CN114847483B

CN114847483B - 长双歧杆菌bl21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用

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Publication number: CN114847483B
Application number: CN202210449134.6A
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 郭晓娟; 汪欣; 朱建国
Original assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Current assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date: 2022-04-26
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2024-01-05
Anticipated expiration: 2042-04-26
Also published as: CN114847483A

Abstract

本发明提供长双歧杆菌BL21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用。所述长双歧杆菌BL21具有优良的耐酸耐胆盐能力，细胞粘附能力好，可以通过调节小鼠的结直肠肿瘤细胞凋亡相关基因的表达，提高促凋亡因子CASP3和Bax的基因表达水平并降低抗凋亡因子Bcl‑xl和Bcl‑2的基因表达水平，诱导小鼠结直肠肿瘤细胞的凋亡，减少小鼠结直肠肿瘤的数量，可以显著缓解结直肠癌，此外，长双歧杆菌BL21还可以显著缓解结直肠癌模型小鼠结肠部位的炎症反应，减轻结直肠癌模型小鼠氧化应激损伤，改善肠道菌群的微生态环境，维持肠道健康，在制备预防或治疗结直肠癌的产品中前景广阔。

Description

长双歧杆菌BL21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及长双歧杆菌BL21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是结肠癌与直肠癌的总称，是发生在人体下消化道结肠或直肠部位的恶性肿瘤。它是由多种因素引起的一种常见的胃肠道恶性肿瘤，比如遗传因素不当的饮食等生活方式，此外有大量的研究也表明CRC与肠道菌群密切相关，成为全球罹患人数最多的三大癌症之一，其死亡率在男性群体中仅次于肺癌，在女性群体中仅次于乳腺癌，而且在过去的20-30年间，结直肠癌的发病率和死亡率在不断上升，并且呈现年轻化趋势，已经成为威胁我国国民身体健康的主要元凶之一，目前临床上关于结直肠癌的治疗包括传统的切除治疗，免疫治疗和基因治疗，这些治疗方法对人体的副作用大，而且效率低，成本高，所以基于目前的治疗现状，寻找一种安全有效且成本相对较低的防治方法是急需解决的问题。

益生菌是一类生活在宿主体内对宿主有益的活性微生物，是人体肠道中的重要成员，它可以通过维持人体肠道内的菌群平衡，维护人体肠道健康，还能刺激人体免疫应答，抑制或预防癌症的发生。而且随着对益生菌研究的不断加深，越来越多的研究表明因其在肠道中的益生作用，益生菌对结直肠癌细胞的抑制和结肠肿瘤的预防治疗具有一定的功效，目前，关于益生菌可以预防和治疗直肠癌机制还未被直接证实，通过体外和动物实验的研究显示，益生菌主要通过以下几个方面来预防和治疗结直肠癌：改善平衡肠道微生物菌群结构，代谢产生具有抗癌活性的化合物，激活机体抗肿瘤免疫，抑制结肠肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡。细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列级联式的主动性细胞死亡的过程，而益生菌及其代谢产物可以通过调控肿瘤细胞凋亡相关基因的表达，从外源性和内源性两个途径，促进肿瘤细胞的主动性死亡，抑制肿瘤细胞的增殖，因此筛选一株对诱导细胞细胞凋亡的信号通路具有重要的促进作用的益生菌，可以将其与传统疗法结合，成为未来治疗和预防结直肠癌的一种有效手段。

目前也有一些关于益生菌抑制结直肠癌相关的研究和专利，CN10718271A公开了一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法，其基于正常人和结直肠癌患者肠道菌群的分析，构建肠道菌群互作网络，筛选到可更好定植肠道抑制结直肠癌致病菌的益生菌，通过菌株复配得到一种可抑制结直肠癌致病菌的复合益生菌，但其并非直接抗肿瘤，且考虑到株水平上功效的差异性，而其未精确到株，因此在实际功效上可能有差异，CN107629988A公开了一种可缓解结直肠癌的两歧双歧杆菌及其用途，其公开的两歧双歧杆菌精确到株，主要是通过调节结直肠组织中Notch1、Notch2信号通路及VEGFR2分子的表达，来减少直肠部位的肿瘤数量，与直接的诱导细胞凋亡通路有差异。因此从诱导细胞凋亡通路筛选合适的益生菌来抑制结直肠癌，与传统治疗方法结合对预防或治疗结直肠癌意义重大。

然而，目前现有技术中利用益生菌制剂来预防、缓解或治疗结直肠癌的策略还十分有限，这些制剂的预防、缓解或治疗效果也有待提高，因此，提供一种预防、缓解或治疗结直肠癌的新策略具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供长双歧杆菌BL21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供长双歧杆菌BL21在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用。

优选地，在预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中，长双歧杆菌BL21的活菌数不低于1×10⁸CFU/g或1×10⁸CFU/mL，可为1×10⁸CFU/g、5×10⁸CFU/g、1×10⁹CFU/g、5×10⁹CFU/g、1×10¹⁰CFU/g、5×10¹⁰CFU/g、1×10¹¹CFU/g、1×10⁸CFU/mL、5×10⁸CFU/mL、1×10⁹CFU/mL、5×10⁹CFU/mL、1×10¹⁰CFU/mL、5×10¹⁰CFU/mL、1×10¹¹CFU/mL等。

优选地，在预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中，长双歧杆菌BL21以冻干粉的形式存在。

优选地，所述冻干粉由包括如下步骤的方法制备得到：

将长双歧杆菌BL21接种于培养基中培养得菌液，离心，收集菌体，与冻干保护剂混合，冻干，即得。

优选地，所述培养的温度为30-40℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，培养的时间为12-24h，例如12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等。

将长双歧杆菌BL21接种于MRS培养基中培养得种子培养液，将种子培养液转接入发酵培养基中进行发酵得发酵液，离心，收集菌体，与冻干保护剂混合，冻干，即得。

优选地，所述长双歧杆菌BL21的接种量为1％-5％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。

优选地，在种子培养液的制备过程中，所述培养的温度为30-40℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，培养的时间为12-24h，例如12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等。

优选地，所述发酵的温度为30-40℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，培养的时间为12-24h，例如12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等。

优选地，所述发酵培养基包含葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、K₂HPO₄、柠檬酸氢二铵、乙酸钠、MgSO₄、MnSO₄或吐温80中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述发酵培养基中的组分以浓度计包括葡萄糖20-40g/L、蛋白胨10-15g/L、牛肉浸粉5-8g/L、酵母浸粉3-7g/L、K₂HPO₄ 2-3g/L、柠檬酸氢二铵2-3g/L、乙酸钠3-5g/L、MgSO₄ 0.3-0.5g/L、MnSO₄ 0.05-0.1g/L和吐温80 0.5-1.5g/L。

上述20-40g/L中的具体数值例如20g/L、22g/L、25g/L、27g/L、30g/L、32g/L、35g/L、37g/L、40g/L等。

上述10-15g/L中的具体数值例如10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L等。

上述5-8g/L中的具体数值例如5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L、7g/L、7.5g/L、8g/L等。

上述3-7g/L中的具体数值例如3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L等。

上述2-3g/L中的具体数值例如2g/L、2.2g/L、2.4g/L、2.6g/L、2.8g/L、3g/L等。

上述3-5g/L中的具体数值例如3g/L、3.2g/L、3.4g/L、3.6g/L、3.8g/L、3g/L、4.2g/L、4.4g/L、4.6g/L、4.8g/L、5g/L等。

上述0.3-0.5g/L中的具体数值例如0.3g/L、0.32g/L、0.35g/L、0.37g/L、0.4g/L、0.42g/L、0.45g/L、0.47g/L、0.5g/L等。

上述0.05-0.1g/L中的具体数值例如0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.1g/L等。

上述0.5-1.5g/L中的具体数值例如0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L等。

优选地，所述冻干保护剂包括海藻糖、蔗糖、甘露醇或吐温中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如海藻糖和蔗糖的组合、甘露醇和吐温的组合、蔗糖和甘露醇的组合等，其他任意的组合方式均可。

优选地，所述冻干保护剂以重量份数计包括海藻糖10-15份、甘油1-2份、甘露醇0.02-0.1份和吐温0.02-0.1份。

上述10-15份中的具体数值例如10份、10.5份、11份、11.5份、12份、12.5份、13份、13.5份、14份、14.5份、15份等。

上述1-2份中的具体数值例如1份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份、1.5份、1.6份、1.7份、1.8份、1.9份、2份等。

上述0.02-0.1份中的具体数值例如0.02份、0.03份、0.04份、0.05份、0.06份、0.07份、0.08份、0.09份、0.1份等。

优选地，所述菌体与冻干保护剂的质量比为1:(1-4)。

上述(1-4)中的具体数值例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4等。

第二方面，本发明提供一种包含长双歧杆菌BL21的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用，所述包含长双歧杆菌BL21的菌剂中还包括鼠李糖乳杆菌LRa05。

优选地，在所述包含长双歧杆菌BL21的菌剂中，长双歧杆菌BL21与鼠李糖乳杆菌LRa05的活菌数之比为(2-4):1。

上述(2-4)中的具体数值例如2、2.2、2.5、2.7、3、3.2、3.5、3.7、4等。

在所述包含长双歧杆菌BL21的菌剂中，两种菌株在满足上述特定的活菌数比例关系时具有更优的协同增效的效果。

在本发明中，所述产品包括药品。

优选地，所述药品的剂型包括溶液剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。

优选地，所述药品还包括药物载体和/或药学上可接受的辅料。

优选地，所述药学上可接受的辅料包括赋形剂、填充剂、崩解剂、粘合剂润滑剂、稀释剂或调味剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如赋形剂和填充剂的组合、粘合剂和赋形剂的组合、稀释剂和调味剂的组合等，其他任意的组合方式均可。

第三方面，本发明提供长双歧杆菌BL21在制备HT-29细胞增殖抑制剂或HT-29细胞凋亡诱导剂中的应用。

进一步地，本发明提供长双歧杆菌BL21在以非诊断/治疗为目的的制备HT-29细胞增殖抑制剂或HT-29细胞凋亡诱导剂中的应用。

本发明还提供一种包含长双歧杆菌BL21的菌剂在以非诊断/治疗为目的的制备HT-29细胞增殖抑制剂中的应用，所述包含长双歧杆菌BL21的菌剂中还包括鼠李糖乳杆菌LRa05。

所述应用例如涉及HT-29细胞增殖或凋亡的相关机制的基础研究等。

第四方面，本发明提供长双歧杆菌BL21在制备TNF-ɑ拮抗剂、IL-6拮抗剂或IL-10分泌促进剂中的应用。

进一步地，本发明提供长双歧杆菌BL21在以非诊断/治疗为目的的制备TNF-ɑ拮抗剂、IL-6拮抗剂或IL-10分泌促进剂中的应用。

所述应用例如与TNF-ɑ、IL-6或IL-10的分泌相关的基础研究等。

第五方面，本发明提供长双歧杆菌BL21在制备Bcl-xl抑制剂、Bcl-2抑制剂、CASP3表达促进剂或Bax表达促进剂中的应用。

进一步地，本发明提供长双歧杆菌BL21在以非诊断/治疗为目的的制备Bcl-xl抑制剂、Bcl-2抑制剂、CASP3表达促进剂或Bax表达促进剂中的应用。

所述应用例如与Bcl-xl、Bcl-2、CASP3或Bax表达相关的基础研究等。

第六方面，本发明提供长双歧杆菌BL21在调节肠道菌群中的应用。

进一步地，本发明提供长双歧杆菌BL21在以非诊断/治疗为目的的调节肠道菌群中的应用。

所述应用例如肠道菌群多样性相关的基础研究等。

第七方面，本发明提供长双歧杆菌BL21在以非诊断/治疗为目的的制备氧化应激抑制剂中的应用。

所述应用例如氧化应激相关机制研究、与T-SOD、GSH或MDA等氧化应激指标相关的基础研究等。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所涉及的长双歧杆菌BL21耐酸耐胆盐性能好，并且能够显著抑制结直肠癌的发生，具体表现在：(1)对HT-29细胞的粘附性好，有利于其在肠道定植，发挥自身的有益功能；(2)可以显著抑制HT-29细胞的增殖；(3)能够调节HT-29细胞凋亡相关基因的表达，提高促凋亡因子CASP3，Bax的基因表达水平，并降低抗凋亡因子Bcl-xl和Bcl-2的基因表达水平，从而诱导HT-29细胞的凋亡；(4)可以显著减少结直肠癌模型小鼠结直肠组织内肿瘤的数量，抗肿瘤能力强；(5)能够降低结直肠癌模型小鼠血清中的促炎因子：TNF-ɑ和IL-6的水平，并提高抗炎因子IL-10的水平，从而缓解小鼠结直肠炎症水平，增强肠道免疫力；(6)能够显著影响结直肠癌小鼠结直肠中氧化应激指标，显著提升结直肠癌小鼠T-SOD和GSH水平，并降低MDA水平，从而减少氧化应激损伤；(7)能够调节结直肠癌模型小鼠结直肠肿瘤细胞凋亡相关基因的表达，提高促凋亡因子CASP3，Bax的基因表达水平，并降低抗凋亡因子Bcl-xl和Bcl-2的基因表达水平，从而诱导小鼠结直肠肿瘤细胞的凋亡；(8)可以改善肠道菌群的微生态环境，保证肠道菌群的平衡。因此，将其用于制备用于预防和/或缓解和/或治疗结肠癌的药品具有很好的前景。

本发明还创造性地发现本发明所涉及的长双歧杆菌BL21菌株和鼠李糖乳杆菌LRa05菌株进行复配使用用于预防和/或治疗结直肠癌，同样具有优异的效果，且与单一BL21菌剂或单一LRa05菌剂相比，复合菌剂具有更显著的预防和/或治疗结直肠癌的效果，说明BL21菌株与LRa05菌株在预防和/或治疗结直肠癌方面具有协同增效作用。

附图说明

图1是实施例3中长双歧杆菌BL21对HT-29细胞的抑制能力分析结果图。

图2是实施例4中长双歧杆菌BL21对HT-29细胞凋亡相关信号通路的调节分析结果图。

图3是实施例7中长双歧杆菌BL21对结直肠癌小鼠结直肠中超氧化物歧化酶水平的影响结果图。

图4是实施例7中长双歧杆菌BL21对结直肠癌小鼠结直肠中谷胱甘肽水平的影响结果图。

图5是实施例7中长双歧杆菌BL21对结直肠癌小鼠结直肠中丙二醛水平的影响结果图。

图6是实施例8中长双歧杆菌BL21对小鼠结直肠组织中凋亡相关信号通路的调节分析结果图。

图7是实施例9中长双歧杆菌BL21对小鼠肠道菌群结构的影响结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

试验材料：

长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BL21菌株于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为保藏编号为CGMCC No.10452，具体保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRa05，(更新后的菌种名称为鼠李糖乳酪杆菌)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1.12734，保藏日期为2020年7月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

HT-29细胞(人结直肠癌细胞株)，购买于中国科学院上海细胞库；RPMI 1640培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清和PBS购自Hyclone公司；MTT，青链霉素和胰酶-EDTA购自北京索莱宝生物科技有限公司；

6周龄ICR健康雄性小鼠，小鼠饲料购自上海斯莱克公司；测定TNF-α、IL-6和IL-10检测用ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，测定超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)检测用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

MRS培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、K₂HPO₄ 2g/L、柠檬酸三铵2g/L、乙酸钠5g/L、MgSO₄ 0.2g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温80 1.0g/L。

实施例1

长双歧杆菌BL21对模拟胃肠液的耐受性分析

(1)长双歧杆菌BL21对模拟胃液的耐受性

将长双歧杆菌BL21按照1％接种于MRS培养基中，于37℃条件下培养16h后，8000rpm离心5min，收集菌体，将收集的菌体用无菌生理盐水重悬洗涤后再次离心收集菌体，将菌体分别重悬于9mL pH2.0、2.5和3.0的人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶，pH2.0，2.5和3.0的MRS培养基)于37℃条件下厌氧静置培养3h，分别在开始0h和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：

存活率(％)＝处理3h后活菌数/初始活菌数×100％。

测试结果如表1所示。

表1长双歧杆菌BL21对模拟胃液的耐受性

由表1可以看出，本发明所述的长双歧杆菌具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中培养3h，存活率可达74.58％以上；在pH为2.5的人工胃液中培养3h，存活率可达85.03％以上；在pH为3.0的人工胃液中培养3h，存活率可达90.61％以上。

(2)长双歧杆菌BL21对模拟肠液的耐受性

将长双歧杆菌BL21按照1％接种于MRS培养基中，于37℃条件下培养16h后，8000rpm离心5min，收集菌体，将收集的菌体用无菌生理盐水重悬洗涤后再次离心取菌体，将收集的菌体重悬于9mL人工模拟肠液(含1％胰蛋白酶，0.3％胆盐MRS培养基)于37℃条件下厌氧静置培养4h，分别在开始0h，处理2h和4h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：

存活率(％)＝处理一定时间后活菌数/初始活菌数×100％。

测试结果如表2所示。

表2长双歧杆菌BL21对模拟肠液的耐受性

由表2可以看出，本发明所述的长双歧杆菌耐胆盐能力也很好，在含0.3％胆盐MRS培养基中培养4h，存活率依然能达到59.12％，存活率达到一半以上，其良好的耐酸耐胆盐特性为其顺利到达肠道，在肠道中发挥抑制结直肠癌提供了保证。

实施例2

长双歧杆菌BL21对HT-29细胞的体外粘附能力研究

1.HT-29细胞培养传代

从超低温冰箱中拿出存有HT-29细胞的冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅中，轻微摇动使其在1-1.5min内快速融化，将冻存管取出，用75％酒精消毒后放入超净台中。用移液枪将细胞悬液吸至离心管中，加入2mLRPMI 1640培养基(含10％双抗，1％胎牛血清)，轻轻吹打混匀后，1080r/min离心5min，小心吸弃上清液，再加入3mL RPMI 1640培养基(含10％双抗，1％胎牛血清)，轻轻吹打重悬细胞，用移液枪将细胞悬液吸至25mL培养瓶中，再补加RPMI 1640培养基至总体积为5mL，然后放到37℃，5％ CO₂培养箱中培养2-3天后，待贴壁细胞数量达到80％-90％时，开始按1:4传代。用移液枪吸弃旧的培养液，加入4mL PBS轻轻摇动培养瓶清洗1-2次后，弃掉PBS，加入2mL胰酶-EDTA，消化1-3min，待发现细胞变圆，细胞间有空隙时，即可将胰酶弃掉，加入4mL RPMI 1640培养基终止消化，并用5mL移液枪反复轻轻吹打细胞，使细胞混匀完全悬浮起来，以1:4分至新的培养瓶中继续培养。

2.长双歧杆菌BL21菌液制备

将长双歧杆菌BL21按照1％接种于MRS培养基中，于37℃条件下培养16h后，8000rpm离心5min，收集菌体，用无菌PBS清洗重悬清洗菌体1次后，再次离心取菌体，以RPMI1640培养基(无双抗和胎牛血清)重悬至菌体浓度为1×10⁸CFU/mL，待用。

3.细胞粘附试验

将按上述细胞培养传代方法培养传代后，收集培养好的细胞，用血球计数板计数，用RPMI 1640培养基(含10％双抗，1％胎牛血清)调整细胞浓度为2×10⁵个/mL，取2mL细胞悬液接种于预先置入无菌盖玻片的6孔板中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养，待细胞贴壁盖玻片长成单层后，用无菌PBS清洗2遍，每孔加入2mL上步制得的长双歧杆菌BL21菌液于37℃，5％ CO₂培养箱中继续孵育2h，取出6孔板，用无菌PBS清洗5次，去除未粘附的菌体，加入甲醇固定30min，固定结束后去掉甲醇，取盖玻片进行革兰氏染色，显微镜观察，随机选取10个视野，记录100个细胞粘附的细菌个数，并计算得到每个细胞粘附的细菌个数，来表示长双歧杆菌BL21对HT-29细胞粘附能力的大小。

表3长双歧杆菌BL21对HT-29细胞粘附能力

由表3可知，发现长双歧杆菌BL21的细胞粘附个数为27.33±2.08个/细胞，处在较高的水平。其较好的细胞黏附能力有利于其在肠道定植，发挥自身的有益功能。

实施例3

长双歧杆菌BL21对HT-29细胞的抑制能力

按照实施例2的方法将HT-29细胞培养传代后，收集对数期的细胞，经胰酶-EDTA消化后，加4mL培养基终止消化，吹打重悬细胞，进行细胞计数，估算出细胞数量，然后用培养基调整细胞浓度为1×10⁵/mL，取100μL细胞悬液接种于96孔板中间孔中，放置于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养，待细胞完全贴壁后，弃去旧培养液，加入100μL RPMI 1640培养基(无抗)后进行分组实验。实验共设置6组，分别为长双歧杆菌BL21组、鼠李糖乳杆菌LRa05组、BL21+LRa05联合组、两歧双歧杆菌HNJ16组、空白对照组和阳性对照组。各组的加药处理方法如下：

长双歧杆菌BL21组(BL21)：加入100μL 1×10⁸CFU/mL的长双歧杆菌BL21菌液；鼠李糖乳杆菌LRa05组(LRa05)：加入100μL密度1×10⁸CFU/mL的鼠李糖乳杆菌LRa05菌液，BL21+LRa05联合组(BL21+LRa05)，加入80μL密度1×10⁸CFU/mL的长双歧杆菌BL21菌液和20μL密度1×10⁸CFU/mL的鼠李糖乳杆菌LRa05菌液；两歧双歧杆菌HNJ16(保藏编号为GDMCCNo.60255)组：加入100μL 1×10⁸CFU/mL的两歧双歧杆菌HNJ16菌液；空白对照组：加入100μL RPMI 1640培养基(无血清)；阳性对照组：加入100μLRPMI 1640培养基(无血清)，同时加入10μg/mL的抗结肠癌药物5-FU(胸苷酸合成酶抑制药)。鼠李糖乳杆菌LRa05菌液和两歧双歧杆菌HNJ16菌液的制备方法参照实施例2中长双歧杆菌BL21菌液的制备方法。

各组6个复孔，加药处理后，放入细胞培养箱中继续培养24h，药物作用结束后，吸弃旧液并用PBS润洗，每孔加入100μL 5mg/mL MTT，继续孵育4h后，小心吸弃废液，每孔加入150μL DMSO，震荡摇匀10min，以充分溶解甲瓒(Formazan)，然后用酶标仪在490nm处测定吸光度值，按照如下公式计算细胞存活率：

HT-29细胞存活率(％)＝(各组的OD值/空白组的OD值)×100％，结果如图1所示。

由图1可以看出长双歧杆菌BL21可以显著抑制HT-29细胞增殖，并且抑制效果优于专利已报道的两歧双歧杆菌HNJ16，此外还可以发现BL21+LRa05联合组对HT-29细胞的抑制效果优于单一菌剂组，说明BL21菌株与LRa05菌株在抑制HT-29细胞方面具有协同增效作用，进一步推知，将二者联用在预防或治疗结直肠癌方面也极有可能产生更好的疗效。

实施例4

长双歧杆菌BL21对HT-29细胞凋亡相关信号通路的调节

选取生长状态好的HT-29细胞，消化后，按照实施例3的方法将细胞密度调整为1×10⁵/mL，接种于6孔板中，每孔接种2mL，37℃，5％ CO₂培养箱中孵育24h贴壁后，移除培养液，加入2mL RPMI 1640培养基(无抗)后，进行分组处理。实验组(BL21)：加入2mL 1×10⁸CFU/mL的长双歧杆菌BL21菌液；对照组：加入2mL RPMI 1640培养基(无血清)。分组处理后放入细胞培养箱中继续培养24h，处理结束后，吸弃培养液，用PBS润洗2遍后，每孔加入1mLTRIzol(细胞裂解液)进行直接裂解，然后用RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒按照说明书提取细胞内的RNA，将1.5μg的RNA，根据RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit的说明书，通过反转录反应得到cDNA，荧光定量PCR，具体操作采用SYBRGreen qPCR法，所用引物如表4所示。

表4细胞凋亡相关基因引物序列

结果如图2所示，与对照组相比，长双歧杆菌BL21处理组促凋亡基因CASP3和Bax表达水平均显著上调，抗凋亡基因Bcl-xl和Bax表达水平显著下调，说明长双歧杆菌BL21主要是通过调节细胞凋亡相关基因水平，诱导细胞凋亡来达到预防、缓解或治疗结直肠癌的作用。

实施例5

长双歧杆菌BL21对小鼠结直肠肿瘤的抑制作用

(1)动物实验设计及结直肠癌小鼠模型建立

取体重20-25g的6周龄健康ICR级小鼠70只，随机分为7组：空白对照组(Control)，结直肠癌模型组(CRC组)，长双歧杆菌BL21实验组(BL21组)，鼠李糖乳杆菌LRa05实验组(LRa05组)，长双歧杆菌BL21和鼠李糖乳杆菌LRa05联合组(BL21+LRa05组)，两歧双歧杆菌HNJ16实验组(HNJ16组)和阳性对照组(5-FU组)。

造模方法采用AOM-DSS法，具体为：先腹腔注射AOM(7.5mg/kg)，后续通过在饮用水中经口给予2％葡聚糖硫酸钠DSS(w/v)4天，正常水饲养7天，再次通过在饮用水中经口给予2％葡聚糖硫酸钠DSS(w/v)4天，正常水饲养15天。

空白对照组不进行造模，按照0.1mL/10g灌胃3％蔗糖溶液，每天一次。其他组均进行造模，并在造模期间，各组每天给药一次：结直肠癌模型组按照0.1mL/10g灌胃3％蔗糖溶液；BL21实验组灌胃200μL 5×10⁹CFU/mL的长双歧杆菌BL21菌液；LRa05实验组灌胃200μL5×10⁹CFU/mL鼠李糖乳杆菌LRa05菌液；BL21+LRa05实验组灌胃150μL 5×10⁹CFU/mL的长双歧杆菌BL21菌液和50μL 5×10⁹CFU/mL鼠李糖乳杆菌LRa05菌液；两歧双歧杆菌HNJ16实验组灌胃200μL 5×10⁹CFU/mL两歧双歧杆菌HNJ16菌液；阳性对照组灌胃10mg/kg的5-FU。

造模干预结束后，将小鼠解剖，取小鼠血清，结肠和直肠，并将结肠和直肠解剖剥离瘤块，称瘤重，按平均瘤重计算抑瘤率，具体计算方法：

抑瘤率(％)＝[(CRC组平均瘤重-各组平均瘤重)/CRC组平均瘤重]×100％。

结果如表5所示。

表5长双歧杆菌BL21对小鼠结直肠肿瘤的抑制作用

可以看到，长双歧杆菌BL21的抑瘤率达到44.1％，可以显著抑制小鼠结直肠肿瘤的生长，且抑制肿瘤的效果优于专利已报道的两歧双歧杆菌HNJ16，鼠李糖乳杆菌LRa05也具有一定的抑制肿瘤的效果，抑瘤率为35.1％，此外，还可以发现将长双歧杆菌BL21和鼠李糖乳杆菌LRa05联合灌胃对小鼠结直肠肿瘤的抑制效果最好，抑瘤效果与抗结肠癌药物5-FU效果相当，而且优于单一菌剂组，说明BL21菌株与LRa05菌株在抑制结直肠肿瘤效果方面具有协同增效作用(与实施例3得到的结论一致)。

实施例6

长双歧杆菌BL21对结直肠癌小鼠血清中炎症因子的影响

取实施例5得到的血清，分析各组小鼠的血清肿瘤坏死因子TNF-α、白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)的含量，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测：采用ELISA试剂盒(上海慕柏生物技术有限公司)按照试剂盒说明书检测结肠组织中炎症介质(包括TNF-α、IL-6和IL-10)的水平。结果如表6所示。

表6长双歧杆菌LRa05对对小鼠血清中炎症因子的影响

结直肠癌小鼠模型(CRC组)血清中促炎因子TNF-α和IL-6水平较空白对照组(Control组)显著升高，抑炎因子IL-10水平显著降低，而长双歧杆菌BL21(BL21组)可将显著降低TNF-α和IL-6水平，同时显著提升IL-10水平，说明长双歧杆菌BL21可以抑制肠道炎症，提高肠道免疫力，从而达到缓解或预防结直肠癌的功效。

实施例7

长双歧杆菌BL21对结直肠癌小鼠结直肠中氧化应激指标的影响

取实施例5得到的各组小鼠的结肠组织，加入生理盐水中，然后匀浆，得到10％结肠匀浆。将匀浆离心10min(5,000g，4℃)以获得上清液。通过南京建成生物工程公司的检测试剂盒测定超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平。

结果如图3、图4和图5所示：与空白对照组(Control组)即正常小鼠相比，结直肠癌小鼠(CRC组)的T-SOD和GSH水平显著降低(p<0.001)，且MDA含量显著升高(p<0.001)。而给予长双歧杆菌BL21干预的结直肠癌小鼠的T-SOD和GSH水平明显升高，MDA水平显著降低(p<0.001)。此结果充分证实了长双歧杆菌BL21对结直肠癌小鼠结直肠中氧化应激指标产生了显著影响，包括促进T-SOD和GSH水平的升高，和MDA水平的降低。

实施例8

长双歧杆菌BL21对小鼠结直肠组织中凋亡相关信号通路的调节

取实施例5得到的小鼠的结肠组织，加入1mL TRIzol(细胞裂解液)，采用组织破碎仪进行研磨破碎，然后按照实施例6的方法采用试剂盒提取RNA，并进行反转录和q-PCR定量分析，所用引物如表7所示。

表7小鼠结肠组织中凋亡相关基因引物序列

结果如图6所示，与空白对照组相比，结直肠癌小鼠模型(CRC组)促凋亡基因CASP3和Bax表达水平均出现明显下降，抗凋亡基因Bcl-xl和Bcl-2表达水平均出现显著升高，而与CRC组相比，长双歧杆菌BL21干预组(BL21组)的CASP3和Bax基因表达水平显著上调，同时Bcl-xl和Bcl-2基因表达水平显著下调，说明长双歧杆菌BL21在体内可以通过调节细胞凋亡相关基因水平，诱导细胞凋亡达到抑制或缓解结直肠癌的作用。

实施例9

长双歧杆菌BL21对小鼠肠道菌群结构的影响

取实施例5中小鼠的粪便，采用Fast DNA Stool Mini Kit提取粪便微生物基因组DNA，具体流程参照试剂盒说明书，经过琼脂凝胶中电泳确定DNA的纯度后，将得到的DNA溶液送至二代测序仪测序并分析。

具体结果如图7所示，与空白对照组相比，在结直肠癌小鼠模型(CRC组)中，厚壁菌门和疣微菌门相对丰度显著降低，放线菌门和拟杆菌门相对丰度也有所减少，而变形菌门和梭杆菌门均明显增加，长双歧杆菌BL21干预后，小鼠肠道内厚壁菌门和疣微菌门的相对丰度均显著增加，同时也显著降低了变形菌门和梭杆菌门的相对丰度，此结果充分说明了长双歧杆菌BL21可以调节小鼠肠道菌群的结构，改善肠道菌群失衡，可能通过调节微生物菌群代谢功能、影响小鼠肠道组织重要功能基因表达而影响结直肠癌变进展。

实施例10

长双歧杆菌BL21冻干粉的制备

将长双歧杆菌BL21冻存管溶解后，按照2％接种于MRS培养基中，于37℃培养20h，得到长双歧杆菌BL21种子培养液，将得到的种子培养液按照1％转接入发酵培养基中进行高密度培养，培养条件为37℃，16h，得到长双歧杆菌BL21发酵液，6500rpm下离心15min，收集菌泥，按照菌泥与冻干保护剂质量比1:2，加入含冻干保护剂的溶液，经过乳化后，进行冷冻干燥，得到长双歧杆菌BL21冻干粉。

发酵培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、K₂HPO₄2g/L、柠檬氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、MgSO₄ 0.2g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温80 1.0g/L。

含冻干保护剂的溶液以质量百分含量计包括：海藻糖10％，甘油2％，甘露醇0.1％，吐温80 0.02％，余量为水。

实施例11

长双歧杆菌BL21在制备功能性发酵乳中的应用

将1.2％的稀奶油加入到75℃的89.8％生牛乳中，再将0.5％稳定剂(0.3％果胶和0.2％大豆多糖)、8％白砂糖和0.5％乳清蛋白粉混匀后加入奶液中搅拌溶解均匀后，于50℃水合30min后进行均质，均质条件为：均质温度为65℃，均质压力为18Mpa，均质结束后于95℃杀菌5min，然后冷却至42℃后，取实施例10得到的长双歧杆菌BL21冻干粉与嗜热链球菌(ATCC BAA-491)和保加利亚乳杆菌(即德氏乳杆菌保加利亚亚种，ATCC BAA-365)按照活菌数比2:1:1接种，42℃发酵12h，得发酵乳，于4℃下进行后熟，后熟时间为12h，获得含有长双歧杆菌BL21的酸奶。

实施例12

长双歧杆菌BL21在制备胶囊制品中的应用

取实施例10得到的长双歧杆菌BL21冻干粉10重量份，与6.4重量份的低聚果糖，5重量份的硬脂酸镁，0.3重量份的二氧化硅和78.3重量份的麦芽糊精复配充分混匀后得到含有长双歧杆菌BL21益生菌粉剂，把这种粉剂装入市售的药用微胶囊中，得到含长双歧杆菌BL21的胶囊制品。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的长双歧杆菌BL21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 微康益生菌（苏州）股份有限公司

<120> 长双歧杆菌BL21及包含其的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中

的应用

<130> 2022-4-24

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaattgtgg aattgatgcg tga 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctacaacgat cccctctgaa aaa 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catataaccc cgtcaacgca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcagccgcca caaacatac 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggctggttc ctgagcttcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcatgatcc ctccggccgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccagagttt gagccgagtg 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccatccctt cgtcgtcct 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgactggaa agccgaaact c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgacccgtcc tttgaatttc t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agacaggggc ctttttgcta c 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aattcgccgg agacactcg 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tggccttcta cgccagaca 19

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccaggaatca gttgaccaag tc 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agacgcagct actgctgttg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cggatcgttt ccaccgagac 20

Claims

1.长双歧杆菌BL21在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用；

所述长双歧杆菌BL21为长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株，于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为保藏编号为CGMCC No. 10452。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中，长双歧杆菌BL21的活菌数不低于1×10⁸CFU/g或1×10⁸CFU/mL。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中，长双歧杆菌BL21以冻干粉的形式存在。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述冻干粉由包括如下步骤的方法制备得到：

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述培养的温度为30-40℃，培养的时间为12-24 h。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述冻干保护剂包括海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇或吐温中的任意一种或至少两种的组合。

7.一种包含长双歧杆菌BL21的菌剂在制备预防、缓解或治疗结直肠癌的产品中的应用，其特征在于，所述包含长双歧杆菌BL21的菌剂中还包括鼠李糖乳杆菌LRa05；

所述长双歧杆菌BL21为长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株，于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为保藏编号为CGMCC No. 10452；

所述鼠李糖乳杆菌LRa05为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株，于2020年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.1.12734。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，在所述包含长双歧杆菌BL21的菌剂中，长双歧杆菌BL21与鼠李糖乳杆菌LRa05的活菌数之比为(2-4):1。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括药品。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药品的剂型包括溶液剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。

11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药品还包括药物载体和/或药学上可接受的辅料。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂或调味剂中的任意一种或至少两种的组合。

13.长双歧杆菌BL21在制备HT-29细胞增殖抑制剂或HT-29细胞凋亡诱导剂中的应用；

14.长双歧杆菌BL21在制备Bcl-xl抑制剂、Bcl-2抑制剂、CASP3表达促进剂或Bax表达促进剂中的应用；

所述长双歧杆菌BL21为长双歧杆菌

Bifidobacterium longum

BL21菌株，于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为保藏编号为CGMCC No. 10452。