CN114836379B - 抗血液肿瘤药物活性成分的获得方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了治疗/预防血液肿瘤药物活性成分的获得方法。该方法中，首次对NK‑92细胞、NK‑92MI细胞分泌的细胞外囊泡进行三级分离，获得两组包括大中小三种尺寸的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)；然后利用NK‑92细胞、NK‑92MI细胞的微小RNA(miRNA)序列和两组细胞外囊泡的miRNA序列组成的大样本进行活性筛选，获得对血液肿瘤细胞杀伤力强的活性miRNA。通过本发明获得的活性miRNA可参与调节基因的表达，具有治疗/预防血液肿瘤的作用；这些活性miRNA可能调节免疫细胞的早期发育，影响免疫细胞发育及分化；活性miRNA可能参与免疫功能的调控，对血液肿瘤具有治疗/预防作用。本发明提出的活性miRNA在脂质体中的转染效率高，转染后的抗肿瘤效果显著。

Description

抗血液肿瘤药物活性成分的获得方法及其用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及相关的活性成分在制备治疗/预防白血病药物上的用途。
背景技术
血液系统恶性肿瘤(Hematological Malignant Tumors)是一种血液系统恶性疾病，具有高度恶性和分化障碍等特点，包括急、慢性白血病及淋巴瘤等。慢性粒细胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia，CML)是一种发生在多能造血干细胞上的恶性骨髓增殖性肿瘤。其特点是产生大量不成熟的白细胞，这些白细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓正常造血功能，并能够通过血液在全身扩散，导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等。目前白血病的治疗方法主要包括化疗、局部放疗、靶向治疗、中药治疗和骨髓移植等，然而存在药物治疗效果欠佳、骨髓移植费用昂贵、容易产生耐药及复发等棘手问题。因此，临床上亟需能够有效治疗/预防血液肿瘤/白血病的新型活性成分和新型药物。
自然杀伤细胞(Natural Killer cells，NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结等组织器官中。NK细胞不同于T细胞和B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。NK-92是生长、增殖依赖于IL-2的人源性NK细胞株，NK-92MI是源自NK-92细胞株、经基因转染得到的IL-2非依赖性NK细胞株。两株人源性NK细胞株可以方便和经济地实现稳定、大量、长期扩增，并已被证实对很多恶性肿瘤具有细胞毒性。细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡的统称。科学家们最早于1983年从绵羊网织红细胞中分离出携带亲本细胞成分的细胞外囊泡，其后细胞外囊泡陆续在血液、尿液、羊水、唾液等体液中被发现和报道。细胞外囊泡通常携带母细胞内的重要生物活性物质，例如蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等，能够通过与靶细胞的结合而调控细胞功能，参与细胞间交流。
本发明利用两种人源性NK细胞株NK-92和NK-92MI作为获取NK细胞分泌的细胞外囊泡的来源。
发明内容
鉴于上述背景技术，本发明的目的是提供一种活性成分的获得方法及其在制备治疗/预防白血病药物上的用途。
经研究，本发明提供如下技术方案：一种用于制备抗血液肿瘤药物的活性成分的获得方法，包括：
1)将以下8组miRNA进行差异表达分析，筛选出差异倍数显著或平均表达量高的miRNA；8组miRNA为：NK-92表达的miRNA、NK-92MI表达的miRNA、NK-92细胞外囊泡LEV表达的miRNA、NK-92细胞外囊泡SEV表达的miRNA、NK-92细胞外囊泡EXO表达的miRNA、NK-92MI细胞外囊泡LEV表达的miRNA、NK-92MI细胞外囊泡SEV表达的miRNA、NK-92MI细胞外囊泡EXO表达的miRNA。
2)将步骤1筛选出的miRNA，基于差异倍数或平均表达量的高低进行排序，筛选出差异倍数高或平均表达量高的活性miR-X。
进一步地，本发明提供上述NK-92的细胞外囊泡LEV、SEV与EXO，以及NK-92MI的细胞外囊泡LEV、SEV与EXO的获得方法，具体为：
(1)将NK-92或NK-92MI细胞培养24-48h后的培养液收集到50mL离心管中，在4℃条件下以离心力400g离心10min，去除死细胞，收集上层溶液；在4℃条件下以离心力2000g离心20min，进一步去除死细胞和细胞碎片，收集上清液。
(2)将第(1)步收集的上清液，在4℃条件下以离心力10000g离心30min，获得沉淀为LEV，并收集上清液。在含有沉淀的离心管中加入40mL磷酸盐缓冲液(PBS)，清洗1-2遍(4℃，10000g离心30min)，将获得的LEV存放于-80℃。
(3)将第(2)步得到的上清液转移至超离管中，在4℃条件下以离心力110000g离心70min，沉淀为EXO，所得沉淀使用PBS在4℃条件下以离心力110000g离心70min进行清洗，将沉淀清洗1-2遍,最后用50μL PBS吹打混匀，将所获得的EXO存放于-80℃条件。
(4)将第(3)步得到上清液在4℃条件下以离心力167200g离心16h，沉淀即为SEV，所得沉淀用PBS在4℃条件下以离心力167200g离心4h清洗，将沉淀清洗2-3遍，最后用50μLPBS吹打混匀，将获得的SEV存放于-80℃。
基于以上方法至少可以获得如下活性成分：
(a)序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.6任一项所示的miR-X，或经修饰的miR-X衍生物；
SEQ ID NO.1(bta-miR-2478-L-2):ATCCCACTTCTGACACCA；
SEQ ID NO.2(hsa-miR-1260a):ATCCCACCTCTGCCACCA；
SEQ ID NO.3(hsa-miR-197-3p):TTCACCACCTTCTCCACCCAGC；
SEQ ID NO.4(hsa-miR-296-5p):AGGGCCCCCCCTCAATCCTGT；
SEQ ID NO.5(hsa-miR-339-5p):TCCCTGTCCTCCAGGAGCTCACG；
SEQ ID NO.6(hsa-miR-223-3p):TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA
(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miR-X；
(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；
(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miR-X的微小RNA、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；
(e)所述(a)中所述的微小RNA的激动剂。
具体地，(e)中所述激动剂选自下组：促进miR-X表达的物质、提高miR-X活性的物质。
本发明还提供上述一种活性成分的用途，所述的活性成分用于制备一药物，所述药物用于治疗/预防血液肿瘤。
本发明还提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有上述活性成分，和药学上可接受的载体。
具体地，所述的药物组合物的制剂形式为冻干粉针、微针、注射剂、片剂、贴剂、胶囊、口服混悬液、或介入栓塞用微球。
具体地，所述药物组合物的递送方法有：转载法、装载药物法、直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法和纳米材料组装法等阳离子材料复合物递送，以及细菌携带质粒表达RNA法、病毒包装表达RNA法等递送方式。
本发明的有益效果在于：本发明首次对NK-92细胞、NK-92MI细胞分泌的细胞外囊泡进行三级分离，获得两组包括大中小三种尺寸的细胞外囊泡，然后利用NK-92细胞、NK-92MI细胞的miRNA序列和两组细胞外囊泡的miRNA序列组成的大样本进行活性筛选，获得对血液肿瘤细胞杀伤力强的活性miRNA。通过本发明获得的活性miRNA可参与调节基因的表达，在治疗/预防血液肿瘤中具有一定的优势；这些活性miRNA可能调节免疫细胞的早期发育，影响免疫细胞发育及分化；活性miRNA可能参与免疫功能的调控，对血液肿瘤具有治疗/预防作用。本发明提出的活性miRNA在脂质体中的转染效率高，转染后的抗肿瘤效果显著。
附图说明
图1NK-92和NK-92MI两种细胞株提取不同尺寸细胞外囊泡的流程图；
图2.NK-92和NK-92MI细胞株分泌的不同尺寸细胞外囊泡的电镜图；
图3.NK-92和NK-92MI细胞株分泌的不同尺寸细胞外囊泡的粒径图；
图4.NK-92和NK-92MI细胞株的抗血液肿瘤效果图；
图5.NK-92和NK-92MI细胞株的miRNA生信分析图；
图6NK-92和NK-92MI细胞株分别分泌的不同尺寸细胞外囊泡抗血液肿瘤效果图；
图7NK-92和NK-92MI细胞株分别分泌的不同尺寸细胞外囊泡miRNA生信分析图；
图8活性miRNA-X mimics(模拟物)及miRNA-X inhibitors(抑制剂)转染效果图；
图9活性miRNA-X的mimics(模拟物)及miRNA-X inhibitors(抑制剂)转染后抗血液肿瘤的效果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
实施例1.活性miRNA-X筛选
本实施例中，使用的细胞株均为人源性细胞株，全部购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(National Collection of Authenticated Cell Cultures，国家模式与特色实验细胞资源库)。
人免疫细胞株NK-92所使用的培养液成分为：添加12.5％马血清(Gibco，CA，USA)和12.5％胎牛血清(Gibco，CA，USA)的MEM-α(Hyclone，UT，USA)，以及0.2mM肌醇(Sigma，DA，DE)，0.1mMβ巯基乙醇(Sigma，DA，DE)，0.02mM叶酸(Sigma，DA，DE)和200U/mL重组IL-2(Novoprotein，SHH，CN)。
人免疫细胞株NK-92MI的培养液成分与上述NK-92细胞株的培养液成分相似，但不含重组IL-2。
人白血病细胞株K562在含有10％正常胎牛血清和1％青霉素-链霉素(Yeasen，SHH，CN)的RPMI-1640培养基(Gibco，CA，USA)中培养。
所有细胞株在保持37℃、含有5％CO2及湿润环境的细胞培养箱(Thermo FisherScientific，MA，USA)中进行培养。
1.1细胞外囊泡(EVs)的分离、获取及纯化
无外泌体的培养液制备：将血清(含有1:1混合的马血清和胎牛血清)与MEM-α培养液按1:4体积比混合后，平均分装到超速离心管(规格：25×89mm)中并配平，将超速离心管放入超速离心机中在4℃条件下以离心力120000g离心16h(超离转子：SW32 Ti，Beckman，CA，USA)，离心结束后收集到的上清液即为无外泌体的培养液。
NK-92和NK-92MI细胞株分别在上述无外泌体的培养液(无EVs的培养液)中培养2-3天，随后分别进行下述三部分实验操作，以分别获取细胞外囊泡LEV(LargeExtracellular Vesicle)、细胞外囊泡EXO(Exosome)及细胞外囊泡SEV(SmallExtracellular Vesicle)。
1.1.1细胞外囊泡LEV的分离与获取：①分别收集两株细胞培养2-3天后的培养液，在4℃条件下以离心力400g离心10min，收集上清液；②将上清液在4℃条件下以离心力2000g离心20min，弃去底部的沉淀(沉淀为细胞和碎片)，收集上清液；③将获得的上清液在4℃条件下以离心力10000g离心30min，然后将离心获得的沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)在4℃条件下以离心力10000g离心30min以洗涤沉淀，最后获得的沉淀分别为来源于两株免疫细胞株的LEV，即NK-92LEV和NK-92MI LEV(如图2A，D；图3A，D)；④分别用50-100μL PBS轻轻吹打、溶解和混匀LEV沉淀，并存放于-80℃。
1.1.2细胞外囊泡EXO的分离与获取：①将1.1.1.实验操作③中以在4℃条件下离心力10000g离心30min后得到的上清液用直径为0.22μm的无菌过滤器进行过滤，分别收集过滤后的液体；②在4℃条件下以离心力110000g将过滤后收集的液体分别离心70min(超离转子：SW32 Ti)，分别收集获得的沉淀；③将获得的沉淀分别用PBS重新洗涤悬浮，在4℃条件下以离心力110000g离心和洗涤70min，并重复该PBS重悬及洗涤的实验操作1-2次，最终获得沉淀为来源于两株免疫细胞株的EXO，即NK-92EXO和NK-92MI EXO(如图2B，E；图3B，E)；④分别用50-100μL PBS轻轻吹打、溶解和混匀EXO沉淀，并存放于-80℃。
1.1.3细胞外囊泡SEV的分离与获取：①将1.1.2.实验操作①过滤后收集的液体在4℃条件下以离心力110000g离心70min，在1.1.2.实验操作②收集沉淀用于分离和获得细胞外囊泡EXO的同时，分别收集上清液；②将获得的上清液分别在4℃条件下以167000g的转速离心16h，分别收集获得的沉淀；③将获得的沉淀分别用PBS重新洗涤悬浮，在4℃条件下以离心力167000g离心和洗涤4h，并重复该PBS重悬及洗涤的实验操作2-3次，最终获得沉淀为来源于两株免疫细胞株的SEV，即NK-92SEV和NK-92MI SEV(如图2C，F；图3C，F)；④分别用50-100μL PBS轻轻吹打、溶解和混匀EXO沉淀，并存放于-80℃。
上述不同类型细胞外囊泡分离、获取的流程汇总如图1所示，所得到的细胞外囊泡的透射电镜及粒径表征分别如图2、图3所示。
采用上述实验方法分离并获得两组、共6种细胞外囊泡后，进一步通过下列实验流程去除囊泡表面吸附的RNA：将获得的各种EVs分别用PBS重悬，加入适量的RNA酶(RNase A，Ambion，TX，USA)，使RNase A最终浓度为1U/mL，随后将含有RNase A的各种细胞外囊泡溶液在37℃水浴锅(JingHong，SHH，CN)中孵育20min。本实验步骤遵循国际细胞外囊泡协会(International Society for Extracellular Vesicles，ISEV)的指南规范操作。
1.2人源细胞株NK-92和NK-92MI及其分泌的细胞外囊泡的miRNA测序及生物信息学分析
1.2.1 NK-92和NK-92MI细胞株的miRNA测序
我们用总RNA纯化试剂盒(Norgen Biotek Corp，Thorold，ON，Canada)分别提取NK-92和NK-92MI培养细胞样本的总RNA(包括所有miRNA和小分子RNA)；使用Bioanalyzer2100(Agilent，CA，USA)分析获得的RNA的质量和数量，并确保RIN值>7.0；分别从两种细胞株提取的RNA样本中取1μg总RNA，使用TruSeq小分子RNA样品制备试剂盒(Illumina，SD，USA)制备小分子RNA文库；按照Illumina HiSeq 2500(Hanyu，SHH，China)的制造商提供的操作说明，委托联川生物有限公司(LC Sciences，HZ，CN)对上述两种细胞株样本中的miRNA分别进行50bp单端测序。
1.2.2两组细胞外囊泡的miRNA测序
为了去除1.1中添加的RNA酶，并同步纯化细胞外囊泡，我们按照1.1中获取和纯化相应细胞外囊泡的步骤重新进行超离和洗涤；采用与1.2.1中相同的方法提取各种细胞外囊泡的总RNA、制备小分子RNA文库，并对各种细胞外囊泡样本中的miRNA分别进行50bp单端测序。
1.2.3 miRNA测序结果的生物信息学分析
首先，使用ACGT101-miR分析软件(LC Sciences，TX，USA)对人源细胞株及其分泌的细胞外囊泡的miRNA测序数据进行生物信息学分析。该软件的主要分析流程如下：原始数据经过质控处理后得到clean reads，将clean reads去除3’接头并进行长度筛选，保留碱基长度在18-26nt的序列；其后将剩余序列与RNA数据库序列进行比对，如mRNA数据库、RFam数据库(包含rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA等)及Repbase数据库(重复序列数据库)，并进行过滤。
其次，基于测序数据及生物信息学分析软件，对具有潜在重要生物学功能的miRNA进行筛选。主要筛选方法及流程：①基于DESeq2(V 1.26.0)(R语言软件包)，对两种细胞株的miRNA测序结果，以及两组细胞外囊泡的miRNA测序结果进行差异表达分析，将其中符合log2 Fold Change>1.25及统计分析p值＜0.05的miRNA作为差异表达miRNA并进行聚类分析，从两种细胞株的测序数据中筛选出15条表达量高且差异显著(NK92相比NK92-MI显著下调)的miRNA(图5及表1)，同时从细胞外囊泡的测序数据中筛选出50条(图7及表2)共同表达量高的miRNA；②基于具有功能的miRNA应该在表达水平上具有优势的假设，对细胞株及细胞外囊泡的miRNA的平均表达量分别进行计算，并基于平均表达量的高低对上述差异表达miRNA进行排序；③根据①筛选出的miRNA的表达量及变化倍数，最终从上述15条细胞株中初步筛选获得的miRNA中遴选出在NK-92MI中表达显著高于NK-92的4条目标miRNA(我们率先通过实验研究发现NK-92MI细胞株的抗血液肿瘤效果优于NK-92细胞株，结果如图4，用GraphPad Prism软件One-way ANOVA进行分析；*，P＜0.05)，包括1条未知的miRNA(bta-miR-2478_L-2)(差异倍数最明显)和3条已知的miRNA(hsa-miR-1260a，hsa-miR-197-3p，hsa-miR-296-5p)(图5)。同时，从上述50条细胞外囊泡miRNA中初步筛选获得的miRNA中遴选出在EXO中表达显著高于LEV和SEV的2条目标miRNA(我们率先通过实验研究发现EXO抗血液肿瘤效果显著优于LEV和SEV，结果如图6，用GraphPad Prism软件One-way ANOVA进行分析；*，P＜0.05，**，P＜0.01，***，P＜0.001)，包括已知的hsa-miR-339-5p和hsa-miR-223-3p(图7)。
以上6条目标miRNA即为本申请所述的活性miRNA，标识为miRNA-X。
表1 NK-92/NK-92MI两细胞株之间表达水平变化显著的前15条miRNA测序结果
Figure BDA0003402648970000091
表2 NK-92/NK-92MI中EVs共同表达量高的50条miRNA测序结果
Figure BDA0003402648970000092
Figure BDA0003402648970000101
Figure BDA0003402648970000111
实施例2.活性miRNA-X表达载体构建
我们将上述miRNA-X在Lipofectamine 3000脂质体内进行表达。
首先，miRNA mimic起始量为5nmol，加入250μL的RNA-free水稀释成20μM的贮存液，分装成5管，-20℃保存。
其次，miRNA mimic和mimic对照的实验浓度设为50nM，并操作如下：
①取5μL miRNA-X mimic和mimic对照分别加入到95μL opti-MEM中；
②取3μL Lipofectamine 3000加入到97μL opti-MEM中，加完后静置5min。
最后，将①加入到②中，轻轻吹打后静置15min，得到表达miRNA-X的Lipofectamine 3000脂质体。
上述构建获得的miRNA-X表达载体，事实上是miRNA应用的代表性剂型，为后续制备各种基于活性miRNA-X的药物提供一种思路。后续可制备含有上述活性miRNA-X及其激活剂/抑制剂的脂质体药物，给药方式为外敷或注射。
实施例3.活性miRNA-X转染效率测试
为验证实施例1筛选的6种miRNA-X在血液肿瘤细胞中的转染效率，我们进行了体外转染实验。首先，选用实施例1筛选出的6个活性miRNA-X相同的miRNA-X mimics(RiboLife Science，JS，CN)与人白血病细胞株K562共孵育，具体实验步骤为：
①接种K562细胞：将处于对数生长期的K562细胞按1×105～5×105个/孔接种到6孔板中。
②将实施例2构建获得的表达miRNA-X的Lipofectamine 3000脂质体加入到K562细胞中。
③转染12h后换液，继续培养48h后收集K562细胞，利用RT-PCR实验检测转染效率。
通过RT-PCR实验检测K562白血病细胞内活性miRNA-X的表达水平，我们证实转染miRNA-X mimics后，6种miRNA-X的表达水平都显著上升(图8)。
为进一步验证实施例1筛选的6种miRNA-X的抑制剂的转染效率，我们将相应的6种miRNA-X inhibitors(Ribo Life Science，JS，CN)与人白血病细胞株K562共孵育，具体实验步骤为：将处于对数生长期的K562细胞按1×105～5×105个/孔接种到6孔板中；miRNA-Xinhibitors起始量为5nmol，加入250μL的RNA-free水稀释成20μM的贮存液，分装成5管，-20℃保存。设定miRNA-X inhibitor和inhibitor对照的浓度为100nM，具体操作如下：①取10μL miRNA-X inhibitor和inhibitor对照，分别加入到90μL opti-MEM中；②取6μLLipofectamine 3000加入到94μL opti-MEM中，加完后静置5min。随后将①加入到②中，轻轻吹打后静置15min，然后加入到K562细胞中。转染12h后换液，继续培养48h后收集K562细胞，利用RT-PCR实验检测转染效率。
通过RT-PCR实验检测K562白血病细胞内活性miRNA-X的表达水平，我们证实转染miRNA-X inhibitor后，6种miRNA-X的表达水平都显著下降(图8)。
由上述miRNA-X mimics和inhibitors转染实验可知：我们筛选获得的miRNA-X借助上述方法构建的携载体系成功转染到血液肿瘤细胞中，并在肿瘤细胞中分别对miRNA-X的表达产生符合预期、理想的调节效应。
实施例4.活性miRNA-X的抗血液肿瘤活性测试
为了进一步验证miRNA-X具有抗血液肿瘤的作用，我们将活性miRNA-X mimics/inhibitors与K562人白血病细胞株共孵育。具体实验步骤为：
将miRNA-X mimics/inhibitors转染至K562人白血病细胞中，转染步骤如实施例3中所述；转染12h后给转染体系换液，继续培养48h后加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(简称MTT，Sigma，DA，DE)以检测K562细胞的存活率，用于评价miRNA-Xmimics/inhibitors对K562细胞的抗肿瘤效果。
实验结果表明6种miRNA-X mimics对K562白血病肿瘤细胞都起到了显著的抑制肿瘤增殖的作用，而miRNA-X inhibitors没有抑制K562肿瘤细胞增殖的作用(图9，用GraphPad Prism软件One-way ANOVA进行分析。**,P＜0.01；***,P＜0.001。)。
由此可知，过表达6种miRNA-X中的任意一种均能够显著抑制血液肿瘤细胞的增殖和发挥抗血液肿瘤的作用。本领域技术人员可以预见，基于6种miRNA-X开发的活性成分亦能够显著抑制血液肿瘤细胞的增殖和发挥抗血液肿瘤的作用，包括但不限于：①对miR-X进行修饰的miR-X衍生物；②能在宿主内加工成前述6种miR-X的前体miRNA；③能被宿主转录形成②中所述的前体miRNA的多核苷酸；④含有miR-X或①中所述miR-X衍生物的表达载体、或②中所述前体miRNA的表达载体、或③中所述的多核苷酸的表达载体(如实施例2)；⑤促进miR-X表达和/或提高miR-X活性的激动剂。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 抗血液肿瘤药物活性成分的获得方法及其用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
acccaccgac acca 14
<210> 2
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
atcccacctc tgccacca 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
ttcaccacct tctccaccca gc 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
agggcccccc ctcaatcctg t 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
tccctgtcct ccaggagctc acg 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
tgtcagtttg tcaaataccc ca 22

Claims (4)

1.活性成分的用途，所述的活性成分用于制备一药物，所述药物用于治疗/预防人慢性髓系白血病；所述活性成分为：
(a)序列如SEQIDNO.1~SEQIDNO.6任一项所示的miR-X；
(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miR-X；
(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的miRNA；
(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miR-X的miRNA、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物包括所述活性成分和药学上可接受的溶媒或者载体。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其特征在于，所述药物的制剂形式为冻干粉针、微针、注射剂、片剂、贴剂、胶囊、口服混悬液或介入栓塞用微球。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的递送方法有：阳离子材料复合物递送法、细菌携带质粒表达RNA法、病毒包装表达RNA法。
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