CN113604410B - 一种植物乳杆菌yt013及其应用 - Google Patents

一种植物乳杆菌yt013及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌YT013及其应用。本发明从浆水中筛选出了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YT013，所述植物乳杆菌YT013于2018年11月12日保藏于武汉大学菌种保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018775。所述的植物乳杆菌YT013对胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌细胞具有较强抑制作用；并且所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum YT013来源于浆水，具有较高的安全性，可作为抗胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌候选药物，具有潜在的开发应用前景。

Description

一种植物乳杆菌YT013及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌YT013及其应用。
背景技术
胃癌(GC)是威胁人类健康的常见疾病。根据国际癌症研究机构(IARC)编制的GLOBOCAN 2018，胃癌的发病率是世界上第五大最常见癌症，也是第三大癌症死亡原因。此外，根据2019年国家癌症登记中心(NCCR)的登记数据，中国癌症的发病率和死亡率一直在上升，这使得胃癌自2010年以来成为主要死因，其中胃癌的发病率和死亡率是中国第二大癌症，仅次于肺癌。结直肠癌(colorectalcancer，CRC)也是一种常见的恶性肿瘤，占我国恶性肿瘤的第四位，并有上升的趋势，具有较高的发病率和病死率。其中2012年全球癌症统计结果表明，世界范围内结直肠癌在发达国家的死亡率及发病率均位列前三，在发展中国家其男女发病率及死亡率均位列前三。近年来，在我国CRC发病率及死亡率为14.2/10万和7.4/10万，均居第五位。现阶段我国结直肠癌发病率明显上升，其在41-65岁人群中发病率最高，且呈现稳定的增长趋势。
目前，胃癌治疗的主要困难是手术治疗，对进展期胃癌疗效差，不能根除肿瘤细胞，易发生转移和复发。化疗不仅容易产生耐药性，而且容易引起严重的副作用。所谓的“低毒”靶向药物，当肿瘤或肿瘤细胞的靶蛋白突变通过其他途径增殖时，容易产生非靶向效应和特殊毒性反应。大肠癌的治疗以手术切除癌肿为首选，辅之以放射治疗、化疗药物治疗及中医药治疗等，其中术后服用5-Fu等化疗药物可以防止肿瘤复发。但是5-Fu等一线化疗药物缺乏选择性，靶向性，并且作用于细胞的DNA，影响细胞增殖。
令人欣慰的是，与传统治疗药物相比，天然药物因其安全有效、疗效稳定、副作用少而受到广泛关注。近年来，通过人们对天然产物的研究发现，天然产物抗肿瘤的效果具有低毒高效的特点。其中益生菌作为一种安全的可食用的食品，其在多种疾病中的缓解及治疗作用逐步被研究所证实，例如促进消化吸收、增强免疫力、预防生殖系统感染、缓解过敏反应、预防与抑制肿瘤、预防与抑制心脑血管疾病、预防与抑制神经性疾病等。因此，开发治疗胃癌的天然药物可以克服传统药物的缺点，提高患者的生活质量。
发明人前期研究发现，将浆水加入RPMI培养基或DMEM培养基重悬沉淀，恒温培养，离心获得的浆水无细胞培养液对结直肠癌、胃癌、肝癌和胰腺癌细胞均具有一定的抑制作用，但是需要浆水无细胞培养液的量较多。
植物乳杆菌是乳酸菌的一种，属于革兰氏阳性菌，可发酵碳水化合物并且产生大量乳酸，因其优越的发酵性能和多样的功能性，得到广泛的关注，其发酵食品在全球各地食用历史悠久，同时也是公认安全(GRAS)的食用菌种。目前，植物乳杆菌已被广泛地应用到营养保健、发酵食品、生物医药、饲料、畜牧养殖等行业中。植物乳杆菌也是人体胃肠道的益生菌群，代谢可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质，具有调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等作用。但对植物乳杆菌抑制结直肠癌相关研究报道很少。
本发明从浆水中筛选出了一种植物乳杆菌YT013，该菌株对人胃癌AGS、结肠癌HCT116、肝癌HepG2、胰腺癌PANC-1的生长具有显著的抑制作用，且其对结直肠癌、胃癌、肝癌和胰腺癌细胞的抑制作用显著强于同体积的浆水无细胞培养液；可作为抗胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌候选药物，具有潜在的开发应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一株抑制胃癌、结直肠癌细胞生长的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌YT013于2018年11月12日保藏于武汉大学菌种保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018775；具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YT013，所述植物乳杆菌YT013于2018年11月12日保藏于武汉大学菌种保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M 2018775。
优选地，所述植物乳杆菌YT013的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明提供了一种上述第一方所述的植物乳杆菌YT013在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌。
第三方面，本发明提供了一种上述第一方所述的植物乳杆菌YT013的无细胞培养液在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌。
第四方面，本发明提供了一种植物乳杆菌YT013发酵冻干粉的制备方法，所述制备方法为：将上述第一方所述的植物乳杆菌YT013发酵，将发酵液经蛋白酶孵育后，离心、冻干，即得植物乳杆菌YT013发酵冻干粉。
优选地，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将上述第一方所述的植物乳杆菌YT013接种于MRS培养基上，活化；
(2)将步骤(1)活化后的植物乳杆菌YT013接种到MRS培养基中发酵获得发酵剂；
(3)将步骤(2)所述的发酵剂加入到MRS培养基中培育获得发酵液；
(4)将步骤(3)所述的发酵液离心，调pH为中性，获取无细胞发酵液；
(5)将步骤(4)所述的发酵液用蛋白酶孵育，离心，冻干，即得植物乳杆菌YT013发酵液冻干粉。
优选地，所述步骤(2)中植物乳杆菌YT013的接种量为5％。
优选地，所述步骤(3)中培育条件为：37℃，培育48h。
优选地，所述步骤(4)中pH为7.2。
第五方面，本发明提供了一种植物乳杆菌YT013无细胞培养液的制备方法，所述制备方法为：根据上述第四方面所述方法制备获得植物乳杆菌YT013发酵液冻干粉；将植物乳杆菌YT013发酵液冻干粉，用细胞培养基溶解，然后用无菌滤膜过滤，即得植物乳杆菌YT013无细胞培养液。
本发明的有益效果是：①本发明提供的植物乳杆菌YT013或其无细胞培养液对胃癌细胞、结肠癌细胞、肝癌以及胰腺癌细胞等多种肿瘤细胞具有较强抑制作用，能够用于制备抗肿瘤药物；②本发明所述的植物乳杆菌YT013或其无细胞培养液对胃癌细胞、结肠癌细胞、肝癌以及胰腺癌细胞等多种肿瘤细胞的抑制作用显著强于同体积的浆水无细胞培养液；③本发明提供的植物乳杆菌YT013来源于浆水，具有较高的安全性，可作为抗肿瘤的候选药物，具有潜在的开发应用前景。
附图说明
图1植物乳杆菌YT013的系统进化树；
图2植物乳杆菌YT013抗AGS胃癌细胞实验结果图；
图3植物乳杆菌YT013抗HCT116结直肠癌细胞实验结果图；
图4植物乳杆菌YT013抗HepG2肝癌细胞实验结果图；
图5植物乳杆菌YT013抗PANC-1胰腺癌细胞实验结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
在本发明的下述实施例中所用菌株来源如下：
实验菌株：植物乳杆菌YT013分离于浆水(采集于36°2′28.30″北，103°51′29.35″东)，其他实验材料和仪器如无特殊说明，均可通过商业途径购买。
实施例1植物乳杆菌YT013的分离与纯化
1.分离
购买市售浆水，并记录购买地的地理坐标(采集于36°2′28.30″北，103°51′29.35″东)，用稀释涂布平板法和平板划线法进行分离。
2.纯化培养
(1)样品涂布：将浆水样本在无菌条件下稀释10-4、10-5、10-6、10-7四个梯度，涂布于MRS培养基表面，每个浓度梯度5个重复；
(2)培养：将涂布有浆水样本的MRS培养基平板置于37℃恒温培养；
(3)纯化：挑取培养24h-48h的各平板上的单菌落用划线法进行纯化(纯化培养基及温度和分离时一致)，待长出菌落后观察菌落形态和菌体细胞显微形态，有必要时再次纯化，挑选菌落形态整齐、显微镜下菌系细胞形态一致的菌落藏待用。
3.植物乳杆菌YT013的16S rRNA的序列分析
植物乳杆菌YT013的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库，利用BLAST搜索同源性较高的序列，用CLUSTAL X 1.81和MEGA 6.0软件进行序列的比对分析并建立系统发育树，结果如图1所示。可知该菌株隶属于乳杆菌属(Lactobacillus)，初步确定该菌为植物乳杆菌YT013。
4.菌株初步鉴定与保藏
植物乳杆菌YT013通过革兰氏染色初步证明是植物乳杆菌YT013，该菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YT013，于2018年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018775；保藏地址为：中国武汉，武汉大学；联系电话：027-48754052。
实施例2植物乳杆菌YT013抗癌细胞增殖
1.实验用材料的制备
(1)取植物乳杆菌YT013菌株，37℃活化培养两代，离心(2000g，15min，4℃)后用紫外分光光度计计算细菌浓度，将植物乳杆菌YT013加入MRS培养基中，终浓度为1.0×108CFU/mL，37℃恒温培养48h，收集发酵液；
(2)发酵液经离心(2000g，15min，4℃)除去细胞，用1M NaOH调节pH为7.2，获取无细胞发酵液；
(3)用1mg/mL的蛋白酶37℃孵育30min，除去蛋白，然后将蛋白酶(失活100℃，10min)，离心(2000g，10min)后获得发酵上清；
(4)将步骤(3)所获得的上清液冻干，即得植物乳杆菌YT013上清液冻干粉；产率为38.20mg/mL；
(5)将步骤(4)所获得的上清液冻干粉，用细胞培养基溶解，然后用0.22μm的无菌滤膜过滤两次，即得植物乳杆菌YT013无细胞培养液。
2.植物乳杆菌YT013抗胃癌细胞
(1)将胃癌细胞AGS按照104/孔加入96孔板，每孔含100μL培养基，过夜培养；
(2)按照每孔200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL加入上述培养基溶液；相当于每孔分别加入植物乳杆菌YT013发酵上清液5.24μL、10.47μL、15.71μL、20.94μL、26.18μL。每个孔重复六次。然后将平板在37℃和5％CO2中孵育48h；
(3)加入含10μL CCK-8的培养基100μL，37℃孵育2h后450nm测量吸光度；
(4)通过与阴性对照对比计算植物乳杆菌YT013抗胃癌效果。
实验结果如图2所示，植物乳杆菌YT013无细胞培养液对胃癌细胞AGS具有显著的抑制作用，且随着植物乳杆菌YT013无细胞培养液浓度增大，其对胃癌细胞AGS的抑制率增加，呈剂量依赖性。并且与浆水无细胞培养液相比，同等体积下效果更显著。即，本发明所述的植物乳杆菌YT013具有抗胃癌的作用。
3.植物乳杆菌YT013抗结直肠癌细胞
(1)将结直肠癌细胞HCT116按照104/孔加入96孔板，每孔含100μL培养基，过夜培养；
(2)按照每孔200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL加入上述培养基溶液；相当于每孔分别加入植物乳杆菌YT013发酵上清液5.24μL、10.47μL、15.71μL、20.94μL、26.18μL。每个孔重复六次，然后将平板在37℃和5％CO2中孵育48h；
(3)加入含10μL CCK-8的培养基100μL，37℃孵育2h后450nm测量吸光度；
(4)通过与阴性对照对比计算植物乳杆菌YT013抗结直肠癌效果。
实验结果如图3所示，植物乳杆菌YT013无细胞培养液对结肠癌细胞HCT116具有显著的抑制作用，且随着植物乳杆菌YT013无细胞培养液浓度增大，其对结肠癌细胞HCT116的抑制率增加，呈剂量依赖性。并且与浆水无细胞培养液相比，同等剂量下效果更显著。即本发明所述的植物乳杆菌YT013具有抗结肠癌的作用。
4.植物乳杆菌YT013抗肝癌细胞
(1)将肝癌细胞HepG2按照104/孔加入96孔板，每孔含100μL培养基，过夜培养；
(2)按照每孔200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL加入上述培养基溶液；相当于每孔分别加入植物乳杆菌YT013发酵上清液5.24μL、10.47μL、15.71μL、20.94μL、26.18μL。每个孔重复六次，然后将平板在37℃和5％CO2中孵育48h；
(3)加入含10μL CCK-8的培养基100μL，37℃孵育2h后450nm测量吸光度；
(4)通过与阴性对照对比计算植物乳杆菌YT013抗结直肠癌效果。
实验结果如图4所示，植物乳杆菌YT013无细胞培养液对肝癌细胞HepG2具有显著的抑制作用，且随着植物乳杆菌YT013无细胞培养液浓度增大，其对肝癌细胞HepG2的抑制率增加，呈剂量依赖性。并且与浆水无细胞培养液相比，同等剂量下效果更显著。即本发明所述的植物乳杆菌YT013具有抗肝癌的作用。
5.植物乳杆菌YT013抗胰腺癌细胞
(1)将胰腺癌细胞PANC-1按照104/孔加入96孔板，每孔含100μL培养基，过夜培养；
(2)按照每孔200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL加入上述培养基溶液；相当于每孔分别加入植物乳杆菌YT013发酵上清液5.24μL、10.47μL、15.71μL、20.94μL、26.18μL。每个孔重复六次，然后将平板在37℃和5％CO2中孵育48h；
(3)加入含10μL CCK-8的培养基100μL，37℃孵育2h后450nm测量吸光度；
(4)通过与阴性对照对比计算植物乳杆菌YT013抗结直肠癌效果。
实验结果如图5所示，植物乳杆菌YT013无细胞培养液对胰腺癌细胞PANC-1具有显著的抑制作用，且随着植物乳杆菌YT013无细胞培养液浓度增大，其对胰腺癌细胞PANC-1的抑制率增加，呈剂量依赖性。并且与浆水无细胞培养液相比，同等剂量下效果更明显。即本发明所述的植物乳杆菌YT013具有抗胰腺癌的作用。
综上，本发明通过体外CCK-8抗肿瘤活性评价发现，本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YT013对人胃癌细胞株AGS、结直肠癌细胞株HCT116、肝癌细胞株HepG2、胰腺癌细胞株PANC-1的生长均具有显著的抑制作用，同时抑制效果具有浓度依赖性。且效果明显优于浆水无细胞培养液。即，本发明所述的植物乳杆菌YT013可用于制备抗肿瘤药物，尤其可用于制备制抑制胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌的药物。
以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 一种植物乳杆菌YT013及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1338
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
tcggaatcag gacaacccga tacatgttag atctagcgaa ctctgggatt ggttggtgct 60
agcatctcga tttacatttg agtgaggggt gactggtgag taaacgtggg aaacctgccc 120
ggaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cattacaact tggaccgcat 180
ggaccgagtt tgtttagggc tacggctatc tatttggatg gtcccgcggc gtattagcta 240
gatggggagg taacggctcc ccatggcaat gatacttatc cgacctgaga gggtaaacgg 300
ccacattggg actgacacac ggcccccact cctacgggag gtattaatag ggaatcttcc 360
tcaatggacc actgtctgat ggaacaacgc cgccagagcg aaaaagggtt tcggctcgta 420
aaactctgtt gttaaagaaa aacctatctg agagtaactc tatctctatt gacggcattt 480
aacctcaaaa tttcggctaa ctcttcgcct tccttcgcgg taatacgtag ctggaaagcg 540
ttttccggac ccattgggtt caatgcaatt gcaggctttt ttttaaactt gatgtgaaag 600
ccttcattca accgaagaag tgcatcggaa actgagacac ttgatagcta aaaggacagt 660
ggaactcctg tgtaccggtg atctgctcat atatatgcta acaccttcac tgaccttagc 720
gactgttagg gaccgtaact gaccctgcaa gctcgaaagt acggtccaaa taactgggaa 780
atttataccc tgcgaatcca aatcgacttt ccatcgaatt gctacccagt ttgaacgggt 840
tttccgacca tccagtcgct gcttctaacc gaatgctttt tttctccaca ggtggaataa 900
cggccctaac gcgctgcaat actaccagag aaattgacgg gagagccctt cccagcctga 960
tgtgattcat gggggtttaa tttccaaaga atcatcccaa gaactcttcc caagtgtcct 1020
agccttacca aacgggcgat ctgatagctt tattatattt tctcccttcc gtgaaaaatg 1080
gagattacta cggaggttgc aatggccttt tgcctcactg ctacgcgggc gtagggactt 1140
ccggcttggg ggctttatga acccctataa acggaattga ttaactctaa ttttccttga 1200
tctcatccct ggccagactt ttagagagcc tggggggagc acacatcact gtcgcaggag 1260
ataaattagc gcccagaggt agtcgtccac ctctaccggt agcacacgag aatacgggcc 1320
ggtgggactg gcgtacag 1338

Claims (6)

1.植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）YT013的发酵冻干粉或无细胞培养液在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为胃癌、肝癌、胰腺癌；所述植物乳杆菌YT013于2018年11月12日保藏于武汉大学菌种保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2018775。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌YT013发酵冻干粉的制备方法为：将植物乳杆菌YT013发酵，将发酵液经蛋白酶孵育后，离心、冻干，即得植物乳杆菌YT013发酵冻干粉。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将植物乳杆菌YT013接种于MRS培养基上，活化；
（2）将步骤（1）活化后的植物乳杆菌YT013接种到MRS培养基中发酵获得发酵剂；
（3）将步骤（2）所述的发酵剂加入到MRS培养基中培育获得发酵液；
（4）将步骤（3）所述的发酵液离心，调pH为中性，获取无细胞发酵液；
（5）将步骤（4）所述的发酵液用蛋白酶孵育，离心，冻干，即得植物乳杆菌YT013发酵液冻干粉。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中植物乳杆菌YT013的接种量为5%。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中培育条件为：37℃，培育48h。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌YT013无细胞培养液的制备方法为：根据权利要求2-5任一所述应用制备获得植物乳杆菌YT013发酵液冻干粉；将植物乳杆菌YT013发酵液冻干粉，用细胞培养基溶解，然后用无菌滤膜过滤，即得植物乳杆菌YT013无细胞培养液。
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