CN117487725B - 一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌及其应用 - Google Patents

一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌及其应用，所述具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌命名为嗜酸乳杆菌LA98 Lactobacillus acidophilus LA98菌株，保藏编号为CCTCC NO：M 20231525，保藏日期为2023年8月23日。本发明所述嗜酸乳杆菌在增强免疫细胞活性及调节肠道菌群调节能力方面具有较好的效果。

Description

一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌及其应用。
背景技术
人类胃肠道中含有大量有益的细菌群落，它们对维持人体健康起着重要的作用。正常、稳定、有益的肠道微生物菌群具有多种生物学功能，如提高营养物质的消化和吸收，调节肠道微生物群的平衡，稳定肠道屏障的完整性，防御肠道病原菌粘附和侵袭，刺激宿主细胞和体液免疫反应。影响肠道菌群组成最常用的方法是饮食益生菌，多年来，许多种类的微生物被使用，它们主要由乳酸细菌和双歧杆菌组成，但也包括芽孢杆菌和真菌。传统的益生菌，如乳酸细菌和双歧杆菌，在预防疾病和促进人体健康方面均表现出积极的作用，具有较高的理论研究和产品应用价值。
益生菌是指活体微生物，当摄入足够数量时，给宿主带来健康益处。通过研究益生菌在模拟胃肠道中的存活情况、对病原菌生长的抑制能力、对药物的敏感性以及对胃肠道的黏附能力，进一步认识益生菌益生作用的机制及其在不同领域的应用价值。
近年来的研究显示，益生菌具有抗过敏的潜能。研究表明，乳酸杆菌可以促进巨噬细胞及其他免疫细胞的增殖，因而改善宿主的免疫功能，这表明乳酸杆菌对机体免疫细胞活性的调节存在一定联系。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌，所述具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌命名为嗜酸乳杆菌 LA98 Lactobacillus acidophilus LA98菌株，保藏编号为CCTCC NO：M 20231525，保藏日期为2023年8月23日。
本发明所述嗜酸乳杆菌，在增强免疫细胞活性及调节肠道菌群调节能力方面具有较好的效果。
第二方面，本发明提供一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌培养物，所述培养物由以下方式制得：将第一方面所述的具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌接种于培养基中，35-40℃下培养22-26 h，即得。
所述温度可以选择35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，时间可以选择22 h、23h、24 h、25 h、26 h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种具有调节免疫力功效的益生菌剂，所述益生菌剂中的菌株包括第一方面所述的嗜酸乳杆菌 LA98 Lactobacillus acidophilus LA98菌株。
优选地，所述益生菌剂中嗜酸乳杆菌的活菌数不低于1×108CFU/g，例如1×108CFU/g、2×108CFU/g、3×108CFU/g、4×108CFU/g、5×108CFU/g、6×108CFU/g、7×108CFU/g、8×108CFU/g、9×108CFU/g、1×109CFU/g、2×109CFU/g、5×109CFU/g、8×109CFU/g、1×1010CFU/g、1×1011CFU/g、1×1012CFU/g等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
优选地，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
优选地，所述益生菌剂中的菌株还包括保藏编号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株。
优选地，嗜酸乳杆菌 LA98 Lactobacillus acidophilus LA98菌株与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株的活菌数之比为(1-10):(1-3)，其中(1-10)中的具体点值均可选择1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，(1-3)中的具体点值均可选择1、2、3等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第四方面，本发明提供一种根据第三方面所述的具有调节免疫力功效的益生菌剂的制备方法，所述制备方法包括：将菌株接种于培养基中，培养，离心收集菌泥，将菌泥与保护剂混合，冷冻干燥，即得。
第五方面，本发明提供一种根据第一方面所述的LA98菌株或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备具有调节免疫力功效的产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所述嗜酸乳杆菌，在增强免疫细胞活性及调节肠道菌群调节能力方面具有较好的效果。
附图说明
图1是嗜酸乳杆菌对免疫低下小鼠体重的影响。
图2是嗜酸乳杆菌对免疫低下小鼠免疫球蛋白的影响。
图3是嗜酸乳杆菌对免疫低下小鼠细胞因子的影响。
图4是嗜酸乳杆菌对免疫低下小鼠菌群α-多样性的影响，其中A图为香农指数结果，B图为辛普森指数结果。
图5是嗜酸乳杆菌对免疫低下小鼠肠道菌群的影响，其中A图至H图依次为毛螺菌属NK4A136、未分类的Muribaculaceae、拟普雷沃氏菌属、布劳特氏菌属、惰性真杆菌、巴恩斯氏菌属、螺杆菌、Escherichia_Shigella的相对含量。
图6是嗜酸乳杆菌对免疫低下小鼠回肠组织的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述内容中涉及的嗜酸乳杆菌 LA98 Lactobacillus acidophilus LA98菌株，分类命名为嗜酸乳杆菌 LA98 Lactobacillus acidophilus LA98，保藏编号为CCTCC NO：M20231525，保藏时间为2023年8月23日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
下述内容中涉及的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株，分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏编号为CGMCC No.24377，保藏时间为2022年1月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
MRS培养基配方：蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉5 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、无水乙酸钠5 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、吐温80 1 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4 0.2 g/L、MnSO40.05 g/L和水，pH6.5，固体MRS培养基中额外加入1.5%的琼脂粉，121℃高压灭菌20min。
实施例1
嗜酸乳杆菌的分离筛选与鉴定
（1）菌株的分离筛选
采集青年粪便样本，取0.5g至4.5mL无菌生理盐水中，充分振荡分散样品，取100μL样品梯度稀释，选取合适梯度均匀涂布于MRS琼脂平板上，置于厌氧条件下，37℃培养36h后，挑选单菌落，进行革兰氏染色，镜检观察菌落形态特征，初步筛选疑似乳杆菌的菌株。菌株在MRS固体培养基上进行反复划线纯化培养，获得乳杆菌纯化菌株，将纯化菌株保藏在-80℃甘油管。
（2）分子生物学鉴定
对筛选的目的菌株进行培养，收集菌体，提取基因组DNA，采用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT扩增，扩增其16S rDNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并对PCR产物进行测序。其中PCR反应体系：10×buffer 10μL，10mM dNTP 2μL，上下引物各1μL，DNA模板2μL，Taq酶0.5μL，ddH2O 34.5μL。95℃预变性10min；然后94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min共35个循环，结束后72℃延伸5min。将PCR产物通过凝胶电泳检测后送往武汉金开瑞生物工程有限公司测序。将鉴定的基因序列用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，根据分子生物学鉴定结果，确定菌株为嗜酸乳杆菌，将该菌株命名为嗜酸乳杆菌并送保藏。
16SrDNA测序结果如下
SEQ ID NO.1：
AAGGGGTACCGTGGTCTGTATCGAGGGTCCCAGCGAGCTGACACCAGCAGATTCACTTCGGTGATGACGTTGGGAACGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCAATCCGTAGAGATACGGAGTTCCCTTCGGGGACACTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGTACAACGAGGAGCAAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTTAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAAGTCGGAACAACACCATCTAGTAGCAACAAGGTACACCCAGTGAAGCCCC。
实施例2
胃肠道耐受性实验
人工胃液：配制PBS溶液，加入0.3%胃蛋白酶，用1mol/L HCl调节pH值至2.5，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
人工胆盐：配制0.5%生理盐水，加入0.1%胰蛋白酶，0.3%牛胆粉，调整pH到8.0，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
将待测菌株活化2代后调整菌液浓度为108CFU/mL。取1mL菌悬液离心，收集菌体，分别接入1mL配制好人工胃液和人工胆盐液中混匀，37℃条件下消化，同时分别取0h和3h的消化液检测活菌数，计算存活率，结果见表1。其中，菌株存活率（%）= Nt/N0×100%，式中N0表示菌株0h的活菌数（CFU/mL），Nt表示菌株3h的活菌数（CFU/mL），测试结果如表1所示。
表1
实验结果表明，胃液消化3h，嗜酸乳杆菌的存活率为92.65%，胆盐消化3h后，嗜酸乳杆菌存活率为99.68%，这表明嗜酸乳杆菌有较强的耐胃酸和肠液的能力。
实施例3
嗜酸乳杆菌对三种病原菌的抑制能力
将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌分别接种于液体TSA培养基中，37℃厌氧培养24h，活化2代后，进行抑菌实验。采用牛津杯双层平板法，在无菌平皿加入10mL琼脂培养基凝固后，放入牛津杯，将致病菌以1:100的体积比混合到MRS培养基中，体系致病菌活菌数在106数量级，取出牛津杯后，加入100μL嗜酸乳杆菌菌液（108CFU），37℃培养24h后测量抑菌圈直径。以无菌生理盐水为阴性对照。
表2
由上表可知，嗜酸乳杆菌能有效抑制肠道病原菌，尤其是大肠杆菌，沙门氏菌，抑菌圈直径分别为40mm，43.5mm，显示出较强的抑制能力。
实施例4
抗生素敏感性测定
试验采用K-B（药敏纸片琼脂扩散法）进行抗生素敏感性测定。将待测菌株进行活化，制备菌悬液并调整浓度为108CFU/mL，取200μL菌悬液加到MRS固体平板表面，用无菌棉签均匀的将菌液涂于平板，再用无菌镊子将抗生素药敏纸片贴在MRS固体培养基上，做好标记，37℃培养24h后，用游标卡尺测定抑菌圈的直径。表3所示为嗜酸乳杆菌LA98对常用抗生素敏感性结果，实验结果表明：嗜酸乳杆菌对这13种抗生素均表现出敏感，这说明该菌株安全，可用于生物制品或膳食补充剂。
表3
实施例5
嗜酸乳杆菌对CaCO-2细胞黏附性测定
将菌株置于MRS培养基中培养24h，然后取出离心、收集菌体，用PBS洗涤3次后，将菌体重悬于不含双抗的DMEM培养液中，调节菌悬液的浓度为108CFU/mL。调整细胞状态良好的CaCO-2细胞悬液到105cell/mL，接种1mL到12孔细胞培养板中，于5% CO2浓度的培养箱中孵育至细胞长至单层，用无菌PBS洗涤两次，血球计数板进行细胞计数；加入菌悬液1mL，于5% CO2培养箱中37℃孵育2h后，用无菌PBS洗涤细胞3次，除去未黏附的菌悬液，每孔加入0.2mL胰酶-EDTA缓冲液消化细胞5min，消化完后加入0.8mL PBS吹打均匀，取菌液进行稀释活菌计数。每个实验做3个平行，通过黏附实验检测菌株对细胞的黏附性，结果如表4。
表4
由上表4可知：嗜酸乳杆菌LA98对CaCO-2细胞黏附能力为2.01CFU/cell。这表明，嗜酸乳杆菌能黏附在肠上皮细胞上，具有较好的黏附能力，可以定植于肠道中，从而发挥益生性能，调节机体微生态平衡。
实施例6
嗜酸乳杆菌对免疫低下小鼠体重及免疫器官指数影响
雄性Balb/c小鼠（6-8周；20±2g）饲养于湖北省疾病预防控制中心动物房，实验动物使用许可证号：安评中心动（福）第202210219号。动物实验维持在20-22°C，湿度40-60%，循环12h光照/12h暗。小鼠可以自由高压灭菌后标准实验室饮食和水。一周适应后，将小鼠分为3组（n=12）：正常组（NC组）、模型组（CTX组）、益生菌组（LA组，1×109CFU/d）。正常组，模型组，以无菌生理盐水灌胃，益生菌组灌胃嗜酸乳杆菌LA，每日1次，连续14天，其中，除正常组小鼠外，其余小鼠均于第7，8，9天腹腔注射CTX 80mg/kg/d。结束实验后，脱臼处死，取胸腺，脾脏称重，计算脾脏指数和胸腺指数。
小鼠体重如图1所示，在连续腹腔注射3天环磷酰胺后，与对照组相比，其他两组小鼠均显著降低。在第10天开始，灌胃嗜酸乳杆菌LA98的益生菌组，体重缓慢增加，而模型组小鼠体重仍持续下降。在实验最后一天，与NC相比，MC组小鼠的体重显著降低；与MC组相比，益生菌组小鼠的体重显著升高（P<0.05）。嗜酸乳杆菌LA98对小鼠免疫器官指数影响如表5所示。
表5
注：其中a、b、c为对显著性差异的标注，相同字母代表没有显著差异，而不同字母代表有显著差异。
由表5所知，对免疫器官指数进行分析发现，与对照组相比，模型组胸腺指数均明显降低，与模型组相比，嗜酸乳杆菌LA98能提高小鼠胸腺指数；而环磷酰胺注射后导致小鼠脾脏出现代偿性增大，喂食嗜酸乳杆菌LA98后能显著降低脾脏指数，并恢复到对照组水平。
实施例7
嗜酸乳杆菌对免疫低下小鼠免疫球蛋白及细胞因子影响
收集小肠组织匀浆上清液，采用ELISA试剂盒检测sIgA水平，以及细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17和IL-10水平。结果用试剂盒中提供的标准细胞因子表示为每毫升小肠组织匀浆上清液中的细胞因子浓度。
由图2所示，可以看出与NC组相比，MC组小鼠小肠组织中的sIgA含量在注射环磷酰胺后显著下降，而益生菌组sIgA含量显著升高，益生菌组sIgA含量高于对照组。结果表明，LA可通过刺激sIgA的分泌来提高机体免疫力，恢复机体免疫功能。图3小肠组织中细胞因子检测的结果显示，与NC组相比，MC组小鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17含量显著降低（P<0.05），抗炎因子IL-10含量显著降低；与MC组相比，灌胃嗜酸乳杆菌LA98后，四种促炎因子含量显著升高（P<0.05），抗炎因子IL-10含量显著升高，以上结果说明嗜酸乳杆菌LA98能显著提升模型小鼠免疫因子水平，提高免疫力。
实施例8
嗜酸乳杆菌对免疫低下小鼠肠道菌群影响
实验结束后，以颈椎脱臼法处死小鼠，腹部消毒后解剖，取各组小鼠盲肠内容物。从小鼠粪便样本中提取微生物基因组DNA，并用紫外分光光度法进行定量。在Mi SeqIllumina测序平台上对样本中所有细菌的16S rDNA V3 ~ V4高变区进行了测序，以确定肠道微生物群的特征。
α多样性表示物种的微生物群落多样性，如图4，根据辛普森指数、香农指数组间差异趋势可知，注射环磷酰胺会造成小鼠肠道菌群α多样性指数的显著下降（P<0.05），而益生菌组辛普森指数和香农指数均有升高，与模型组相比，益生菌组显著升高（P<0.05）。说明嗜酸乳杆菌LA98干预能显著提升免疫低下小鼠肠道菌群α多样性指数，增加小鼠肠道中微生物多样性。
由图5可知，小鼠肠道中菌群分布在注射环磷酰胺后发生改变，在属水平上，与对照组相比，模型组中的拟普雷沃氏菌属Alloprevotella，未分类的Muribaculaceae，毛螺菌属Lachnospiraceae_NK4A136_group，未分类的惰性真杆菌[Eubacterium]_siraeum_ group，巴恩斯氏菌属，相对丰度均降低，而与模型组相比，益生菌组均呈现显著升高的趋势。其中拟普雷沃氏菌属，毛螺菌属能产生短链脂肪酸（SCFAs），SCFAs可以诱导促炎细胞因子的产生，参与免疫反应，而Muribaculaceae介导免疫反应的发生。有研究报道，惰性真杆菌有效促进γδT细胞增殖，从而促进CD8+T淋巴细胞增殖，据文献《Enterococcus hiraeand Barnesiella intestinihominis facilitate cyclophosphamide-inducedtherapeutic immunomodulatory effects》报道，巴恩斯氏菌属可以通过诱导Th1、Th17，以及CD4+和CD8+T细胞的免疫响应恢复抗肿瘤效果。而与对照组相比，环磷酰胺注射后的模型组小鼠，螺杆菌属和大肠埃希菌-志贺氏菌属含量显著升高，而喂食益生菌后，含量显著降低，这表明LA98能通过调节肠道菌群平衡来改善人体健康。
实施例9
嗜酸乳杆菌对免疫低下小鼠肠道组织结构的影响
如图6所示回肠结构：NC组小鼠的肠绒毛紧致良好，排列整齐，隐窝结构完整，上皮细胞形态完整；MC组小肠黏膜病变严重，结构不完整，排列疏松，绒毛明显破裂，隐窝出现损伤，炎症细胞浸润；而LA98组小肠绒毛损伤均有得到缓解，隐窝结构完好，炎性细胞浸润程度得到减轻，未出现大面积溃疡，且两组益生菌处理组均未见显著差异；以上结果表明，嗜酸乳杆菌LA98均能缓解回肠结构组织发生炎症损伤的情况。
实施例10
嗜酸乳杆菌对免疫细胞的调节作用
（1）嗜酸乳杆菌对巨噬细胞RAW264.7的增殖率的影响
在96孔板中将细胞浓度调整为1×104cell/mL，100μL/孔接种于96孔板，培养24h至细胞贴壁生长。
对照组（NC）：在板孔中只加入100μL DMEM细胞培养液，不做其他任何处理，放置于37℃和5% CO2培养箱中培养24h；
用DMEM重悬嗜酸乳杆菌LA98、鼠李糖乳杆菌LRa05和嗜酸乳杆菌NCFM，将嗜酸乳杆菌LA98和鼠李糖乳杆菌LRa05菌悬液按照活菌数1:1混合后，离心用DMEM重悬；将嗜酸乳杆菌LA98和鼠李糖乳杆菌LRa05菌悬液按照活菌数1:1混合后，离心用DMEM重悬。
其中NCFM为市售菌株，购买自广东省微生物保藏中心。
将嗜酸乳杆菌LA98菌悬液、鼠李糖乳杆菌LRa05菌悬液和上述混合菌悬液与细胞按照100:1（CFU:细胞个数）的比例调整菌悬液后，加100μL菌液到不同的孔中，并培养24h。
细胞培养结束后，加入10μL CCK-8试剂，37℃避光孵育1h，然后吸去孔板中上清液，PBS洗2次，用酶标仪测定450nm波长下各孔的吸光值（OD值）。
细胞存活率计算公式：CV=OD1/OD2×100%。
式中，CV：细胞存活率（%）；
OD1：各处理组在450nm波长下的OD值；
OD2：对照组在450 nm波长下的OD值。
益生菌对巨噬细胞RAW264.7增殖率的影响如表6所示
表6
由表6可知，与对照组相比，嗜酸乳杆菌LA98处理组能显著提高巨噬细胞RAW264.7增殖率，这表明嗜酸乳杆菌LA98能显著提升巨噬细胞RAW264.7的增殖率。而将嗜酸乳杆菌LA98与LRa05复配后，巨噬细胞RAW264.7的增殖率，相比于对照组，增加了65.36%；这表明，嗜酸乳杆菌LA98与LRa05复合菌剂能显著提升巨噬细胞增殖率，菌株间可以相互配合，且该复配方式优于其他复配方式。
（2）嗜酸乳杆菌对巨噬细胞RAW264.7的细胞因子调节作用
将细胞浓度调整为1×106cell/mL，0.5mL/孔接种于24孔板，培养24h（贴壁生长）。
对照组（NC）：在板孔中只加入0.5mL细胞培养液，不做其他任何处理，放置于37℃和5% CO2培养箱中培养24h；
用DMEM重悬嗜酸乳杆菌LA98、鼠李糖乳杆菌LRa05和嗜酸乳杆菌NCFM，将嗜酸乳杆菌LA98和鼠李糖乳杆菌LRa05菌悬液按照活菌数1:1混合后，离心用DMEM重悬，将嗜酸乳杆菌LA98和鼠李糖乳杆菌LRa05菌悬液按照活菌数1:1混合后，离心用DMEM重悬。
将嗜酸乳杆菌LA98菌悬液、鼠李糖乳杆菌LRa05菌悬液和上述混合菌悬液与细胞按照100:1（CFU:细胞个数）的比例调整菌悬液后，加100μL菌液到不同的孔中，并培养24h。
细胞培养结束后，1000rpm，离心10min，取上清液，用ELISA试剂盒测定促炎因子TNF-α，抗炎因子IL-10含量。细胞因子TNF-α，IL-10是固有免疫应答阶段产生的免疫效应分子。益生菌对巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α，IL-10影响如表7所示。
表7
与对照组相比，嗜酸乳杆菌LA98处理组能显著提高TNF-α，IL-10的含量，分别提高了255.88pg/mL，296.79pg/mL，这表明嗜酸乳杆菌LA98能够刺激巨噬细胞分泌促炎因子和抗炎因子。而将嗜酸乳杆菌LA98与LRa05复配后，巨噬细胞分泌的促炎因子和抗炎因子含量，分别提高了913.35pg/mL，1057.3 pg/mL。这表明，嗜酸乳杆菌LA98与LRa05复合菌剂提升巨噬细胞分泌免疫因子能力强于单菌，菌株间存在相互配合，且该复配方式优于其他复配方式。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌，其特征在于，所述具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌命名为嗜酸乳杆菌 LA98 Lactobacillus acidophilus LA98菌株，保藏编号为CCTCC NO：M 20231525，保藏日期为2023年8月23日。
2.一种具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌培养物，其特征在于，所述培养物由以下方式制得：将权利要求1所述的具有调节免疫力功效的嗜酸乳杆菌接种于培养基中，35-40℃下培养22-26 h，即得。
3.一种具有调节免疫力功效的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中的菌株包括权利要求1所述的嗜酸乳杆菌 LA98 Lactobacillus acidophilus LA98菌株。
4.根据权利要求3所述的具有调节免疫力功效的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中嗜酸乳杆菌的活菌数不低于1×108CFU/g。
5.根据权利要求3所述的具有调节免疫力功效的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
6.根据权利要求3所述的具有调节免疫力功效的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
7.根据权利要求3所述的具有调节免疫力功效的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中的菌株还包括保藏编号为CGMCC No.24377的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株。
8.根据权利要求7所述的具有调节免疫力功效的益生菌剂，其特征在于，嗜酸乳杆菌LA98 Lactobacillus acidophilus LA98菌株与鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LRa05菌株的活菌数之比为(1-10):(1-3)。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的具有调节免疫力功效的益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将菌株接种于培养基中，培养，离心收集菌泥，将菌泥与保护剂混合，冷冻干燥，即得。
10.根据权利要求1所述的LA98菌株或权利要求2所述的培养物或权利要求3-8中任一项所述的益生菌剂在制备具有调节免疫力功效的产品中的应用。
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