CN104740648A - miRNA-214抑制剂在抑制调节性T细胞中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了miRNA-214抑制剂在抑制调节性T细胞(Treg细胞)中的应用。具体地，本发明公开了微小RNA-214(miRNA-214)能够促进Treg细胞从而帮助肿瘤进行免疫逃逸，实验证明，抑制miRNA-214能够抑制Treg细胞的生长，从而抑制肿瘤生长。因此，miRNA-214有望开发为抗肿瘤药物或抑制免疫应答亢进的药物。

Description

miRNA-214抑制剂在抑制调节性T细胞中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，具体地，涉及miRNA-214抑制剂用于抑制调节性T细胞(Treg)以及抑制肿瘤免疫逃逸，从而预防或治疗肿瘤中的应用

背景技术

microRNA来源于长度约1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60-80nt的具有茎环结构的miRNA前体。前提miRNA转运至胞质后，被进一步切割成长约18-26nt的双链miRNA。双链miRNA解开后，成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)，与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其表达。

尽管microRNA在细胞总RNA中所占的比重很小，但由于miRNA参与生命过程中一系列的重要进程,包括早期胚胎发育、细胞增殖和细胞死亡、细胞凋亡与脂肪代谢、细胞分化以及在基因表达调控中的作用。而细胞增殖及凋亡等常在肿瘤中发生异常,因此推测miRNA的异常缺失、突变或过表达将导致人类疾病的发生。

在哺乳动物在长期的进化历程中，免疫调控已形成了一套复杂的自查与平衡系统，以保证机体在抵抗外源性抗原时可以保持一种自身耐受状态，这其中的许多机制现在仍未完全清楚。

近来，越来越多证据显示miRNA在免疫调控和免疫细胞的发育中扮演者及其重要的角色。到目前为止，只有相对较少的特异性miRNA被揭示出可作为免疫系统的重要调控因子。尤其是在肿瘤免疫相关领域，人们对miRNA所起到的作用知之甚少。

因此，本领域迫切需要了解在肿瘤治疗领域，各种不同miRNA的作用，以开发新的肿瘤治疗药物。

发明内容

本发明提供了miRNA-214在调节性T细胞及肿瘤免疫逃逸中的应用。

本发明的一方面，提供了一种miRNA-214或其前体的拮抗剂的用途，用于制备抑制Treg细胞从而促进T细胞介导的免疫应答的药物组合物。

在另一优选例中，所述的miRNA-214来源于人或非人哺乳动物；较佳地所述的非人哺乳动物为大鼠、小鼠。

在另一优选例中，所述的miRNA-214拮抗剂包括miRNA-214或其前体的反义核酸序列。

在另一优选例中，所述Treg细胞包括CD4⁺CD25⁺Treg、CD4⁺Th3、CD4⁺Tr1、CD4⁺CD25⁺Treg、CD4⁺CD8⁺Ts。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括miRNA-214或其前体的拮抗剂作为活性成分，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。

在另一优选例中，所述的拮抗剂还进一步抑制肿瘤免疫逃逸。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括结肠癌、肝癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、纤维细胞癌、骨髓瘤、周围神经鞘膜瘤。

在另一优选例中，所述的抑制Treg细胞包括抑制Treg细胞自T细胞分化、抑制Treg细胞的生长、抑制Treg细胞的增殖。

本发明第二方面，提供了一种筛选用于预防或治疗肿瘤的候选化合物的方法，且该化合物可作为Treg的抑制剂，包括步骤：

(a)在试验组中，向细胞培养体系加入待测化合物，并测定miRNA-214的表达量和/或活性，以及Treg细胞的细胞数量；在对照组中，向细胞培养体系不加入待测化合物，并测定miRNA-214的表达量和/或活性，以及Treg细胞的细胞数量；

其中，若试验组中miRNA-214的表达量和/或活性显著低于对照组，且Treg细胞的细胞数量显著少于对照组，则说明所述候选化合物未能够抑制miRNA-214并抑制Treg细胞从而预防或治疗肿瘤的化合物。

在另一优选例中，还包括步骤

(b)对(a)中的化合物进一步测试其预防或治疗肿瘤的作用。

本发明第三方面，提供了一种体外非治疗性的抑制Treg细胞的方法，向培养体系中加入miRNA-214抑制剂，从而抑制Treg细胞和/或抑制肿瘤免疫逃逸。

本发明第四方面，提供了一种抑制肿瘤逃逸从而预防或治疗肿瘤的方法，向所需的对象施用安全有效量的miRNA-214抑制剂，从而通过抑制Treg细胞抑制肿瘤逃逸并预防或治疗肿瘤。

在另一优选例中，所述的对象为哺乳动物，更佳地，为人。

在另一优选例中，所述的对象为癌症患者，所述的癌症包括结肠癌、肝癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、纤维细胞癌、骨髓瘤、周围神经鞘膜瘤。

本发明第五方面，提供了一种活性成分的用途，所述的活性成分选自下组：

(a)微小RNA-214(miRNA-214)家族，所述miRNA-214家族包括：miRNA-214或经修饰的miRNA-214衍生物、功能与miRNA-214相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的微小RNA；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的微小RNA、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂；

其特征在于，所述活性成分用于制备促进调节性T细胞(regulatory T cell,Treg细胞)的组合物。

在另一优选例中，所述活性成分还用于制备抑制T细胞介导的免疫应答的组合物。

在另一优选例中，所述组合物包括权利要求1所述的活性成分以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述促进调节性T细胞包括促进Treg细胞自T细胞分化、促进Treg细胞的生长、促进Treg细胞的增殖。

在另一优选例中，所述的miRNA-214具有如SEQ ID NO.:1(ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU)所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的活性成分还被用于制备免疫抑制药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示miR-214在s-180肿瘤移植模型小鼠和LLC移植模型小鼠血浆和细胞微粒子中的表达水平。图1A为miR-214在s-180肿瘤移植模型小鼠血浆和细胞微粒子中的表达结果。normal作为对照组，S-180为实验组；图1B为miR-214在LLC肿瘤移植模型小鼠血浆和细胞微粒子中的表达结果。MV-free作为对照组，MV为实验组。

图2显示LLC MVs对Treg影响的结果图。PBS作为对照组，LLC MV作为实验组。图2A为具体实验设计流程示意图，首先收集LLC MVs，然后将LLC MVs(含有20μg蛋白MV的100μL PBS)静脉注射C57BL/6J小鼠，每2天一次，一共7次，第14天取小鼠全血、脾脏中T细胞，收集血液和脾脏样本。图2B为miR-214在静脉注射LLCMV的小鼠血浆中的表达结果图。图2C为小鼠经LLC MV处理后，全血中Treg细胞流式细胞检测结果图。图2D为小鼠经LLC MV处理后，脾脏中Treg细胞流式细胞检测结果图。

图3显示LLC MVs对肿瘤生长影响的结果图。PBS作为对照组，LLC MV作为实验组。图3A为具体实验设计流程示意图，首先收集LLC MVs，然后将LLC MVs静脉注射C57BL/6J小鼠，每2天一次，一共7次，第14天给小鼠移植s-180肿瘤（10⁶细胞/只），第24天收集血液和肿瘤组织样本。图3B为miR-214在s-180肿瘤移植小鼠血浆中的表达结果图。图3C为LLC MVs预处理的小鼠中，植入肿瘤的体积变化曲线图。图3D为LLC MVs预处理的小鼠中，植入肿瘤的体积实体图。图3E为LLC MVs预处理的小鼠中，植入肿瘤的重量结果图。

图4显示了体外CD4⁺T细胞经不同浓度的LLC MV或miR-214缺失LLC MV处理72小后，CD4⁺CD25^highFoxp3⁺调节性T细胞诱导效果。图4A为小鼠Treg流式细胞检测结果图。图4B为小鼠Treg含量统计结果柱状图。Control为对照组，5LLC MV、10LLCMV、10LLC MV/miR-214^def为实验组。图4A显示的结果为五组实验的平均值±标准误差均值（SEM）。

图5显示了小鼠经不同MV处理，移植肉瘤S-180细胞后，肿瘤体积和重量的变化。图5A显示了实施例4实验流程图。图5B显示了各组肿瘤的大小，其中，PBS为对照组，CD4⁺T cell、CD4⁺T cell（LLC MV）、CD4⁺T cell（LLC MV/miR-214^def）为实验组。图5C显示了肿瘤的重量，结果与图5B相同。

图6显示了LLC MVs和LLC MV/miR-214^def处理的Foxp3^DTR型小鼠和野生型小鼠外周血CD4⁺T细胞miR-214的表达结果、Tregs细胞数量以及肿瘤的体积。图6A显示了实施例5实验流程图，首先构建Tregs缺失（Foxp3^DTR）模型小鼠；每两天用白喉毒素处理Foxp3^DTR型小鼠与野生型小鼠，持续2周；同时LLC MVs或LLC MV/miR-214^def处理Foxp3^DTR型小鼠与野生型小鼠；第十天，向小鼠注射S-180肉瘤细胞，第十七天处死，收集样本。图6B显示了qRT-PCR分析Foxp3^DTR和Foxp3⁺小鼠的脾脏CD4⁺T细胞中miR-214的表达水平。图6C显示了流式细胞技术分析Foxp3^DTR和Foxp3⁺小鼠全血中的Tregs细胞数量。图6D显示了LLC MVs和LLC MV/miR-214^def处理的Foxp3^DTR型小鼠和野生型小鼠肉瘤的体积。*,p<0.05；**,p<0.01。

图7显示了不同MV处理肉瘤s-180移植小鼠全血和脾脏中CD4⁺和Tregs的变化以及肿瘤生长情况。没有移植肉瘤s-180的小鼠(PBS)和用生理盐水处理的肉瘤s-180模型小鼠(PBS)作为对照组，注射293TMV/anti-miR-214的肉瘤s-180模型小鼠(293TMV/anti-miR-214)和注射293TMV/anti-ncRNA的肉瘤s-180模型小鼠(293TMV/anti-ncRNA)作为实验组。图7A显示了实施例6实验流程图，首先构建肉瘤s-180肿瘤移植小鼠；然后进行分组实验，用不同的MV处理实验组与对照组小鼠；处理2周，收集样本分析检测。图7B-C显示了anti-miR-214ASOs可以成功抑制CD4⁺CD25^highFoxp3⁺Tregs的增殖。其中，图7B1和7C1显示了注射293TMV/anti-miR-214的肉瘤s-180模型小鼠(293TMV/anti-miR-214)全血（B1）和脾脏（C1）中Tregs数量显著降低图；7B2和7C2显示了流式细胞技术分析小鼠全血（B2）和脾（C2）中Tregs数量。图7D-F显示了不同组小鼠在接受MV注射14天后的肿瘤生长情况。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现，miRNA-214通过促进T细胞中Treg细胞的分化、增殖及其活性，抑制了T细胞向免疫应答T细胞的分化，减弱了免疫反应，从而帮助肿瘤细胞完成免疫逃逸；本发明人通过实验证实，抑制miRNA-214可以抑制Treg细胞，促进T细胞向免疫应答T细胞分化，从而抑制肿瘤的免疫逃逸，以达到预防和/或治疗肿瘤的目的。在此基础上，完成了本发明。

T细胞

T细胞参与细胞免疫，是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是身体中为抵御疾病感染、肿瘤而形成的英勇斗士。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。

T细胞按照功能和表面标志可以分成很多种类，目前，接受较为广泛的T细胞分类如下：

细胞毒T细胞（cytotoxic T cell）：消灭受感染的细胞。这些细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素，因为它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8，也被称为杀手T细胞(NK细胞)。CD8⁺T细胞，其表面表达CD8，可以通过MHCI与抗原直接结合参与免疫应答。

辅助T细胞（helper T cell）在免疫反应中扮演中间过程的角色：它可以增生扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。辅助T细胞的主要表面标志是CD4。T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已知的HIV的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。CD4⁺T细胞，在表面表达CD4(cluster ofdifferentiation4），通过与MHCⅡ（主要组织相容性复合体，majorhistocompatibility complex）递呈的多肽抗原反应被激活。一旦激活，可以分泌细胞因子，调节或者协助免疫反应。

调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）：负责调节机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用。调节/抑制T细胞有很多种。

记忆T细胞(memory T cell)：在再次免疫应答中起重要作用。记忆T细胞由于暂时没有非常特异的表面标志，还有很多未知之处。

目前，科学研究发现了多种对于T细胞具有抑制作用的miRNA，如miRNA-144、miRNA-181，这些微小RNA在预防和治疗自身免疫性疾病中起着重要的作用。

调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）

调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）是一类具有独特免疫调节功能的T细胞，在肿瘤免疫、抗感染免疫、免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡等方面具有重要意义。

Treg细胞在体内外具有调节功能，根据其表面标记、产生的细胞因子和作用机制的不同，Treg细胞可分为CD4⁺Th3、CD4⁺Tr1、CD4⁺CD25⁺Treg、CD4-CD8⁺Ts和NKT（自然杀伤性T细胞）等多种亚型。在这些种类繁多的调节性T细胞中，CD4⁺CD25⁺Treg细胞处于极为重要的地位。CD4⁺CD25⁺Treg细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特征，其免疫无能性表现在对高浓度IL-2的单独刺激、固相包被或可溶性抗CD3单抗或抗CD3和抗CD28单抗的联合作用呈无应答状态，也不分泌IL-2，也就是说CD4⁺CD25⁺Treg细胞对所有传统的T细胞受体（T-cell receptor，TCR）介导的实验性刺激因素均表现为无能性。而免疫抑制性则表现在活化后能够强有力地抑制CD4⁺和CD8⁺效应T淋巴细胞的活化、增殖及功能，这种免疫抑制不具有MHC限制性。

CD4⁺CD25⁺Treg细胞是一群独特的专职抑制细胞，其表面表达CD4、CD25、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR）、叉头/翼状螺旋转录因子（forkhead/winged helix transcription factor,Foxp3）等。转录因子Foxp3与CD4⁺CD25⁺Treg细胞的产生、发育和功能密切相关，而且Foxp3的表达被认为CD4⁺CD25⁺Treg细胞的特征性标志。小鼠Foxp3基因位于染色体XA1.1，全长30858bp，编码蛋白含431个氨基酸。在胸腺内优势表达于CD4⁺CD25⁺CD8-T胸腺细胞，在外周优势表达于CD4⁺CD25⁺Treg细胞。Foxp3缺陷小鼠由于体内CD4⁺CD25⁺Treg细胞的数量和功能缺失，导致一种X连锁隐性自身免疫和炎性综合症IPEX的发生，表现为CD4⁺T细胞无节制的活化和繁殖。Foxp3在小鼠主要表达于CD4⁺T淋巴细胞，与CD4⁺CD25⁺Treg细胞的产生和功能成熟密切相关。用逆转录病毒作为载体将Foxp3基因被动转移给未经抗原活化的CD4⁺CD25⁺T细胞内，使CD25⁺T细胞拥有与CD4⁺CD25⁺Treg细胞相似的表型和功能特征，表现为体外增殖能力和IL-2分泌能力下调，和CD25、CTLA-4、GITR和CD103等与其功能相关的表面分子上调；且能以细胞接触依赖方式抑制CD4⁺CD25⁺效应性T细胞的增殖及IL-2分泌。

在免疫平衡方面，Treg细胞发挥重要作用，参与肿瘤免疫逃逸。机体肿瘤状态时Treg细胞往往呈升高趋势，Treg是具有能识别靶细胞MHC分子所提呈的TCR自身抗原肽，并能发挥一定的免疫抑制功能的T细胞。它作为一种专职的Treg细胞亚群，主要发挥免疫抑制功能，通过下调机体对外来抗原或自身抗原的免疫应答水平，来维持自身耐受。

肿瘤患者体内Treg细胞增高的机制：

（1）肿瘤组织分泌的某些细胞因子能将CD4⁺CD25T细胞直接转变为CD4⁺CD25⁺Treg；

（2）肿瘤细胞能表达CCL22趋化因子，促使表达趋化因子C-C-基元受体4（CCR4）、趋化因子C-C-基元受体8（CCR8）的CD4⁺CD25⁺Treg迁移到肿瘤微环境；

（3）肿瘤组织大量释放肿瘤相关抗原（TAAs），能被耐受性树突状细胞如pDC或imDC所捕获并提呈给Treg细胞识别，从而引起了Treg细胞的活化、增殖；

（4）经肿瘤抗原刺激后，Treg细胞表达淋巴归巢分子CCR7和CD62L，从外周血回到淋巴结，通过细胞分裂快速积聚。

上述结果导致了由肿瘤抗原诱导的、Treg介导的特异性免疫抑制。

Treg发挥肿瘤免疫抑制作用，主要发生在两个部位：一是在肿瘤引流淋巴结内，这些大量增殖的Treg细胞相应地抑制了同一淋巴结中效应细胞的增殖；二是在肿瘤组织内，增加的Treg细胞抑制了TIL中效应T细胞杀伤肿瘤细胞的功能。

Treg细胞发挥抑制作用的分子基础主要由：

（1）通过CTLA4依赖的直接细胞接触抑制方式来抑制效应细胞的功能；

（2）分泌抑制性细胞因子如TGF-β或IL-10来抑制CD4⁺T细胞的活化和增殖，或者CD8⁺效应细胞及前体；

（3）作用APC增加色氨酸新陈代谢来抑制CD4⁺T细胞的活化和增殖；

（4）Treg细胞形成使效应细胞转变成免疫抑制细胞的微环境，使一些CD4⁺CD25T细胞能被CD4⁺CD25⁺Treg诱导并分泌TGF-β或IL-10。

Treg细胞可能还依赖这种局部微环境干扰CD8+T细胞的增殖、细胞因子的分泌和细胞毒作用的能力。同时，Treg细胞的增加可以促进肿瘤的生长，抑制肿瘤免疫效应。Treg细胞介导的免疫抑制干预了免疫应答的各个阶段。CD4⁺CD25⁺Treg细胞在肿瘤的发生、演进过程中扮演着重要的角色。

细胞微粒子(Microvesicles)

这是一类大小在10-500nm之间，由细胞产生(例如分泌)的、具有脂质双层膜的生物(囊泡)结构。早在1967年就有报道，其来源于血小板，包含囊泡，当时被称为“platelet dust”，具有促进凝结的作用。后来体外研究发现内皮细胞、血管平滑肌细胞、白细胞、淋巴细胞、红细胞等也都能释放(细胞)微粒子。根据微粒子产生的途径，又可以将微粒子区分为exosomes和shedding vesicles。Exosomes是细胞在被刺激的情况下，通过多囊泡小体(Multivesicular bodies，MVBs)胞吐到细胞外的，而shedding vesicles则是直接从细胞表面以出芽的方式分泌出来的。目前，不同细胞分泌的shedding vesicles被命名为不同的名称，比如中性粒细胞和单核细胞分泌的被称为ectosomes，而血小板分泌的则被称为microparticles。细胞微粒子的膜成分取决于其来源的细胞，主要由脂质和蛋白质组成。

本发明人研究发现细胞微粒子来源于生物体，对生物体具有高亲和性，是理想的药物用载体，高效、特异性地递送miRNA,例如微小RNA-214(miRNA-214)家族，所述miRNA-214家族包括：miRNA-214或经修饰的miRNA-214衍生物、和核心序列为ugccugucuacacuugcugugc、长度为18-26nt、功能与miRNA-214b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物。

具体地，本发明人发现：细胞微粒子是一种在生物体内转运效率高，特异性强的生物囊泡载体，且不同细胞释放的微粒子的膜表成分(包括特异性表面受体及膜脂结构)与对应细胞的质膜成分相同，因此，细胞微粒子带有来源细胞表面特有的受体蛋白或膜脂结构，与对应的靶细胞有高亲和性；同时，由于细胞微粒子中还含有miRNA-214家族发挥作用所需的重要蛋白，因此，如果采用细胞微粒子作为运送miRNA-214家族的载体，就可以高效率、选择性地递送miRNA-214家族到靶细胞/组织，从而大大提高miRNA-214家族调控细胞功能的作用。因此，由于细胞微粒子(包括所有具有细胞微粒子特征的膜脂囊泡结构，比如exosome和shedding vesicles以及针对各种细胞分泌的shedding vesicles的特称)可以提高miRNA-214家族运输的特异性、靶向性和稳定性；以及可以促进miRNA-214家族作用效果等优点。肿瘤分泌的miRNA-214家族包裹在肿瘤衍生的细胞微粒子中，可能参与调解肿瘤与免疫细胞的信号传导，调节免疫细胞功能，有助于肿瘤免疫逃逸。

miRNA及其前体

本发明提供了一类涉及肿瘤免疫逃逸相关的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA是指：微小RNA-214(miRNA-214)家族，所述miRNA-214家族包括：miRNA-214或经修饰的miRNA-214衍生物，其功能与miRNA-214-相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的微小RNA来源于人或非人哺乳动物；较佳地所述的非人哺乳动物为大鼠、小鼠，鼠和人的miRNA-214家族序列完全一致。所述的“功能与miRNA-214相同或基本相同”是指保留了miRNA-23b-3p的≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%的抑制自身免疫的功能。

本发明还包括miRNA变体和衍生物。此外，广义上的miRNA衍生物也可包括miRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA-214进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。

药物组合物及施用方法

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

在本发明中，miRNA-214可被用于制备抑制免疫应答的免疫抑制药物组合物，该药物组合物可用于治疗免疫反应亢进的各种疾病。

而miRNA-214抑制剂则可被用于制备抑制肿瘤免疫逃逸的药物组合物，其中，miRNA-214抑制剂作用于Treg，抑制Treg的分化、增殖以及活化。

本发明的有益效果：

1.本发明miRNA-214作用于Treg细胞，具有促进Treg细胞分化、增殖，从而抑制了具有免疫功能的T细胞的功能。

2.本发明miRNA-214及其前体可用于抑制免疫应答，从而治疗免疫亢进引起的各种自身免疫性疾病。

3.本发明miRNA-214抑制剂可用于阻止Treg细胞，从而抑制肿瘤通过Treg细胞产生的免疫逃逸。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1构建肿瘤移植模型小鼠

首先选择小鼠肉瘤S-180细胞（来源于中国科学院细胞库）和小鼠Lewis肺癌细胞（LLC）（来源于中国科学院细胞库）构建肿瘤移植模型小鼠；然后提取不同肿瘤移植模型小鼠的血浆和细胞微粒子（MVs）；再采用Real time-PCR方法检测miR-214在不同肿瘤移植模型小鼠的血浆和细胞微粒子中的表达水平。

1.1构建小鼠肉瘤S-180细胞移植模型小鼠和Lewis肺癌细胞（LLC）移植模型小鼠

选用C57BL/6J小鼠，分为三组：

i.对照组：C57BL/6J小鼠，皮下打入100uL生理盐水；

ii.肉瘤S-180细胞移植模型小鼠：C57BL/6J小鼠，腋下皮下注入肉瘤S-180细胞（100uL，10⁶细胞/只）建立肿瘤小鼠模型；

iii.Lewis肺癌细胞（LLC）移植模型小鼠：C57BL/6J小鼠，腋下皮下注入LLC细胞（100uL，10⁶细胞/只）建立肿瘤小鼠模型。

1.2肿瘤移植模型小鼠的血浆和细胞微粒子（MVs）的提取分离方法

采用差速离心法分离肿瘤移植模型小鼠的血浆和细胞微粒子（MVs）。

在转速300×g,1,200×g,和10,000×g下离心分离细胞组织残渣，收集上清，上清在转速110,000×g下离心70分钟。弃上清，沉淀用PBS和缺少FBS的培养基悬浮。以上离心操作均在4℃条件下进行。

1.3采用Real time-PCR方法检测miR-214在不同肿瘤移植模型小鼠的血浆和细胞微粒子中的表达水平

采用TRIzol法提取不同肿瘤移植模型小鼠的血浆和细胞微粒子中总RNA。采用Real time-PCR方法（Taqman小分子探针）检测miR-214在不同肿瘤移植模型小鼠的血浆和细胞微粒子中的表达水平。

利用AMV反转录酶、茎环结构的反转录引物，将1微升总RNA反转录成cDNA，用TaqMan PCR试剂盒和Applied Biosystems7900PCR仪检测miR-214在不同肿瘤移植模型小鼠的血浆和细胞微粒子中的表达水平。所有实验均包括阴性对照，且重复三次。反应后，Ct通过固定的阈值设置确定。为准确检测目标miRNAs的表达水平，一些固定浓度的已知的miR寡核苷酸也经过相同步骤处理作为对照。之后，根据标准曲线确定每种miRNAs的表达量。而由于细胞微粒子中U6snRNA较少，且没有相关管家基因作为对照的研究，所以细胞微粒子中的miRNAs含量只能以其中的总蛋白含量为标准来确定。

具体结果如图1所示。

由图1A可见，与对照组相比，miR-214在实验组（S-180）s-180肿瘤移植模型小鼠血浆中表达水平增加到对照组（normal）的3.5倍。

MV-free作为对照组，与对照组相比，miR-214在实验组（MV）s-180肿瘤移植模型小鼠细胞微粒子中表达水平增加到对照组（MV-free）的130倍。

由图1B可见，与对照组相比，miR-214在实验组（LLC）LLC肿瘤移植模型小鼠血浆中表达水平增加到对照组（normal）的35倍。

MV-free作为对照组，与对照组相比，miR-214在实验组（MV）LLC肿瘤移植模型小鼠细胞微粒子中表达水平增加到对照组（MV-free）的4.5倍。

综上所述，移植S-180和LLC细胞后，肿瘤移植模型小鼠血浆中的miR-214表达水平均有显著增加，并且增加的miR-214主要存在于细胞微粒子中。

实施例2LLC MVs促进Treg增殖和肿瘤生长

第一组实验：首先收集LLC MVs，然后将LLC MVs静脉注射C57BL/6J小鼠，第14天取小鼠全血、脾脏中T细胞，收集血液和脾脏样本；再采用Real-time PCR的方法检测血浆中miR-214的表达水平采用eBiosience Treg流式检测试剂盒（由eBiosience公司提供）在流式细胞仪上检测各组小鼠全血和脾脏中CD4⁺CD25^highFoxp3⁺细胞的含量。具体实验设计流程示意图见图2A。

第二组实验：首先收集LLC MVs，然后将LLC MVs静脉注射C57BL/6J小鼠，第14天给小鼠移植s-180肿瘤，第24天收集血液和肿瘤组织样本；再采用Real-time PCR的方法检测血浆中miR-214的表达水平；测量肿瘤组织的体积、重量。具体实验设计流程示意图见图3A。

2.1小鼠的全血和细胞微粒子（MVs）的提取分离方法，具体操作如实施例1所述。

2.2采用Real-time PCR的方法检测血浆中miR-214的表达水平，具体操作如实施例1所述。

2.3采用eBiosience Treg流式检测试剂盒（由eBiosience公司提供）在流式细胞仪上检测各组小鼠全血和脾脏中CD4⁺CD25^highFoxp3⁺细胞的含量

具体操作步骤包括：

1).细胞配置成10⁶/ml的细胞悬液，用缓冲液悬浮细胞；

2).取100ul细胞，标记Fc（1ug/样品）封闭15分钟，4℃；

3).细胞标记CD4（0.125ug/样品）和CD25（0.06ug/样品）的抗体，4℃孵育30分钟；

4).用缓冲液洗细胞，接着用固定破膜剂通透细胞膜30分钟到18小时，4℃；

5).通透结束后用通透缓冲液洗细胞，标记Foxp3（0.5ug/样品）的抗体4℃孵育30分钟；

6).用通透缓冲液洗细胞后，缓冲液悬浮细胞，上流式机器检测。

7).检测各组小鼠全血和脾脏中CD4⁺CD25^highFoxp³⁺细胞的含量。

2.4测量肿瘤组织的体积、重量的方法

利用游标卡尺检测肿瘤的长，宽，高。肿瘤重量及体积由此公式计算：体积=π/6×(长)×(宽)×(高)。

具体结果见图2和图3。

其中，图2B显示了为miR-214在静脉注射LLC MV的小鼠血浆中的表达结果图。PBS作为对照组，与对照组相比，实验组（LLC MV）血浆miR-214的水平显著增加。

图2C显示PBS作为对照组，LLC MV为实验组，LLC MV处理后，CD4⁺CD25^highFoxp³⁺Tregs在小鼠总外周血从3.2%增加到5.5%。

图2D显示了PBS作为对照组，LLC MV为实验组，LLC MV处理后，CD4⁺CD25^highFoxp³⁺Tregs在脾脏CD4+T细胞中从7.8%增加到12.7%。

图3B显示了PBS作为对照组，与对照组相比，实验组（LLC MV）血浆miR-214的水平显著增加。与对照组相比，LLC MV-预处理的s-180肿瘤移植小鼠血浆中miR-214水平增加20倍。

图3C显示了PBS预处理作为对照组，LLC MV为实验组，LLC MV处理后，植入肿瘤的体积显著增大。

图3D显示了LLC植入10⁵S-180细胞时，PBS预处理作为对照组，LLC MV预处理为实验组，对照组小鼠中肿瘤没有生长,而实验组肿瘤生长迅速；然而，植入10⁶S-180细胞时，实验组比对照组植入的肿瘤细胞生长更迅速。

图3E显示了PBS预处理作为对照组，LLC MV预处理为实验组，与对照组相比，实验组（LLC MVs）预处理的小鼠的肿瘤重量显著增加。

实施例3miR-214缺失的细胞微粒子对Treg细胞的影响

方法：用反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide）敲除LLC细胞中的miR-214，收集培养液中的MV，即获得LLC细胞来源的miR-214缺失细胞微粒子；然后用美天旎CD4+T细胞磁珠分选试剂盒（德国美天旎生物技术公司）分选出小鼠脾脏中CD4+T细胞并培养；采用eBiosience Treg流式检测试剂盒（eBiosience公司）在流式细胞仪上检测各组小鼠CD4⁺CD25^highFoxp3⁺细胞的含量。

3.1小鼠Lewis肺癌细胞系（LLC细胞）（源于中国科学院细胞库）的培养

在完全培养基，高糖DMEN，10%FBS，4mmol/L谷氨酰胺，双抗的培养条件下，于5%的CO2培养箱中培养LLC小鼠Lewis肺癌细胞系（源于中国科学院细胞库）。

3.2采用反义寡核苷酸的方法敲除miR-214

LLC细胞接种于60毫升培养皿上，每皿使用300pmol的anti-miR-214（Ambion公司）进行转染,anti-miRNA(anti-ncRNA，Ambion公司)作为阴性对照。

3.3制备LLC细胞来源的miR-214缺失细胞微粒子

用anti-miR-214、anti-miRNA(anti-ncRNA)，根据说明书用脂质体转染试剂转染LLC细胞。6个小时后，将培养基换成混合1%细胞微粒子去除的胎牛血清的DMEM中，48小时后，取得细胞培养液，分离得到微粒子。

3.4小鼠CD4+T细胞的提取和培养

提取：取小鼠（6-8周）新鲜脾脏，研碎后过200目筛网，制成单细胞悬液；将制成的细胞悬液用小鼠淋巴细胞分离液分离，取其中的乳白色淋巴细胞，用PBS洗两遍；用美天旎CD4⁺T细胞分选试剂盒（德国美天旎生物技术公司）标记细胞，滤过磁力柱，从而分选得到CD4⁺T细胞。

培养条件：培养液是RPMI1640，12%FBS，4mmol/L谷氨酰胺，1mmol/L HEPES，双抗，在5%的CO₂培养箱中培养。

培养方法：将分选得到的CD4⁺T细胞，配成终浓度为106细胞/ml的浓度，为了活化CD4⁺T细胞,培养液中加入1μg/mL的小鼠CD3e抗体，1μg/mL的小鼠CD28抗体。

3.5分组实验：

对照组：小鼠原代培养的CD4⁺T细胞未用LLC MV处理；

实验组1：小鼠原代培养的CD4⁺T细胞经5LLC MV(每10⁵细胞中加入5ug蛋白)的LLC细胞微粒子处理；

实验组2：小鼠原代培养的CD4⁺T细胞经10LLC MV(每10⁵细胞中加入10ug蛋白)的LLC细胞微粒子处理；

实验组3：小鼠原代培养的CD4⁺T细胞经10LLC MV/miR-214^def(每10⁵细胞中加入10ug蛋白)的敲除miR-214的LLC细胞微粒子处理。

3.6采用eBiosience Treg流式检测试剂盒（eBiosience公司）在流式细胞仪上检测各组小鼠CD4⁺CD25^highFoxp3⁺细胞的含量。具体操作如实施例1所述。具体结果见图4。

图4A可见，Control为对照组，5LLC MV、10LLC MV、10LLC MV/miR-214^def为实验组。与对照组相比，经5LLC MV、10LLC MV处理后，CD4⁺CD25^highFoxp3⁺细胞水平显著增加；经10LLC MV/miR-214^def后，CD4⁺CD25^highFoxp3⁺细胞水平与对照组相比没有显著变化。

图4B可见，Control为对照组，5LLC MV、10LLC MV、10LLC MV/miR-214^def为实验组。与对照组相比，经5LLC MV、10LLC MV处理后，CD4⁺CD25^highFoxp3⁺细胞水平显著增加；经10LLC MV/miR-214^def后，CD4⁺CD25^highFoxp3⁺细胞水平与对照组相比没有显著变化。

综上所述，由图4可见，外源性miR-214(不同浓度的LLC MV，含有miR-214的细胞微粒子)显著提高了CD4⁺CD25^highFoxp3⁺调节性T细胞的水平，而miR-214缺失的细胞微粒子对Tregs增长无明显作用。体外试验验证Treg细胞增长依赖于miR-214。

其中，图4A显示了五组流式实验中一组数据作为代表。五组实验相互独立，其图中标记的结果为平均值±标准误差均值（SEM）。

实施例4miR-214诱导Treg细胞，anti-miR-214有助于抑制肿瘤

方法

4.1分组实验：

对照组：裸鼠（购自南京军区总医院实验动物中心）用生理盐水（PBS）处理；

实验组1：裸鼠经原代培养的CD4⁺T细胞处理；

实验组2：裸鼠经原代培养的LLC细胞微粒子预处理的CD4⁺T细胞（10μg蛋白/10⁵CD4⁺T细胞）处理；

实验组3：裸鼠经原代培养的去除miR-214的LLC细胞微粒子预处理的CD4⁺T（10μg蛋白/10⁵CD4⁺T细胞）细胞处理。

实验组1-3按5×10⁶细胞数/只尾静脉注入不同分组裸鼠，对照组裸鼠尾静脉注射生理盐水。

4.2实验组和对照组裸鼠皮下植入10⁶个肉瘤S-180细胞/只。

5天后，收集样本。

观察实验组和对照组的裸鼠，在注入外源性miR-214诱导处理的CD4⁺T细胞诱导产生miR-214后，裸鼠的肿瘤生长是否有差异。

4.3测量肿瘤组织的体积、重量的方法。具体操作步骤如实施例2所述。

共分为4组，每组n=6-8，结果以平均值±SEM计。

结果

图5B可见，PBS为对照组，CD4⁺T细胞、CD4⁺T细胞（LLC MV）、CD4⁺T细胞（LLC MV/miR-214^def）为实验组，CD4⁺T细胞（LLC MV）实验组的肿瘤大小与对照组相比，显著增大；CD4⁺T细胞和CD4⁺T细胞（LLC MV/miR-214^def）实验组的肿瘤大小与对照组相比，显著变小。

由此可见，裸鼠输入外源性miR-214诱导的Treg比例增加的CD4⁺T细胞后，肿瘤的体积显著大于对照组，而输入没有处理的CD4⁺T细胞以及敲除miR-214的LLC MV处理的CD4⁺T细胞的裸鼠，肿瘤体积显著小于对照组。

图5C显示了肿瘤的重量，结果与图5B相一致。CD4⁺T细胞（LLC MV）实验组的肿瘤重量与对照组相比，显著增加；CD4⁺T细胞和CD4⁺T细胞（LLC MV/miR-214^def）实验组的肿瘤重量与对照组相比，显著减少。由此可见，输入外源性miR-214处理的Treg比例增加的CD4⁺T细胞后，肿瘤的重量显著大于对照组，而输入没有处理的CD4⁺T细胞以及敲除miR-214的LLC MV处理的CD4⁺T细胞的裸鼠，肿瘤体积显著小于对照组。

结论

肿瘤分泌miR-214诱导的Tregs可明显促进小鼠体内植入肿瘤的生长，这说明肿瘤分泌miR-214诱导的Tregs可以显著抑制能杀伤肿瘤细胞的毒性细胞，比如，自然杀伤细胞（NK）和巨噬细胞的免疫应答反应。

实施例5肿瘤细胞分泌的含有miR-214的微粒子是作用于Treg细胞从而产生促瘤作用。

LLC MV/miR-214^def是指被去除miR-214，即缺失miR-214的MV。

5.1构建Tregs缺失（Foxp3^DTR）模型小鼠。

Foxp3^DTR转基因小鼠可以用来构建Treg细胞敲除小鼠。由于Treg细胞表达白喉毒素受体，所以白喉毒素处理后，Foxp3^DTR小鼠的Treg细胞被敲除。实验采用的Foxp3^DTR小鼠，对照小鼠为野生型Foxp3⁺型小鼠(由南京大学模式动物研究所提供)。

用白喉毒素处理Foxp3^DTR型小鼠与野生型（WT，Foxp3⁺）小鼠。

Foxp3^DTR型小鼠与野生型同窝出生小鼠连续六天腹腔内注射白喉毒素，注射量按50μg/kg体重计算。

由于白喉毒素不会降低对照组Foxp3⁺型同窝出生小鼠的Treg含量，但会导致Foxp3^DTR小鼠淋巴结、外周血、脾脏、和胸腺中的Treg含量出现剂量依赖性降低；经6天处理，Treg细胞被完全消除。

5.2从注射白喉毒素首日开始，Foxp3^DTR型小鼠与野生型小鼠通过尾静脉注射含有miR-214的LLC MV和缺失miR-214的LLC MV/miR-214^def(含有20μg蛋白MV的100μL PBS)此处理每两天进行一次，持续两周。

5.3第十天，小鼠皮下注射S-180肉瘤细胞，第十七天处死，收集样本。

5.4利用Real-time PCR方法检测小鼠血浆中miR-214的表达水平。具体操作步骤如实施例1所述。

5.5利用美天旎CD4⁺T细胞磁珠分选试剂盒（德国美天旎生物技术公司）分选出CD4⁺T细胞。具体操作步骤如实施例2所述。

5.6采用eBiosience Treg流式检测试剂盒（eBiosience公司）在流式细胞仪上检测各组小鼠CD4⁺CD25^highFoxp3⁺细胞的含量。具体操作步骤如实施例2所述。

5.7测量肿瘤体积。具体操作步骤如实施例2所述。

具体结果如表1和图6所示。

结果

图6B可见，在LLC MV注射后，Foxp3^DTR型小鼠和野生型Foxp3⁺同窝出生幼鼠的外周血CD4⁺T细胞miR-214的表达量显著升高，而注射LLC MV/miR-214^def的Foxp3^DTR型小鼠和野生型Foxp3⁺小鼠体内miR-214表达量不变。

图6C可见，在LLC MVs和LLC MV/miR-214^def处理的第7天、第13天、第15天、第17天，与LLC MV/miR-214^def处理相比，LLC MV处理的Foxp3⁺小鼠外周血CD4⁺T细胞中Tregs百分比均明显上升。但是，LLC MVs和LLC MV/miR-214^def两种处理对Foxp3^DTR型小鼠外周血CD4⁺T细胞的Tregs比例均没有影响。

图6D可见，LLC MVs处理的Foxp3⁺型小鼠肉瘤细胞增殖速度高于LLCMV/miR-214^def处理的Foxp3⁺型小鼠；LLC MVs和LLC MV/miR-214^def不能促进Foxp3^DTR型小鼠的肿瘤生长。

表1显示了LLC MVs和LLC MV/miR-214^def处理的Foxp3^DTR型小鼠和野生型小鼠外周血CD4⁺T细胞中miR-214的相对表达量、TregCD4⁺T细胞的水平，以及肉瘤的体积。表1的结果与图6的结果相同。

表1

实施例6.miR-214抑制剂能够抑制Treg细胞的增殖

方法:n＝6-8，数据以平均值±标准误差均值进行统计

将anti-miR-214（ASO）转染293T细胞，得到了富含anti-miR-214的MV。提前给小鼠腋下皮下植入S-180肿瘤细胞，待肿瘤生长一周后达到比较均匀的大小时（直径0.6cm左右），将对照293T来源的MV与改造过的293T MV/anti-miR-214尾静脉注射给小鼠，每次每只小鼠20ugMV，隔天注射一次，具体流程见图4-1,14天后处死小鼠，收集数据。

6.1构建肉瘤细胞s-180肿瘤移植小鼠。具体操作步骤如实施例1所述。

6.2将anti-miR-214转染293T细胞,培养后收集培液上清，分离得到了富含anti-miR-214的293TMV/anti-miR-214。将anti-ncRNA转染293T细胞，得到了低水平miR-214的293TMV/anti-ncRNA

6.3分组实验：

对照组1：没有移植肉瘤s-180的小鼠；

对照组2：肉瘤s-180肿瘤移植小鼠，第七天开始每2天一次尾静脉注射生理盐水（100ul PBS）；

实验组1：肉瘤s-180肿瘤移植小鼠，第七天开始每2天一次尾静脉注射293TMV/anti-ncRNA（20μg蛋白MV,100μL PBS）；

实验组2：肉瘤s-180肿瘤移植小鼠，第七天开始每2天一次尾静脉注射293TMV/anti-miR-214（20μg蛋白MV,100μL PBS）。

MV处理2周每两天一次，第21天收集样本。

6.4利用美天旎CD4+T细胞磁珠分选试剂盒（德国美天旎生物技术公司）分选出CD4+T细胞。具体操作步骤如实施例2所述。

6.5采用eBiosience Treg流式检测试剂盒（eBiosience公司）在流式细胞仪上检测各组小鼠CD4⁺CD25^highFoxp3⁺细胞的含量。具体操作步骤如实施例2所述。

6.6测量肿瘤体积、重量的方法。具体操作步骤如实施例2所述。

结果：

图7B-C可见，与没有移植肉瘤s-180的对照组(PBS)和用生理盐水处理的肉瘤s-180模型小鼠(PBS)相比，注射293TMV/anti-miR-214的肉瘤s-180模型小鼠(293TMV/anti-miR-214)全血（B1）和脾脏（C1）中Tregs数量显著降低；注射293TMV/anti-ncRNA的肉瘤s-180模型小鼠(293TMV/anti-ncRNA)全血（B1）和脾脏（C1）中CD4⁺T细胞的数量没有显著变化。由此可见，anti-miR-214ASOs可以成功抑制CD4+CD25highFoxp3⁺Tregs的增殖。

此外，图7D-F可见，与没有移植肉瘤s-180的对照组(PBS)和用生理盐水处理的肉瘤s-180模型小鼠(PBS)相比，注射293TMV/anti-miR-214的肉瘤s-180模型小鼠(293TMV/anti-miR-214)肿瘤生长速度显著降低，体积显著减小，重量显著降低；注射293TMV/anti-ncRNA的肉瘤s-180模型小鼠(293TMV/anti-ncRNA)肿瘤生长速度、体积和重量没有显著变化。

结论：以上结果证实了MV运送anti-miR-214ASOs是一种抑制肿瘤诱导Tregs增殖、抑制植入肿瘤生长的有效手段。肿瘤分泌miR-214将CD4⁺T细胞转变成为免疫抑制Tregs细胞，并促进肿瘤逃逸。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种miRNA-214或其前体的拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备抑制Treg细胞从而促进T细胞介导的免疫应答的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miRNA-214拮抗剂包括miRNA-214或其前体的反义核酸序列。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Treg细胞包括CD4⁺CD25⁺Treg、CD4⁺Th3、CD4⁺Tr1、CD4⁺CD25⁺Treg、CD4⁺CD8⁺Ts。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括miRNA-214或其前体的拮抗剂作为活性成分，和药学上可接受的载体。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的拮抗剂还进一步抑制肿瘤免疫逃逸。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括结肠癌、肝癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、纤维细胞癌、骨髓瘤、周围神经鞘膜瘤。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制Treg细胞包括抑制Treg细胞自T细胞分化、抑制Treg细胞的生长、抑制Treg细胞的增殖。

8.一种筛选用于预防或治疗肿瘤的候选化合物的方法，且该化合物可作为Treg的抑制剂，其特征在于，包括步骤：

(a)在试验组中，向细胞培养体系加入待测化合物，并测定miRNA-214的表达量和/或活性，以及Treg细胞的细胞数量；在对照组中，向细胞培养体系不加入待测化合物，并测定miRNA-214的表达量和/或活性，以及Treg细胞的细胞数量；

其中，若试验组中miRNA-214的表达量和/或活性显著低于对照组，且Treg细胞的细胞数量显著少于对照组，则说明所述候选化合物未能够抑制miRNA-214并抑制Treg细胞从而预防或治疗肿瘤的化合物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括步骤

(b)对(a)中的化合物进一步测试其预防或治疗肿瘤的作用。

10.一种体外非治疗性的抑制Treg细胞的方法，其特征在于，向培养体系中加入miRNA-214抑制剂，从而抑制Treg细胞和/或抑制肿瘤免疫逃逸。

11.一种抑制肿瘤逃逸从而预防或治疗肿瘤的方法，其特征在于，向所需的对象施用安全有效量的miRNA-214抑制剂，从而通过抑制Treg细胞抑制肿瘤逃逸并预防或治疗肿瘤。

12.一种活性成分的用途，所述的活性成分选自下组：

(a)微小RNA-214(miRNA-214)家族，所述miRNA-214家族包括：miRNA-214或经修饰的miRNA-214衍生物、功能与miRNA-214相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的微小RNA；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的微小RNA、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂；

其特征在于，所述活性成分用于制备促进调节性T细胞(regulatory T cell,Treg细胞)的组合物。