CN105441357A - 一株产抗肿瘤活性胞外多糖的植物乳杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产抗肿瘤活性胞外多糖的植物乳杆菌。本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus？plantarum)YW11，其保藏号CGMCC？NO.11863。还提供了一种制备胞外多糖的方法，包括如下步骤：发酵上述的植物乳杆菌(Lactobacillus？plantarum)，收集发酵液，得到胞外多糖。本发明的实验证明了植物乳杆菌胞外多糖具有较好的抗肿瘤活性，且对机体无毒，可开发为具有潜在健康功效食品或辅助药物用于治疗结肠癌。

Description

一株产抗肿瘤活性胞外多糖的植物乳杆菌
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株产抗肿瘤活性胞外多糖植物乳杆菌。
背景技术
植物乳杆菌是一种兼性厌氧异型发酵乳杆菌，广泛存在各种食品中，如蔬菜，肉，鱼类和乳制品等。同时也常见于健康人体的肠道中，每克健康人群粪便中平均含有107-109个植物乳杆菌，对于维持人体肠道微生态平衡，促进人体健康具有重要作用。但目前植物乳杆菌的诸多功能及其人体作用机制并不清楚，明确其代谢产物如胞外多糖的功能，是确定菌株生物活性和开发功能性食品的基础。
乳酸菌胞外多糖是菌株生长代谢过程中分泌到胞外的大分子多糖。可作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂、填充剂和持水剂应用到食品、医药、石油化工以及生化产品等领域。胞外多糖还具有多种生理活性，包括降血压、降胆固醇，抗氧化、抗溃疡、抗病毒、改善肠道微生态环境和增强人体免疫力等。将产胞外多糖菌株加入到乳制品中作为发酵或辅助发酵菌株，可有效改善发酵乳品的质构、口感、流变学特性和风味等指标，还可进一步提高产品的营养保健作用。我国的乳酸菌胞外多糖研究起步较晚，与世界发达国家还存在差距，已知具有明确生物活性的乳酸菌胞外多糖较少。
藏灵姑是我国青海、西藏等地区的传统发酵乳制品，有着长时间的食用历史，其中含有丰富的乳酸菌和酵母等微生物资源。近年的研究也表明，藏灵姑发酵食品具有降压，降脂，调整肠道微生态平衡等多种作用。藏灵姑发酵乳的黏稠特性也表明其中可能含有微生物分泌的增稠大分子。因此如何从中筛选产胞外多糖乳酸菌，开发自主产权、功能明确的具有健康促进作用的菌株对挖掘传统乳制品的生物活性，并在此基础上开发功能性食品具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YW11。
本发明提供的物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YW11，其保藏号CGMCCNO.11863。
本发明的另一个目的是提供一种制备胞外多糖的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，收集发酵液，得到胞外多糖。
上述方法中，在收集发酵液后，还包括如下步骤：
1)用三氯乙酸水溶液与发酵液混匀，反应，收集反应液中的上清液；
2)将所述上清液与无水乙醇混匀，静置，收集沉淀；
3)将所述沉淀溶于水中，收集大于8000Da的产物，得到胞外多糖。
由上述方法制备的胞外多糖也是本发明饱和的范围。
上述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或其发酵产物或其菌悬液或其培养液或上述的胞外多糖在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用也是本发明饱和的范围。
上述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或其发酵产物或其菌悬液或其培养液或上述的胞外多糖在制备抑制肿瘤细胞生长产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述肿瘤为结肠癌，所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。
本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗肿瘤或抑制肿瘤细胞生长产品。
本发明提供的产品，其活性成分为上述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或其发酵产物或其菌悬液或其培养液或上述的胞外多糖。
上述产品中，所述肿瘤为结肠癌，所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。
上述产品为药物。
YW11于2015年12月11日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNO.11863，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
本发明的实验证明，本发明发现了一株新的植物乳杆菌，将其发酵收集胞外多糖，检测胞外多糖能够抑制结肠癌细胞HT-29的生长，对HT-29移植瘤有明显的抑制作用，且对荷瘤裸鼠体重、肝脏指数、肾脏指数和心脏指数均没有显著影响，可显著降低荷瘤裸鼠血清中谷草转氨酶(AST)和肌酐(Cr)的水平，恢复谷丙转氨酶(ALT)和尿素氮(BUN)至正常水平，提高荷瘤裸鼠血液中白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)的数目，同时提高荷瘤裸鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二醛(MDA)水平，因此证明，植物乳杆菌YW11的胞外多糖具有较好的抗肿瘤活性，且对机体无毒，可开发为具有潜在健康功效食品或辅助药物用于治疗结肠癌。
附图说明
图1为不同浓度胞外多糖的肿瘤抑制效果。
图2为YW11胞外多糖对HT-29荷瘤裸鼠血清生化指标的影响。
图3为YW11胞外多糖对HT-29荷瘤裸鼠血清中SOD活性(A)和MDA水平(B)的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、乳杆菌YW11的获得
一、乳杆菌YW11的分离、纯化
取5g待分离藏灵姑样品加入45mL无菌生理盐水中，震荡混匀后逐级稀释到适宜浓度，取50μL稀释后的菌液涂布于MRS琼脂平板，于37℃厌氧培养72h。挑取平板上生长的乳酸菌典型单菌落(圆形，中等大小，凸起，微白色边缘整齐)于MRS琼脂培养基上反复划线，直至获得纯培养物为止，得到纯化单菌落YW11。
二、乳杆菌YW11的鉴定
1、表型鉴定
挑取上述一分离得到的YW11单菌落，在MRS培养基中培养，取菌液，涂布于MRS琼脂平板，于37℃厌氧培养48-72h，形成乳酸菌典型单菌落(圆形，中等大小，凸起，微白色边缘整齐)。
2、生理生化鉴定
挑取上述一分离得到的YW11单菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，其中革兰氏染色阳性，细胞形态为杆状或链杆状，同时过氧化氢酶试验为阴性的菌株，初步鉴定为乳杆菌。
3、API50CH鉴定
将活化好的上述一分离得到的YW11菌液稀释到适宜浓度，涂布于MRS琼脂平板上，于37℃培养48h，用无菌牙签挑取菌株单菌落接入API50CH液体培养基中制成菌悬液，再接入到API50CH鉴定试剂条中，37℃厌氧培养48h，记录菌株对49种碳水化合物的发酵结果，将结果输入梅里埃公司的鉴定软件APILABPLUS(BioMérieux,France)中进行判定。
根据下表1中的糖代谢图谱，鉴定菌株YW11为植物乳杆菌。
表1植物乳杆菌YW11的API50CH检测结果
4、16SrDNA鉴定
提取菌株YW11的基因组DNA进行片段扩增。采用乳酸菌16SrDNA基因的通用引物，正向引物：A27F5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，反向引物：A1495R3′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5′，1.5％琼脂糖凝胶电泳。PCR产物委托北京鼎国生物有限公司进行测序，将测序结果(序列1)与NCBI数据库中的核酸序列进行比对。结果显示YW11菌株与NCBI数据库中KM265361等植物乳杆菌的16SrDNA序列相似度超过99％。
经过上述鉴定，YW11为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
YW11于2015年12月11日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNO.11863，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
5、体外益生特性
(1)菌株在模拟人工胃液中的耐受性测定
取活化好的YW11菌液，6000×g4℃离心10min，收集菌体。用无菌PBS缓冲液(pH6.5)洗涤2次，加入5mLPBS缓冲液(pH6.5)制成菌悬液。取1mL菌悬液接入含9mLpH3.0的模拟人工胃液(0.2g/100mLNaCI，0.35g/100mL胃蛋白酶，过滤除菌)试管中，置于37℃厌氧培养3h。分别于接种后0h和3h取样，稀释涂布于MRS琼脂平板上，37℃培养48h后，进行活菌计数。菌株存活率计算公式：
存活率(％)＝logcfuN1/logcfuN0×100
式中：N1为胃液处理3h后活菌数；N0为胃液处理0h后活菌数。
(2)菌株对胆盐的耐受性测定
取活化好的YW11菌株按3％(体积百分含量)接种量分别接种于含有0.3和0.6g/100mL牛胆盐浓度的MRS液体培养基中，置于37℃厌氧培养3h。分别于接种后0h和3h取样，稀释涂布于MRS琼脂平板上，37℃培养48h后，进行活菌计数。菌株存活率计算公式：
存活率(％)＝logcfuN1/logcfuN0×100
式中：N1为胆盐溶液处理3h后活菌数；N0为胆盐溶液处理0h后活菌数。
结果表明，菌株YW11具有良好的酸和胆盐耐受性，在pH3.0条件下培养3h，存活率为82.28％；在胆盐浓度为0.3和0.6g/100mL牛胆盐的MRS培养基中培养3h，存活率分别为97.42％和95.35％。
体外益生特性研究表明，模拟人工胃液(pH3.0，处理3h)、低浓度胆盐(0.3和0.6g/mL，处理3h)有较好的耐受性。
实施例2、乳杆菌YW11的胞外多糖(EPS)的获得
一、乳杆菌YW11的胞外多糖的获得
1、植物乳杆菌发酵
将实施例1获得的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YW11CGMCCNO.11863按照接种量2.70％(质量百分含量)接种于SDM培养基中，32℃发酵18h，得到发酵液，含有胞外多糖。
上述每1LSDM培养基由胰蛋白胨10.0g、YNB(酵母氮源)6.7g、K2HPO42.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸钠5.0g、MgSO4·7H2O0.2g、MnSO4·H2O0.05g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL，加蒸馏水至1000mL，1mol/L乙酸调pH6.6，121℃灭菌15min；pH6.27。
2、胞外多糖的提取纯化
1)胞外多糖的粗糖提取
将上述1获得的发酵液于100℃水浴加热15min，以灭活可能存在的降解多糖的酶类。向发酵液中加入80％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)水溶液至终浓度为4％(质量/体积)，室温下搅拌2h，10000×g4℃离心45min，去除细胞和蛋白。取上清液并加入两倍体积的低温无水乙醇，于4℃冷藏静置12h，10000×g4℃离心45min。沉淀用蒸馏水溶解，装入分子截流量为8000～14000Da(上海易佰聚，产品型号：T25-14-005)的透析袋中透析48h，每8h换一次蒸馏水。再经浓缩、冷冻干燥制得粗多糖。
2)胞外多糖的纯化
DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析纯化，上述1)制备的粗多糖用蒸馏水溶解后(20mg/mL)，经DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析(2.6×40cm，GEHealthcare，产品目录号：17-0709-01)，上样量100mg，依次用蒸馏水(1-30管)、0.2mol/LNaCl(31-70管)、0.5mol/LNaCl(71-120管)线性梯度洗脱，洗脱速度为1mL/min，每管收集5mL，采用苯酚硫酸法(赵宁,问亚琴,&潘秋红(2011).苯酚-硫酸法测定干红葡萄酒中的多糖含量.中外葡萄与葡萄酒(05),9-12.)逐管检测多糖含量，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，冷冻干燥，得到离子交换层析纯化后多糖。
再将离子交换层析纯化后多糖用0.9％(w/v)的NaCl水溶液溶解后(2mg/mL)，经SepharoseCL-6B凝胶柱层析(2.5×50cm)，上样量5mg，用0.9％NaCl水溶液脱，洗脱速度为0.5mL/min，洗脱时间240min。每管收集5mL，逐管检测多糖含量，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，冷冻干燥，得到纯化的胞外多糖。
苯酚硫酸法检测，确定纯化的胞外多糖产量为131.263mg/L(发酵液)。
3)胞外多糖的验证
采用凝胶渗透色谱(GPC)与多角度激光光散射(MALLS)联用法(刘蕊,黎爽,&高峡(2010).利用凝胶渗透色谱-激光光散射联用技术(GPC-MALLS)测定医用高分子材料的分子量及分子量分布.全国生物医药色谱学术交流会(p.1).中国江西景德镇.)测得上述2)获得的纯化的胞外多糖EPS的重均分子量(Mw)为1.1×105Da。
单糖组成分析：
a、单糖水解，称取5mg上述2)获得的纯化的胞外多糖EPS样品至安培瓶中，再加入2mL的2mol/L三氟乙酸(TFA)，用酒精喷灯封口，于烘箱中120℃水解2h，水解液减压蒸干后，再加入少量甲醇减压蒸干(重复5次)以除去残留的TFA，然后加少量水溶解，冷冻干燥，即得完全酸水解单糖样品；
b、糖腈乙酸酯衍生物的制备，精密称取各单糖标准品(鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，美国Sigma公司))5mg、NaBH430mg和5mg肌醇至安培瓶中，慢慢滴入2mL蒸馏水，边加边震荡，室温下使还原反应成糖醇(反应2h)，慢慢滴入几滴冰乙酸以中和过量的NaBH4，边加边震荡，直至不再产生气泡。
将旋转蒸发仪调至60℃真空旋蒸至样品完全干燥，之后每次用0.1％(v/v)盐酸甲醇溶液2mL复溶后再次蒸干，重复4-5次以除去硼酸根。处理完毕将产物置于105℃烘箱脱水15min，拿出加入吡啶和乙酸酐各0.5mL，用酒精喷灯封口，沸水浴反应1h，所得产物经微孔膜(0.22μm)除去杂质，进行气相色谱分析。完全酸水解后EPS样品衍生物的制备同样按照此方法制备。c气相色谱条件，色谱仪：Agilent7890A气相色谱仪；色谱柱：DB225毛细管柱(30m×0.25mm)；检测器：氧火焰离子检测器(FID)；流速：1mL/min；分流比：1:50；柱温：220℃；检测器温度：250℃；进样口温度：250℃；进样量：1μL。
结果显示，纯化的胞外多糖EPS由葡萄糖、半乳糖按摩尔比为2:1组成。
3、胞外多糖的功能
1)胞外多糖治疗HT-29荷瘤裸鼠
(1)HT-29荷瘤裸鼠造模
在无菌操作环境下，将人结肠癌细胞HT-29(中国医学科学院肿瘤医院)传代后，稳定培养24h，在对数生长期，调整细胞浓度至1×107个/mL，以200μL/只的细胞悬液浓度，注射接种于裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)右腋皮下，操作在1h内完成。小鼠接种肿瘤细胞24h后随机分组，每组10只。设空白对照组、模型组、阳性对照组(5-Fu)、EPS低、中、高剂量组。
(2)给药
每天给药1次，连续14天，每天灌胃量均为0.2mL/10g体质量，腹腔注射0.1mL/10g体质量。给药剂量和途径如下：
空白对照组：健康裸鼠，每天灌胃生理盐水(0.2mL/10g体质量/天)，自由进食和饮水。
模型对照组：接种结肠癌细胞HT-29裸鼠，每天灌胃生理盐水(0.2mL/10g体质量/天)，自由进食和饮水。
阳性对照组(5-Fu)：接种结肠癌细胞HT-29裸鼠，每天腹腔注射5-Fu(5-氟尿嘧啶，天津金耀有限公司)(25mg/kg体质量/天)，自由进食和饮水。
EPS低剂量组：接种结肠癌细胞HT-29裸鼠，每天灌胃EPS(10mg/kg体质量/天)，自由进食和饮水。
EPS中剂量组：接种结肠癌细胞HT-29裸鼠，每天灌胃EPS(25mg/kg体质量/天)，自由进食和饮水。
EPS高剂量组：接种结肠癌细胞HT-29裸鼠，每天灌胃相同剂量EPS(50mg/kg体质量/天)，自由进食和饮水。
(3)肿瘤抑制率和脏器指数测定
末次给药后24h，禁食8h，脱颈椎处死裸鼠，迅速取出瘤块、脾脏、肝脏、肾脏、心脏，经生理盐水洗涤后用滤纸吸干，称重。肿瘤抑制率和脏器指数计算公式如下：
抑瘤率(％)＝[(C-T)/C]×100
式中：C为模型对照组平均瘤重；T为实验组平均瘤重。
结果显示，EPS低剂量组、EPS中剂量组、EPS高剂量组的抑瘤率分别为17.16％、26.26％和36.58％，与药物剂量呈正比。
另外，在14天喂养期间，每隔2天进行肿瘤体积测量以及裸鼠体重称重，肿瘤体积计算公式如下：
肿瘤体积(mm3)＝(L×S2)/2
式中：L为肿瘤块长径；S为肿瘤块短径。
结果如图1所示，可以看出，EPS处理组荷瘤裸鼠肿瘤体积均低于模型对照组，说明，EPS有抑制肿瘤或肿瘤细胞的功能。
脏器指数＝脏器重量(mg)/体重(g)
结果如表2所示，与模型对照组相比，EPS处理组荷瘤裸鼠的脾脏指数均有所增加，尤其是EPS高剂量组(50mg/kg)荷瘤裸鼠的脾脏指数显著增加(P<0.05)。同时，阳性对照组(5-Fu)荷瘤裸鼠的脾脏指数显著低于模型对照组(P<0.05)。
表2植物乳杆菌YW11胞外多糖对HT-29荷瘤裸鼠脏器指数的影响(n＝10)
*P<0.05，表示与模型对照组相比差异显著；
**P<0.01，表示与模型对照组相比差异极显著；
#P<0.05，表示与阳性对照组相比差异显著；
##P<0.01，表示与阳性对照组相比差异极显著。
(4)血液生化指标测定
末次给药后24h，禁食8h，眼球取血；利用SymexXE-2100型号血液分析系统测定血液参数：红细胞、白细胞、血红蛋白、淋巴细胞和血小板。
结果如表3所示，与模型对照组相比，阳性对照组(5-Fu)荷瘤裸鼠血液中的白细胞数目和淋巴细胞数目均明显减少(P<0.05)，而EPS各剂量组处理的荷瘤裸鼠血液中的白细胞数目和淋巴细胞数目均显著增加(P<0.01)。
表3YW11胞外多糖对HT-29荷瘤裸鼠血液常规参数的影响
aP<0.05，表示与模型对照组相比差异显著；aaP<0.01，表示与模型对照组相比差异极显著；bP<0.05，表示与阳性对照组相比差异显著；bbP<0.01，表示与阳性对照组相比差异极显著；cP<0.05，表示与空白对照组相比差异显著；ccP<0.01，表示与空白对照组相比差异极显著；
(5)脏器损伤程度测定
末次给药后24h，禁食8h，眼球取血，按照试剂盒方法(购自于南京建成生物工程研究所)，测定血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的含量。
结果如图2所示，与空白对照组相比，模型对照组裸鼠血清中的AST、ALT、BUN、Cr水平显著上升(P<0.01)。与模型对照组相比，EPS各剂量处理组荷瘤裸鼠血清中的AST、ALT、BUN、Cr水平均有显著下降(P<0.01)，尤其是AST和BUN水平基本恢复正常，表明植物乳杆菌YW11EPS对荷瘤裸鼠的肝脏和肾脏有一定的保护作用。
(6)脂质过氧化测定
末次给药后24h，禁食8h，眼球取血，按照试剂盒方法，测定血清中超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量(购自于南京建成生物工程研究所)。
结果如图3所示，与模型对照组相比，阳性对照组(5-Fu)和EPS各剂量处理组的荷瘤裸鼠血清中SOD活力均有所提高，但差异不显著(P>0.05)，阳性对照组(5-Fu)和EPS各剂量处理组的荷瘤裸鼠血清中MDA水平均有不同程度的降低，其中阳性对照组(5-Fu)和EPS低剂量组(10mg/kg)下降不显著(P>0.05)，而EPS中剂量组和高剂量组下降显著(P<0.01，P<0.05)。
上述结果表明，胞外多糖EPS对荷瘤裸鼠体重、肝脏指数、肾脏指数和心脏指数均没有显著影响，可有效抑制HT-29肿瘤的生长和繁殖，每天口服50g/kg体重的抑制效果最好。

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YW11，其保藏号CGMCCNO.11863。
2.一种制备胞外多糖的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，收集发酵液，得到胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在收集发酵液后，还包括如下步骤：
1)用三氯乙酸水溶液与发酵液混匀，反应，收集反应液中的上清液；
2)将所述上清液与无水乙醇混匀，静置，收集沉淀；
3)将所述沉淀溶于水中，收集大于8000Da的产物，得到胞外多糖。
4.由权利要求2或3所述方法制备的胞外多糖。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或其发酵产物或其菌悬液或其培养液或权利要求4所述的胞外多糖在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或其发酵产物或其菌悬液或其培养液或权利要求4所述的胞外多糖在制备抑制肿瘤细胞生长产品中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为结肠癌，所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。
8.一种预防和/或治疗肿瘤或抑制肿瘤细胞生长产品，其活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或其发酵产物或其菌悬液或其培养液或权利要求4所述的胞外多糖。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述肿瘤为结肠癌，所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。
10.根据权利要求5-7中任一所述的应用或权利要求8或9所述的产品，其特征在于：所述产品为药物。
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