CN116421630A - 一种防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品及其应用，其中，所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中至少包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌；所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，包括：AM06和AM02中的一种或两种；其中，所述AM06为保藏编号为CGMCC No.22793的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06；所述AM02为保藏编号为CGMCC No.22794的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02；本发明提供的嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过大量实验证明，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的活菌、灭活菌、菌体裂解液具有防治肿瘤的作用，且当其余免疫检查点抑制剂如PD‑1抗体或CTLA‑4抗体等联用时，可显著增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效应。

Description

一种防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品及其应用
技术领域
本发明属于药学技术领域，尤其涉及一种防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品及其应用。
背景技术
近十几年来恶性肿瘤的发病率及死亡率持续上升，发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅；每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿，社会负担日益加重。
常见的恶性肿瘤为肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。早期肺癌多无明显症状，临床上多数患者出现症状就诊时已属晚期，致晚期肺癌整体5年生存率不高。胃癌是导致恶性肿瘤患者死亡的第三大原因，>60％的患者确诊时已是局部进展期或晚期，无法通过手术根治，单纯化疗效果欠佳，致胃癌患者的5年相对生存率仅为35.9％。结直肠癌早期无明显症状，约25％结直肠癌患者在确诊时已出现远处转移，预后较差，IV期结直肠癌5年相对生存率仅为14％。70％～80％肝细胞癌患者确诊时已为进展期，仅能接受系统治疗等姑息性治疗方式，预后极差。
对于无手术根治机会或转移性肿瘤患者，目前应采取以全身药物治疗为主的综合治疗。全身药物治疗主要包括化疗药物、分子靶向药物及免疫治疗药物。针对相应基因突变的分子靶向药物和免疫治疗相关药物正在不断地发展，尤其是免疫治疗药物如抗PD-1/L1单抗已被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准应用于多种晚期实体瘤患者的一线治疗，对于化疗疗效欠佳或无法行化疗的肿瘤患者，若选择合适的人群，有助于延长晚期肿瘤患者的生存期和提高生活质量。
虽然免疫检查点阻断治疗在临床应用中带来持久的肿瘤抑制作用，但仅对部分患者有效，如何提高免疫检查点抗体药物应答率是目前面临的主要难题。目前医学研究认为，免疫检查点阻断治疗的持续治疗能带来更好的治疗效果，然而在有限的免疫检查点应答患者中，强烈的副反应，如严重的消化道不良反应、皮肤剧烈瘙痒、肝损伤、肺炎、肾功能损害等，使得这些患者不得不中止免疫治疗，从而无法获得预期的临床受益。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中至少包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌；
所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，包括：AM06和AM02中的一种或两种；
其中，所述AM06为保藏编号为CGMCC No.22793的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06；所述AM02为保藏编号为CGMCC No.22794的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02；
优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06和所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02均于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
优选地，所述AM06的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AM02的核酸序列如SEQ IDNO.2所示。
优选地，所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中还包括单克隆抗体；
优选地，所述单克隆抗体包括PD-1抗体、CD20抗体和CTLA-4抗体中的一种或多种。
优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌为活菌、形态结构完整的灭活菌和形态结构不完整的灭活菌中的一种或多种。
优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，为阿克曼氏菌活菌体、经过灭活处理、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理或物理处理的阿克曼氏菌、阿克曼氏菌裂解物、阿克曼氏菌液体培养上清液中的一种或多种。
优选地，所述产品包括组合物；
所述组合物中包括所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，以及抗肿瘤药物；
优选地，所述组合物为药物组合物；
所述药物组合物的剂型包括灌肠剂、注射剂型、外用药物剂型和口服剂型；
优选地，所述药物组合物的给药方式包括口服、灌肠、皮下注射、静脉注射和肌内注射；
优选地，所述口服剂型包括散剂、混悬剂、片剂、胶囊剂、膜剂和颗粒剂；
优选地，所述口服剂型的释药方式包括缓释和非缓释；
优选地，所述组合物为益生菌组合物。
优选地，所述抗肿瘤药物为免疫检查点抑制剂；
优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌和所述免疫检查点抑制剂在给药时同时给药或分别给药。
优选地，所述免疫检查点抑制剂选自：抗体和化合物中的一种或两种组合。
优选地，所述免疫检查点抑制剂的免疫检查点选自PD-1/PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、A2aR、B7/H3、4-1BB、OX-40、TIGHT、CD-28、TNFR2、NKG2A、CD86、CD80、ICOS、CD40和GITR中的一种或多种。
优选地，所述免疫检查点抑制剂的免疫检查点为PD-1/L1；
所述免疫检查点为PD-1/L1的单抗剂选自纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、阿特朱单抗、阿维单抗和德瓦鲁单抗中的一种或多种。
优选地，所述组合物中还包括辅料；
所述辅料包括稀释剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、矫味剂、包衣剂和增溶剂中的一种或多种。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种如上述所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品在制备防治肿瘤的产品中的应用，所述肿瘤包括消化系统肿瘤、淋巴系统肿瘤、生殖泌尿系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、皮肤肿瘤中的一种或多种。
优选地，所述防治肿瘤的产品包括食品、保健食品、药品、检测试剂和检测试剂盒；
优选地，所述药品的剂型包括散剂、混悬剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或管饲制剂、灌肠剂；
优选地，所述药品包括人用药或动物用药；
所述保健食品的剂型包括散剂、混悬液、口服液、片剂、胶囊和颗粒剂。
优选地，所述肿瘤为消化系统肿瘤；
优选地，所述消化系统肿瘤，包括直肠癌、胃癌、食管癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌中的一种或多种。
优选地，所述肿瘤为淋巴系统肿瘤；
优选地，所述淋巴系统肿瘤，包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。
优选地，所述肿瘤为生殖泌尿系统肿瘤；
优选地，所述生殖泌尿系统肿瘤包括肾癌、膀胱癌、尿路上皮癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌和前列腺癌中的一种或多种。
优选地，所述肿瘤为呼吸系统肿瘤；
优选地，所述呼吸系统肿瘤包括头颈部癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌中的一种或多种；
优选地，所述头颈部癌包括鼻咽癌和喉癌。
优选地，所述肿瘤为皮肤肿瘤；
优选地，所述皮肤肿瘤包括黑素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌中的一种或多种。
本发明提供一种防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品及其应用。其中，所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中至少包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌；所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，包括：AM06和AM02中的一种或两种；所述AM06为保藏编号为CGMCC No.22793的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06；所述AM02为保藏编号为CGMCC No.22794的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02。本发明提供的防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中的嗜粘蛋白阿克曼氏菌通过大量实验证明，其活菌、灭活菌、菌体裂解液具有防治肿瘤的作用，且当其余免疫检查点抑制剂如PD-1抗体或CTLA-4抗体等联用时，可显著增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效应。
附图说明
图1为AM02的菌落特征图；
图2为AM06的菌落特征图；
图3为AM02进行革兰氏染色后的显微镜观察图；
图4为AM06进行革兰氏染色后的显微镜观察图；
图5为本发明实施例3方法中给与SUDHL-6细胞皮下荷瘤NCG小鼠肿瘤细胞的CD8+T细胞与Treg细胞的比值图；
图6为本发明实施例6中各组对小鼠瘤体中CD8+效应T细胞数量的影响；
图7为本发明实施例6中各组对小鼠瘤体中CD4+CD25+Treg细胞数量的影响；
图8为本发明实施例6中各组对小鼠瘤体中IL-1的影响；
图9为本发明实施例6中各组对小鼠瘤体中IL-6的影响；
图10为本发明实施例6中各组对小鼠瘤体中IL-8的影响；
图11为本发明实施例6中各组对小鼠瘤体中VEGF的影响；
图12为实施例8方法中嗜粘蛋白阿克曼氏菌对肝癌小鼠体重变化的影响。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合具体实施例的方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
本申请中，提供了一种防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中至少包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌；所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，包括：AM06和AM02中的一种或两种。
上述，防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品可以为嗜粘蛋白阿克曼氏菌菌株单体或者菌株与其他物质的组合物。
需要说明的是，本申请中所涉及的菌株(嗜粘蛋白阿克曼氏菌)的保藏信息如下：
1、AM02:分类命名：Akkermansia muciniphila，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京路朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2021年6月28日，保藏编号：CGMCC No.22794
2、AM06:分类命名：Akkermansia muciniphila，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京路朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2021年6月28日，保藏编号：CGMCC No.22793。
本发明提供一种嗜粘蛋白阿克曼氏菌在制备防治肿瘤的产品中的应用，其中所提供的嗜粘蛋白阿克曼氏菌，包括：AM06和AM02中的一种或两种；其中，所述AM06为保藏编号为CGMCC No.22793的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06；所述AM02为保藏编号为CGMCC No.22794的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02。
经过测序，所述AM06的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AM02的核酸序列如SEQID NO.2所示。
嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila，又名嗜粘蛋白阿克曼菌、阿克曼氏菌、Akk菌)是一种人类肠道的正常菌的类别，属于粘蛋白分解细菌，目前已经公开的嗜粘蛋白阿克曼氏菌下的一个菌株种类为ATCC BAA-835菌株，或称BAA-835。本发明中，提供的：AM06和AM02，属于嗜粘蛋白阿克曼氏菌，区别于BAA-835的两种菌株。
通过实验证明，本发明中提供的防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(AM06和AM02)其相对于现有的ATCC BAA-835菌株均具有显著的防治肿瘤的作用。
进一步的，所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中还包括单克隆抗体；进一步的，所述单克隆抗体包括PD-1抗体、CD20抗体和CTLA-4抗体中的一种或多种。
上述，单克隆抗体，是由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体(McAb)，简称单抗。在本实施例中，单克隆抗体可以为单克隆抗体药物，单抗药物一般分为:治疗疾病(尤其是肿瘤)的单抗药剂、抗肿瘤单抗偶联物、治疗其他疾病的单抗。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。
通过大量实验证明，本发明中提供的防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(AM06和AM02)其相对于ATCC BAA-835菌株具有显著的防治肿瘤的作用，且当其与免疫检查点抑制剂联用时，可显著增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效应。
上述，PD-1抗体(PD-1ab，PD1)，为单克隆抗体，其中PD-1(程序性死亡受体1)，也称为CD279(分化簇279)，是一种重要的免疫抑制分子。通过向下调节免疫系统对人体细胞的反应，以及通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受。这可以预防自身免疫性疾病，但它也可以防止免疫系统杀死癌细胞。市售PD-1抗体产品例如信迪利单抗(商品名达伯舒)、斯鲁利单抗(商品名汉斯状)等等。
上述，CD20单抗是一种用于治疗B淋巴瘤的单克隆抗体制剂。CD20是指存在于B淋巴细胞表面的一种分子标记物，其它类型的淋巴细胞中都没有CD20分子标记物。由于这种分子标记物只存在于B淋巴细胞当中，所以在临床上就发明了CD20的单克隆抗体。现研制出的针对CD20的抗体，即CD20单抗。市售CD20单抗产品，例如利妥昔单抗(商品名美罗华)、瑞帕妥单抗(安平希)等等。
上述，CTLA-4抗体，为细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，也称为CD152(分化簇152)，是一种蛋白受体，其作为免疫检查点起作用并下调免疫应答。CTLA4在调节性T细胞中组成型表达，但在活化后仅在常规T细胞中上调-这种现象在癌症中特别显著。当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时，它起到“关闭”开关的作用。市售产品例如伊匹木单抗(逸沃)。
上述，在防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中，可以包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌和单克隆抗体，其中，嗜粘蛋白阿克曼氏菌包括AM06和AM02两种，而单克隆抗体汇中可以包括PD-1抗体、CD20抗体和CTLA-4抗体中的一种或多种，因此在防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中可以以上述组分进行不同组合得到不同的防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品。
通过实验证明，AKK菌株(AM02和AM06)与单克隆抗体(PD-1抗体、CD20抗体和CTLA-4抗体)进行组合联用后，在药效学实验中肿瘤重量更低，抑瘤率变大；并且联用组的肿瘤抑制率要明显优于对应的菌株单用组和对应的抗体单用组的两组之和(p<0.01)，体现出菌株与单克隆抗体联用具有明显的协同作用。说明AM02及AM06可以显著抑制肿瘤的生长，与作为免疫抑制剂的单克隆抗体联用后，AM02及AM06可以增强单克隆抗体的治疗效果，体现出了显著的协同作用。
所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌为活菌、形态结构完整的灭活菌和形态结构不完整的灭活菌中的一种或多种。
根据其状态，分为灭活菌和活菌。其中，灭活菌是一种通过特殊的灭活技术，保留有益菌原有结构及特性，但不再具备生长繁殖能力的有益菌。灭活是为了维持益生菌的活性，抵抗环境因素对它的杀灭作用，工程技术人员常采用包裹技术，并可辅以全程冷链。灭活菌在此根据其形态结构分为形态结构完整和形态结构不完整的灭活菌。
进一步的，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌为活菌、形态结构完整的灭活菌和形态结构不完整的灭活菌中的一种或多种。
进一步的，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，为阿克曼氏菌活菌体、经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的阿克曼氏菌、阿克曼氏菌裂解物、阿克曼氏菌液体培养上清液中的一种或多种。
需要说明的是，肠道微生物可通过其表面分子(如荚膜多糖、鞭毛和表面蛋白等)以及代谢物(如短链脂肪、吲哚和肌苷等)影响宿主的免疫系统甚至影响免疫检查点抑制剂的疗效。有研究表明，免疫检查点抑制剂可削弱了肠屏障功能，使假长双歧杆菌产生的关键代谢物肌苷进入血液，并促进了抗肿瘤T细胞免疫。肌苷作用于T细胞表达的腺苷2A受体，在常规树突状细胞的共刺激下，可促进Th1细胞的分化和活化，从而增强免疫检查点抑制剂的治疗效果；在肠癌、膀胱癌和黑色素瘤小鼠模型中，补充肌苷可增强免疫检查点抑制剂的疗效。
嗜黏蛋白阿克曼氏菌，即为Akkermansia muciniphila，又称为Akk菌。2004年，荷兰学者Derrien等从人类粪便中分离和鉴定出了一种新的粘液降解菌，即嗜黏蛋白阿克曼氏菌。2013年，Everard等发现肥胖和2型糖尿病小鼠肠道嗜黏蛋白阿克曼氏菌的丰度明显降低；接受嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗后可逆转高脂饮食引起的代谢紊乱，包括脂肪量增加、代谢性内毒素血症、脂肪组织炎症和胰岛素抵抗；还减轻了肠道炎症，改善肠道屏障功能。随后越来越多的研究，包括早衰症，渐冻症、动脉粥样硬化病变、肥胖、胰岛素抵抗以及酒精性肝病等，将调节嗜黏蛋白阿克曼氏菌作为改善疾病的作用靶点。正因为嗜黏蛋白阿克曼氏菌具有改善脂质和糖代谢紊乱，减轻炎症和改善肠道屏障等多方面的作用，嗜黏蛋白阿克曼氏菌也被作为下一代候选益生菌。
AKK是人类肠道内Verrucomicrobiain门的第一个成员和唯一代表，其16S rRNA基因序列相对容易检测，AKK作为三种主要人类肠道微生物组的肠型(富含瘤胃球菌的III型)之一的主要成员，占我们肠道微生物的1％至5％。开发AKK在肿瘤治疗方面的研究是有必要的。
本实施例中提供的防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，包括AM06和AM02两种，通过大量实验证明，嗜粘蛋白阿克曼氏菌的AM06和AM02的活菌、灭活菌、菌体裂解液具有防治肿瘤，如防治结直肠癌和胃癌等的作用，且当其余免疫检查点抑制剂如PD-1抗体或CTLA-4抗体等联用时，可显著增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效应。
进一步的，所述产品包括组合物；
所述组合物中包括所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，以及抗肿瘤药物；
上述，该组合物可以为应用于防治肿瘤的组合物，可以为用于抗肿瘤，具有防癌治癌的肿瘤抑制药物，或肿瘤检测药物。
优选地，所述组合物为药物组合物；
所述药物组合物的剂型包括灌肠剂、注射剂型、外用药物剂型和口服剂型；
优选地，所述药物组合物的给药方式包括口服、灌肠、皮下注射、静脉注射和肌内注射；
优选地，所述口服剂型包括散剂、混悬剂、片剂、胶囊剂、膜剂和颗粒剂；
优选地，所述口服剂型的释药方式包括缓释和非缓释；
优选地，所述组合物为益生菌组合物。
进一步的，所述抗肿瘤药物为免疫检查点抑制剂；
优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌和所述免疫检查点抑制剂在给药时同时给药或分别给药。
进一步的，所述免疫检查点抑制剂选自：抗体和化合物中的一种或两种组合。
上述，所述化合物可以为大分子化合物、小分子化合物中的一种或多种组合。
上述，抗体可以包括但不限于单克隆抗体和多克隆抗体。
进一步的，所述免疫检查点抑制剂的免疫检查点选自PD-1/PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、A2aR、B7/H3、4-1BB、OX-40、TIGHT、CD-28、TNFR2、NKG2A、CD86、CD80、ICOS、CD40和GITR中的一种或多种。
进一步的，所述免疫检查点抑制剂的免疫检查点为PD-1/L1；
所述免疫检查点为PD-1/L1的单抗剂选自纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、阿特朱单抗、阿维单抗和德瓦鲁单抗中的一种或多种。
进一步的，所述组合物中还包括辅料；
所述辅料包括稀释剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、矫味剂、包衣剂和增溶剂中的一种或多种。
此外，本实施例还提供一种防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品在制备防治肿瘤的产品中的应用。其中，所述肿瘤包括消化系统肿瘤、淋巴系统肿瘤、生殖泌尿系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、皮肤肿瘤中的一种或多种。
进一步的，所述防治肿瘤的产品包括食品、保健食品、药品、检测试剂和检测试剂盒；
进一步的，所述药品的剂型包括散剂、混悬剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或管饲制剂、灌肠剂；
进一步的，所述药品包括人用药或动物用药；
所述保健食品的剂型包括散剂、混悬液、口服液、片剂、胶囊和颗粒剂。
在其中一种产品实现方式中，所述肿瘤为消化系统肿瘤；
进一步的，所述消化系统肿瘤，包括直肠癌、胃癌、食管癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌中的一种或多种。
在其中一种产品实现方式中，所述肿瘤为淋巴系统肿瘤；
所述淋巴系统肿瘤，包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。
在其中一种产品实现方式中，所述肿瘤为生殖泌尿系统肿瘤；
进一步的，所述生殖泌尿系统肿瘤包括肾癌、膀胱癌、尿路上皮癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌和前列腺癌中的一种或多种。
在其中一种产品实现方式中，所述肿瘤为呼吸系统肿瘤；
进一步的，所述呼吸系统肿瘤包括头颈部癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌中的一种或多种；
进一步的，所述头颈部癌包括鼻咽癌和喉癌。
在其中一种产品实现方式中，所述肿瘤为皮肤肿瘤；
进一步的，所述皮肤肿瘤包括黑素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌中的一种或多种。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1：嗜粘蛋白阿克曼氏菌的培养
培养方法：1、将嗜粘蛋白阿克曼氏菌种划线接种于GlcNAc血红素BHA平板，厌氧培养3天。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。(1)菌落特征：嗜粘蛋白阿克曼氏菌在上述培养基上培养3天后，呈现圆形凸起、边缘整齐、不透明、白色、大小不均一的菌落，参见图1和图2。(2)显微镜下形态：嗜粘蛋白阿克曼氏菌进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，椭圆形、单个或成链状排列，参见图3和图4。
2、选取单个菌落接种于添加了GlcNAc的BHI肉汤中进行发酵培养48小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速16000×g，离心30min，去上清，收集沉淀物，即得嗜粘蛋白阿克曼氏菌菌泥。分别培养得到AM02、AM06、ATCC BAA-835嗜粘蛋白阿克曼氏菌。
实施例2：嗜粘蛋白阿克曼氏菌灭活菌、裂解液的制备
AKK灭活菌制备方法：
1、取嗜粘蛋白阿克曼氏菌菌泥，按菌泥:生理盐水(m:v)＝1:5～1:20的比例添加适量生理盐水，搅拌分散均匀，重悬成嗜粘蛋白阿克曼氏菌液。
2、取适量重悬后的嗜粘蛋白阿克曼氏菌液于无菌三口圆底烧瓶内，将各三口圆底烧瓶置于磁力搅拌器加热盘上，放入无菌搅拌子，并插入温度电极，设置转速200-800rpm，温度设置成70℃～100℃，保温加热30min～60min，热灭活结束后补加灭菌纯化水至原总重，制备成粘蛋白阿克曼灭活菌。
裂解液的制备方法：取适量重悬后的嗜粘蛋白阿克曼氏菌菌液，在冰浴中50W超声10秒，然后停止10秒，重复超声至菌体破裂，制备成粘蛋白阿克曼灭活菌裂解液。
实施例3：嗜粘蛋白阿克曼氏菌的菌粉的制备
1、取发酵液(实施例1中制备得到)，在进行离心处理，收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:50(m:v)比例加入生理盐水对菌体进行重悬洗涤，再次离心收集洗涤后的菌体，得菌泥；
2、对步骤1所得菌体加入(5％甘露醇+0.9％NaCl)混合成的赋形剂，按菌体：赋形剂＝1:20(m:m)比例进行添加，重悬分散均匀，得原液；
3、将步骤2所得的原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1.5h后，-20±2℃预冻1h，最后-40±2℃再预冻1.5h，0.25mbar真空度下经1次干燥(-5±2℃和0±2℃)、0.1mbar解析干燥(35±2℃)制备成菌粉，菌粉的菌数达到1×1011Cell/g以上。用于以下实施例。
实施例4：嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)小鼠的药效实验
一、实验设计及方法
本实施例选用免疫缺陷NCG(NOD Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/NjuCrl)小鼠进行实验，并采用移植瘤模型的方法建立小鼠DLBCL模型。6周龄的小鼠，皮下注射107个处于对数生长期的SUDHL-6人弥漫大B淋巴瘤细胞，2周后可见肿瘤出现，每2天用游标卡尺测量肿瘤大小，在肿瘤大小达到100mm3后，选择肿瘤大小均匀的小鼠随机分组。
实验分组：模型组、CD20抗体(美罗华，利妥昔单抗体)组、ATCC BAA-835组、中剂量AM06组、中剂量AM02组、高剂量AM06、高剂量AM02、AM06灭活菌组、AM02灭活菌组、ATCC BAA-835灭活菌组、中剂量AM06+CD20抗体组、中剂量AM02+CD20抗体组、高剂量AM06+CD20抗体组和高剂量AM02+CD20抗体组，每组10只小鼠。并以分组当日作为day 0，按下表1进行给药，共给药22天。嗜粘蛋白阿克曼氏菌及灭活菌分别采用实施例1和实施例2方法制得。
表1、实验动物分组及方案
Figure SMS_1
二、肿瘤测量和实验指标
从day 0开始，每2天用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
抑瘤疗效用TGI(％)评价，TGI(％)反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积/该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积/同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
在实验终点，小鼠安乐死。采集各组小鼠肿瘤，所有肿瘤进行称重。肿瘤分为三份，一份速冻，一份于福尔马林中固定，一份用于病理切片。
三、流式上机检测：收集新鲜采集的肿瘤样本剪碎成小块，制备肿瘤组织单细胞悬液，之后抽取1×106个活细胞进行抗体染色。抗体染色固定后，重悬细胞，并转移至流式管中，进行上机检测，每个样本收集至少10,000个活细胞。
四、统计分析：基于实验结束时获得的数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test(two-tailed)进行统计分析。使用GraphPadPrism软件进行所有数据分析，p<0.05认为有显著性差异。
五、实验结果
1.肿瘤体积
给与SUDHL-6细胞皮下荷瘤NCG小鼠受试药物治疗后各组肿瘤体积变化如下表所示。
表2a、各组不同时间点的瘤体积
Figure SMS_2
表2b、各组不同时间点的瘤体积
Figure SMS_3
注：a、平均值±SD。
表3a、受试物对A431模型的抑瘤药效评价(基于分组给药后第22天肿瘤体积计算得出)
Figure SMS_4
/>
Figure SMS_5
表3b、联合给药与单用受试物和单抗的抑瘤效果之和的对比
Figure SMS_6
注：a.平均值±SD；
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积/该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积/同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％；
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(two-tailed)方法计算；d.根据TGI计算，两组间p值按照unpaired t-test(two-tailed)方法计算。
4.流式实验结果：流式实验结果如图5所示，图中数据点代表组内每只小鼠的CD8+T细胞与Treg细胞的比率，误差线代表SEM。
六、结果分析
给药期间各组荷瘤小鼠的瘤块体积如表2a和表2b所示，CD20抗体利妥昔单抗(美罗华)、嗜粘蛋白阿克曼氏菌BAA-835、AM06、AM02可减小肿瘤的体积(p<0.0001)，嗜粘蛋白阿克曼活菌与灭活菌效力相当；嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06减小瘤块体积的效果优于CD20抗体利妥昔单抗(美罗华)(p<0.05)；嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06和AM02减小瘤块体积的效果均优于嗜黏蛋白阿克曼/氏菌ATCC BAA-835(p<0.05)；利妥昔单抗与嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06/AM02联合给药可显著大幅度地减小瘤块体积(p<0.0001)。
给药结束后，CD20抗体组、ATCC BAA-835组、中剂量AM06组、中剂量AM02组、高剂量AM06组、高剂量AM02组、AM06灭活菌组、AM02灭活菌组、ATCC BAA-835灭活菌组、中剂量AM06+CD20抗体组、中剂量AM02+CD20抗体组、高剂量AM06+CD20抗体组以及高剂量AM02+CD20抗体组的抑瘤率分别为29.96％、26.95％、37.25％、34.23％、36.35％、33.26％、36.59％、32.32％、25.37％、87.45％、84.92％、87.55％和84.34％(表3a)。
CD8+T细胞在肿瘤免疫中发挥重要作用，是直接杀伤肿瘤细胞的效应细胞，Treg(调节性T细胞)是肿瘤微环境中一群普遍存在的抑制性T细胞，能抑制肿瘤抗原特异性T细胞的功能。CD8+T/Treg的比值是反映免疫治疗效果和肿瘤微环境变化的一个重要指标，如图5所示，相比模型组，CD20抗体组、中剂量AM06组、中剂量AM02组、高剂量AM06组、高剂量AM02组、AM06灭活组、AM02灭活组、中剂量AM06+CD20抗体组、中剂量AM02+CD20抗体组、高剂量AM06+CD20抗体组以及高剂量AM02+CD20抗体组的CD8+T/Treg的比值升高(p<0.05)；此外，相比CD20抗体组，CD8+T/Treg的比值在中剂量AM06+CD20抗体组、中剂量AM02+CD20抗体组、高剂量AM06+CD20抗体组、高剂量AM02+利妥昔单抗联合给药组中显著上升(p<0.0001)。
上述数据说明嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06/AM02对非霍奇金淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤)的抑制作用与CD20抗体(利妥昔单抗)相当，且在实验终点AM06的效果优于利妥昔单抗(p<0.05)，灭活菌与活菌效力相当；嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06/AM02与利妥昔单抗联用明显优于利妥昔单抗单独使用，且抑瘤效果显著优于单用菌株和单用抗体之和(p<0.0001)(表3b)，说明联用具有明显的协同效果；中、高剂量的AM06/AM02单独使用以及中、高剂量的AM06/AM02联合利妥昔单抗给药的效果之间不存在剂量依赖性(p>0.05)。
由以上实施例的结果可见，本发明方法获取的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06/AM02对非霍奇金淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤)的抑制作用与利妥昔单抗相当；且嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06/AM02能够有效地增加单克隆抗体对非霍奇金淋巴瘤的治疗效果。
实施例5：嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗经典型霍奇金淋巴瘤(HL)小鼠的药效实验
一、实验设计及方法
本实施例选用4至5周龄(20-22克体重)BNX(NIH-Beige-NudeXID，NIH-III)三联联合免疫小鼠进行实验，并采用移植瘤模型的方法建立小鼠HL模型。体重20-22g的小鼠，皮下注射5×106个处于对数生长期的人H-RS细胞系(L1236或HD-MyZ)至腹部表面，5天内形成可触及的肿块，待肿瘤体积达到60mm3(L1236)/160mm3(HD-MyZ)后，选择肿瘤大小均匀的小鼠随机分组。
实验分组：模型组、PD-1抗体(达伯舒，信迪利单抗)组、ATCC BAA-835组、中剂量AM06组、中剂量AM02组、高剂量AM06、高剂量AM02、AM06灭活菌组、AM02灭活菌组、ATCC BAA-835灭活菌组、中剂量AM06+PD-1抗体组、中剂量AM02+PD-1抗体组、高剂量AM06+PD-1抗体组和高剂量AM02+PD-1抗体组，每组10只小鼠。并以分组当日作为day 0，按下表4进行给药，共给药22天。嗜粘蛋白阿克曼氏菌及灭活菌分别采用实施例1和实施例2方法制得。
表4、实验动物分组及方案
Figure SMS_7
Figure SMS_8
二、肿瘤测量和实验指标
用游标卡尺测量day0、day1、day2、day3、day4、day5、day7、day10、day12、day15、day18、day22的肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
抑瘤疗效用TGI(％)评价，TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积/该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积/同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
在实验终点，小鼠安乐死。采集各组小鼠肿瘤，所有肿瘤进行称重。肿瘤分为三份，一份速冻，一份于福尔马林中固定，一份用于病理切片。
三.统计分析：基于实验结束时获得的数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test(two-tailed)进行统计分析。使用GraphPadPrism软件进行所有数据分析，p<0.05认为有显著性差异。
四.实验结果
1.肿瘤体积
给予L1236细胞皮下荷瘤BNX小鼠受试药物治疗后各组肿瘤体积变化如下表所示。
表5、给予L1236细胞的各组不同时间点的瘤体积
Figure SMS_9
续上表：
Figure SMS_10
Figure SMS_11
注：a.平均值±SD
给予HD-MyZ细胞皮下荷瘤BNX小鼠受试药物治疗后各组肿瘤体积变化如下表所示。
表6、给予HD-MyZ细胞的各组不同时间点的瘤体积
Figure SMS_12
/>
续上表：
Figure SMS_13
注：a.平均值±SD
表7、受试物对L1236模型的抑瘤药效评价(基于分组给药后第22天肿瘤体积计算得出)
Figure SMS_14
注：a.平均值±SD；
b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积/该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积/同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％；
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(two-tailed)方法计算。
表8、受试物对HD-MyZ模型的抑瘤药效评价(基于分组给药后第22天肿瘤体积计算得出)
Figure SMS_15
/>
Figure SMS_16
注：a.平均值±SD；b.肿瘤生长抑制评价指标根据公式TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积/该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积/同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％；c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(two-tailed)方法计算。
五.结果分析
给药期间各组荷瘤小鼠的瘤块体积如表5和表6所示，PD-1抗体(信迪利单抗，达伯舒)，嗜粘蛋白阿克曼氏菌BAA-835、AM06、AM02及其灭活菌均可减小肿瘤的体积(p<0.0001)，嗜粘蛋白阿克曼活菌与灭活菌相当，在实验终点，AM06和AM02抑制肿瘤生长的效力均优于BAA-835；PD-1抗体与嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06/AM02联合给药可显著大幅度地减小瘤块体积(p<0.0001)。其中，PD-1抗体与嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06联用，在给药18天，可以完全消退L1236细胞建立的小鼠肿瘤(表5)；给药22天，完全消退HD-MyZ细胞建立的小鼠肿瘤(表6)。在实验终点，PD-1抗体与嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02联用，可以使肿瘤体积缩小至3mm3左右。
给药结束后，PD-1抗体组、ATCC BAA-835组、中剂量AM06、中剂量AM02、高剂量AM06、高剂量AM02、AM06灭活菌组、AM02灭活菌组、ATCC BAA-835灭活菌组、中剂量AM06+PD-1抗体组、中剂量AM02+PD-1抗体组、高剂量AM06+PD-1抗体组以及高剂量AM02+PD-1抗体组对L1236细胞诱导的小鼠肿瘤的抑瘤率(表7)分别为47.46％、58.62％、45.00％、51.67％、61.67％、51.72％、58.33％、55.00％、49.15％、100.00％、95.00％、100.00％和96.67％；对HD-MyZ细胞诱导的小鼠肿瘤的抑瘤率(表8)分别为56.84％、58.97、53.18％、56.64％、59.64％、57.20％、58.36％、55.62％、52.13％、100.00％、99.93％、100.00％和99.96％。
上述数据说明嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06、AM02及其灭活菌对霍奇金淋巴瘤的抑制作用与PD-1抗体相当，且活菌与灭活菌的效力相当；AM02与PD-1抗体联用组(活菌、灭活菌)，以及AM06与PD-1抗体联用组(活菌、灭活菌)，其肿瘤重量更低，抑瘤率变大；并且联用组的肿瘤抑制率要明显优于对应的菌株单用组和PD-1抗体单用组的两组之和(p<0.0001)，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用。说明AM02及AM06可以显著抑制肿瘤的生长，与免疫抑制剂PD-1抗体联用后，AM02及AM06可以增强PD-1抗体的治疗效果，体现出了显著的协同作用。嗜粘蛋白阿克曼氏菌中、高剂量的AM06/AM02单独使用以及中、高剂量的AM06/AM02联合利妥昔单抗给药的效果之间不存在剂量依赖性(p>0.05)。
实施例6：嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗小鼠B16F10皮肤黑色素瘤模型的药效实验
为了验证阿克曼氏菌联合PD-1抑制剂对黑色素瘤的治疗作用，本实施例采用B16F10黑色素瘤细胞在C57BL/6小鼠中建立肿瘤模型，进行实验。观察了阿克曼氏菌联合PD-1抑制剂(商品编号BE0146，购自BioXcell)治疗小鼠肿瘤模型中肿瘤体积、相对肿瘤增殖率、肿瘤重量、抑瘤率、CD8+效应T细胞、调节性T细胞(Treg细胞)及相关细胞因子的变化情况。
具体实验设计如下：
一、小鼠皮肤黑色素瘤细胞培养：取B16F10细胞置于RPMI 1640完全培养基中(含有10％ FBS和1％双抗)在37℃、5％CO2的培养箱中培养。镜下观察，当细胞密度达80％左右时，加入2-3mL胰蛋白酶消化，将细胞悬液转移到50mL离心管中1000rpm离心5min，弃上清液，加入5mL无抗生素的含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞。吸取10μL细胞悬液于1.5mL离心管中，加入10μL苔盼蓝染液混匀，取10μL混匀后的液体加入到细胞计数板中，上机进行计数。根据计数结果，调整细胞浓度为5×105cells/mL。置于冰上备用。
二、小鼠肿瘤模型建立：(1)瘤体接种：实验用7周雄性C57BL/6小鼠，待小鼠自然生长1周后，进行瘤体接种。分别给除空白组外全部小鼠接种肿瘤细胞，用鼠源性B16F10细胞进行下腹部皮下注射造模，注射细胞量为5×105cells/mL×0.2mL/只。观察小鼠肿瘤生长情况。(2)建模成功标志：小鼠出现消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征，小鼠接种部位可触及肿块。
三、小鼠体内实验
(1)实验分组：瘤体接种1周后，肿瘤体积达到约100mm3时，选择肿瘤生长大小均匀的动物，按下表9开始分组给药：
表9、实验分组及给药方案
Figure SMS_17
Figure SMS_18
(2)给药方法：给药时间点为给药日的上午10点，联合用药组先给药PD-1抗体，再给药活菌/灭活菌。
(3)检测项目：肿瘤体积及相对肿瘤增殖率：给药0d，14d后分别测量长径及短径长度以计算和记录瘤体体积。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。相对肿瘤增殖率T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV，CRTV：对照组RTV)。RTV＝Vt/V0(Vt每一次测量时肿瘤体积均值，V0给药时所测得肿瘤体积均值)。
肿瘤重量及抑瘤率：给药时间结束后，处死全部小鼠，无菌操作下剥离小鼠肿块，剥离的每组肿块称重。抑瘤率计算公式为：抑瘤率(％)＝(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量×100％。
CD8+效应T细胞、Treg细胞水平及细胞因子的水平：将小鼠肿块分别研磨为细胞悬液，700目过滤网过滤组织残渣后，PBS洗涤2遍，离心计数，每组标本取两管细胞样本分别上机检测。
(4)观察指标
肿瘤体积及相对肿瘤增殖率、肿瘤重量及抑瘤率、CD8+效应T细胞、CD4+CD25+Treg细胞(Treg细胞)、及细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、VEGF。
四、实验结果
(1)肿瘤体积：给药0d，14d天瘤体体积如下表10所示。
表10、各组小鼠肿瘤体积表(mean±SE，n＝8)
Figure SMS_19
注：两组间p值按照unpaired t-test(two-tailed)方法计算；T/C(％)为相对肿瘤增值率。
由上表可以看出，PD-1抗体和阿克曼氏菌可以抑制肿瘤的生长，其中AM06组抑制肿瘤效力显著优于PD-1抗体组(P＜0.05)，极显著优于BAA-835组(P＜0.01)，与AM02组效力相当(P＞0.05)，AM02组抑制肿瘤效力与PD-1抗体组相当(P＞0.05)，显著优于BAA-835组(P＜0.05)。AM06灭活菌组抑制肿瘤效力与PD-1抗体组相当(P＞0.05)，显著优于BAA-835灭活菌组(P＜0.05)，与AM02组效力相当(P＞0.05)，AM02组抑制肿瘤效力与PD-1抗体组、BAA-835灭活菌相当(P＞0.05)；相较于单独使用阿克曼氏菌或是PD-1抗体，阿克曼氏菌或灭活阿克曼氏菌AM06、AM02和PD-1抗体联用抑制肿瘤更显著。
(2)肿瘤重量及抑瘤率
表11a、各组小鼠肿瘤重量及抑瘤率(mean±SE，n＝8)
Figure SMS_20
表11b、联合给药与单用受试物和单抗的抑瘤效果之和的对比
Figure SMS_21
注：两组间p值按照unpaired t-test(two-tailed)方法计算。
如上表(表11a和表11b)所示，PD-1抗体和阿克曼氏菌可以抑制肿瘤的生长，其中AM06组抑制肿瘤效力极显著优于PD-1抗体组、BAA-835组(P＜0.01)，与AM02组效力相当(P＞0.05)，AM02组抑制肿瘤效力显著优于PD-1抗体组、BAA-835组(P＜0.05)。AM06灭活菌组抑制肿瘤效力与PD-1抗体组相当(P＞0.05)，显著优于BAA-835灭活菌组(P＜0.05)，与AM02组效力相当(P＞0.05)，AM02组抑制肿瘤效力显著优于PD-1抗体组(P＜0.05)，极显著优于BAA-835灭活菌组(P＜0.01)；相较于单独使用阿克曼氏菌或是PD-1抗体，阿克曼氏菌或灭活阿克曼氏菌AM06、AM02分别与PD-1抗体联用的抑制肿瘤更显著，且抑瘤效果优于单用菌株和单用抗体之和(p<0.01)，显示出菌株和抗体具备极强地协同作用。
(3)CD8+效应T细胞
使用流式细胞计数分别分析各组处理给药结束后瘤体中CD8+效应T细胞占比。瘤体中CD8+效应T细胞，模型组显著高于空白组，实验组显著高于模型组。阿克曼氏菌AM06联合PD-1抑制剂组也均显著高于阿克曼氏菌或是PD-1抗体单独使用组，如图6所示。
(4)CD4+CD25+Treg细胞(Treg细胞)
使用流式细胞计数检测脾脏和瘤体中Treg细胞占比。
瘤体Treg细胞，模型组显著高于空白组，实验组低于模型组。阿克曼氏菌AM06联合PD-1抑制剂组各组内无显著差异，均高于空白组如图7所示。
(5)细胞因子：采用luminex技术检测皮肤黑色素瘤小鼠模型中IL-1、IL-6、IL-8、VEGF等细胞因子的水平。
图8、图9、图10和图11分别为IL-1、IL-6、IL-8、VEGF的变化情况。相较于空白组，模型组中IL-1、IL-6、IL-8、VEGF等促炎因子显著升高。PD-1抑制剂能够有效调节上述细胞因子，下调IL-1、IL-6、IL-8、VEGF等促炎因子水平，而阿克曼氏菌AM06及灭活菌可以加强PD-1抑制剂效果。
实施例7：嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗A431皮肤基底细胞肿瘤模型的药效实验
为了验证阿克曼氏菌联合PD-1抑制剂对基底细胞癌的治疗作用，本实施例采用A431表皮癌细胞在C57BL/6小鼠中建立肿瘤模型，进行实验。观察了阿克曼氏菌联合PD-1抑制剂(商品编号BE0146，购自BioXcell)治疗小鼠肿瘤模型中肿瘤体积、相对肿瘤增殖率、肿瘤重量、抑瘤率的变化情况。
具体实验设计如下：
一、A431表皮癌细胞的培养：取A431细胞置于DMEM高糖完全培养基中在37℃、5％CO2的培养箱中培养。镜下观察，当细胞密度达80％左右时，加入2-3mL胰蛋白酶消化，将细胞悬液转移到50mL离心管中1000rpm离心5min，弃上清液，加入5mL无抗生素的含10％胎牛血清的DMEM高糖完全培养基重悬细胞。吸取10μL细胞悬液于1.5mL离心管中，加入10μL苔盼蓝染液混匀，取10μL混匀后的液体加入到细胞计数板中，上机进行计数。根据计数结果，调整细胞浓度为5×105cells/mL。置于冰上备用。
二、小鼠肿瘤模型建立：(1)瘤体接种：实验用7周雄性C57BL/6小鼠，待小鼠自然生长1周后，进行瘤体接种。分别给除空白组外全部小鼠接种肿瘤细胞，用A431细胞进行背部皮下注射造模，注射细胞量为5×105cells/mL×0.2mL/只。观察小鼠肿瘤生长情况。(2)建模成功标志：小鼠出现消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征，小鼠接种部位可触及肿块。
三、小鼠体内实验
(1)实验分组：瘤体接种1周后，肿瘤体积达到约100mm3时，选择肿瘤生长大小均匀的动物，按下表12开始分组给药：
表12、实验分组及给药方案
Figure SMS_22
(2)给药方法：给药时间点为给药日的上午10点，联合用药组先给药PD-1抗体，再给药活菌/灭活菌。
(3)检测项目：肿瘤体积及相对肿瘤增殖率：给药0d，14d后分别测量长径及短径长度以计算和记录瘤体体积。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。相对肿瘤增殖率T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV，CRTV：对照组RTV)。RTV＝Vt/V0(Vt每一次测量时肿瘤体积均值，V0给药时所测得肿瘤体积均值)。
肿瘤重量及抑瘤率：给药时间结束后，处死全部小鼠，无菌操作下剥离小鼠肿块，剥离的每组肿块称重。抑瘤率计算公式为：抑瘤率(％)＝(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量×100％。
(4)观察指标：肿瘤体积及相对肿瘤增殖率、肿瘤重量及抑瘤率、
四、实验结果
(1)肿瘤体积：给药0d，14d天瘤体体积如下表13所示。
表13、各组小鼠肿瘤体积表(mean±SE，n＝8)
Figure SMS_23
注：两组间p值按照unpaired t-test(two-tailed)方法计算。
由上表可以看出，PD-1抗体和阿克曼氏菌可以抑制肿瘤的生长，其中AM06组抑制肿瘤效力显著优于PD-1抗体组(P＜0.05)，极显著优于BAA-835组(P＜0.01)，与AM02组效力相当(P＞0.05)；AM02组抑制肿瘤效力显著优于PD-1抗体组(P＜0.05)，极显著优于BAA-835组(P＜0.01)；AM06灭活菌组抑制肿瘤效力显著优于PD-1抗体组(P＜0.05)，极显著优于BAA-835灭活菌组(P＜0.01)，与AM02组效力相当(P＞0.05)；AM02组抑制肿瘤效力与PD-1抗体组相当(P＞0.05)，极显著优于BAA-835灭活菌组(P＜0.01)；相较于单独使用阿克曼氏菌或是PD-1抗体，阿克曼氏菌或灭活阿克曼氏菌AM06、AM02和PD-1抗体联用抑制肿瘤更显著，体现了菌株与抗体联用的显著的协同效果。
(2)肿瘤重量及抑瘤率
表14、各组小鼠肿瘤重量及抑瘤率(mean±SE，n＝8)
Figure SMS_24
/>
Figure SMS_25
表14b、联合给药与单用受试物和单抗的抑瘤效果之和的对比
Figure SMS_26
注：两组间p值按照unpaired t-test(two-tailed)方法计算。
如上表所示，PD-1抗体和阿克曼氏菌可以抑制肿瘤的生长，其中AM06组抑制肿瘤效力极显著优于PD-1抗体组、BAA-835组(P＜0.01)，与AM02组效力相当(P＞0.05)，AM02组抑制肿瘤效力极显著优于PD-1抗体组、BAA-835组(P＜0.01)，AM06灭活菌组抑制肿瘤效力显著优于PD-1抗体组(P＜0.05)，显著优于BAA-835灭活菌组(P＜0.05)，与AM02组效力相当(P＞0.05)，AM02组抑制肿瘤效力与PD-1抗体组、BAA-835灭活菌组相当(P＞0.05)；相较于单独使用阿克曼氏菌或是PD-1抗体，阿克曼氏菌或灭活阿克曼氏菌AM06、AM02和PD-1抗体联用抑制肿瘤更显著，且抑瘤效果优于单用菌株和单用抗体之和(p<0.01)，显示出菌株和抗体具备极强地协同作用。以上结果说明了阿克曼氏菌AM06或AM02及其灭活菌联合PD-1抑制剂可以显著改善小鼠肿瘤微环境。
实施例8：嗜粘蛋白阿克曼氏菌用于治疗食管癌的药效试验
1、实验设计和方法：6～8周龄wistar雄性大鼠130只，适应性喂养2周后，随机分为造模组(120只，皮下注射0.15％ MBNA溶液)和正常组(10只，皮下注射0.9％生理盐水)，每周两次，连续10周，诱变6周随机抽取3只大鼠食管黏膜增生情况，诱变7周后，根据体重将造模组随机分为9组：模型组、阳性药组(PD-1抗体，BE0146，BioXcell 200μg/只)、AM06活菌组、AM02活菌组、AM06灭活菌组、AM02灭活菌组、AM06上清液组、AM02上清液组、ATCC BAA-835活菌组，每组10只，诱变7周后开始给药，空白组和模型组给予生理盐水，给药组按相应剂量药物早晚给药，连续给药13周；其中，AM06、AM02和ATCC BAA-835各组菌液浓度均为1010CFU/mL/只，PD-1抗体(BE0146，BioXcell)浓度为200μg/只。嗜粘蛋白阿克曼氏菌采用实施例一中所述方法制得，嗜粘蛋白阿克曼氏菌上清液采用实施例四(1)中所述方法制得。
于造模第0、7、9、11、13、15、17、20周称量大鼠体重，大鼠于给药结束(即第20周)前一天禁食不禁水，称量大鼠体重，麻醉后，腹主动脉取血，摘取食管并进行称重，统计各食管上皮瘤体体积大于1mm3瘤体数，测量食管长径与短径，计算食管瘤体体积，ELISA方法检测各组大鼠血清中COX-2和PTX3的表达水平。
2、实验结果
(1)一般情况观察：实验过程中，正常组大鼠皮毛柔顺，有光泽，对外界刺激反应较灵敏，其余各组大鼠逐渐出现活动减少，食量下降，耸毛，毛发缺乏光泽，易脱落，对外界刺激反应较迟钝等现象，整个实验过程中大鼠状态良好，自由活动饮食饮水正常。
参考图12，造模组大鼠的体重在第7～20周内显著低于空白对照组；第7～9周，各给药组大鼠体重与模型组体重无明显变化，第11～20周，各给药组大鼠体重明显高于模型组，其中不同给药对于大鼠体重的改善程度为：阳性药组≈AM06≈AM02＞BAA-835。
(2)大鼠食管瘤体数量和体积：食管黏膜层均出现全段病变，上皮增厚黏膜粗糙，出现颗粒样突起或乳突瘤样改变，成瘤率为100％，表示食管癌模型建立成功。如表15所示，与模型组相比，各给药组食管瘤体数量和体积存在不同程度减少，其中阳性药组、AM06和AM02组大鼠肿瘤体积显著低于模型组和BAA-835组，各给药组对食管瘤体数量和体积的影响程度为：阳性药组≈AM06≈AM02＞BAA-835组。
表15、嗜粘蛋白阿克曼氏菌对大鼠食管瘤体数量(mean±SD，n＝10)和体积的影响
组别 食管瘤体数量(个) 瘤体体积中位数/mm3
空白组 0 0
模型组 9.86±2.61 176.65b
阳性药组 6.92±1.43ab 53.71aab
AM06活菌 6.37±2.04ab 69.67aab
AM02活菌 7.16±2.85ab 73.48aab
AM06灭活菌 6.15±2.46ab 74.67aab
AM02灭活菌 6.62±2.59ab 80.39aab
AM06上清液 6.02±2.75ab 70.52aab
AM02上清液 6.93±2.29ab 78.05aab
BAA-835 9.15±2.80 102.58a
注：a表示与模型组相比P＜0.05；aa表示与模型组相比P＜0.01；b表示与BAA-835组相比P＜0.05。
(3)血清中炎症相关蛋白COX-2和PTX3表达水平：COX-2催化生成的PG在调节食管癌细胞的增殖和凋亡中起重要作用，有研究表明，91％的食管鳞癌和78％的食管腺癌中观察到COX-2的表达；PTX3是先天免疫的重要组成部分，可通过调节补体依赖性，巨噬细胞持续性，肿瘤促进性炎症等而作为肿瘤抑制因子发挥重要作用。ELISA法测定COX-2和PTX3，结果如下表16所示，与模型组相比，各给药组与空白组COX-2表达下调，PTX3表达量上调，其中阳性药组、AM06和AM02组能够显著影响COX-2和PTX3表达，改善效果明显优于BAA-835组，各给药组对其影响程度为：阳性药组≈AM06≈AM02＞BAA-835组。
表16、大鼠血清中炎症相关蛋白COX-2和PTX3的表达(mean±SD，n＝10)
组别 COX-2(ng/mL) PTX3(pg/mL)
空白组 4.62±1.30aaabb 1489.24±80.35ab
模型组 18.39±6.61b 892.71±64.26
阳性药组 8.14±2.86aab 1265.64±92.65ab
AM06活菌 8.33±2.15aab 1259.51±82.74ab
AM02活菌 9.91±3.02aab 1195.65±153.41ab
AM06灭活菌 8.84±3.46aab 1268.74±143.55ab
AM02灭活菌 10.23±3.57aab 1125.40±126.48ab
AM06上清液 8.24±2.52aab 1296±94.46ab
AM02上清液 10.34±2.10aab 1095.38±115.63ab
BAA-835 14.57±2.84a 966.67±115.28
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01，aaa表示与模型组相比P＜0.001；b表示于BAA-835组相比P＜0.05，bb表示于BAA-835组相比P＜0.01。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼氏菌能有效改善大鼠食管癌，其疗效阳性药≈AM06≈AM02＞BAA-835组。
实施例9：嗜粘蛋白阿克曼氏菌与PD-1抗体联用用于防治食管癌的药效试验
1.实验设计和方法
(1)Eca-109细胞培养：食管癌细胞株Eca-109用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基(含100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素，以7.4％ NaHCO3调整pH值到7.2～7.4)，于37℃、5％CO2及95％空气饱和湿度的恒温培养箱中培养，取对数生长期细胞，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化细胞，加入全培养基RPMI 1640终止消化，充分吹打后，无血清RPMI 1640培养液洗涤2次，1500rpm，离心5min，重悬于生理盐水中，调整细胞浓度为1×107/mL。
(2)食管癌模型建立：110只BALB/C/nu/nu裸小鼠(雌性，体质量16～18g，4周龄)，随机分为11组：空白对照组、模型组、阳性药组(PD-1抗体，BE0146，BioXcell 200μg/只)、AM06活菌组、AM02活菌组、AM06灭活菌组、AM02灭活菌组、AM06活菌联用PD-1抗体、AM02活菌联用PD-1抗体、AM06灭活菌联用PD-1和AM02灭活菌联用PD-1抗体，每组10只。造模组小鼠采用接种食管癌Eca-109细胞方法建立食管癌模型(细胞接种于裸鼠左侧腋窝及右侧臀部皮下，0.2mL/部位)，各给药组小鼠于接种第3天进行灌胃处理，每日2次，其中，AM06、AM02和ATCC BAA-835各组菌液浓度均为1010CFU/mL/只，PD-1抗体(BE0146，BioXcell)浓度为200μg/只，共给药4周。
30天后称量裸鼠体重，颈椎脱臼法处死小鼠并剥离皮下肿瘤，称瘤重，计算：肿瘤抑制率＝(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100％，RT-PCR法检测COX-2mRNA表达。
2.实验结果
(1)一般情况观察：接种食管癌Eca-109细胞后，造模组小鼠于第5天左右开始成瘤，瘤体逐渐增大，成瘤率达100％。
(2)肿瘤重量和肿瘤抑制率
如下表17所示，模型组小鼠肿瘤重量明显高于各给药组，不同给药组均能抑制小鼠肿瘤生长，其中，AM06与PD-1抗体联用组、AM02与PD-1抗体联用组的抑瘤效果显著优于每种AKK菌株单用组和阳性药物单用组，并且肿瘤抑制率要明显优于AKK菌株单用组和阳性药物单用组的两组之和，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用；且AM06和AM02单用效果显著优于BAA-835组，即不同给药组对瘤体的抑制程度为：AM06与PD-1抗体联用组≈AM02与PD-1抗体联用组＞AM06组≈阳性药组≈AM02组＞BAA-835组。
表17、小鼠肿瘤重量和抑制率(mean±SD，n＝10)
组别 瘤体重量(g) 肿瘤抑制率(％)
空白组 0 0
模型组 1.35±0.16b /
阳性药组 1.14±0.23aab 15.56±3.6
AM06活菌 1.17±0.18aab 13.33±1.7
AM02活菌 1.2±0.25aab 11.11±2.6
AM06灭活菌 1.14±0.13aab 15.56±2.1
AM02灭活菌 1.09±0.19aab 19.26±1.4
AM06活菌+PD-1抗体 0.96±0.14aaabb 38.89±5.2
AM02活菌+PD-1抗体 0.91±0.11aaabb 32.59±3.3
AM06灭活菌+PD-1抗体 0.89±0.20aaabb 34.07±3.8
AM02灭活菌+PD-1抗体 0.84±0.18aaabb 37.78±4.5
BAA-835 1.28±0.16a 5.19±2.6
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01，aaa表示与模型组相比P＜0.001；b表示与BAA-835组相比P＜0.05，bb表示与BAA-835组相比P＜0.01。
(3)COX-2mRNA表达：取小鼠肿瘤组织，采用RT-PCR法检测COX-2mRNA表达量(扩增片段255bp，上引：5'-AGAATGCATTGGAAACATCGACAG-3'；下引：5'-CCTGTTGCGGAGAAAGGAGTC-3')，测定结果如下表18所示，空白组和各给药组小鼠瘤组织内COX-2mRNA表达量下调，其中AM06或AM02与PD-1抗体联用组和空白组COX-2表达量显著低于模型组、AKK单用组和阳性药组，AM06、AM02单用效果显著优于BAA-835组，不同给药组对其影响程度为：AM06与PD-1抗体联用组≈AM02与PD-1抗体联用组＞AM06组≈AM02组≈阳性药组＞BAA-835组。
表18、小鼠COX-2mRNA表达量(mean±SD，n＝10)
Figure SMS_27
Figure SMS_28
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01；b表示与BAA-835组相比P＜0.05，bb表示与BAA-835组相比P＜0.01。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼氏菌与PD-1抗体联用能有效改善大鼠食管癌。
实施例10：嗜粘蛋白阿克曼氏菌用于防治肝癌的药效试验
1.实验设计和方法
(1)接种瘤株制备：将H22瘤株接种于昆明小鼠，6天后处死小鼠，无菌取小鼠乳白色腹水，用无菌生理盐水调整肿瘤细胞混悬液浓度为2×105个/mL。
(2)动物模型构建和分组：130只昆明小鼠(雄性，体重18～20g)分为空白组(10只)和造模组(120只)，其中造模组小鼠于右前肢腋窝下部接种(1)中所制备H22细胞混悬液(0.2mL/只)，造模组随机分为9组：模型组、阳性药组(PD-1抗体，BE0146，BioXcell 200μg/只)、AM06活菌组、AM02活菌组、AM06灭活菌组、AM02灭活菌组、AM06上清液组、AM02上清液组、ATCC BAA-835活菌组，每组10只，AM06、AM02和ATCC BAA-835各组菌液浓度均为1010CFU/mL/只，PD-1抗体(BE0146，BioXcell)浓度为200μg/只。各给药组于接种瘤株24小时后给药，每天1次，连续给药10天。嗜粘蛋白阿克曼氏菌采用实施例一中所述方法制得，嗜粘蛋白阿克曼氏菌上清液采用实施例四(1)中所述方法制得。
给药结束24小时后无菌条件下取小鼠脾脏和胸腺，剥离肿瘤组织并称重，计算肿瘤抑制率＝(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100％，剔除脾脏组织的结缔组织，制备脾细胞悬液，MTT法测定NK细胞及T淋巴细胞增殖活性。
2.实验结果
(1)瘤体重量和抑瘤率：如下表19所示，与模型组相比，各给药组小鼠实体瘤肿瘤明显降低，且阳性药组、AM06及AM02活菌及灭活菌均具有显著性差异，其中阳性药组、AM06及AM02各组对肿瘤重量的抑制能力明显优于BAA-835组，不同给药方式对肝癌瘤体抑制率程度主要表现为：阳性药组≈AM06≈AM02＞BAA-835。
表19、嗜粘蛋白阿克曼氏菌对肝癌小鼠实体瘤的影响(mean±SD，n＝10)
组别 瘤体重量(g) 抑瘤率(％)
空白组 0 /
模型组 1.92±0.57b /
阳性药组 1.70±0.39aab 11.46±6.82
AM06活菌 1.54±0.35aab 19.79±8.43
AM02活菌 1.57±0.43aab 18.23±9.62
AM06灭活菌 1.52±0.46aab 20.83±5.47
AM02灭活菌 1.47±0.31aab 23.44±4.10
AM06上清液 1.50±0.42aab 21.88±6.88
AM02上清液 1.54±0.50aab 19.79±5.91
BAA-835 1.86±0.72a 3.12±4.69
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01；b表示与BAA-835组相比P＜0.05。
(2)NK细胞活性及T淋巴细胞增殖活性：肿瘤的发生发展与机体免疫功能密切相关，肿瘤细胞的增殖通常伴有免疫应答的减弱，NK细胞作为一种光谱杀伤细胞，在免疫监视中起重要作用；淋巴细胞增殖活性可以反映机体T细胞介导的免疫应答水平。
采用MTT法测定小鼠NK细胞活性及T淋巴细胞增殖活性，实验结果如下表20所示，与模型组相比，给药组小鼠NK细胞活性和T淋巴细胞增殖活性明显增加，且AM06、AM02和阳性药组的改善程度明显优于BAA-835组，即不同给药对小鼠机体免疫介导能力为：阳性药组≈AM06≈AM02＞BAA-835。
表20、嗜粘蛋白阿克曼氏菌对肝癌小鼠NK细胞活性及T淋巴细胞增殖活性的影响(mean±SD，n＝10)
组别 NK细胞活性(％) T淋巴细胞增殖(A)
空白组 58.63±7.38aaabb 0.32±0.03aabb
模型组 22.39±4.25b 0.17±0.02
阳性药组 50.98±6.67aab 0.26±0.04ab
AM06活菌 49.41±6.21aab 0.24±0.03ab
AM02活菌 47.38±3.95aab 0.23±0.02ab
AM06灭活菌 45.93±6.74aab 0.28±0.04ab
AM02灭活菌 48.34±5.89aab 0.26±0.03ab
AM06上清液 45.14±5.63aab 0.22±0.04ab
AM02上清液 42.67±5.38aab 0.24±0.03ab
BAA-835 35.48±4.66a 0.19±0.01
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01，aaa表示与模型组相比P＜0.001；b表示与BAA-835组相比P＜0.05，bb表示与BAA-835组相比P＜0.01。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼氏菌能有效防治小鼠肝癌的发生。
实施例11：嗜粘蛋白阿克曼氏菌与免疫抑制剂联用用于防治肝癌的药效试验
1.实验设计和方法：150只SPF级SD大鼠(雄性，体质量140±20g)适应性喂养3天后，分为：空白对照组(15只)和造模组(135只)，正常组大鼠腹腔注射生理盐水，造模组大鼠腹腔注射DEN(70mg/kg)，每周一次，连续注射10周，以构建肝癌模型。处死空白对照组和造模组各5只大鼠进行对比分析，肝组织病理学形态等指标显著变化，即肝癌模型构建成功。造模成功后，大鼠随机分为11组：空白对照组、模型组、阳性药组(PD-1抗体，BE0146，BioXcell 200μg/只)、AM06活菌组、AM02活菌组、AM06灭活菌组、AM02灭活菌组、AM06活菌联用PD-1抗体、AM02活菌联用PD-1抗体、AM06灭活菌联用PD-1和AM02灭活菌联用PD-1抗体，每组10只。其中，AM06、AM02和ATCC BAA-835各组菌液浓度均为1010CFU/mL/只，PD-1抗体(BE0146，BioXcell)浓度为200μg/只，每日一次，共给药4周。
给药结束后，腹腔注射3％戊巴比妥进行麻醉，腹主动脉采血，测定肿瘤重量，计算肿瘤抑制率＝(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100％，ELISA法检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量。
1.实验结果
(1)瘤体肿瘤和肿瘤抑制率
如下表21所示，模型组大鼠肿瘤重量明显高于各给药组，不同给药组均能抑制大鼠肿瘤生长，其中AKK(活菌、灭活菌)与PD-1抗体联合用药方式对瘤体的抑制程度显著优于各AKK单用组和阳性药组，并且肿瘤抑制率要明显优于AKK菌株单用组和阳性药物单用组的两组之和，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用；且AM06和AM02组的小鼠肿瘤大小明显小于BAA-835组，即：AM06与PD-1抗体联用组≈AM02与PD-1抗体联用组＞AM06组≈AM02组≈阳性药组＞BAA-835组。
表21、大鼠肿瘤重量和抑制率(mean±SD，n＝10)
组别 瘤体重量(g) 肿瘤抑制率(％)
空白组 0 0
模型组 1.86±0.23b /
阳性药组 1.64±0.16aab 11.83±3.66
AM06活菌 1.52±0.21aab 18.28±4.05
AM02活菌 1.55±0.17aab 16.67±3.21
AM06灭活菌 1.58±0.16aab 15.05±4.93
AM02灭活菌 1.56±0.23aab 16.13±3.65
AM06活菌+PD-1抗体 1.12±0.27*aaabb 49.78±5.14
AM02活菌+PD-1抗体 1.25±0.12aaabb 42.80±4.35
AM06灭活菌+PD-1抗体 1.27±0.35aaabb 41.72±5.69
AM02灭活菌+PD-1抗体 1.35±0.25aaabb 37.42±5.31
BAA-835 1.78±0.17a 4.30±4.58
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01，aaa表示与模型组相比P＜0.001；b表示与BAA-835组相比P＜0.05，bb表示与BAA-835组相比P＜0.01。
(2)血清TNF-α、IL-1β含量
细胞程序性坏死是一种炎症相关的程序性死亡，由TNF-α下游的信号通路介导，使得炎症加剧、细胞死亡，进而促进癌细胞转移。IL-1β在癌症发生的晚期具有重要作用，可以在肿瘤微环境中产生，并通过与血管生成因子的细胞信号传导相互作用驱动血管生成，实现肿瘤转移扩散。
如下表22所示，空白组和各给药组大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量明显低于模型组，即AKK菌与PD-1抗体联用，能够有效抑制肿瘤细胞转移，其中AKK联用组的改善效果明显优于AKK单用组和阳性药组，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用；阳性药组、AM06和AM02组改善效果明显优于BAA-835组。
表22、大鼠血清TNF-α、IL-1β含量(mean±SD，n＝10)
组别 TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL)
空白组 10.16±1.02aaabb 23.64±2.34aaabbb
模型组 15.34±0.93b 51.35±3.65b
阳性药组 12.86±2.33aab 39.64±2.52aab
AM06活菌 12.93±1.35aab 40.25±2.64aab
AM02活菌 13.35±1.82aab 40.46±4.68aab
AM06灭活菌 13.02±1.64aab 41.88±3.41aab
AM02灭活菌 13.46±2.06aab 42.59±3.64aab
AM06活菌+PD-1抗体 10.25±2.66aaabb 32.51±2.88aaabb
AM02活菌+PD-1抗体 11.03±1.25aaabb 35.14±1.62aaabb
AM06灭活菌+PD-1抗体 10.31±1.94aaabb 33.01±2.68aaabb
AM02灭活菌+PD-1抗体 10.35±1.61aaabb 35.95±3.91aaabb
BAA-835 14.50±0.17a 47.35±4.58a
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01，aaa表示与模型组相比P＜0.001；b表示与BAA-835组相比P＜0.05，bb表示与BAA-835组相比P＜0.01，bbb表示与BAA-835组相比P＜0.001。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼氏菌与PD-1抗体联用能有效改善大鼠肝癌。
实施例12：嗜粘蛋白阿克曼氏菌用于防治胰腺癌的药效试验
1.实验设计和方法：
(1)细胞培养：人胰腺癌细胞SW1990用含10％的灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃、5％CO2条件下培养，传代培养，使用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化液消化细胞并制成4×106个/mL单细胞悬液。
(2)胰腺癌裸鼠荷瘤模型的建立及实验分组：130只4～6周龄健康BALB/c雌性裸鼠(体重18～20g)，分为空白组(10只)和造模组(120只)，其中造模组小鼠于背腹侧接种(1)中所制备SW1990细胞混悬液(1mL/只)，接种一周后查看肿瘤情况，有肿瘤生长则表明造模成功。肿瘤接种成功第2周起，将荷瘤小鼠随机分为9组：模型组、阳性药组(PD-1抗体，BE0146，BioXcell200μg/只)、AM06活菌组、AM02活菌组、AM06灭活菌组、AM02灭活菌组、AM06上清液组、AM02上清液组、ATCC BAA-835活菌组，每组10只，AM06、AM02和ATCC BAA-835各组菌液浓度均为1010CFU/mL/只，PD-1抗体(BE0146，BioXcell)浓度为200μg/只。各给药组每天给药1次，连续给药2周。嗜粘蛋白阿克曼氏菌采用实施例一中所述方法制得，嗜粘蛋白阿克曼氏菌上清液采用实施例9(1)中所述方法制得。
2周给药结束后颈椎脱臼处死模型，取下肿瘤组织称重记录，计算肿瘤抑制率＝(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100％，Real-time PCR检测Bcl-2、Bax和Caspase-3mRNA的表达。
2.实验结果
(1)瘤体重量和抑瘤率
如下表23所示，与模型组相比，各给药组小鼠实体瘤肿瘤重量明显降低，其中阳性药组、AM06及AM02活菌及灭活菌均具有显著性差异，且上述给药组中小鼠肿瘤重量显著低于BAA-835组，即不同给药方式对肝癌瘤体抑制率程度主要表现为：阳性药组≈AM06＞AM02＞BAA-835。
表23、嗜粘蛋白阿克曼氏菌对胰腺癌小鼠实体瘤的影响(mean±SD，n＝10)
Figure SMS_29
Figure SMS_30
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01；b表示与BAA-835组相比P＜0.05。
(2)肿瘤组织Bcl-2、Bax和Caspase-3mRNA表达
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3作为关键的执行分子，在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能，它的水平间接反映了细胞的凋亡水平；在线粒体凋亡通路中，Bcl-2家族蛋白质调控线粒体中促凋亡因子的释放，在细胞凋亡与存活中起着重要的作用，Bax是与Bcl-2同源的水溶性相关蛋白，是Bcl-2基因家族中细胞凋亡的促进基因，其过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于死亡，与Bcl-2一起用于肿瘤的研究。
将取下的肿瘤组织研磨提取RNA，Real-time PCR法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3mRNA的CT值，使用2-ΔΔCT法(Livak)计算Bcl-2、Bax和Caspase-3mRNA的表达量，所得结果如下表24所示。与模型组相比，各给药组和空白组Bal-2表达量显著下调，Bax和Caspase-3mRNA表达量明显上调，其中阳性药组、AM06和AM02组对细胞凋亡相关基因的调控能力显著优于BAA-835组。即AKK菌能够有效调控细胞凋亡，不同给药组对其调控能力为：阳性药组≈AM06＞AM02＞BAA-835。
表24、嗜粘蛋白阿克曼氏菌对Bcl-2、Bax和Caspase-3mRNA表达的影响(n＝10)
组别 Bcl-2(2-ΔΔCT) Bax(2-ΔΔCT) Caspase-3(2-ΔΔCT)
空白组 0.38±0.04aabb 3.58±0.36aabb 3.66±0.52aabb
模型组 1.00±0.08 1.00±0.01b 1.00±0.22b
阳性药组 0.42±0.04ab 3.83±0.26aabb 3.41±0.51aabb
AM06活菌 0.45±0.02ab 3.61±0.18aabb 3.86±0.35aabb
AM02活菌 0.57±0.03ab 3.09±0.35aabb 3.27±0.44aabb
AM06灭活菌 0.52±0.06ab 3.52±0.29aabb 3.75±0.38aabb
AM02灭活菌 0.63±0.08ab 2.98±0.26aabb 3.01±0.24aabb
AM06上清液 0.58±0.06ab 3.31±0.34aabb 3.46±0.36aabb
AM02上清液 0.61±0.04ab 2.83±0.28aabb 2.86±0.27aabb
BAA-835 0.82±0.10 1.46±0.16a 1.63±0.32a
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01；b表示与BAA-835组相比P＜0.05，bb表示与BAA-835组相比P＜0.01。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼氏菌能够通过调控细胞凋亡，有效防治小鼠胰腺癌的发生。
实施例13：嗜粘蛋白阿克曼氏菌与免疫抑制剂联用用于防治胰腺癌的药效试验
1.实验设计和方法
(1)细胞培养：细胞株BxPC-3用RPMI1640培养液(含10％胎牛血清、2.0mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素及100mg/L链霉素)在37℃、5％CO2条件下培养，制成浓度为1.0×106个/mL单细胞悬液。
(2)胰腺癌小鼠模型构建：Balb/cnu/nu裸鼠130只(鼠龄4～6周，雄∶雌比为3:1，体重18～22g)，SPF条件下饲养，随机分为：空白对照组(10只)和造模组(120只)。无菌条件下取0.5mL BxPC-3细胞悬液，接种于造模组裸鼠肩胛背部皮下，待肿瘤长大直径达到0.8cm左右(2～3个月)则视为移植瘤模型建立成功，正常组裸鼠注射生理盐水。造模成功后裸鼠随机分为11组：空白对照组、模型组、阳性药组(PD-1抗体，BE0146，BioXcell 200μg/只)、AM06活菌组、AM02活菌组、AM06灭活菌组、AM02灭活菌组、AM06活菌联用PD-1抗体、AM02活菌联用PD-1抗体、AM06灭活菌联用PD-1和AM02灭活菌联用PD-1抗体，每组10只。其中，AM06、AM02和ATCC BAA-835各组菌液浓度均为1010CFU/mL/只，PD-1抗体(BE0146，BioXcell)浓度为200μg/只，隔日一次，共给药8周。
给药结束后，处死裸鼠，取出肿瘤称重，计算肿瘤抑制率＝(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100％，RT-PCR法检测Bcl-2、NF-κB(p65)和cyclinD1 mRNA表达。
2.实验结果
(1)瘤体重量和肿瘤抑制率：如下表25所示，与模型组相比，各给药组小鼠实体瘤肿瘤重量明显降低，即各AKK菌株及与PD-1抗体联用能够有效抑制肿瘤生长，且联用组抑制效果显著优于各AKK菌单用组和阳性药组；AKK(活菌、灭活菌)与PD-1抗体联合用药方式对瘤体的抑制程度显著优于各AKK单用组和阳性药组，并且肿瘤抑制率要明显优于各AKK菌株单用组和阳性药物单用组的两组之和，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用；不同给药方式对肝癌瘤体抑制率程度主要表现为：AM06与PD-1抗体联用组≈AM02与PD-1抗体联用组＞AM06组≈AM02组＞阳性药组。
表25、胰腺癌小鼠实体瘤及肿瘤抑制率(mean±SD，n＝10)
组别 瘤体重量(g) 肿瘤抑制率(％)
空白组 0 /
模型组 1.43±0.33b /
阳性药组 1.24±0.26a 13.29±2.15
AM06活菌 1.27±0.24aab 11.19±1.17
AM02活菌 1.30±0.15aab 9.09±2.34
AM06灭活菌 1.28±0.32aab 10.49±2.84
AM02灭活菌 1.24±0.28aab 13.29±3.68
AM06活菌+PD-1抗体 0.96±0.10aaabb 45.87±4.32
AM02活菌+PD-1抗体 0.93±0.17aaabb 44.97±3.49
AM06灭活菌+PD-1抗体 1.00±0.15aaabb 40.07±3.46
AM02灭活菌+PD-1抗体 1.04±0.13aaabb 37.27±2.97
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01，aaa表示与模型组相比P＜0.001；b表示与阳性药组相比P＜0.05，bb表示与阳性药组相比P＜0.01。
(2)Bcl-2、NF-κB(p65)和cyclinD1 mRNA表达量
NF-κB直接作用于细胞周期或调节影响细胞增殖、凋亡、炎症反应、血管生长及相关MDR基因而导致癌症发生；原癌基因cyclin D1作为NF-κB转录靶基因是一种限制调控G1/S期转换最重要的正性调控基因其过度表达和错误调控均可导致细胞周期调控异常，从而促进肿瘤发生。
采集荷瘤小鼠肿瘤组织，RT-PCR法检测Bcl-2、NF-κB(p65)和cyclinD1 Ct值，并计算表达量。结果如下表26所示，空白对照组及给药组小鼠肿瘤组织中Bcl-2、NF-κB(p65)和cyclinD1的mRNA表达量显著低于模型组，AKK菌联合组小鼠肿瘤组织中Bcl-2、NF-κB(p65)和cyclinD1的mRNA表达量显著低于AKK单用组。不同给药方式对细胞凋亡相关基因调控能力主要表现为：AM06与PD-1抗体联用组≈AM02与PD-1抗体联用组＞AM06组≈AM02组＞阳性药组。
表26、Bcl-2、NF-κB(p65)和cyclinD1 mRNA表达量(n＝10)
组别 Bcl-2 NF-κB(p65) cyclinD1
空白组 0.36±0.02aaabb 0.22±0.01aaabbb 0.33±0.02aaabb
模型组 1.00±0.05b 1.00±0.03b 1.00±0.02b
阳性药组 0.72±0.02a 0.61±0.02a 0.76±0.03a
AM06活菌 0.56±0.03aab 0.44±0.01aab 0.51±0.01aab
AM02活菌 0.62±0.01aab 0.51±0.02aab 0.62±0.02aab
AM06灭活菌 0.54±0.02aab 0.46±0.02aab 0.52±0.02aab
AM02灭活菌 0.65±0.01aab 0.56±0.03aab 0.65±0.02aab
AM06活菌+PD-1抗体 0.39±0.03aaabb 0.28±0.01aaabb 0.36±0.02aaabb
AM02活菌+PD-1抗体 0.49±0.02aaabb 0.35±0.01aaabb 0.45±0.02aaabb
AM06灭活菌+PD-1抗体 0.41±0.02aaabb 0.30±0.01aaabb 0.40±0.01aaabb
AM02灭活菌+PD-1抗体 0.50±0.03aaabb 0.39±0.02aaabb 0.48±0.02aaabb
注：a表示与模型组相比P＜0.05，aa表示与模型组相比P＜0.01，aaa表示与模型组相比P＜0.001；b表示与阳性药组相比P＜0.05，bb表示与阳性药组相比P＜0.01，bbb表示与阳性药组相比P＜0.001。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼氏菌与PD-1抗体联用能有效抑制胰腺癌，具有协同效果。
实施例14：嗜粘蛋白阿克曼氏菌防治结直肠癌中的应用的药效试验
一、实验设计：为了验证实施例1提供的嗜粘蛋白阿克曼氏菌对结直肠癌的治疗作用。将C57BL/6小鼠随机分为2大组，即：空白对照组(10只)和造模组(80只)。实验第1天给予造模组小鼠腹腔注射10mg/kg的AOM，5天后，给予造模组小鼠自由饮用3％右旋葡聚糖苷钠(DSS)，连续饮用6天。然后造模组小鼠休息2周后，再次给予3％DSS饮水，连续自由饮用6天后休息2周。然后再给予1.5％SDD饮水，连续自由饮用6天，结束后根据体重将造模组小鼠随机分为7组，即：模型组(生理盐水，1mL/只，灌胃)、奥沙利铂组(10mg/kg/次,腹腔注射)、BAA-835活菌组(109CFU/只，灌胃)、AM02活菌组(109CFU/只，灌胃)、AM06活菌组(109CFU/只，灌胃)，AM06灭活菌组(109个/只，灌胃)，AM06裂解液组(0.5mL/只，灌胃)每组10只。分组当日开给予相应受试物，除了奥沙利铂组每周给药2次外，其余组别每天给予相应受试物1次，持续给予6周。
二、评判标准：给药结束后，乙醚麻醉小鼠。剪开小鼠腹腔，在冰浴中从肛门向上截取结肠8cm，用生理盐水冲洗后，滤纸吸干，称体质量。记录结直肠肿瘤数目，测量并计算所有肿瘤的总体积。
所有数据均以平均值±标准差表示，应用IBM Watson公司开发的SPSSStatistics 17.0软件(统计产品与服务解决方案)进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计意义。
三、结果与分析：各组动物的结直肠瘤块数量和总体积如下表27所示，可见所有的嗜粘蛋白阿克曼氏菌(BAA-835、AM02和AM06)均可显著降低瘤块数量和总体积(P＜0.05或P＜0.01)，且AM02活菌组和AM06活菌组的瘤块数量和总体积均显著低于BAA-835活菌组(P＜0.05)。且不论受试物的形态是活菌、灭活菌、裂解液，均可显著降低瘤块数量和总体积(P＜0.05或P＜0.01)。
表27、结肠肿瘤数目和总体积
组别 肿瘤数目(个) 总肿瘤体积(mm3)
空白对照组 0 0
模型组 17.4±2.3 21.3±2.2
奥沙利铂组 4.8±2.8 6.6±2.4
BAA-835活菌组 14.2±1.7 18.3±3.1
AM02活菌组 11.3±1.6ab 13.9±1.9ab
AM06活菌组 10.8±2.2a 12.2±3.2a
AM06灭活菌组 12.3±2.4 12.9±2.6
AM06裂解液组 11.8±1.9 11.7±2.5
注：与模型组相比，a表示P＜0.05，与BAA-835组相比，b表示P＜0.05。
由以上实施例的结果可见，嗜粘蛋白阿克曼氏菌可抑制动物的结直肠癌肿瘤的生长，且不同菌株之中AM02和AM06的抗肿瘤作用菌显著强于标准株BAA-835。
实施例15：嗜粘蛋白阿克曼氏菌联合CTLA-4抗体防治结直肠癌中的药效试验
为了验证上述实施例提供的嗜粘蛋白阿克曼氏菌联合CTLA-4抗体对结直肠癌的治疗作用。本实施例选用BALB/c裸鼠进行实验，并采用移植瘤模型的方法建立小鼠结直肠癌模型。取对数生长期的结直肠癌细胞CT-26，用PBS调整细胞数为1-5×107cell/mL，对小鼠皮下接种细胞悬液0.2mL，待移植瘤生长达100mm3以上后，选择肿瘤生长大小均匀的动物，随机分为模型组、CTLA-4抗体组、BAA-835活菌组、AM02活菌组、AM06活菌组、BAA-835活菌+CTLA-4抗体组、AM02活菌+CTLA-4抗体组、AM06活菌+CTLA-4抗体组，每组10只。分组后开始给予受试物，共给药25天，详细给药方式如下表28所示。
表28、给药方案
Figure SMS_31
Figure SMS_32
二、评判标准：用游标卡尺测量皮下移植瘤长径a(mm)与短径b(mm)，并根据公式v＝0.5*a*b2计算瘤体的体积。同时按照以下公式计算抑肿率：肿瘤抑制率(TGI，％)＝[1-(药物处理组day1瘤体体积—药物处理组day25瘤体体积)/(模型组day1瘤体体积—模型组day25瘤体体积)]*100％。
所有数据均以平均值±标准差表示，应用IBM Watson公司开发的SPSSStatistics 17.0软件(统计产品与服务解决方案)进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计意义。
三、结果与分析
给药结束后各组荷瘤裸鼠的瘤块体积如下表29所示，可见CTLA-4抗体单独给药或任意一种嗜粘蛋白阿克曼氏菌单独给药或CTLA-4抗体与任意一种嗜粘蛋白阿克曼氏菌联合给药可显著降低瘤块体积(P＜0.05或P＜0.01)。CTLA-4抗体与任意一种嗜粘蛋白阿克曼氏菌联合给药，均显著优于CTLA-4抗体单独给药或同种嗜粘蛋白阿克曼氏菌单独给药(P＜0.01)，且同等剂量水平下AM02活菌或AM06活菌与CTLA-4抗体联用后瘤块体积均显著小于BAA-835活菌与CTLA-4抗体联用(P＜0.05或P＜0.01)；并且联合给药的肿瘤抑制率要明显优于对应的菌株单用组和CTLA-4抗体单用组的两组之和，体现出菌株与CTLA-4抗体联用具有明显的协同作用。
表29、肿瘤体积和抑瘤率
组别 肿瘤体积(mm3) 肿瘤抑制率(％)
模型组 766.3±26.4 /
CTLA-4抗体组 514.4±32.7aa 36.4±3.2
BAA-835活菌组 695.2±21.3a 11.2±1.8
AM02活菌组 675.5±18.2a 13.6±3.2
AM06活菌组 662.3±21.3a 15.8±2.7
BAA-835活菌+CTLA-4抗体组 432.9±17.9aabbaabbcc 48.1±2.6bcc
AM02活菌+CTLA-4抗体组 392.4±21.7aabbbcaabbcccd 59.3±4.1bbccd
AM06活菌+CTLA-4抗体组 367.8±1.9aabbccaabbccdd 64.2±3.5bbccdd
注：与模型组相比，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01；与CTLA-4抗体组相比，b表示P＜0.05，bb表示P＜0.01；与同种嗜粘蛋白阿克曼氏菌组相比，c表示P＜0.05，cc表示P＜0.01，ccc表示P＜0.001；与BAA-835活菌+CTLA-4抗体组相比，d表示P＜0.05，dd表示P＜0.01。
上述数据说明嗜粘蛋白阿克曼氏菌与CTLA-4抗体联合给药对结直肠癌的抑制作用明显优于CTLA-4抗体或嗜粘蛋白阿克曼氏菌单独使用，且菌株AM02或AM06与CTLA-4抗体联合给药对结直肠癌的抑制作用均优于CTLA-4抗体与BAA-835联用。
实施例16：嗜粘蛋白阿克曼氏菌联合PD-1抗体防治胃癌中的药效试验
一、实验设计
为了验证嗜粘蛋白阿克曼氏菌联合PD-1抗体对胃癌的治疗作用。本实施例选用BALB/c裸鼠进行实验，并采用移植瘤模型的方法建立小鼠胃癌模型。取对数生长期的人胃癌细胞MKN-45，用PBS调整细胞数为1-5×107cell/mL，对小鼠皮下接种细胞悬液0.2mL，待移植瘤生长达100mm3以上后，选择肿瘤生长大小均匀的动物，随机分为模型组、PD-1抗体组、BAA-835活菌组、AM02活菌组、AM06活菌组、BAA-835活菌+PD-1抗体组、AM02活菌+PD-1抗体组、AM06活菌+PD-1抗体组，每组10只。并以分组当日作为day1，按下表30进行给药，共给药24天。
表30、给药方案
Figure SMS_33
二、评判标准：用游标卡尺测量皮下移植瘤长径a(mm)与短径b(mm)，并根据公式v＝0.5*a*b2计算瘤体的体积。同时按照以下公式计算抑肿率：肿瘤抑制率(TGI，％)＝[1-(药物处理组day1瘤体体积—药物处理组day25瘤体体积)/(模型组day1瘤体体积—模型组day25瘤体体积)]*100％。
所有数据均以平均值±标准差表示，应用IBM Watson公司开发的SPSSStatistics 17.0软件(统计产品与服务解决方案)进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计意义。
三、结果与分析：给药结束后各组荷瘤裸鼠的瘤块体积如下表31所示，可见PD-1抗体单独给药或任意一种嗜粘蛋白阿克曼氏菌单独给药或PD-1抗体与任意一种嗜粘蛋白阿克曼氏菌联合给药可显著降低瘤块体积(P＜0.05或P＜0.01)。PD-1抗体与任意一种嗜粘蛋白阿克曼氏菌联合给药均显著优于PD-1抗体单独给药或同种嗜粘蛋白阿克曼氏菌单独给药(P＜0.01)，且同等剂量水平下AM02活菌或AM06活菌与PD-1抗体联用后瘤块体积均显著小于BAA-835活菌与PD-1抗体联用(P＜0.05或P＜0.01)；并且联合给药组的肿瘤抑制率要明显优于对应菌株单用组和PD-1抗体单用组的两组之和，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用。
表31、肿瘤体积和抑瘤率
组别 肿瘤体积(mm3) 肿瘤抑制率(％)
模型组 732.3±23.2 /
PD-1抗体组 495.4±27.3aa 37.4±4.2
BAA-835活菌组 672.2±23.4a 10.1±2.8
AM02活菌组 654.1±21.6a 12.8±1.6
AM06活菌组 642.6±19.8a 14.5±2.4
BAA-835活菌+PD-1抗体组 412.9±25.9aabbcc 49.1±3.6bcc
AM02活菌+PD-1抗体组 372.4±18.7aabbccd 59.7±3.8bbccdd
AM06活菌+PD-1抗体组 345.2±21.4aabbccdd 65.1±2.7bbccdd
注：与模型组相比，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01；与PD-1抗体组相比，b表示P＜0.05，bb表示P＜0.01；与同种嗜粘蛋白阿克曼氏菌组相比，c表示P＜0.05，cc表示P＜0.01；与BAA-835活菌+PD-1抗体组相比，d表示P＜0.05，dd表示P＜0.01。
上述数据说明嗜粘蛋白阿克曼氏菌与PD-1抗体联合给药对胃癌的抑制作用明显优于PD-1抗体或嗜粘蛋白阿克曼氏菌单独使用，且菌株AM02或AM06与PD-1抗体联合给药对胃癌的抑制作用均优于PD-1抗体与BAA-835联用。
实施例17：嗜黏蛋白阿克曼氏菌在体外通过巨噬细胞促进小鼠肺癌细胞系Lewis细胞株凋亡的药效实验
1、实验材料及分组：本实施例通过向小鼠巨噬细胞系RAW264.7加入低、中、高剂量的AM02与AM06活菌液，AM02与AM06灭活菌液进行孵育，使用Transwell共培养小室(Corning，3412)与Lewis细胞共培养，在24h收取细胞采用流式细胞仪(Beckman Coulter)检测肿瘤细胞凋亡情况。以PBS作为对照。上述AM02活菌液、AM06活菌液、AM02灭活菌液、AM06灭活菌液、ATCC BAA-835活菌液均由实施例2方法制备。
2、培养方法
(1)小鼠Lewis细胞和RAW264.7细胞的复苏和传代
小鼠肺癌细胞Lewis细胞和RAW264.7细胞均生长于含10％ FBS的DMEM培养基中(完全培养基)，加入1％青霉素/链霉素，在37℃温度下，5％ CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每两天更换一次培养基。a)液氮中取出细胞株，在37℃恒温水浴锅中迅速融化。无菌条件下打开冻存管，转移液体至15mL的离心管中，用完全培养基2-3mL重悬细胞，1000rpm，离心5min。弃上清后，加入完全培养基5mL，将细胞接种于培养瓶，37℃温度下，5％ CO2浓度的培养箱培养48h。b)弃去原培养液，加入1mL 0.25％胰蛋白酶，消化5min，加入3mL完全培养基终止反应，并移至15mL离心管中，1000rpm离心5分钟；弃上清液，加入适宜的完全培养基，将细胞分接于培养瓶，37℃温度下，5％ CO2浓度的培养箱培养24h。
3、阿克曼氏菌通过RAW264.7巨噬细胞对Lewis细胞凋亡的影响
(1)将500μL的RAW264.7细胞(105)分别接种于6孔Transwell板下室中，分别加入100μL108、109、1010CFU/mL的AM02活菌液、灭活菌液(1010cell/mL)及100μL 108、109、1010CFU/mL的AM06活菌液、灭活菌液(1010cell/mL)，以及100μL 1010CFU/mL的ATCC BAA-835活菌液，进行预处理6h，随后分别加入接种Lewis细胞的上室。设置仅加入等量RAW264.7细胞的孔作为阴性对照，加入等量肿瘤细胞和顺氯氨铂(DDP)(15μM)(齐鲁制药有限公司，下同)的孔作为阳性对照组，每组复孔3个。于37℃温度，5％CO2培养箱培养。
(2)使用Annexin V凋亡检测试剂盒(诺唯赞，A211-01)在24h收集检测Lewis细胞的凋亡情况：a)用不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，1000rpm、4℃离心5min，弃上清。b)洗涤细胞：用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在1000rpm、4℃离心5min，弃上清。c)细胞重悬：加入100μL的1×Binding Buffer，轻轻吹匀至单细胞悬液。d)细胞染色：加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI Staining Solution，轻轻吹匀；避光、室温(20～25℃)孵育10min；加入400μL的1×Binding Buffer，轻轻混匀。染色后样品在1h内用流式细胞仪检测。e)细胞凋亡情况：计算Annexin V-FITC单阳性(Annexin V-FITC﹢/PI﹣)的早期凋亡细胞和Annexin V-FITC和PI双阳性(Annexin V-FITC﹢/PI﹢)的晚期凋亡细胞比例之和。
4、实验结果
表32、阿克曼氏菌对Lewis细胞凋亡的结果(
Figure SMS_34
n＝3)/>
组别 凋亡率(％)
阴性对照 2.58±0.63
阳性对照 34.73±3.57aabb
AM02低剂量 18.14±2.08aabb
AM02中剂量 22.32±4.88aabb
AM02高剂量 25.46±3.00aabb
AM02灭活菌 21.45±2.54aabb
AM06低剂量 17.64±2.07aabb
AM06中剂量 23.08±6.39aabb
AM06高剂量 27.22±5.90aabb
AM06灭活菌 22.57±5.93aabb
ATCC BAA-835 3.29±0.33
注：aa表示与阴性对照比较，P<0.01。bb表示与ATCC BAA-835比较P<0.01。
与阴性对照组(只加RAW264.7细胞)比较，阳性对照、阿克曼氏菌AM02活菌液及灭活菌液、阿克曼氏菌AM06活菌液及灭活菌液均能促进Lewis细胞凋亡，且具有统计学差异。与标准菌株ATCC BAA-835比较，阿克曼氏菌AM02活菌液及灭活菌液、阿克曼氏菌AM06活菌液及灭活菌液均促进了Lewis细胞的凋亡。结果表明，阿克曼氏菌AM02和AM06均能促进肺癌细胞的凋亡，效果明显优于标准株ATCC BAA-835。
因此阿克曼氏菌能通过RAW264.7细胞促进肺癌细胞的凋亡，提示其具有治疗肺癌的作用，效果明显优于标准株ATCC BAA-835。
实施例18：嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗小鼠非小细胞肺癌的药效试验
将处于对数生长期的小鼠肺癌细胞系Lewis细胞调整细胞浓度至2×104个/mL的单细胞悬液，无菌条件下用注射器以0.2mL/只的量将Lewis细胞接种于SPF级C57BL/6小鼠右腋窝皮下，制备Lewis肺癌瘤源小鼠。第11天复种一次，第21天正式实验时，选取生长良好的Lewis肺癌组织，无菌条件下，脱颈椎处死，从腋下剥取瘤体组织，剪碎、匀浆、研磨，按肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1：3比例制成浓度为1×107个/mL的瘤细胞悬液。Lewis肺癌瘤源小鼠细胞悬液以每只0.2mL左右接种于小鼠右前肢腋窝皮下进行造模。造模后一周开始给药，AM02低剂量组(107CFU/只)、AM02中剂量组(108CFU/只)、AM02高剂量组(109CFU/只)、AM02灭活菌组(109个/只)、AM06低剂量组(107CFU/只)、AM06中剂量组(108CFU/只)、AM06高剂量组(109CFU/只)、AM06灭活菌组(109个/只)、ATCC BAA-835活菌组(109CFU/只)、ATCCBAA-835灭活菌组(109个/只)连续灌胃3周；DDP(顺铂，山东齐鲁制药有限公司)组每周腹腔注射1次，连续注射3周。当实验结束或荷瘤鼠出现明显的消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征时，脱颈椎处死，取移植肿瘤测定其重量并计算抑瘤率，取血清至于-80℃冰箱中冻存，用于检测细胞因子等。
一、Lewis细胞培养：Lewis细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养温度为37℃，气体环境为5％ CO2，湿度为饱和湿度；根据细胞生长的速度及培养液的颜色变化更换培养液，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。根据细胞生长情况，将对数生长期的细胞制备成单细胞悬液，将细胞浓度调整至2×104个/mL。
二、Lewis肺癌瘤源小鼠的制备：取6～8周龄，体质量约(20±2)g，SPF级C57BL/6小鼠10只，将处于对数生长期的小鼠肺癌细胞系Lewis细胞调整细胞浓度至2×104个/mL的单细胞悬液，无菌条件下用注射器以0.2mL/只的量将Lewis细胞接种于小鼠右腋窝皮下，当皮下移植瘤长至直径约1cm左右时剥取移植瘤。
三、肺癌移植瘤模型的建立：选取生长良好的Lewis肺癌组织，无菌条件下，脱颈椎处死，从腋下剥取瘤体组织，剪碎、匀浆、研磨，按肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1：3比例制成浓度为1×106个/mL的瘤细胞悬液。在无菌条件下，将上述制备的细胞悬液，以每只0.2mL左右接种于小鼠右前肢腋窝皮下。
四、分组及给药：移植瘤模型建立1周后，将120只小鼠随机分为12组，每组10只：生理盐水组、DDP组、AM02低剂量组(107CFU/只)、AM02中剂量组(108CFU/只)、AM02高剂量组(109CFU/只)、AM02灭活菌组(109个/只)、AM06低剂量组(107CFU/只)、AM06中剂量组(108CFU/只)、AM06高剂量组(109CFU/只)、AM06灭活菌组(109个/只)、ATCC BAA-835活菌组(109CFU/只)、ATCC BAA-835灭活菌组(109个/只)。生理盐水组：0.2mL/只，每天1次，连续灌胃3周；DDP组：按照0.3mL/次、3mg/kg的量进行腹腔注射，每周1次，连续注射3周；AM02、AM06及ATCC BAA-835相关组剂量组：按照0.2mL/只，每天1次，连续灌胃3周。
五、检测指标及方法
(1)肿瘤重量及抑瘤率：给药过程中如有小鼠出现明显的消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征，及给药结束后，脱颈椎处死，取移植肿瘤测其重量并计算抑瘤率，抑瘤率计算公式：抑瘤率(％)＝(生理盐水组平均瘤重-给药组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100；
(2)细胞因子检测：采用Elisa检测肺癌移植瘤小鼠血清中IL-2(R&D Systems，M2000，下同)、IL-6(R&D Systems，M6000B，下同)和IFN-γ(R&D Systems，MIF00，下同)等细胞因子的水平。
六、实验结果
(1)肿瘤重量及抑瘤率
表33、AM02及AM06对肿瘤小鼠的抑瘤药效(n＝10)
Figure SMS_35
Figure SMS_36
a:平均值±SD。b:抑瘤率％＝100％×(生理盐水组肿瘤平均重量-给药组肿瘤重量)/生理盐水组肿瘤平均重量。c:两组间p值按照t-test(two-tailed)方法计算。d：AM02、AM06活菌与ATCC BAA-835活菌组比较，AM02、AM06灭活菌与ATCC BAA-835灭活菌组比较。
各组的肿瘤重量及抑瘤率如上表33所示，与生理盐水组比较，DDP组、AM02与AM06各组、ATCCBAA-835各组均有统计学差异。与DDP组比较，AM02低剂量组、ATCC BAA-835活菌组及灭活菌组有统计学意义，AM02与AM06其余各组均无统计学意义，说明AM02及AM06可以抑制肿瘤的生长，抑制效果与阳性药相似。与ATCC BAA-835活菌组比较，同剂量的AM02及AM06活菌组均有统计学差异；与ATCC BAA-835灭活菌组比较，同剂量的AM02及AM06灭活菌组均有统计学差异。结果说明AM02及AM06可以抑制肿瘤的生长，抑制效果与阳性药相似，显著优于标准株ATCC BAA-835。
(2)细胞因子检测结果
表34、细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ检测结果(
Figure SMS_37
n＝10)
Figure SMS_38
注：aa表示与生理盐水组比较P<0.01；aaa表示与生理盐水组比较P<0.001；bbb表示与ATCC BAA-835活菌组比较P<0.001；ccc表示与ATCC BAA-835灭活菌组比较P<0.001。
IL-2主要由T细胞产生，具有活化T细胞，刺激NK细胞增殖，促进B细胞增殖和抗体分泌的作用。IL-6则是与肿瘤治疗密切相关的细胞因子，有研究表明，IL-6会削弱肿瘤特异性T细胞分化，促进肿瘤细胞存活，而通过抑制IL-6可以阻断肿瘤的生长。IFN-γ主要由巨噬细胞生成，具有增强巨噬细胞抗肿瘤活性的功能。
由上表34可知，DDP组、AM02与AM06各组(活菌与灭活菌)及ATCC BAA-835活菌组均能促进肿瘤小鼠血清中IL-2的含量，与生理盐水组比较有显著性差异。与生理盐水组比较，AM02与AM06各组(活菌与灭活菌)及ATCC BAA-835活菌组均能降低肿瘤小鼠血清中IL-6的含量，与生理盐水组比较有显著性差异。与生理盐水组比较，AM02与AM06各组(活菌与灭活菌)及ATCC BAA-835(活菌与灭活菌)均能促进肿瘤小鼠血清中IFN-γ的含量，与生理盐水组比较有显著性差异。说明阿克曼氏菌上调了肿瘤小鼠血清中抑肿瘤因子IL-2、IFN-γ的水平，下调了IL-6的水平。与ATCC BAA-835活菌组比较，同等剂量的AM02、AM06活菌均能显著上调IL-2、INF-γ的表达，下调IL-6的表达；与ATCC BAA-835灭活菌组比较，同等剂量的AM02、AM06灭活菌均能显著上调IL-2、INF-γ的表达，下调IL-6的表达。
综上所述，阿克曼氏菌AM02及AM06能够调节肿瘤相关免疫因子水平，有效治疗小鼠非小细胞肺癌移植瘤，且效果明显优于标准株ATCC BAA-835。
实施例19：嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗小鼠小细胞肺癌的药效试验
将处于对数生长期的人肺癌NCI-H446细胞调整细胞浓度至3×107个/mL的单细胞悬液，无菌条件下用注射器以0.2mL/只的量将NCI-H446细胞接种于SPF级裸鼠右肋皮下进行造模。造模待瘤体直径约为5～8mm时开始分组给药，AM02低剂量组(107CFU/只)、AM02高剂量组(109CFU/只)、AM02灭活菌低剂量组(107个/只)、AM02灭活菌高剂量组(109个/只)、AM06低剂量组(107CFU/只)、AM06高剂量组(109CFU/只)、AM06灭活菌高剂量组(107个/只)、AM06灭活菌高剂量组(109个/只)、ATCC BAA-835活菌组(109CFU/只)、ATCC BAA-835灭活菌组(109个/只)连续灌胃3周；DDP(顺铂，山东齐鲁制药有限公司)组每周腹腔注射1次，连续注射3周。当实验结束或荷瘤鼠出现明显的消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征时，脱颈椎处死，取移植肿瘤测定其重量并计算抑瘤率，取血清至于-80℃冰箱中冻存，用于检测细胞因子等。
一、小鼠小细胞肺癌移植瘤模型建立：将人肺癌NCI-H446细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养基中,37℃、5％ CO2细胞培养箱内培养。取对数生长期的NCI-H446细胞经胰酶消化分散后,用PBS洗涤2次,2000r/min离心5min，再用PBS制备悬液，调整细胞浓度为3×l07/mL，取0.2mL(6×l06个/只)分别接种于110只裸鼠右肋皮下，SPF(Specificpathogen Free)环境下饲养，大约l周后接种原位出现肿瘤，待瘤体直径约为5～8mm时进行治疗实验。
二、实验分组与给药：待瘤体直径约为5～8mm时，选取造模成功的120只小鼠随机分为12组，每组10只：生理盐水组、DDP组(3mg/kg)、AM02低剂量组(107CFU/只)、AM02高剂量组(109CFU/只)、AM02灭活菌低剂量组(107个/只)、AM02灭活菌高剂量组(109个/只)、AM06低剂量组(107CFU/只)、AM06高剂量组(109CFU/只)、AM06灭活菌高剂量组(107个/只)、AM06灭活菌高剂量组(109个/只)、ATCC BAA-835活菌组(109CFU/只)、ATCC BAA-835灭活菌组(109个/只)。
生理盐水组：0.2mL/只，每天1次，连续灌胃3周；
DDP组：按照0.3mL/次、3mg/kg的量进行腹腔注射，每周1次，连续注射3周；
AM02、AM06及ATCC BAA-835相关组剂量组：按照0.2mL/只，每天1次，连续灌胃3周。
三、检测指标及方法：(1)肿瘤重量及抑瘤率：给药过程中如有小鼠出现明显的消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征，及给药结束后，脱颈椎处死，取移植肿瘤测其重量并计算抑瘤率，抑瘤率计算公式：抑瘤率(％)＝(生理盐水组平均瘤重-给药组瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100。(2)血清中细胞因子检测：采用Elisa检测肺癌移植瘤小鼠模型血清中IL-2(R&D Systems，M2000，下同)、IL-6(R&D Systems，M6000B，下同)和IFN-γ(R&D Systems，MIF00，下同)等细胞因子的水平。
四、实验结果
(1)肿瘤重量及抑瘤率
表35、AM02及AM06对肿瘤小鼠的抑瘤结果(n＝10)
Figure SMS_39
Figure SMS_40
a:平均值±SD。b:抑瘤率％＝100％×(生理盐水组肿瘤平均重量-给药组肿瘤重量)/生理盐水组肿瘤平均重量。c:两组间p值按照t-test(two-tailed)方法计算。d：AM02、AM06活菌与ATCC BAA-835活菌组比较，AM02、AM06灭活菌与ATCC BAA-835灭活菌组比较。
各组的肿瘤重量及抑瘤率如上表35所示，与生理盐水组比较，DDP、AM02与AM06各组、ATCC BAA-835活菌及灭活菌组均有统计学差异，抑制肿瘤的生长。与DDP组比较，AM02高剂量组、AM02灭活菌高剂量组、AM06高剂量组、AM06灭活菌高剂量组无统计学意义，AM02与AM06各低剂量组及ATCC BAA-835活菌组与灭活菌组均有统计学意义。与ATCC BAA-835活菌组比较，同剂量的AM02及AM06活菌组均有统计学差异；与ATCC BAA-835灭活菌组比较，同剂量的AM02及AM06灭活菌组均有统计学差异。结果说明AM02及AM06可以抑制肿瘤的生长，高剂量抑制效果与阳性药相似，显著优于标准株ATCC BAA-835。
(2)细胞因子检测
表36、血清中细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ检测结果(
Figure SMS_41
n＝10)
组别 IL-2(pg/mL) IL-6(pg/mL) IFN-γ(pg/mL)
生理盐水组 500.57±27.04 91.01±5.85 193.47±29.56
DDP组 662.58±46.17aaa 80.42±5.45aaa 284.60±30.14aaa
AM02低剂量组 696.42±29.10aaa 73.65±3.88aaa 313.28±26.76aaa
AM02高剂量组 731.56±35.51aaabbb 70.32±3.42aaabb 346.69±37.49aaabbb
AM02灭活菌低剂量组 676.23±52.77aaa 75.16±4.09aaa 304.45±20.57aaa
AM02灭活菌高剂量组 730.96±17.93aaaccc 72.38±4.64aaac 343.84±19.05aaaccc
AM06低剂量组 704.76±16.38aaa 74.71±3.70aaa 335.14±33.25aaa
AM06高剂量组 743.46±32.72aaabbb 68.18±4.94aaabbb 362.48±40.61aaabbb
AM06灭活菌低剂量组 695.37±35.81aaa 74.35±2.86aaa 324.48±38.86aaa
AM06灭活菌高剂量组 758.33±34.24aaaccc 69.43±5.88aaaccc 338.13±35.55aaaccc
ATCC BAA-835活菌组 619.97±17.68aaa 77.79±5.24aaa 261.12±30.80aaa
ATCC BAA-835灭活菌组 591.91±20.48aaa 81.67±5.12aa 233.44±23.26aa
注：aa表示与生理盐水组比较P<0.01，aaa表示与生理盐水组比较P<0.001；bb表示与ATCC BAA-835活菌组比较P<0.01，bbb表示与ATCC BAA-835活菌组比较P<0.001；c表示与ATCC BAA-835灭活菌组比较P<0.05，ccc表示与ATCC BAA-835灭活菌组比较P<0.001。
IL-2主要由T细胞产生，具有活化T细胞，刺激NK细胞增殖，促进B细胞增殖和抗体分泌的作用。IL-6则是与肿瘤治疗密切相关的细胞因子，有研究表明，IL-6会削弱肿瘤特异性T细胞分化，促进肿瘤细胞存活，而通过抑制IL-6可以阻断肿瘤的生长。IFN-γ主要由巨噬细胞生成，具有增强巨噬细胞抗肿瘤活性的功能。
由上表36可知，DDP组、AM02与AM06各组(活菌与灭活菌)、ATCC BAA-835活菌组及灭活菌组均能促进肿瘤小鼠血清中IL-2的含量，与生理盐水组比较有显著性差异。与生理盐水组比较，AM02与AM06各组(活菌与灭活菌)、ATCC BAA-835活菌组及灭活菌组均能降低肿瘤小鼠血清中IL-6的含量，与生理盐水组比较有显著性差异。与生理盐水组比较，AM02与AM06各组(活菌与灭活菌)、ATCC BAA-835活菌组及灭活菌组均能促进肿瘤小鼠血清中IFN-γ的含量，与生理盐水组比较有显著性差异。说明阿克曼氏菌上调了肿瘤小鼠血清中抑肿瘤因子IL-2、IFN-γ的水平，下调了IL-6的水平。与ATCC BAA-835活菌组比较，同等剂量的AM02、AM06活菌组显著上调了IL-2与INF-γ的表达，下调了IL-6的表达；与ATCC BAA-835灭活菌组比较，同等剂量的AM02、AM06灭活菌组显著上调了IL-2与INF-γ的表达，下调了IL-6的表达。
综上所述，阿克曼氏菌AM02及AM06能够调节肿瘤相关免疫因子水平，有效治疗小鼠小细胞肺癌移植瘤，效果明显优于标准株ATCC BAA-835。
实施例20：嗜黏蛋白阿克曼氏菌治疗小鼠鼻咽癌的药效试验
使用含胎牛血清的RPMI-1640培养基培养人鼻咽癌细胞系HONE1，无菌条件下，将处于对数生长期的HONE1细胞调整细胞浓度至1×107个/mL的单细胞悬液，细胞悬液以每只0.2mL左右接种于5-7周龄，体重20-24g的雌性裸鼠。皮下接种肿瘤后一周开始给药，AM02低剂量组(107CFU/只)、AM02中剂量组(108CFU/只)、AM02高剂量组(109CFU/只)、AM02灭活菌组(109个/只)、AM06低剂量组(107CFU/只)、AM06中剂量组(108CFU/只)、AM06高剂量组(109CFU/只)、AM06灭活菌组(109个/只)、ATCC BAA-835活菌组(109CFU/只)、ATCC BAA-835灭活菌组(109个/只)连续灌胃3周；DDP组(顺铂，山东齐鲁制药有限公司)组每周腹腔注射1次，连续注射3周。当实验结束或荷瘤鼠出现明显的消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征时，脱颈椎处死，取移植肿瘤测定其重量并计算抑瘤率，瘤体组织置于-80℃冰箱中冻存，用于检测凋亡蛋白表达量等。
一、小鼠鼻咽癌模型建立：将人鼻咽癌HONE1细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养基中,37℃、5％ CO2细胞培养箱内培养。取对数生长期的HONE1细胞经胰酶消化分散后,用PBS洗涤3次,1000r/min离心5min，再用PBS制备悬液，调整细胞浓度为1×l07/mL，取0.2mL(2×l06个/只)分别接种于110只裸鼠右肋皮下，SPF(Specific pathogen Free)环境下饲养，大约l周后接种原位出现肿瘤，以瘤块长径大于5mm且触之质硬视为造模成功的标准。
二、分组及给药：移植瘤模型建立1周后，将120只造模成功小鼠随机分为12组，每组10只：生理盐水组、DDP组、AM02低剂量组(107CFU/只)、AM02中剂量组(108CFU/只)、AM02高剂量组(109CFU/只)、AM02灭活菌组(109个/只)、AM06低剂量组(107CFU/只)、AM06中剂量组(108CFU/只)、AM06高剂量组(109CFU/只)、AM06灭活菌组(109个/只)、ATCC BAA-835活菌组(109CFU/只)、ATCC BAA-835灭活菌组(109个/只)。
生理盐水组：0.2mL/只，每天1次，连续灌胃3周；
DDP组：按照0.3mL/次、3mg/kg的量进行腹腔注射，每周1次，连续注射3周；
AM02及AM06相关组剂量组：按照0.2mL/只，每天1次，连续灌胃3周。
三、检测指标：(1)移植瘤重量及抑瘤率：连续给药三周后，取出移植瘤称重并计算抑瘤率，抑瘤率％＝100×(生理盐水组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/生理盐水组肿瘤平均重量。(2)移植瘤的qPCR反应：收集新鲜采集的肿瘤样本剪碎成小块，将剪碎的组织使用qPCR的方法检测肿瘤中Bax、Bcl-2mRNA的表达。
三、实验结果
(1)移植瘤重量及抑瘤率
表37、AM02及AM06对肿瘤小鼠的抑瘤结果(n＝10)
Figure SMS_42
a:平均值±SD。b:抑瘤率％＝100％×(生理盐水组肿瘤平均重量-给药组肿瘤重量)/生理盐水组肿瘤平均重量。c:两组间p值按照t-test(two-tailed)方法计算。d：AM02、AM06活菌与ATCC BAA-835活菌组比较，AM02、AM06灭活菌与ATCC BAA-835灭活菌组比较。
各组的肿瘤重量及抑瘤率如上表37所示，与生理盐水组比较，阳性药、AM02与AM06各组及ATCC BAA-835活菌组均有统计学差异，抑制肿瘤的生长。与DDP组比较，AM02与AM06低剂量组、中剂量组及ATCCATCC BAA-835活菌组与灭活菌组有统计学意义，AM02与AM06其余各组均无统计学意义，与ATCC BAA-835活菌组比较，同剂量的AM02及AM06活菌组均有统计学差异；与ATCC BAA-835灭活菌组比较，同剂量的AM02及AM06灭活菌组均有统计学差异。结果说明AM02及AM06可以抑制肿瘤的生长，高剂量抑制效果与阳性药相似，且显著优于标准株ATCC BAA-835。
(2)移植瘤的qPCR结果
表38、不同组别Bax与Bcl-2mRNA表达结果(x±SD,n＝10)
组别 Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2
生理盐水组 1.000±0.040 1.005±0.099 1.004±0.104
DDP组 1.829±0.228aaa 0.627±0.166aaa 3.083±0.840aaa
AM02低剂量组 1.187±0.202a 0.923±0.240 1.379±0.473a
AM02中剂量组 1.895±0.268aaa 0.725±0.170aaa 2.803±1.092aaa
AM02高剂量组 1.881±0.294aaabbb 0.672±0.172aaab 2.890±0.680aaabbb
AM02灭活菌组 1.902±0.234aaaccc 0.721±0.129aaacc 2.709±0.573aaaccc
AM06低剂量组 1.413±0.291aaa 0.784±0.164aa 1.873±0.640aaa
AM06中剂量组 1.899±0.324aaa 0.691±0.124aaa 2.880±0.930aaa
AM06高剂量组 1.888±0.326aaabbb 0.622±0.183aaabb 3.205±0.724aaabbb
AM06灭活菌组 1.869±0.417aaaccc 0.636±0.083aaaccc 2.982±0.777aaaccc
ATCC BAA-835活菌组 0.310±0.085a 0.895±0.242 0.390±0.211
ATCC BAA-835灭活菌组 0.276±0.063 0.914±0.180 0.319±0.110
注：a表示与生理盐水组比较P<0.05；aa表示与生理盐水组比较P<0.01；aaa表示与生理盐水组比较P<0.001。b表示与ATCC BAA-835活菌组比较P<0.05，bb表示与ATCC BAA-835活菌组比较P<0.01，bbb表示与ATCC BAA-835活菌组比较P<0.001；c表示与ATCC BAA-835灭活菌组比较P<0.05，cc表示与ATCC BAA-835灭活菌组比较P<0.01ccc表示与ATCCBAA-835灭活菌组比较P<0.001。
Bax基因具有促进细胞凋亡的作用，结果如上表38所示，与生理盐水组比较，阳性药、AM02及AM06各组、ATCC BAA-835活菌组给药后均能显著促进Bax mRNA的表达。Bcl-2基因(即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是一种癌基因，它具有明显抑制细胞凋亡的作用。结果如表38所示，与生理盐水组比较，阳性药、AM02及AM06各组给药后均能显著抑制Bcl-2mRNA的表达(除AM02低剂量组)。Bax/Bcl-2是调节细胞凋亡的相关蛋白，Bax表达增强，Bcl-2表达减弱细胞趋向于凋亡。结果如上表所示，Bax/Bcl-2的比值，与生理盐水组比较，阳性药、AM02及AM06各组给药后均能有统计学意义。与ATCC BAA-835活菌组比较，同等剂量的AM02、AM06活菌组显著上调了BaxmRNA的表达，下调了Bcl-2mRNA的表达；与ATCC BAA-835灭活菌组比较，同等剂量的AM02、AM06灭活菌组显著上调了BaxmRNA的表达，下调了Bcl-2mRNA的表达。
综上所述，阿克曼氏菌AM02及AM06能够通过促进肿瘤细胞凋亡，有效治疗小鼠鼻咽癌移植瘤，效果明显优于标准株ATCC BAA-835。
实施例21：嗜黏蛋白阿克曼氏菌联合PD-1抗体治疗小鼠非小细胞肺癌的药效试验
将处于对数生长期的小鼠肺癌细胞系Lewis细胞调整细胞浓度至2×104个/mL的单细胞悬液，无菌条件下用注射器以0.2mL/只的量将Lewis细胞接种于SPF级C57BL/6小鼠右腋窝皮下，制备Lewis肺癌瘤源小鼠。第11天复种一次，第21天正式实验时，选取生长良好的Lewis肺癌组织，无菌条件下，脱颈椎处死，从腋下剥取瘤体组织，剪碎、匀浆、研磨，按肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1：3比例制成浓度为1×107个/mL的瘤细胞悬液。Lewis肺癌瘤源小鼠细胞悬液以每只0.2mL左右接种于小鼠右前肢腋窝皮下进行造模。造模后一周开始给药，模型组(生理盐水)、PD-1抗体(10mg/kg)、AM02组(108CFU/只)、AM02+PD-1抗体组(108CFU/只+10mg/kg)、AM06组(108CFU/只)、AM06+PD-1抗体组(108CFU/只)给药3周。当实验结束或荷瘤鼠出现明显的消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征时，脱颈椎处死，取移植肿瘤测定其重量并计算抑瘤率，取瘤体组织用于流式检测T细胞亚群等。
一、Lewis细胞培养：Lewis细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，培养温度为37℃，气体环境为5％ CO2，湿度为饱和湿度；根据细胞生长的速度及培养液的颜色变化更换培养液，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。根据细胞生长情况，将对数生长期的细胞制备成单细胞悬液，将细胞浓度调整至2×104个/mL。
二、Lewis肺癌瘤源小鼠的制备：取6～8周龄，体质量约(20±2)g，SPF级C57BL/6小鼠10只，将处于对数生长期的小鼠肺癌细胞系Lewis细胞调整细胞浓度至2×104个/mL的单细胞悬液，无菌条件下用注射器以0.2mL/只的量将Lewis细胞接种于小鼠右腋窝皮下，当皮下移植瘤长至直径约1cm左右时剥取移植瘤。
三、肺癌移植瘤模型的建立：选取生长良好的Lewis肺癌组织，无菌条件下，脱颈椎处死，从腋下剥取瘤体组织，剪碎、匀浆、研磨，按肿瘤质量(g)与生理盐水(mL)1：3比例制成浓度为1×106个/mL的瘤细胞悬液。在无菌条件下，将上述制备的细胞悬液，以每只0.2mL左右接种于小鼠右前肢腋窝皮下。
四、分组及给药
表39、分组及给药情况表
Figure SMS_43
a N：每组小鼠数目；b给药体积：根据小鼠体重调整(10μL/g)。AM02、AM06给药为固定体积：200μL/只。
四、检测指标及方法：(1)肿瘤重量及抑瘤率：给药过程中如有小鼠出现明显的消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征，及给药结束后，脱颈椎处死，取移植肿瘤测其重量并计算抑瘤率，抑瘤率计算公式：抑瘤率(％)＝(生理盐水组平均瘤重-给药组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100；(2)肿瘤内T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤内CD4+T细胞和CD8+T细胞在CD45+T细胞中的比列。
五、实验结果
(1)肿瘤重量及抑瘤率
表40、AM02及AM06对肿瘤小鼠的抑瘤药效(n＝10)
Figure SMS_44
Figure SMS_45
a:平均值±SD。b:抑瘤率％＝100％×(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤重量)/模型组肿瘤平均重量。c:两组间p值按照t-test(two-tailed)方法计算。
各组的肿瘤重量及抑瘤率如上表40所示，PD-1抗体组、AM02单用组及与PD-1抗体联用组、AM06单用组及与PD-1抗体联用组均抑制肿瘤生长，与模型组比较有统计学差异，而标准菌株ATCC BAA-835未抑制肿瘤生长。与PD-1抗体组比较，AM02与AM06组无统计学意义；而AM02和PD-1抗体联用组，以及AM06与PD-1抗体联用组，肿瘤重量更低(P<0.05)，抑瘤率变大；并且联用组的肿瘤抑制率要明显优于对应的菌株单用组和PD-1抗体单用组的两组之和，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用。说明AM02及AM06可以抑制肿瘤的生长，且菌株与免疫抑制剂PD-1抗体联用后，AM02及AM06可以显著的协同增强PD-1抗体的治疗效果。
(2)T细胞亚群流式结果
表41、肿瘤组织中CD4+与CD8+在CD45+细胞中的占比(
Figure SMS_46
n＝10)
组别 CD4+/CD45+ CD8+/CD45
模型组 17.64±1.50 18.89±1.35
PD-1抗体组 19.67±1.48aa 22.09±2.08aaa
AM02组 19.72±1.25aa 22.00±1.83aaa
AM02+PD-1抗体组 23.02±1.38aaa 34.69±3.60aaa
AM06组 19.51±1.71a 22.82±2.06aaa
AM06+PD-1抗体组 22.07±1.61aaa 36.63±4.66aaa
ATCC BAA-835组 18.41±2.21 18.21±1.84
注：a表示与模型组比较P<0.05；aa表示与模型组比较P<0.01；aaa表示与生理盐水组比较P<0.001。
CD8+T细胞(TC或CTL细胞)能杀伤表达抗原的靶细胞，它在抗毒感染、急性同种异型移植物排斥和对肿瘤细胞的杀伤作用是重要的效应细胞。CD4+T细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞，主要由辅助T(Th)细胞分化而来，可与MHCⅡ类分子的非多肽区结合，参与T细胞抗原受体(TCR)识别抗原的信号转导。上表41中的结果显示，与模型组比较，除标准菌株ATCC BAA-835组外，其余各组均能不同程度的上调肿瘤内CD4+T与CD8+T细胞在CD45+T细胞中的比例。与单用组比较，AM02与PD-1抗体联用及AM06与PD-1抗体联用上调肿瘤内CD4+T与CD8+T细胞在CD45+T细胞中比例的程度更高。
综上所述，阿克曼氏菌AM02及AM06联用PD-1抗体能够调节肿瘤微环境中浸润T细胞的比例，增强机体的抗肿瘤活性，有效治疗小鼠非小细胞肺癌移植瘤。
实施例22：嗜黏蛋白阿克曼氏菌联用PD-1抗体治疗小鼠小细胞肺癌的药效试验
将处于对数生长期的人肺癌NCI-H446细胞调整细胞浓度至3×107个/mL的单细胞悬液，无菌条件下用注射器以0.2mL/只的量将NCI-H446细胞接种于SPF级裸鼠右肋皮下进行造模。造模待瘤体直径约为5～8mm时开始分组给药，模型组(生理盐水)、PD-1抗体(10mg/kg)、AM02组(108CFU/只)、AM02+PD-1抗体组(108CFU/只+10mg/kg)、AM06组(108CFU/只)、AM06+PD-1抗体组(108CFU/只)给药3周。当实验结束或荷瘤鼠出现明显的消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征时，脱颈椎处死，取移植肿瘤测定其重量并计算抑瘤率，取血清至于-80℃冰箱中冻存，用于检测细胞因子等。
一、小鼠小细胞肺癌移植瘤模型建立：将人肺癌NCI-H446细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养基中,37℃、5％ CO2细胞培养箱内培养。取对数生长期的NCI-H446细胞经胰酶消化分散后,用PBS洗涤2次,2000r/min离心5min，再用PBS制备悬液，调整细胞浓度为3×l07/mL，取0.2mL(6×l06个/只)分别接种于110只裸鼠右肋皮下，SPF(Specificpathogen Free)环境下饲养，大约l周后接种原位出现肿瘤，待瘤体直径约为5～8mm时进行治疗实验。
二、实验分组与给药
表42、分组及给药情况表
Figure SMS_47
a.N：每组小鼠数目；b.给药体积：根据小鼠体重调整(10μL/g)。AM02、AM06给药为固定体积：200μL/只。
三、检测指标及方法：(1)肿瘤重量及抑瘤率：给药过程中如有小鼠出现明显的消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征，及给药结束后，脱颈椎处死，取移植肿瘤测其重量并计算抑瘤率，抑瘤率计算公式：抑瘤率(％)＝(模型组平均瘤重-给药组瘤重)/模型组平均瘤重×100。(2)血清中细胞因子检测：采用Elisa检测肺癌移植瘤小鼠模型血清中IL-2(R&DSystems，M2000，下同)和IFN-γ(R&D Systems，MIF00，下同)等细胞因子的水平。
四、实验结果
(1)肿瘤重量及抑瘤率
表43、各组对肿瘤小鼠的抑瘤结果(n＝10)
Figure SMS_48
a:平均值±SD。b:抑瘤率％＝100％×(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤重量)/模型组肿瘤平均重量。c:两组间p值按照t-test(two-tailed)方法计算。
各组的肿瘤重量及抑瘤率如上表43所示，PD-1抗体组、AM02单用组及与PD-1抗体联用组、AM06单用组及与PD-1抗体联用组均抑制肿瘤生长，与模型组比较有统计学差异；而标准菌株ATCC BAA未抑制肿瘤生长。与PD-1抗体组和菌株的各个单用组比较，AM02与PD-1抗体的联用组，及AM06与PD-1抗体的联用组，其肿瘤重量更低，抑瘤率显著变大；并且联合给药的肿瘤抑制率要明显优于对应的菌株单用组和PD-1抗体单用组的两组之和，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用。说明AM02及AM06可以抑制肿瘤的生长，与免疫抑制剂PD-1抗体联用后，AM02及AM06可以增强PD-1抗体的治疗效果，体现出了显著的协同作用。
(2)细胞因子检测
表44、血清中细胞因子IL-2、IFN-γ检测结果(
Figure SMS_49
n＝10)
Figure SMS_50
Figure SMS_51
注：aaa表示与模型组水组比较P<0.001。
IL-2主要由T细胞产生，具有活化T细胞，刺激NK细胞增殖，促进B细胞增殖和抗体分泌的作用。IFN-γ主要由巨噬细胞生成，具有增强巨噬细胞抗肿瘤活性的功能。由上表44可知，PD-1抗体组、AM02与AM06单用及联用组均能促进肿瘤小鼠血清中IL-2的含量，与模型组比较有显著性差异，AM02及AM06与PD-1抗体联用比单用IL-2上升幅度更大。PD-1抗体组、AM02与AM06单用及联用组均能促进肿瘤小鼠血清中IFN-γ的含量，与模型组比较有显著性差异，AM02及AM06与PD-1抗体联用比单用IFN-γ上升幅度更大。说明阿克曼氏菌与PD-1抗体联用可以上调肿瘤小鼠血清中抑肿瘤因子IL-2、IFN-γ的水平。
综上所述，阿克曼氏菌AM02及AM06与PD-1抗体联用能够调节肿瘤相关免疫因子水平，有效治疗小鼠小细胞肺癌移植瘤。
实施例23：嗜黏蛋白阿克曼氏菌利用PD-1抗体治疗小鼠鼻咽癌的药效试验
使用含胎牛血清的RPMI-1640培养基培养人鼻咽癌细胞系HONE1，无菌条件下，将处于对数生长期的HONE1细胞调整细胞浓度至1×107个/mL的单细胞悬液，细胞悬液以每只0.2mL左右接种于5-7周龄，体重20-24g的雌性裸鼠。皮下接种肿瘤后一周开始给药，模型组(生理盐水)、PD-1抗体(10mg/kg)、AM02组(108CFU/只)、AM02+PD-1抗体组(108CFU/只+10mg/kg)、AM06组(108CFU/只)、AM06+PD-1抗体组(108CFU/只)给药3周。实验结束或荷瘤鼠出现明显的消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征时，脱颈椎处死，取移植肿瘤测定其重量并计算抑瘤率，瘤体组织置于-80℃冰箱中冻存，用于检测细胞因子表达。
一、小鼠鼻咽癌模型建立
将人鼻咽癌HONE1细胞培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养基中,37℃、5％CO2细胞培养箱内培养。取对数生长期的HONE1细胞经胰酶消化分散后,用PBS洗涤3次,1000r/min离心5min，再用PBS制备悬液，调整细胞浓度为1×l07/mL，取0.2mL(2×l06个/只)分别接种于110只裸鼠右肋皮下，SPF(Specific pathogen Free)环境下饲养，大约l周后接种原位出现肿瘤，以瘤块长径大于5mm且触之质硬视为造模成功的标准。
二、分组及给药
表45、分组及给药情况表
Figure SMS_52
a.N：每组小鼠数目；b.给药体积：根据小鼠体重调整(10μL/g)。AM02、AM06给药为固定体积：200μL/只。
三、检测指标：
(1)移植瘤重量及抑瘤率：连续给药三周后，取出移植瘤称重并计算抑瘤率，抑瘤率％＝100×(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量。
(2)瘤组织中的细胞因子检测：收集新鲜采集的肿瘤样本剪碎成小块，将剪碎的组织使用qPCR的方法检测肿瘤中IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平。
三、结果
(1)移植瘤重量及抑瘤率
表46、各组对肿瘤小鼠的抑瘤结果(n＝10)
Figure SMS_53
a:平均值±SD。b:抑瘤率％＝100％×(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤重量)/模型组肿瘤平均重量。c:两组间p值按照t-test(two-tailed)方法计算。
各组的肿瘤重量及抑瘤率如上表46所示，PD-1抗体组、AM02单用组及与PD-1抗体联用组、AM06单用组及与PD-1抗体联用组均抑制肿瘤生长，与模型组比较有统计学差异，而标准菌株ATCC BAA-835未抑制肿瘤生长。与PD-1抗体组比较，AM02与AM06组无统计学意义；AM02与PD-1抗体联用组，以及AM06与PD-1抗体联用组，其肿瘤重量更低，抑瘤率变大；并且联用组的肿瘤抑制率要明显优于对应的菌株单用组和PD-1抗体单用组的两组之和，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用。说明AM02及AM06可以抑制肿瘤的生长，与免疫抑制剂PD-1抗体联用后，AM02及AM06可以增强PD-1抗体的治疗效果，体现出了显著的协同作用。
(2)移植瘤的qPCR结果
表47、肿瘤因子IL-2、IFN-γ检测结果(
Figure SMS_54
n＝10)
组别 IL-2 IFN-γ
模型组 1.00±0.24 1.00±0.019
PD-1抗体组 9.86±0.93aaa 8.08±0.33aaa
AM02组 10.79±3.88aaa 7.22±1.16aaa
AM02+PD-1抗体组 27.72±5.28aaa 20.54±2.45aaa
AM06组 10.28±3.51aaa 7.46±0.93aaa
AM06+PD-1抗体组 25.56±3.82aaa 19.87±3.85aaa
ATCC BAA-835组 1.06±0.13 1.08±0.38
注：aaa表示与模型组比较P<0.001。
IL-2主要由T细胞产生，具有活化T细胞，刺激NK细胞增殖，促进B细胞增殖和抗体分泌的作用。IFN-γ主要由巨噬细胞生成，具有增强巨噬细胞抗肿瘤活性的功能。由上表47可知，PD-1抗体组、AM02与AM06单用及联用组均能促进肿瘤因子IL-2的含量，与模型组比较有显著性差异，AM02及AM06与PD-1抗体联用比单用IL-2上升幅度更大。PD-1抗体组、AM02与AM06单用及联用组均能促进肿瘤因子中IFN-γ的含量，与模型组比较有显著性差异，AM02及AM06与PD-1抗体联用比单用IFN-γ上升幅度更大。说明阿克曼氏菌与PD-1抗体联用可以上调肿瘤因子IL-2、IFN-γ的水平。
综上所述，阿克曼氏菌AM02及AM06与PD-1抗体联用能够调节肿瘤相关免疫因子水平，有效治疗小鼠小细胞鼻咽癌移植瘤。
实施例24：嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗小鼠Caki2肾癌细胞移植的药效实验
一、实验设计及流程：
1.Caki2肾癌细胞培养：Caki2肾癌细胞生长于McCoy’5A培养基加入10％的胎牛血清、100U/mL的青霉素、0.1mg/mL的链霉素。细胞培养于37℃、5％CO2的湿润细胞培养箱中。当细胞在镜下视野中铺满面积约80％以上时，进行细胞传代。首先将细培养瓶中废液倒掉，应用PBS冲洗两次，随后加入2-3mL胰蛋白酶，放入细胞培养箱中消化1-2min，随后应用含10％血清培养基中和胰蛋白酶，并用滴管捶打细胞，并放入15mL离心管中。将离心管放入离心机后配平，转速800rpm，离心5min。离心后倒掉废液，进行传代。选取状态好且对数生长期的肾癌细胞，吸取10μL细胞悬液于1.5mL离心管中，加入10μL苔盼蓝染液混匀，取10μL混匀后的液体加入到细胞计数板中，上机进行计数。根据计数结果，调整细胞浓度为5×106cells/mL。置于冰上备用。
2.小鼠肿瘤模型建立：(1)瘤体接种：实验用6周雄性裸鼠，待小鼠自然生长1周后，进行瘤体接种。分别给除正常对照组外全部小鼠接种肿瘤细胞，将Caki2肾癌细胞种植于小鼠背部，注射细胞量为5×106cells/mL×0.2mL/只。观察小鼠肿瘤生长情况。(2)建模成功标志：小鼠出现消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征，小鼠接种部位可触及肿块。小鼠成功接种瘤细胞7天后分组。
3.小鼠体内实验
(1)实验分组
表48、实验分组表
Figure SMS_55
(2)给药方法：瘤体接种7天后开始给药，给药时间点为给药日的上午10点，联合用药组先给药PD-1抗体，再给药活菌/灭活菌，共给药3周。
(3)检测项目与方法：肿瘤重量与肿瘤生长抑制率：抑瘤率＝100％(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量。
肿瘤组织中的T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤组织内CD80+、CD86+T细胞。CD80、CD86分子参与抗原提呈过程和T细胞介导的细胞免疫，在机体的抗肿瘤效应中发挥重要作用。近年来的研究表明，CD80和CD86在肾细胞癌组织中的表达明显低于于癌周组织和正常肾组织，这使得抗原提呈作用减弱，肿瘤抗原不能引起有效免疫应答，从而诱导了T细胞的无能状态，最终导致机体的免疫系统不能将肿瘤细胞清除，是肿瘤无限制性生长的重要原因。
细胞因子检测：ELISA检测小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ的含量。IL-2、IL-4、IFN-γ能够诱导机体产生免疫效应，有抗肿瘤作用。
数据统计与分析：使用SPSS统计软件25.0进行统计学分析。
二、实验结果
(1)肿瘤重量与肿瘤生长抑制率
表49、各组小鼠肿瘤重量与肿瘤生长抑制率(mean±SD)
组别 肿瘤重量(g) 抑瘤率(％)
正常对照组 0aaa /
模型组 4.88±0.63 /
PD-1抗体组 3.21±0.28a 36.07％
AM02活菌组 3.35±0.16ab 31.35％
AM06活菌组 3.32±0.28ab 31.96％
BAA-835标准株活菌组 4.82±0.36 1.23％
AM02灭活菌组 3.41±0.38ac 30.12％
AM06灭活菌组 3.38±0.27ac 30.74％
BAA-835标准株灭活菌组 4.79±0.11 1.84％
AM02活菌+PD-1抗体组 0.82±0.13aaaddffgg 83.20％
AM06活菌+PD-1抗体组 0.73±0.15aaaddffhh 85.04％
BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组 3.44±0.58a 29.51％
AM02灭活菌+PD-1抗体组 0.76±0.41aaaeeffii 84.43％
AM06灭活菌+PD-1抗体组 0.83±0.41aaaeeffjj 82.99％
BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组 3.24±0.41a 33.61％
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.001；b表示与BAA-835标准株活菌组比较，差异显著p<0.05；c表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差异显著p<0.05；dd表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ee表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ff表示与PD-1抗体组相比，差异显著p<0.01；gg表示与AM02活菌组相比，差异显著p<0.01；hh表示与AM06活菌组相比，差异显著p<0.01；ii表示与AM02灭活菌组相比，差异显著p<0.01；jj表示与AM06灭活菌组相比，差异显著p<0.01。
与空白组相比，模型组明显成瘤，造模成功。与模型组相比，PD-1组、AM02活菌组、AM06活菌组、AM02灭活菌组、AM06灭活菌组，肿瘤重量显著下降(p<0.05)；与模型组相比，AM02活菌+PD-1抗体组、AM06活菌+PD-1抗体组、AM02灭活菌+PD-1抗体组、AM06灭活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.01)。AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌有抑制肿瘤的作用，优于BAA-835标准株活菌/灭活菌。
与BAA-835标准株活菌组相比，AM02活菌组、AM06活菌组的肿瘤重量显著下降(p<0.05)。与BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组相比，AM02活菌+PD-1抗体组、AM06活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.01)。与BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组相比，AM02灭活菌+PD-1抗体组、AM06灭活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.01)。AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌分别与PD-1抗体联用可发挥更好的抗肿瘤效果，优于BAA-835标准株活菌/灭活菌。
分析对比单用PD-1抗体组、AM02活菌/灭活菌组、AM06活菌/灭活菌组的抑瘤率之和与联用组的抑瘤率，如下表50所示：
表50、联合给药与单用受试物和单抗的抑瘤效果之和的对比
Figure SMS_56
Figure SMS_57
由上述结果可见，AM02与PD-1抗体联用组(活菌、灭活菌)，以及AM06与PD-1抗体联用组(活菌、灭活菌)，其肿瘤重量更低，抑瘤率变大；并且联用组的肿瘤抑制率要明显优于对应的菌株单用组和PD-1抗体单用组的两组之和(p<0.01)，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用。说明AM02及AM06可以显著抑制肿瘤的生长，与免疫抑制剂PD-1抗体联用后，AM02及AM06可以增强PD-1抗体的治疗效果，体现出了显著的协同作用。
(2)T细胞亚群
表51、各组小鼠肿瘤组织中的T细胞亚群(mean±SD)
组别 CD80+T细胞(％) CD86+T细胞(％)
正常对照组 2.59±1.57a 1.24±2.16a
模型组 5.74±1.87 6.14±1.74
PD-1抗体组 11.74±1.95a 12.67±1.56a
AM02活菌组 10.37±1.47ab 12.20±1.95ab
AM06活菌组 9.98±1.86ab 12.24±1.79ab
BAA-835标准株活菌组 5.79±1.14 6.17±1.59
AM02灭活菌组 9.75±1.59ac 12.24±1.15ac
AM06灭活菌组 9.95±1.78ac 12.12±1.89ac
BAA-835标准株灭活菌组 5.96±1.57 6.27±1.11
AM02活菌+PD-1抗体组 15.04±1.78aaadd 16.28±1.46aaadd
AM06活菌+PD-1抗体组 15.08±1.28aaadd 17.74±1.84aaadd
BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组 9.58±1.84a 11.86±1.77a
AM02灭活菌+PD-1抗体组 14.98±1.62aaaee 16.29±1.59aaaee
AM06灭活菌+PD-1抗体组 15.03±1.35aaaee 17.01±1.11aaaee
BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组 9.87±1.48a 12.29±1.84a
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.01；b表示与BAA-835标准株活菌组比较，差异显著p<0.05；c表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差异显著p<0.05；dd表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ee表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01。
正常对照组与模型组相比，CD80+、CD86+细胞含量较低(p<0.05)，原因是未接种肿瘤细胞，无肿瘤相关免疫应答。与模型组相比，PD-1抗体组、AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌的CD80+、CD86+T细胞百分比上升(p<0.05)。
与BAA-835标准株活菌/灭活菌+PD-1抗体组相比，AM02活菌/灭活菌+PD-1抗体组(联用)、AM06活菌/灭活菌+PD-1抗体组(联用)能够使肿瘤组织CD80+、CD86+T细胞百分比上升更显著(p<0.001)。说明阿克曼氏菌AM02、AM06不仅有抑瘤作用，还能够有效增强PD-1抗体的抗肿瘤效应。
(3)细胞因子
表52、各组小鼠外周血细胞因子(mean±SD)
Figure SMS_58
Figure SMS_59
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.001；b表示与BAA-835标准株活菌组比较，差异显著p<0.05；c表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差异显著p<0.05；dd表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ee表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01。
正常对照组与模型组相比，IL-2、IL-4、IFN-γ含量较低(p<0.01)，原因是未接种肿瘤细胞，无肿瘤相关免疫应答。IL-2、IFN-γ、IL-4是免疫激活因子，能够刺激机体免疫产生抗肿瘤效应，与模型组相比，AM02活菌/灭活菌组、AM06活菌/灭活菌组、PD-1抗体组显著上调了上述细胞因子水平，AM02活菌/灭活菌组、AM06活菌/灭活菌组与PD-1抗体联用均能增强PD-1抗体的上调细胞因子水平的效果，AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌的上调细胞因子水平均优于BAA-835活菌/灭活菌。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌不仅具有抑瘤作用，且与PD-1抗体联用能够增加PD-1抗体的疗效，增强机体抗肿瘤免疫，抑制肾细胞癌移植瘤生长。
实施例25：嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗小鼠T24细胞膀胱癌移植瘤的药效实验
一、实验设计及流程
1.T24膀胱癌细胞培养：(1)提前于恒温水浴锅预热所用培养试剂，超净台用紫外照射30min，所有拿入超净台的物品均用75％酒精棉擦拭；(2)于15mL离心管中加入3mL无血清RPMI 1640培养基，取出待复苏的细胞，迅速置入37℃水浴锅中，使其快速融化；(3)将细胞迅速移至15mL离心管中，轻柔吹打均匀，室温，1000rpm，离心5min；(4)弃上清，加入1mL含10％FBS的RPMI 1640培养基，轻柔吹打使细胞成单细胞悬液，转移至培养皿中；(5)向培养皿中加入9mL完全培养液，八字摇法摇晃均匀，放入恒温培养箱内培养；(6)24h后在显微镜下观察细胞生长状况，若形态正常，即可换液，用于后续实验。(7)待细胞生长至密度约90％时进行传代，弃掉旧培养液，加入2-3mL无菌PBS洗涤细胞，重复两次；(8)弃去PBS，加入2mL0.25％胰酶消化液(含0.02％ EDTA)，在显微镜下观察，当细胞呈单个圆形状态时即可终止，加入2mL含10％ FBS的完全培养液，轻柔吹打细胞，使其脱落；(9)将培养皿中液体转移至15mL离心管中，室温，1000rpm，离心5min；(10)弃上清，加3mL PBS，重悬细胞，再次离心；(11)弃上清后加入2mL完全培养液，重悬细胞，转移至两个新的培养皿中，各皿补加9mL完全培养液，八字摇晃至充分混合，放入培养箱内培养。(12)收集对数期生长的T24细胞，PBS洗涤3次，重悬于无血清RPMI 1640的培养基中，计数并调整为2.0×105/mL。
2.小鼠肿瘤模型建立：(1)瘤体接种：实验用6周雄性裸鼠，待小鼠自然生长1周后，进行瘤体接种。分别给除正常对照组外全部小鼠接种肿瘤细胞，将T24细胞种植于小鼠背部，注射细胞量为5×106cells/mL×0.2mL/只。观察小鼠肿瘤生长情况。(2)建模成功标志：小鼠出现消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征，小鼠接种部位可触及肿块。小鼠成功接种瘤细胞7天后分组。
3.小鼠体内实验
(1)实验分组
表53、实验分组表
Figure SMS_60
/>
Figure SMS_61
(2)给药方法：瘤体接种7天后开始给药，给药时间点为给药日的上午10点，联合用药组先给药PD-1抗体，再给药活菌/灭活菌，共给药3周。
(3)检测项目与方法：肿瘤重量与肿瘤生长抑制率：抑瘤率＝100％(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量。肿瘤组织中的T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤组织内CD4+、CD8+T细胞。细胞因子检测：ELISA检测小鼠血清中IL-2、IFN-γ的含量。数据统计与分析：使用SPSS统计软件25.0进行统计学分析。
二、实验结果
(1)肿瘤重量与肿瘤生长抑制率
表54、各组小鼠肿瘤重量与肿瘤生长抑制率(mean±SD)
组别 肿瘤重量(g) 抑瘤率(％)
正常对照组 0aaa /
模型组 5.89±0.63 /
PD-1抗体组 4.21±0.21a 28.52％
AM02活菌组 4.35±0.12ab 26.15％
AM06活菌组 4.32±0.24ab 26.65％
BAA-835标准株活菌组 5.82±0.12 1.18％
AM02灭活菌组 4.41±0.13ac 25.13％
AM06灭活菌组 4.38±0.28ac 25.63％
BAA-835标准株灭活菌组 5.46±0.19 7.3％
AM02活菌+PD-1抗体组 1.12±0.13aaadddfffggg 80.98％
AM06活菌+PD-1抗体组 1.31±0.15aaadddfffhhh 77.76％
BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组 4.14±0.16a 29.71％
AM02灭活菌+PD-1抗体组 1.35±0.31aaaeeefffiii 77.08％
AM06灭活菌+PD-1抗体组 1.21±0.21aaaeeefffjjj 79.46％
BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组 4.28±0.41a 27.33％
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.001；b表示与BAA-835标准株活菌组比较，差异显著p<0.05；c表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差显著p<0.05；ddd表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.001；eee表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.001；fff表示与PD-1抗体组相比，差异显著p<0.001；ggg表示与AM02活菌组相比，差异显著p<0.001；hhh表示与AM06活菌组相比，差异显著p<0.001；iii表示与AM02灭活菌组相比，差异显著p<0.001；jjj表示与AM06灭活菌组相比，差异显著p<0.001。
与空白组相比，模型组明显成瘤，造模成功；与模型组相比，PD-1组、AM02活菌组、AM06活菌组、AM02灭活菌组、AM06灭活菌组，肿瘤重量显著下降(p<0.05)；与模型组相比，AM02活菌+PD-1抗体组、AM06活菌+PD-1抗体组、AM02灭活菌+PD-1抗体组、AM06灭活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.001)。AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌有抑制肿瘤的作用，优于BAA-835标准株活菌/灭活菌。
与BAA-835标准株活菌组相比，AM02活菌组、AM06活菌组的肿瘤重量显著下降(p<0.05)。与BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组相比，AM02活菌+PD-1抗体组、AM06活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.001)。与BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组相比，AM02灭活菌+PD-1抗体组、AM06灭活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.001)。AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌分别与PD-1抗体联用可发挥更好的抗肿瘤效果，优于BAA-835标准株活菌/灭活菌。
分析对比单用PD-1抗体组、AM02活菌/灭活菌组、AM06活菌/灭活菌组的抑瘤率之和与联用组的抑瘤率，如下表55所示：
表55、联合给药与单用受试物和单抗的抑瘤效果之和的对比
Figure SMS_62
由上述结果可见，AM02与PD-1抗体联用组(活菌、灭活菌)，以及AM06与PD-1抗体联用组(活菌、灭活菌)，其肿瘤重量更低，抑瘤率变大；并且联用组的肿瘤抑制率要明显优于对应的菌株单用组和PD-1抗体单用组的两组之和(p<0.001)，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用。说明AM02及AM06可以显著抑制肿瘤的生长，与免疫抑制剂PD-1抗体联用后，AM02及AM06可以增强PD-1抗体的治疗效果，体现出了显著的协同作用。
(2)T细胞亚群
表56、各组小鼠肿瘤组织中的T细胞亚群(mean±SD)
组别 CD4+T细胞(％) CD8+T细胞(％)
正常对照组 2.36±1.57a 3.24±2.16a
模型组 6.74±1.87 6.14±1.74
PD-1抗体组 11.69±1.91a 12.67±1.16a
AM02活菌组 10.62±1.88ab 12.21±1.85ab
AM06活菌组 11.25±1.86ab 12.24±1.37ab
BAA-835标准株活菌组 6.79±1.24 6.18±1.64
AM02灭活菌组 10.75±1.69ac 12.12±1.15ac
AM06灭活菌组 10.95±1.68ac 12.47±1.89ac
BAA-835标准株灭活菌组 6.62±1.57 6.25±1.22
AM02活菌+PD-1抗体组 16.04±1.78aaadd 16.28±1.46aaadd
AM06活菌+PD-1抗体组 15.25±1.28aaadd 17.74±1.84aaadd
BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组 10.32±1.67a 11.86±1.77a
AM02灭活菌+PD-1抗体组 15.96±1.12aaaee 16.29±1.59aaaee
AM06灭活菌+PD-1抗体组 15.83±1.58aaaee 17.01±1.11aaaee
BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组 11.87±1.36a 6.29±1.84a
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.01；b表示与BAA-835标准株活菌组比较，差异显著p<0.05；c表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差异显著p<0.05；dd表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ee表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01。
正常对照组与模型组相比，CD4+、CD8+细胞含量较低(p<0.05)，原因是未接种肿瘤细胞，无肿瘤相关免疫应答。与模型组相比，PD-1抗体组、AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌的CD4+、CD8+T细胞百分比显著上升(p<0.05)。
与BAA-835标准株活菌/灭活菌+PD-1抗体组相比，AM02活菌/灭活菌+PD-1抗体组、AM06活菌/灭活菌+PD-1抗体组给药组能够使肿瘤组织CD4+、CD8+T细胞百分比上升更显著(p<0.001)。说明阿克曼氏菌AM02、AM06能够有效增强PD-1抗体的抗肿瘤效应，效果显著优于BAA-835标准株活菌/灭活菌。
(3)细胞因子
表57、各组小鼠外周血细胞因子(mean±SD)
组别 IL-2(pg/mL) IFN-γ(pg/mL)
正常对照组 1.58±1.88aa 2.59±1.03aa
模型组 5.68±2.16 7.64±1.01
PD-1抗体组 11.89±1.72a 12.08±1.76a
AM02活菌组 10.85±2.40ab 11.79±1.34ab
AM06活菌组 10.78±2.25ab 11.85±2.52ab
BAA-835标准株活菌组 5.75±1.68 8.84±2.56a
AM02灭活菌组 10.37±1.97ac 11.07±2.45ac
AM06灭活菌组 10.93±1.84ac 10.74±1.61ac
BAA-835标准株灭活菌组 5.53±1.91 8.30±2.16
AM02活菌+PD-1抗体组 15.37±1.86aaadd 16.83±1.28aaadd
AM06活菌+PD-1抗体组 15.39±1.26aaadd 17.13±2.96aaadd
BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组 10.98±2.68a 11.63±1.76a
AM02灭活菌+PD-1抗体组 15.96±2.24aaaee 17.37±1.13aaaee
AM06灭活菌+PD-1抗体组 16.11±1.97aaaee 16.97±2.12aaaee
BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组 10.85±1.78a 11.11±2.48a
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aa表示与模型组比较，差异显著p<0.01；aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.001；b表示与BAA-835标准株活菌组比较，差异显著p<0.05；c表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差异显著p<0.05；dd表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ee表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01。
正常对照组与模型组相比，IL-2、IL-4含量较低(p<0.01)，原因是未接种肿瘤细胞，无肿瘤相关免疫应答。IL-2、IFN-γ是免疫激活因子，能够刺激机体免疫产生抗肿瘤效应，与模型组相比，AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌、PD-1抗体显著上调了上述细胞因子水平，AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌与PD-1抗体联用均能增强PD-1抗体的上调上述细胞因子水平的效果，优于BAA-835活菌/灭活菌。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌与PD-1抗体联用能够增加PD-1抗体的疗效，增强机体抗肿瘤免疫，抑制膀胱肿瘤的生长。
实施例26：嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗小鼠上尿路细胞癌UMUC3细胞转移瘤的药效实验
一、实验设计及流程
1.上尿路细胞癌UMUC3细胞培养：(1)提前于恒温水浴锅预热所用培养试剂，超净台用紫外照射30min，所有拿入超净台的物品均用75％酒精棉擦拭；(2)于15mL离心管中加入3mL无血清培养基，取出待复苏的细胞，迅速置入37℃水浴锅中，使其快速融化；(3)将细胞迅速移至15mL离心管中，轻柔吹打均匀，室温，1000rpm，离心5min；(4)弃上清，加入1mL含10％FBS的培养基，轻柔吹打使细胞成单细胞悬液，转移至培养皿中；(5)向培养皿中加入9mL完全培养液，八字摇法摇晃均匀，放入恒温培养箱内培养；(6)24h后在显微镜下观察细胞生长状况，若形态正常，即可换液，用于后续实验。(7)待细胞生长至密度约90％时进行传代，弃掉旧培养液，加入2-3mL无菌PBS洗涤细胞，重复两次；(8)弃去PBS，加入2mL 0.25％胰酶消化液(含0.02％ EDTA)，在显微镜下观察，当细胞呈单个圆形状态时即可终止，加入2mL含10％FBS的完全培养液，轻柔吹打细胞，使其脱落；(9)将培养皿中液体转移至15mL离心管中，室温，1000rpm，离心5min；(10)弃上清，加3mL PBS，重悬细胞，再次离心；(11)弃上清后加入2mL完全培养液，重悬细胞，转移至两个新的培养皿中，各皿补加9mL完全培养液，八字摇晃至充分混合，放入培养箱内培养。(12)收集对数期生长的UMUC3细胞，PBS洗涤3次，重悬于无血清的培养基中，再使用荧光转染UMUC3细胞(UMUC3-luc)，计数并调整为1.0×106个/mL。
2.小鼠肿瘤模型建立：(1)瘤体接种：实验用6周雌性严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠，待小鼠自然生长1周后，除正常对照组外全部小鼠接种肿瘤细胞，将1.0×106个/mL×150μL经尿道注入小鼠膀胱，结扎尿道阻止小鼠排尿，4小时后松开结扎缝线，约10-20％的UMUC3-luc细胞通过膀胱输尿管返流至上尿道。(2)建模成功标志：通过体外荧光检测系统(IVIS)检测UMUC3-luc细胞在小鼠体内的位置和数量(强度越高，数量越多)。小鼠出现虚弱、体重下降表示建模成功。小鼠成功接种瘤细胞7天后分组。
3.小鼠体内实验
(1)实验分组
表58、实验分组表
Figure SMS_63
(2)给药方法：瘤体接种7天后开始给药，给药时间点为给药日的上午10点，联合用药组先给药PD-1抗体，再给药活菌/灭活菌，共给药3周。
(3)检测项目与方法：肿瘤重量与肿瘤生长抑制率：抑瘤率＝100％(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量。外周血的T细胞亚群：流式细胞术分析外周血内CD4+、CD8+T细胞。细胞因子检测：ELISA检测小鼠血清中IL-2、IFN-γ的含量。数据统计与分析：使用SPSS统计软件25.0进行统计学分析。
二、实验结果
(1)肿瘤重量与肿瘤生长抑制率
表59、各组小鼠肿瘤重量与肿瘤生长抑制率(mean±SD)
Figure SMS_64
/>
Figure SMS_65
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.001；b表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差显著p<0.05；c表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.05；dd表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ee表示与PD-1抗体组相比，差异显著p<0.01；ff表示与AM02活菌组相比，差异显著p<0.01；gg表示与AM06活菌组相比，差异显著p<0.01；hh表示与AM02灭活菌组相比，差异显著p<0.01；ii表示与AM06灭活菌组相比，差异显著p<0.01。
与空白组相比，模型组明显成瘤，造模成功。与模型组相比，PD-1组、AM02活菌组、AM06活菌组、AM02灭活菌组、AM06灭活菌组，BAA-835标准株活菌组肿瘤重量显著下降(p<0.05)；与模型组相比，AM02活菌+PD-1抗体组、AM06活菌+PD-1抗体组、AM02灭活菌+PD-1抗体组、AM06灭活菌+PD-1抗体组、BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.01；
p<0.001)。AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌有抑制肿瘤的作用，并且优于BAA-835标准株活菌/灭活菌。
与BAA-835标准株活菌组相比，AM02组、AM06组的肿瘤重量显著下降(p<0.05)。与BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组相比，AM02活菌+PD-1抗体组、AM06活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.001)。与BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组相比，AM02灭活菌+PD-1抗体组、AM06灭活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.01)。AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌与PD-1抗体联用可发挥更好的抗肿瘤效果，优于BAA-835标准株活菌/灭活菌。
分析对比单用PD-1抗体组、AM02活菌/灭活菌组、AM06活菌/灭活菌组的抑瘤率之和与联用组的抑瘤率，如下表60所示：
表60、联合给药与单用受试物和单抗的抑瘤效果之和的对比
Figure SMS_66
由上述结果可见，AM02与PD-1抗体联用组(活菌、灭活菌)，以及AM06与PD-1抗体联用组(活菌、灭活菌)，其肿瘤重量更低，抑瘤率变大；并且联用组的肿瘤抑制率要明显优于对应的菌株单用组和PD-1抗体单用组的两组之和(p<0.05)，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用。说明AM02及AM06可以显著抑制肿瘤的生长，与免疫抑制剂PD-1抗体联用后，AM02及AM06可以增强PD-1抗体的治疗效果，体现出了显著的协同作用。
(2)T细胞亚群
表61、各组小鼠外周血中的T细胞亚群(mean±SD)
组别 CD4+T细胞(％) CD8+T细胞(％)
正常对照组 3.58±1.58a 2.38±0.39a
模型组 3.87±1.67 2.14±0.42
PD-1抗体组 7.69±1.48a 6.68±1.16a
AM02活菌组 7.02±1.11a 6.20±1.76a
AM06活菌组 6.19±1.19a 6.19±1.84a
BAA-835标准株活菌组 5.97±1.24a 5.08±1.44a
AM02灭活菌组 6.75±1.76ab 6.16±1.56ab
AM06灭活菌组 6.95±1.38ab 6.52±1.82ab
BAA-835标准株灭活菌组 3.62±1.76 3.32±1.17
AM02活菌+PD-1抗体组 13.14±1.38aaacc 14.30±1.83aaacc
AM06活菌+PD-1抗体组 14.21±1.37aaacc 14.74±1.82aaa
BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组 8.32±1.98a 6.46±1.35a
.AM02灭活菌+PD-1抗体组 13.99±0.87aaadd 14.29±1.40aaadd
AM06灭活菌+PD-1抗体组 13.83±1.42aaadd 14.01±1.19aaadd
BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组 7.87±1.35a 7.22±1.33a
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.01；b表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差异显著p<0.05；cc表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；dd表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01。
由于实验小鼠属于免疫缺陷小鼠，机体免疫对于肿瘤无应答，模型组CD4+和CD8+与正常对照组相比无统计学差异。与模型组相比，PD-1抗体组、AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌、BAA-835标准株活菌组的CD4+、CD8+T细胞百分比上升(p<0.05)。
与BAA-835标准株活菌/灭活菌+PD-1抗体组相比，AM02活菌/灭活菌+PD-1抗体组、AM06活菌/灭活菌+PD-1抗体组给药组能够使肿瘤组织CD4+、CD8+T细胞百分比上升更显著(p<0.01)。说明阿克曼氏菌AM02、AM06能够有效增强PD-1抗体的抗肿瘤效应。
(3)细胞因子
表62、各组小鼠外周血细胞因子(mean±SD)
组别 IL-2(pg/mL) IFN-γ(pg/mL)
正常对照组 2.23±1.72aa 2.49±1.85aa
模型组 2.58±2.04 2.36±1.46
PD-1抗体组 6.89±1.49a 6.88±1.82a
AM02活菌组 6.85±2.35a 6.76±1.37a
AM06活菌组 6.78±2.29a 6.82±2.42a
BAA-835标准株活菌组 5.75±1.76a 5.14±2.46a
AM02灭活菌组 6.37±1.19ab 6.14±2.28ab
AM06灭活菌组 6.13±1.45ab 10.74±1.36ab
BAA-835标准株灭活菌组 2.53±1.76 2.30±2.10
AM02活菌+PD-1抗体组 13.37±1.48aaacc 14.03±1.06aaacc
AM06活菌+PD-1抗体组 13.39±1.76aaacc 13.81±2.75aaacc
BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组 10.98±2.55a 10.63±1.13a
AM02灭活菌+PD-1抗体组 13.96±2.50aaadd 14.32±1.24aaadd
AM06灭活菌+PD-1抗体组 13.11±1.38aaadd 14.27±2.38aaadd
BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组 6.85±1.76a 6.11±2.28a
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.01；b表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差异显著p<0.05；cc表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；dd表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01。
由于实验小鼠属于免疫缺陷小鼠，机体免疫对于肿瘤无应答，模型组IL-2和IFN-γ与正常对照组相比无统计学差异。IL-2、IFN-γ是免疫激活因子，能够刺激机体免疫产生抗肿瘤效应，与模型组相比，AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌、PD-1抗体显著上调了上述细胞因子水平；AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌与PD-1抗体联用均能增强PD-1抗体的上调上述细胞因子水平的效果，均优于BAA-835活菌/灭活菌。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌单用或与PD-1抗体联用通过增加效应T细胞数量，上调免疫激活因子水平，增强机体抗肿瘤免疫，抑制上尿路细胞移植瘤生长。
实施例27：嗜粘蛋白阿克曼氏菌治疗小鼠Tramp-C1前列腺癌移植瘤的药效实验
一、实验设计及流程
1.小鼠前列腺癌Tramp-C1细胞培养：TRAMP-C1细胞常规培养于含10％灭活的FBS及0.01nmol/L的去氢表雄酮的DMEM新鲜培养液中置37℃、5％CO2无菌孵箱中。细胞长满至80％～90％时用0.25％的胰酶消化传代培养。选取状态好且处于对数生长期的细胞，消化后1500rpm离心收集细胞沉淀，用PBS重悬细胞，反复3次，最后一次重悬细胞后细胞计数，稀释配置成1.0×108个/mL细胞悬液，置于冰上备用。
2.小鼠肿瘤模型建立：(1)瘤体接种：实验用6周雄性C57BL/6小鼠，待小鼠自然生长1周后，进行瘤体接种。所有小鼠在造模前按3.5μL/g体重10％水合氯醛麻醉小鼠，将小鼠腹部朝上固定于无菌手术台上，切开下腹部显露出腹腔，在10倍显微镜下进行精细操作，找到小鼠膀胱和生殖腺之后向两侧推开，暴露前列腺，除对照组外所有小鼠用微量注射器分别向两侧前列腺侧叶注射Tramp-C11细胞悬液1.0×108个/mL×10μL，观察到包膜鼓起并脱离腺体为注射成功标志，对照组(假手术)小鼠在前列腺同一位置注入等体积的PBS溶液。(2)建模成功标志：小鼠出现消瘦、蜷缩、精神萎靡等衰竭体征。小鼠成功接种瘤细胞7天后分组。
3.小鼠体内实验
(1)实验分组
表63、实验分组表
Figure SMS_67
Figure SMS_68
(2)给药方法：给药时间点为给药日的上午10点，联合用药组先给药PD-1抗体，再给药活菌/灭活菌，PD-1抗体共给药4周。
(3)检测项目与方法：给药结束后摘眼球取血，脱颈处死小鼠，取癌组织。肿瘤重量与肿瘤生长抑制率：抑瘤率＝100％(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量。肿瘤组织中的T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤组织内CD3+、CD8+T细胞。细胞因子检测：ELISA检测小鼠血清中IL-2、IFN-γ的含量。数据统计与分析：使用SPSS统计软件25.0进行统计学分析。
二、实验结果
(1)肿瘤重量与肿瘤生长抑制率
表64、各组小鼠肿瘤重量与肿瘤生长抑制率(mean±SD)
组别 肿瘤重量(g) 抑瘤率(％)
正常对照组 0aaa /
模型组 4.87±0.53 /
PD-1抗体组 3.20±0.18a 34.29％
AM02活菌组 3.35±0.46ab 31.21％
AM06活菌组 3.37±0.28ab 30.80％
BAA-835标准株活菌组 4.81±0.14 1.23％
AM02灭活菌组 3.46±0.18ac 28.95％
AM06灭活菌组 3.45±0.39ac 29.16％
BAA-835标准株灭活菌组 4.46±0.86 8.42％
AM02活菌+PD-1抗体组 1.12±0.64aaaddffgg 77.00％
AM06活菌+PD-1抗体组 1.29±0.37aaaddffhh 73.51％
BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组 3.14±0.25a 35.52％
AM02灭活菌+PD-1抗体组 1.35±0.26aaaeeffii 72.28％
AM06灭活菌+PD-1抗体组 1.21±0.38aaaeeffjj 75.15％
BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组 3.28±0.37a 32.65％
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.001；b表示与BAA-835标准株活菌组比较，差异显著p<0.05；c表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差异显著p<0.05；dd表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ee表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ff表示与PD-1抗体组相比，差异显著p<0.01；gg表示与AM02活菌组相比，差异显著p<0.01；hh表示与AM06活菌组相比，差异显著p<0.01；ii表示与AM02灭活菌组相比，差异显著p<0.01；jj表示与AM06灭活菌组相比，差异显著p<0.01。
与空白组相比，模型组明显成瘤，造模成功。与模型组相比，PD-1组、AM02活菌组、AM06活菌组、AM02灭活菌组、AM06灭活菌组，肿瘤重量显著下降(p<0.05)；与模型组相比，AM02活菌+PD-1抗体组、AM06活菌+PD-1抗体组、AM02灭活菌+PD-1抗体组、AM06灭活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.001)。AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌有抑制肿瘤的作用，优于BAA-835标准株活菌/灭活菌。
与BAA-835标准株活菌组相比，AM02活菌组、AM06活菌组的肿瘤重量显著下降(p<0.05)。与BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组相比，AM02活菌+PD-1抗体组、AM06活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.001)。与BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组相比，AM02灭活菌+PD-1抗体组、AM06灭活菌+PD-1抗体组的肿瘤重量显著下降(p<0.01)。AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌与PD-1抗体联用可发挥更好的抗肿瘤效果，优于BAA-835标准株活菌/灭活菌。
分析对比单用PD-1抗体组、AM02活菌/灭活菌组、AM06活菌/灭活菌组的抑瘤率之和与联用组的抑瘤率，如下表65所示：
表65、联合给药与单用受试物和单抗的抑瘤效果之和的对比
Figure SMS_69
Figure SMS_70
由上述结果可见，AM02与PD-1抗体联用组(活菌、灭活菌)，以及AM06与PD-1抗体联用组(活菌、灭活菌)，其肿瘤重量更低，抑瘤率变大；并且联用组的肿瘤抑制率要明显优于对应的菌株单用组和PD-1抗体单用组的两组之和(p<0.01)，体现出菌株与PD-1抗体联用具有明显的协同作用。说明AM02及AM06可以显著抑制肿瘤的生长，与免疫抑制剂PD-1抗体联用后，AM02及AM06可以增强PD-1抗体的治疗效果，体现出了显著的协同作用。
(2)T细胞亚群
表66、各组小鼠肿瘤组织中的T细胞亚群(mean±SD)
组别 CD3+T细胞(％) CD8+T细胞(％)
正常对照组 3.58±1.58a 4.38±0.60a
模型组 5.87±1.68 7.14±0.42
PD-1抗体组 10.69±1.52a 11.68±1.16a
AM02活菌组 10.02±1.43ab 11.20±1.98ab
AM06活菌组 9.19±1.72ab 11.19±1.76ab
BAA-835标准株活菌组 6.13±1.46 7.25±1.41
AM02灭活菌组 10.11±1.86ac 11.16±1.56ac
AM06灭活菌组 10.03±1.48ac 11.52±1.82ac
BAA-835标准株灭活菌组 5.92±1.46 7.32±1.29
AM02活菌+PD-1抗体组 12.14±1.38aaadd 15.30±1.81aaadd
AM06活菌+PD-1抗体组 13.21±1.26aaadd 15.74±1.84aaadd
BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组 11.03±1.16a 6.46±1.39a
.AM02灭活菌+PD-1抗体组 12.92±0.89aaaee 14.28±1.60aaaee
AM06灭活菌+PD-1抗体组 12.86±1.37aaaee 14.69±1.21aaaee
BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组 10.88±1.38a 7.22±1.31a
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.01；b表示与BAA-835标准株活菌组比较，差异显著p<0.05；c表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差异显著p<0.05；dd表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ee表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01。
正常对照组与模型组相比，CD3+、CD8+细胞含量较低(p<0.05)，原因是未接种肿瘤细胞，无肿瘤相关免疫应答。与模型组相比，PD-1抗体组、AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌的CD3+、CD8+T细胞百分比上升(p<0.05)。
与BAA-835标准株活菌+PD-1抗体组相比，AM02活菌+PD-1抗体组、AM06活菌+PD-1抗体组给药组能够使肿瘤组织CD3+、CD8+T细胞百分比上升更显著(p<0.01)。与BAA-835标准株灭活菌+PD-1抗体组相比，AM02灭活菌+PD-1抗体组、AM06灭活菌+PD-1抗体组给药组能够使肿瘤组织CD3+、CD8+T细胞百分比上升更显著(p<0.01)。说明阿克曼氏菌AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌能够有效增强PD-1抗体的抗肿瘤效应。
(3)细胞因子
表67、各组小鼠外周血细胞因子(mean±SD)
Figure SMS_71
Figure SMS_72
注：a表示与模型组比较，差异显著p<0.05，aaa表示与模型组比较，差异显著p<0.01；b表示与BAA-835标准株活菌组比较，差异显著p<0.05；c表示与BAA-835标准株灭活菌组比较，差异显著p<0.05；dd表示与BAA-835标准株活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01；ee表示与BAA-835标准株灭活菌组+PD-1抗体组比较，差异显著p<0.01。
正常对照组与模型组相比，IL-2、IFN-γ含量较低(p<0.01)，原因是未接种肿瘤细胞，无肿瘤相关免疫应答。IL-2、IFN-γ是免疫激活因子，能够刺激机体免疫产生抗肿瘤效应，与模型组相比，AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌、PD-1抗体显著上调了上述细胞因子水平，AM02活菌/灭活菌、AM06活菌/灭活菌与PD-1抗体联用均能增强PD-1抗体的上调上述细胞因子水平的效果，AM02、AM06的活菌/灭活菌均优于BAA-835活菌/灭活菌。
综上所述，阿克曼氏菌AM02、AM06活菌/灭活菌单用或与PD-1抗体联用通过增加效应T细胞数量，上调免疫激活因子水平，增强机体抗肿瘤免疫，抑制前列腺癌移植瘤生长。
以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量的调整，这些都属于本发明的保护范围之内。以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提，还可以做出若干变形和改进，包括但不限于比例、流程、用量的调整，这些都属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，其特征在于，所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中至少包括嗜粘蛋白阿克曼氏菌；
所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，包括：AM06和AM02中的一种或两种；
其中，所述AM06为保藏编号为CGMCC No.22793的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06；所述AM02为保藏编号为CGMCC No.22794的嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02；
优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM06和所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌AM02均于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
优选地，所述AM06的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AM02的核酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.如权利要求1所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，其特征在于，所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品中还包括单克隆抗体；
优选地，所述单克隆抗体包括PD-1抗体、CD20抗体和CTLA-4抗体中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，其特征在于，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌为活菌、形态结构完整的灭活菌和形态结构不完整的灭活菌中的一种或多种。
4.如权利要求1所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，其特征在于，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，为阿克曼氏菌活菌体、经过灭活处理、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理或物理处理的阿克曼氏菌、阿克曼氏菌裂解物、阿克曼氏菌液体培养上清液中的一种或多种。
5.如权利要求1所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，其特征在于，所述产品包括组合物；
所述组合物中包括所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌，以及抗肿瘤药物；
优选地，所述组合物为药物组合物；
所述药物组合物的剂型包括灌肠剂、注射剂型、外用药物剂型和口服剂型；
优选地，所述药物组合物的给药方式包括口服、灌肠、皮下注射、静脉注射和肌内注射；
优选地，所述口服剂型包括散剂、混悬剂、片剂、胶囊剂、膜剂和颗粒剂；
优选地，所述口服剂型的释药方式包括缓释和非缓释；
优选地，所述组合物为益生菌组合物。
6.如权利要求5所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，其特征在于，所述抗肿瘤药物为免疫检查点抑制剂；
优选地，所述嗜粘蛋白阿克曼氏菌和所述免疫检查点抑制剂在给药时同时给药或分别给药；
优选地，所述免疫检查点抑制剂选自：抗体和化合物中的一种或两种组合；
优选地，所述免疫检查点抑制剂的免疫检查点选自PD-1/PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、A2aR、B7/H3、4-1BB、OX-40、TIGHT、CD-28、TNFR2、NKG2A、CD86、CD80、ICOS、CD40和GITR中的一种或多种；
优选地，所述免疫检查点抑制剂的免疫检查点为PD-1/L1。
7.如权利要求6所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，其特征在于，所述免疫检查点为PD-1/L1的单抗剂选自纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、阿特朱单抗、阿维单抗和德瓦鲁单抗中的一种或多种。
8.如权利要求5所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品，其特征在于，所述组合物中还包括辅料；
所述辅料包括稀释剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、矫味剂、包衣剂和增溶剂中的一种或多种。
9.一种如权利要求1-2或4-8中任一项或权利要求3所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品在制备防治肿瘤的产品中的应用，其特征在于，所述肿瘤包括消化系统肿瘤、淋巴系统肿瘤、生殖泌尿系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、皮肤肿瘤中的一种或多种；
优选地，所述肿瘤为消化系统肿瘤；
优选地，所述消化系统肿瘤，包括直肠癌、胃癌、食管癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌中的一种或多种；
优选地，所述肿瘤为淋巴系统肿瘤；
优选地，所述淋巴系统肿瘤，包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中的一种或多种；
优选地，所述肿瘤为生殖泌尿系统肿瘤；
优选地，所述生殖泌尿系统肿瘤包括肾癌、膀胱癌、尿路上皮癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌和前列腺癌中的一种或多种；
优选地，所述肿瘤为呼吸系统肿瘤；
优选地，所述呼吸系统肿瘤包括头颈部癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌中的一种或多种；
优选地，所述头颈部癌包括鼻咽癌和喉癌；
优选地，所述肿瘤为皮肤肿瘤；
优选地，所述皮肤肿瘤包括黑素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌中的一种或多种。
10.如权利要求9所述防治肿瘤的嗜粘蛋白阿克曼氏菌产品在制备防治肿瘤的产品中的应用，其特征在于，所述防治肿瘤的产品包括食品、保健食品、药品、检测试剂和检测试剂盒；
优选地，所述药品的剂型包括散剂、混悬剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、口服液或管饲制剂、灌肠剂；
优选地，所述药品包括人用药或动物用药；
所述保健食品的剂型包括散剂、混悬液、口服液、片剂、胶囊和颗粒剂。
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