可以看出，在属水平上，Tyzzerella菌以及Candidatus Saccharimonas菌在三药联用组升高(也是丰度较低，同时研究较少)；图38为PD1单抗+DTX组和西兰花提取物+PD1单抗+DTX组在种水平上的肠道菌群的结果对比图，在种水平上，三药联用组梭菌种明显下降(未查询到梭菌有益菌有害菌信息)。上述结果中没有发现特别有意义的菌群改变，可能是因为尾静脉注射肿瘤细胞，构建转移模型的过程中，出现腹腔转移，影响了肠道菌群的结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.西兰花提取物在制备抗肿瘤的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗肿瘤包括：抑制肿瘤生长从而控制肿瘤体积，和/或提高具有抗肿瘤作用的T细胞活化水平或促进CD8+T细胞生长从而增强T细胞的抗肿瘤功能，和/或抑制具有促肿瘤作用的免疫细胞生长。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述T细胞活化水平通过检测所述T细胞表达的PD1、CD69、CD107a和干扰素r中的任意一种或多种而测得。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述具有促肿瘤作用的免疫细胞为MDSC和M2型巨噬细胞。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为皮下移植瘤和/或转移瘤。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述西兰花提取物与PD1和DTX联用。
7.西兰花提取物在制备调节肠道菌群的药物中的制剂中的应用。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述调节肠道菌群包括：使有益菌水平升高和/或有害菌水平降低，其中，所述有益菌为Akkermansia菌和g__Clostridiales_unclassified，所述有害菌为g__Rikenellaceae_RC9_gut_group和/或g__Desulfovibrio。
9.如权利要求1～8中任一项所述的用途，其特征在于，所述西兰花提取物的剂量为80-200μmol/kg萝卜硫素当量，且所述西兰花提取物通过以下工艺获得：
取西兰花种子或西兰花芽苗，冻干后80～300目研磨，得第一组分，取山葵或辣根，冻干80～800目研磨，得第二组分，取柠檬，冻干研磨得第三组分；将第一组分，第二组分和第三组分在密封容器中或者在氮气保护下在水中混合得混合溶液，其中所述第一组分和第二组分为首次混合。
10.一种抗肿瘤药物，包括西兰花提取物，优选地，所述抗肿瘤药物还包括PD1单抗和DTX。
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