CN107541498A - 一种tcr基因修饰的cd8+t记忆性干细胞的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属免疫学及肿瘤治疗学技术领域，涉及一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞的制备方法及其用途；本方法包括：将肿瘤抗原与未成熟的树突状细胞共孵育，获得特异性肿瘤抗原负载的成熟树突状细胞后与CD8+初始T细胞共培养，并加入干细胞分化抑制剂促进CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞产生；分离获得CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；再克隆特异识别特定抗原表位的T细胞受体基因(TCR)，通过慢病毒包装或逆转录病毒载体共转染自体的CD8+Tscm细胞，体外制备不同肿瘤特定抗原特异性的CD8+TCR‑Tscm细胞。该方法制得的CD8+TCR‑Tscm细胞具有克服肿瘤异质性，特异性高，不良反应少的高效持久的防治肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明属免疫学及肿瘤治疗学技术领域，涉应用基因工程技术在体外制备CD8+T记忆性干细胞的方法，具体涉及一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞(T cellReceptor-T memory stem cell，CD8+TCR-Tscm)的制备方法及其用途；尤其是可识别多种肿瘤特异性抗原的TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞(TCR-Tscm)的体外制备方法及其在用于制备防治肿瘤制剂中的用途。
背景技术
现有技术公开了恶性肿瘤属系统性疾病，是人体正常器官组织细胞在各种致病因素的作用下发生恶性改变，逃避免疫监视，打破免疫均衡，产生了免疫耐受，继而呈无限制生长的新生物。鉴于恶性肿瘤作为一种内源性疾病，手术、化疗、放疗及分子靶向治疗等外在干预性治疗措施还存在一定的局限性。随着肿瘤免疫学及分子生物学等学科的发展，通过调动或激发机体自身的免疫功能，从而抑制和杀伤肿瘤细胞的免疫治疗成为肿瘤治疗新的热点。
自上世纪80年代以来，过继性细胞免疫治疗(Adoptive Cell Transfer,ACT)包括淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine activated killer,LAK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)等已先后应用于临床，但由于细胞回输后在体内活性持续较短、缺乏肿瘤特异性及疗效不确切等诸多问题，其在临床应用中受到限制。
有研究报道了新一代具有肿瘤抗原特异性的TCR基因修饰的T细胞(TCR-T)和嵌合型抗原受体细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)能克服传统细胞治疗缺乏特异性的弊端，推动了以免疫细胞为基础的精准靶向免疫治疗的发展。研究显示，CAR的基本结构包括肿瘤相关抗原识别区域(如scFv)、配合基或肽、铰链区等细胞外区域、跨膜区域以及包含一个或多个信号分子的细胞内信号区域。CAR-T细胞是将识别肿瘤相关抗原(TAA)的单链抗体(scFv)和T细胞的活化序列在体外进行基因重组，形成重组质粒，通过转染技术，在体外转染，纯化和大规模扩增经过基因改造和修饰后的T细胞；CAR-T在体外及体内均有显现对特定肿瘤抗原具有高度亲和性，CAR-T在体内能够迅速扩增，及对抗原负荷肿瘤细胞具有高效选择性杀伤作用，等。
目前有诸多机构在进行有关CAR-T疗法的研究，但尚无统一标准，尤其其中在CAR设计、培养技术、淋巴细胞去除方法以及所干预的疾病等存在不同。研究显示，“第一代”CAR-T虽能够特异性地靶向抗原，但没有共刺激分子，临床活性不高且在机体内的存在短暂；“第二代”CAR-T细胞加入了共刺激分子，如CD28、或CD137(4-1BB等),如美国国家癌症研究院(NCI)使用的是靶向CD19含CD28共刺激域的第二代CAR，且通过逆转录病毒进行基因转导，治疗的疾病是非霍奇金淋巴瘤，而宾夕法尼亚大学研究使用的是加入4-1BB共刺激分子的CAR，治疗的疾病是ALL和CLL；“第三代”CAR-T细胞又多加入一个共刺激分子，例如CD28+4-1BB或CD28+OX40，等等。
近年来肿瘤靶向治疗研究的热点之一是嵌合型抗原受体(CAR,chimeric antigenreceptor)修饰的T细胞能够被赋予特异的肿瘤抗原识别能力,并能够引发特异的肿瘤杀伤活性。目前,有针对多种肿瘤的CAR-T细胞在临床试验并取得疗效，该免疫疗法在晚期难治性白血病和淋巴瘤患者的临床试验显现示出非常振奋人心的结果，如，在接受了CTL019输注(靶向CD19抗原的CAR-T疗法)的30名复发性或难治性ALL受试者中，治疗后1个月90％患者获得完全缓解，其中甚至包括15位已经接受过干细胞移植的患者，6个月时无事件生存率为67％(20人)，总体生存率为78％(23人)，另外还有1名患者2年随访时仍然持续完全缓解。
另有利用NY-ESO-1靶点治疗多发性骨髓瘤的临床I/II期的试验结果显示，T细胞受体基因修饰的T(TCR-T)细胞疗法使80％的多发性骨髓瘤晚期患者在接受自体干细胞移植后有临床反应，其中，14/20的PR，2/20的CR，而且无一例出现巨噬细胞活化综合征，结果表明修改后的T细胞是安全的。但是目前的CAR-T细胞在实体瘤治疗中还面临着一系列科学难题：一是因为实体瘤缺乏免疫原性较强的特异性膜抗原；二是回输的T细胞在体内持续时间较短；三是回输的T细胞因缺乏归巢受体导致肿瘤组织浸润的数量少；四是肿瘤局部的免疫抑制微环境，导致免疫细胞杀伤活性降低；五是肿瘤的异质性，等等。
研究公开了肿瘤抗原特异性记忆T细胞(memory T cells)是一类具有抗肿瘤作用的T细胞亚型，当再次遇到同样抗原时能够产生快速且更强的抗肿瘤免疫应答；记忆T细胞通过是否表达趋化因子受体CCR7和L-Selectin(CD62L)可分为CD62L+CCR7+的中心记忆T细胞(Tcm)，CD62L-CCR7-的效应记忆T细胞(Tem)，CD62L-CCR7+的效应Te和CD62L+CCR7-的初始Tn细胞；Gattinoni等在小鼠中发现一类具有自我更新能力的抗原特异性CD8+T细胞，这些称为Tscm(T-memory stem cells)的表面标志CD62LhiCD44lowSca-1+，Tscm不仅能维持自我更新，在抗原的再次刺激分化为Tcm和Tem,有临床前研究发现移植Tscm比Tcm和Tem在体内保持更长的存活时间。
近期有研究发现人记忆性干细胞样T细胞(Tscm)是T细胞亚群.其具有干细胞的特征,具有较强的多向分化潜能,Tscm细胞能够分化为中枢性记忆性T细胞(Tcm),效应性记忆性T细胞(Tem)和效应性T细胞(Tef),在分化的同时能够维持自我更新，业内认为，其在免疫学和肿瘤治疗领域有着巨大的市场前景。但是，自体肿瘤性抗原免疫记忆的形成过程很复杂，须经过抗原提呈细胞对抗原的处理，加工和提呈，在适宜的抗原量及适宜时间的刺激下，活化的T细胞经历扩增期，在清除抗原后T细胞进入收缩期和记忆形成期。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟在现有技术的基础上进行优化改进，提供一种体外制备可识别多种肿瘤特异性抗原的TCR基因修饰的CD8+T记忆干细胞(TCR-Tscm)的方法及其特异性抗肿瘤作用。
发明内容
本发明的目的是对现有技术进一步改进优化，应用基因工程技术在体外制备CD8+T记忆性干细胞的方法，具体提供一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞(T cellReceptor-T memory stem cell，CD8+TCR-Tscm)的制备方法及其用途；尤其是一种可识别多种肿瘤特异性抗原的TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞(TCR-Tscm)的体外制备方法
本发明的进一步目的是提供本方法制得的肿瘤抗原特异性TCR基因修饰的CD8+T记忆干细胞(TCR-Tscm)用于制备防治恶性肿瘤制剂中的用途。
基于业内共识，理想的多功能TCR基因修饰的CD8+T记忆干细胞(TCR-Tscm)不仅能够识别胞内肿瘤特异性抗原，而且能浸润到肿瘤组织中及突破肿瘤微环境的免疫耐受，以及克服肿瘤异质性的难题，从而产生持久高效的抗肿瘤效应。
本发明在现有技术(申请号201410842198.8)的基础上进一步优化。
本发明提供了一种体外制备多功能TCR基因修饰的CD8+T记忆干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将合成的肿瘤特异性抗原肽与未成熟的树突状细胞共孵育，获得特异性肿瘤抗原负载的成熟树突状细胞；
(2)将步骤(1)获得的成熟树突状细胞与CD8+初始T细胞共培养，并加入干细胞分化抑制剂促进、产生肿瘤抗原特异性的特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；
(3)分离获得能特异性识别特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；
(4)从分离获得的特异性识别表达特定肿瘤抗原的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞中克隆特异识别特定抗原表位的T细胞受体(TCR)基因α链和β链；
(5)用步骤(4)获得的识别特定抗原表位的TCR基因α链和β链，构建识别不同肿瘤特定抗原的TCR基因，通过慢病毒包装或逆转录病毒载体转染自体的CD8+Tscm细胞，体外制备不同肿瘤特定抗原特异性的CD8+TCR-Tscm细胞；
(6)用CRISPR/Cas9基因敲除步骤(5)制备的抗原特异性的CD8+TCR-Tscm细胞一个或多个抑制性受体基因。
本发明中，肿瘤抗原来自人工合成的特异性肿瘤抗原表位肽或者佐剂重组人钙网蛋白复合物；所述的肿瘤特异性抗原肽来源于：NY-ESO-1,AFP,CEA,CA-125,MUC-1,ETA,MAGE,突变的Ras、Raf及突变的p53,以及肿瘤特异性突变抗原，如EGFR点突变T790M,G719X,L858R和缺失性突变等，但并不局限于这些肿瘤特异性突变抗原；
本发明中，所述的肿瘤抗原由肿瘤细胞在免疫原性细胞死亡诱导剂作用下释放；
本发明中，所述的未成熟的树突状细胞通过单个核细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的作用下，诱导形成；
本发明中，步骤(1)中将肿瘤抗原与未成熟的树突状细胞共孵育时，同时加入肿瘤坏死因子α；
本发明中，从悬浮的单个核细胞分选出所述的CD8+初始T细胞。
本发明中，所述的干细胞分化抑制剂是mTOR抑制剂、白介素-7、白介素-15或者其组合。
本发明中，所述的肿瘤抗原特异性CD8+T记忆性干细胞具有CD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+CD95+IL-2Rβ+的标记特征；
本发明的步骤(5)中，根据不同肿瘤表达特异性抗原的不同共转染效应的2个或2个以上TCR基因；
本发明的步骤(6)中，所述的抑制性受体基因包括PD-1，CTLA4，TIM3，B7-1,BTLA,VISTA,LAG-3；
本发明中，所述的免疫原性细胞死亡诱导剂是8％玫瑰红、甲胺喋呤、阿霉素或者奥沙利铂中的一种或者几种；
本发明中，所述的肿瘤细胞源自经处理后产生免疫原性细胞死亡的病人自体肿瘤组织细胞；
本发明中，所述的肿瘤细胞包括血液系统肿瘤、实体瘤细胞、胸腹水脱落肿瘤细胞,或者对应的肿瘤干细胞；
本发明中，所述的单个核细胞来源于肿瘤患者、健康者离体细胞或者脐带血。
本发明中，所述的mTOR抑制剂是雷帕霉素或依维莫司。
另一方面，本发明提供了肿瘤抗原特异性CD8+TCR-Tscm细胞在制备抗肿瘤药剂中的应用。所述的抗肿瘤药剂可用于治疗恶性肿瘤，包括实体瘤和血液系统肿瘤；以及在晚期肿瘤治疗中发挥特异性抗肿瘤作用；以及在预防术后复发中发挥特异性抗肿瘤作用。
进一步，本发明提供了肿瘤抗原特异性CD8+TCR-Tscm细胞在制备肿瘤检测试剂盒中的应用。例如在肿瘤发生的高危人群中发挥特异性预防作用，或者在阻断和清除癌前病变中发挥特异性抗肿瘤作用。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明获得的多功能TCR基因修饰的CD8+T记忆干细胞(CD8+TCR-Tscm)具有特异性识别胞内特异性抗原；在体内持续时间长；突破肿瘤免疫抑制微环境克服肿瘤的异质性。
(2)本发明以ICD诱导剂诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，释放危险信号分子及肿瘤抗原，提高树突状细胞摄取，加工和提呈抗原效果，同时，肿瘤全细胞抗原特异性Tscm抗肿瘤效果更佳。
(3)小分子多肽抗原性很弱，人工合成抗原表位肽与重组CRT蛋白复合物，促进树突状细胞摄取，加工和提呈抗原效果，并且容易合成和大规模量化生产以及同时使用多种抗原肽，便于诱导针对多种肿瘤抗原特异性TCR的Tscm细胞。
(4)本发明有关的肿瘤细胞包括肿瘤干细胞，由于肿瘤干细胞全细胞抗原诱导的Tscm细胞可特异性清除相应的肿瘤干细胞，避免了目前针对肿瘤干细胞标志(如CD133等)的单克隆抗体及小分子靶向药物治疗所致的严重不良反应。
(5)本发明有关的干细胞分化抑制剂mTOR抑制剂和IL-7联合应用，提高Tscm产量。
(6)本发明通过病毒载体共转染针对不同肿瘤特定抗原特异性的TCR基因α链和β链获得能识别多种肿瘤抗原的CD8+TCR-Tscm细胞，克服了单一TCR-Tscm细胞无法高效清除异质性肿瘤细胞的难题。
(7)本发明应用CRISPR/Cas9基因敲除技术敲除CD8+TCR-Tscm细胞的PD-1等一个或多个抑制性受体基因，克服了肿瘤免疫逃逸，提高抗肿瘤效果。
(8)本发明采用CD8+初始T淋巴细胞，去除了抑制性的Treg及MDSCs，降低了免疫耐受的发生。
附图说明
图1为本TCR基因修饰的CD8+T记忆干细胞(CD8+TCR-Tscm)的体外制备方法流程简图。
图2为ICD诱导剂诱导肿瘤细胞CRT转位体现ICD示意图，其中ICD诱导剂诱导结肠癌细胞CT-26产生ICD，b和c组均可见CRT转位。a:对照组；b:阿霉素组；c:奥沙利铂组。
图3为Tscm细胞流式细胞仪检测鉴定结果示意图，其中，经抗原活化的CD8+CD3+T淋巴细胞在IL-7和IL-15或TWS119作用下(B、D)较对照组(A、C)产生CD3+CD8+CD62L+CCR7+CD95+分子表型的Tscm细胞显著增多。
图4为小鼠Tscm细胞特异性细胞毒试验示意图，其中，鼠结肠癌CT26细胞经奥沙利铂诱导ICD后，冲击树突状细胞激活CD8+初始T细胞，通过本发明获得的Tscm对CT26细胞较A20细胞明显的特异性细胞毒杀伤作用。
图5为人Tscm细胞特异性细胞毒试验示意图，其中，体外细胞毒实验中NY-ESO-1(157-170)特异性CD8+Tscm对表达NY-ESO-1的H1299肺腺癌细胞具有细胞毒效应，对不表达NY-ESO-1的A549肺癌细胞无细胞毒效应。
图6为预防肿瘤发生-再接种成瘤试验示意图，其中，CT26荷瘤小鼠根治性手术后，输注肿瘤特异性CT26-Tscm细胞可明显预防对侧部位接种CT26细胞的成瘤，亦即预防术后复发，但对未输注CT26-Tscm细胞的对照组及无关小鼠淋巴瘤A20细胞接种的成瘤没有预防作用。
图7为人T细胞活化过程中表面PD-1受体的动态变化示意图，其中，通过流式细胞仪检测到PD-1受体在T细胞未活化状态下几乎不表达或低表达，而用CD3/CD28磁珠活化T细胞后，表达PD-1的T细胞比例逐渐增高，在第2天达到顶峰，随后表达逐渐下降，至第7天回到活化前基线水平(图7A，7B)。
图8为PD-1在不同T细胞亚群之间的表达差异示意图，其中，按对抗原应答的不同，将T细胞分为初始T细胞(T cells,Tn)，记忆T细胞(memory T cells,Tm)以及效应T细胞(effector T cells,Te)，其中Tm进一步分成中枢记忆性T细胞(central memory Tcells,Tcm)和效应记忆性T细胞(effector memory T cells,Tem)，流式检测分析显示，PD-1在不同T细胞亚群之间表达有明显差异：Tn<Tcm<Tem(图8)。
图9为特异性识别HLA-A2结合的NY-ESO-1(157-170)抗原肽的CD8+TCR-Tscm细胞在体内较之Tn,Tcm,Tem细胞具有更强的抗肿瘤效应(图9)。
结合下述实施例和附图进一步阐述本发明；其中包括：
第一方面，提供了一种应用ICD诱导剂模拟体内诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，释放危险信号分子CRT或利用CRT与人工合成肿瘤抗原表位肽复合物，易被树突状细胞吞噬，处理，加工和提呈肿瘤细胞全抗原或人工合成多抗原性的方法；ICD诱导剂包括：1)玫瑰红(RB)；2)甲胺喋呤(MTX)；2)阿霉素(ADM)；4)奥沙利铂(L-OHP)。
第二方面，提供了所述ICD诱导剂的合理使用方法，ICD诱导剂的合理组合方式包括：1)RB；2)RB+L-OHP；3)MTX+ADM；4)RB+L-OHP+ADM；5)RB+L-OHP+ADM+MTX。
第三方面，提供了联合应用mTOR抑制剂和IL-7抑制干细胞分化方法。
第四方面，提供了应用IL-15维持Tscm细胞干性的方法。
第五方面，提供了按照免疫记忆形成规律，确立了抗原刺激的时间，亦即初始T细胞活化后特定去除抗原负载的树突状细胞，分离出活化的CD8+T细胞，模拟体内抗原清除的方式产生Tscm的方法，这是Tscm产生的关键点。
具体实施方式
实施例1
一种体外制备可识别多种肿瘤特异性抗原的TCR基因修饰的CD8+T记忆干细胞(TCR-Tscm)的方法，该方法包括以下步骤：
(A)由肿瘤病人或健康供者外周血中分离得到的单个核细胞培养分别收集贴壁生长和悬浮生长的单个核细胞；(B)在适当浓度粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的作用下，培养步骤(C)得到的贴壁生长的单核细胞，诱导形成未成熟的树突状细胞；(D)肿瘤抗原由新鲜肿瘤细胞在联合使用1至4种免疫原性细胞死亡(ICD)诱导剂作用下，释放出肿瘤抗原或人工合成的特异性肿瘤抗原表位肽和佐剂重组人钙网蛋白复合物，易被DC细胞摄取，或肿瘤特异性抗原肽来源于：NY-ESO-1,AFP,CEA,CA-125,MUC-1,ETA,MAGE,突变的Ras、Raf及突变的p53,包括肿瘤特异性突变抗原(如EGFR点突变T790M,G719X,L858R和缺失性突变等)，但并不局限于这些肿瘤特异性突变抗原；(E)将步骤(B)得到的未成熟的树突状细胞与步骤(C)得到的肿瘤全细胞抗原共孵育，并适时加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)，使所说的未成熟树突状细胞变为特异性肿瘤抗原负载的具有很强抗原递呈效应的成熟树突状细胞；(E)将步骤(A)中悬浮的单个核细胞用免疫磁珠分选出CD8+初始T细胞，并用无血清含白细胞介素2(IL-2)培基培养；(F)用步骤(D)得到的特异性肿瘤抗原负载的具有很强抗原递呈效应的成熟树突状细胞与步骤(E)中预先分选的CD8+初始T细胞共培养48小时后，收集活化的T细胞，加入抑制干细胞分化的mTOR抑制剂和白介素-7及维持干性的白介素-15，以促进肿瘤抗原特异性的Tscm产生；(G)分离步骤(F)得到能特异性识别同种肿瘤细胞的带有特定标记的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞(Tscm)；(H)步骤G分离获得的特异性识别表达特定肿瘤抗原的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞中克隆出特异识别特定抗原表位的T细胞受体基因(TCR)；构建识别不同肿瘤特定抗原的TCR(，通过慢病毒包装或逆转录病毒载体转染自体的CD8+Tscm细胞，体外制备不同肿瘤特定抗原特异性的CD8+TCR-Tscm细胞。(I)
应用CRISPR/Cas9基因敲除技术敲除步骤(I)制备的抗原特异性的CD8+TCR-Tscm细胞一个或多个抑制性受体基因。
实施例2肿瘤细胞经ICD诱导剂诱导出现ICD特征性的CRT转位现象
采用ICD诱导剂诱导产生免疫原性细胞死亡的肿瘤细胞作为全细胞抗原的来源，具体步骤如下：
1，手术切除肿瘤标本或粗针穿刺活检肿瘤组织，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净(以结肠癌CT26肿瘤为模型)；
2，无菌生理盐水洗3次；用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
3，200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
4，用无血清培养基重悬细胞至1-2x107/ml，加入奥沙利铂或阿霉素等ICD诱导剂作用24小时，如果是用8％玫瑰红只需30分钟；然后提取部分进行检测ICD标志CRT的转位。实验结果见图2。
5，加入离心管中，3000rpm，离心10min，去除部分上清后-80℃保存备用。
实施例2 DC细胞的培养及鉴定
树突状细胞(Dendritic Cells，DC)是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)，实验证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naive Tcells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞，DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用，若将肿瘤抗原负载的DC与分选的CD8+初始T淋巴细胞共培养，在特定细胞因子作用下，能刺激机体产生肿瘤抗原特异性的Tscm细胞；
DC细胞的培养及鉴定步骤为：
1，静脉采集抗凝外周血50ml-60ml；
2，淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离纯化单个核细胞(PBMC)；
3，无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的PBMC，细胞数量需达到1-3x108。贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF(500U/ml)和重组人IL-4(500U/ml)的无血清培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
4，每3d半量换液一次，并补足细胞因子；
5，在培养的第5天，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50mg/ml，对DC进行抗原负载；
6，在培养的第6d，加入重组人TNF-a(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；
7，在培养的第7d，收获DC细胞，其数量应达到1×106个以上；
8，DC的质检：流式细胞仪检测DC细胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表达，以确定DC是否成熟，从而筛选到成熟的DC。
实施例3 CD8+Tscm细胞的制备及鉴定
1，PBMC用无血清培养液培养，收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2x106/ml；
2，用免疫磁珠法阳性选择CD8+初始T淋巴细胞；
3，抗原负载的DC细胞和CD8+初始T细胞，按一定数目比的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2(300U/ml)及重组人IL-7(300U/ml)和IL-15(300U/ml)；
4，共培养3天后分离出T淋巴细胞继续添加重组人IL-2(300U/ml)及重组人IL-7(300U/ml)和IL-15(300U/ml)的培基培养，每3天半量换液一次。
5，在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×106个以上；
6，CD8+Tscm细胞的鉴定：流式细胞仪检测细胞表面CD8、CD62L，CCR7，CD95等分子的表达。
实验结果显示，经抗原活化的CD8+CD3+T淋巴细胞在IL-7和IL-15作用下(B)较对照组(A)产生CD3+CD8+CD62L+CCR7+CD95+分子表型的Tscm细胞显著增多(如图3所示)。
实施例4鼠源Tscm细胞特异性细胞毒杀伤效应
以体外制备的结肠癌细胞CT-26全细胞抗原特异性Tscm细胞为效应细胞，以结肠癌细胞CT-26细胞为靶细胞，鼠源淋巴瘤细胞A20作为对照靶细胞，将效应细胞与靶细胞按不同的比例(数目比)加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1x104个，终体积为200μl，设3个复孔。培养4小时，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率，
结果显示，结肠癌CT26细胞经奥沙利铂诱导ICD后，冲击树突状细胞激活CD8+初始T细胞，通过本发明方法获得的Tscm对CT26细胞较A20细胞明显的特异性细胞毒杀伤作用(如图4所示)。
实施例5人源识别NY-ESO-1的CD8+TCR-Tscm细胞特异性细胞毒杀伤效应
以体外制备的NY-ESO-1的CD8+TCR-Tscm细胞为效应细胞，以NY-ESO-1+肺癌A549细胞为靶细胞，NY-ESO-1-的肺癌细胞H1299作为对照靶细胞，将效应细胞与靶细胞按不同的比例(数目比)加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1x104个，终体积为200μl，设3个复孔，培养4小时，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率，结果如图5所示，通过本发明制备的NY-ESO-1的CD8+TCR-Tscm细胞对H1299细胞较A549细胞明显的特异性细胞毒杀伤作用。
实施例6 Tscm预防肿瘤术后复发-再接种成瘤试验
制备Barb/C小鼠CT26肿瘤模型；待肿瘤直径达到0.5cm时手术性根治切除肿瘤标本无菌条件下，制成单细胞悬液；用无血清培养基重悬细胞至1-2x107/ml，加入奥沙利铂或阿霉素等ICD诱导剂作用24小时，然后提取部分进行检测ICD标志CRT的转位。利用同一品系小鼠脾脏淋巴细胞按照肿瘤特异性Tscm制作流程(参见图1)制备CT26细胞抗原性Tscm，术后2周回输Tscm，继而在原接种区对侧部位接种5×105CT26细胞，以接种鼠源5×105A20细胞作为对照，观察4周后接种成瘤率，
结果如图6所示，CT26荷瘤小鼠根治性手术后，输注肿瘤特异性CT26-Tscm细胞可明显预防对侧部位接种CT26细胞的成瘤，亦即预防术后复发，但对未输注CT26-Tscm细胞的对照组及无关小鼠淋巴瘤A20细胞接种的成瘤没有预防作用。
实施例7人T细胞活化过程中表面PD-1受体的动态变化
1)淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞(PBMC)，
淋巴细胞分离液提前从冰箱取出，待溶液温度升至室温后再混匀使用；采静脉血到肝素抗凝管，混匀，避免出现血液凝集或溶血现象，血液与PBS l：l稀释，摇匀；用毛细管吸取抗凝血，将抗凝血加至另一含淋巴细胞分离液的15ml离心管中，保持两液体界面清晰；将离心管配平放置水平离心机，2000rpm离心20分钟；用毛细管吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层至另15ml管中；加入PBS，旋转试管使液体混匀，2000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀即为外周血单个核细胞(PBMC)；RPMI l 640培养液重悬沉淀，并转移至l0cm细胞培养皿，37℃、50％C02培养2小时，使单核细胞贴壁；收集悬浮细胞即为外周血淋巴细胞；
2)磁珠分选获得的T细胞在添加10％胎牛血清、双抗(青霉素100U/ml和链霉素100u g/m1))的RPMll640完全培养液中培养；
3)刺激活化：完成于分离后第1天。以人CD3/CD28磁珠活化T细胞，并加入重组人细胞因子IL-2；
4)维持培养：每3天半量换液，将细胞液用巴氏吸管移入50ml离心管，封口后离心1200rpm，5min，按计算去除的量吸去旧培养液，重悬后补加新培养液，补加重组人IL-2(终浓度为50IU/m1)和重组人IL-15(终浓度为lng/mL)；
5)流式细胞术检测T细胞膜PD1表达，结果显示。PD-1受体在T细胞未活化状态下几乎不表达或低表达，而用CD3/CD28磁珠活化T细胞后，总T细胞中表达PD-1的T细胞比例逐渐增高，在第2天达到顶峰，随后表达逐渐下降，至第7天回到活化前基线水平(如图7所示)。
实施例8 PD-1在不同T细胞亚群之间的表达差异
同实施例7中获得的经免疫磁珠分选人T细胞在添加10％胎牛血清、双抗(青霉素100U/ml和链霉素100u g/m1))的RPMll640完全培养液中培养，以人CD3/CD28磁珠活化T细胞，并加入重组人细胞因子IL-2，每3天半量换液，将细胞液移入50ml离心管，封口后离心1200rpm，5min，计算去除的旧培养液的量并吸去，重悬后补加新培养液；补加重组人IL-2(终浓度为50IU/m1)和重组人IL-15(终浓度为lng/mL)，流式检测分析，结果显示，PD-1在不同T细胞亚群之间表达有明显差异：Tn<Tcm<Tem(如图8所示)。
实施例9人源识别NY-ESO-1的CD8+TCR-Tscm细胞的体内抗肿瘤作用
以NY-ESO-1+的H1299肺癌细胞及NY-ESO-1-肺癌A549细胞分别接种4周龄裸鼠，以体外制备的NY-ESO-1的CD8+TCR-Tscm细胞及相应的Tcm,Tem,Tn细胞1x106个/200μl，尾静脉注射，每隔2天测量肿瘤长短经，计算肿瘤体积，根据结果绘制肿瘤生长状况；
结果如图9所示，其中显示，A.通过本发明制备的NY-ESO-1的CD8+TCR-Tscm细胞较相应的Tcm,Tem,Tn对H1299细胞种植瘤生长明显的抑制作用；B.NY-ESO-1的CD8+TCR-Tscm细胞对H1299细胞种植瘤较A549细胞种植瘤生长明显的抑制作用。
本发明建立了一种体外制备可识别多种肿瘤特异性抗原的TCR基因修饰的CD8+T记忆干细胞(TCR-Tscm)的方法，利用该方法能将病人外周血初始CD8+T细胞转变成敲除了PD1等1个或多个抑制性受体的能识别多种肿瘤抗原的CD8+TCR-Tscm细胞，回输后在体内存活时间更长，克服肿瘤抑制性，从而抗肿瘤效果更好；所述TCR-Tscm细胞有助于高效临床肿瘤治疗和预防新模式。
本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明所作的举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例作各种修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明说明书的内容或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (17)
1.一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞的体外制备方法，其特征在于，其包括步骤：
(1)将合成的肿瘤特异性抗原肽与未成熟的树突状细胞共孵育，获得特异性肿瘤抗原负载的成熟树突状细胞；
(2)将步骤(1)获得的成熟树突状细胞与CD8+初始T细胞共培养，并加入干细胞分化抑制剂促进、产生肿瘤抗原特异性的特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；
(3)分离获得能特异性识别特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；
(4)从分离获得的特异性识别表达特定肿瘤抗原的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞中克隆特异识别特定抗原表位的T细胞受体(TCR)基因α链和β链；
(5)用步骤(4)获得的识别特定抗原表位的TCR基因α链和β链，构建识别不同肿瘤特定抗原的TCR基因，通过慢病毒包装或逆转录病毒载体转染自体的CD8+Tscm细胞，体外制备不同肿瘤特定抗原特异性的CD8+TCR-Tscm细胞；
(6)用CRISPR/Cas9基因敲除步骤(5)制备的抗原特异性的CD8+TCR-Tscm细胞一个或多个抑制性受体基因。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抗原为人工合成的特异性肿瘤抗原表位肽或者佐剂重组人钙网蛋白复合物；所述的肿瘤特异性抗原肽选自：NY-ESO-1,AFP,CEA,CA-125,MUC-1,ETA,MAGE,突变的Ras、Raf及突变的p53,以及肿瘤特异性突变抗原，如EGFR点突变T790M,G719X,L858R和缺失性突变。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抗原由肿瘤细胞在免疫原性细胞死亡诱导剂作用下释放。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的未成熟的树突状细胞通过单个核细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的作用下诱导形成。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中将肿瘤抗原与未成熟的树突状细胞共孵育时，同时加入肿瘤坏死因子α。
6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，从悬浮的单个核细胞分选出所述的CD8+初始T细胞。
7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞分化抑制剂是mTOR抑制剂、白介素-7、白介素-15或者其组合。
8.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抗原特异性CD8+T记忆性干细胞具有CD45RA+CD45RO-CCR7+ CD62L+CD95+IL-2Rβ+的标记特征。
9.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，根据肿瘤表达特异性抗原的不同共转染效应的2个或2个以上TCR基因。
10.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述的抑制性受体基因包括PD-1，CTLA4，TIM3，B7-1,BTLA,VISTA,LAG-3。
11.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的免疫原性细胞死亡诱导剂是8％玫瑰红、甲胺喋呤、阿霉素或者奥沙利铂中的一种或者几种。
12.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞源自经处理后产生免疫原性细胞死亡的病人自体肿瘤组织细胞。
13.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞为血液系统肿瘤、实体瘤细胞、胸腹水脱落肿瘤细胞,或者对应的肿瘤干细胞。
14.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单个核细胞来源于肿瘤患者或健康者离体细胞或者脐带血。
15.按权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的mTOR抑制剂是雷帕霉素或依维莫司。
16.权利要求1的方法制得的特定抗原特异性的CD8+ TCR-Tscm细胞在用于制备抗肿瘤药剂中的应用。
17.权利要求1的方法制得的TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞在用于制备肿瘤检测试剂盒中的应用。
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