CN112430573A - 一种nk细胞的培养体系及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种NK细胞的培养体系及培养方法。本发明提供的培养体系包括组分1和组分2；组分1包括NK细胞无血清培养基和灭活的基因工程细胞；组分2为NK细胞无血清培养基。利用本发明培养体系对NK细胞进行培养、扩增，14天可获得90％以上的效应细胞，扩增倍数约11000倍，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。

Description

一种NK细胞的培养体系及培养方法

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种NK细胞的培养体系及培养方法。

背景技术

NK细胞是目前已知的杀死发生肿瘤免疫编辑的肿瘤细胞的最主要的免疫细胞，是临床上进行肿瘤细胞免疫治疗的重要手段之一，临床研究表明，异体和自体的NK细胞免疫治疗是安全的。2009年卫生部就曾发布《自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术管理规范(征求意见稿)》，把NK细胞免疫治疗技术作为第三类医疗新技术列入了临床治疗的应用范围。但十年来，NK细胞治疗技术并没有在临床上得到广泛的应用，在前期的一些临床试验中，自体NK细胞疗法临床应用的疗效并不明显,其中根本原因是，无法得到足够数量和活性的NK免疫细胞影响了NK细胞的治疗效果，可以想象，在肿瘤负荷较大的患者，如果回输的NK细胞90％的以上处于沉默状态，而不是激活状态，那它对肿瘤细胞肯定不能有很好的杀伤作用，另外根据体外试验证明当NK细胞与肿瘤细胞在效靶比为10:1时，杀伤效率可达到80％以上，但是如果回输的NK细胞量远远小于体内的肿瘤细胞量，这个治疗效果就会减弱。因此，如何在体外实现NK细胞大规模扩增培养是目前NK细胞治疗的关键问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种NK细胞的培养体系及培养方法。本发明扩增体系可明显提高NK细胞的存活率和扩增倍数。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种NK细胞的培养体系，包括组分1和组分2；

所述组分1包括NK细胞无血清培养基和灭活的基因工程细胞；

所述组分2为NK细胞无血清培养基；

所所述组分1和组分2中，NK无血清培养基包括IL2、白蛋白和NK细胞基础培养基；

所述基因工程细胞为表达(Ⅰ)和(Ⅱ)所示蛋白的滋养细胞：

(Ⅰ)CD4、CD8、CD137L中至少一种；

(ⅠI)IL21和IL12的一种或两种。

一些实施方案中，所述组分1包括NK细胞基础培养基和：

灭活的基因工程细胞 1×10⁵～1×10⁷cell cell/mL；

IL-2 100～500U/mL；

白蛋白 1～9％v/v；

所述组分2包括NK细胞基础培养基和100～500U/mL IL-2、1～9％v/v白蛋白。

本发明提供的培养体系中，组分1在配制时，先不添加白蛋白和灭活的基因工程细胞，在培养细胞时再加入。组分2在配制时，先不添加白蛋白，在培养细胞时再加入。

一些具体实施例中，所述组分1包括NK细胞基础培养基和：

灭活的基因工程细胞 1×10⁶cell/mL；

IL-2 200U/mL；

白蛋白 5v/v％；

所述组分2包括NK细胞基础培养基和200U/mL IL-2、5％v/v白蛋白。

一些具体实施例中，所述组分1包括NK细胞基础培养基和：

灭活的基因工程细胞 1×10⁶cell/mL；

IL-2 200U/mL；

白蛋白 5v/v％；

所述组分2包括NK细胞基础培养基和200U/mL IL-2、1％v/v白蛋白。

一些实施方案中，所述IL-21为跨膜IL-21；所述IL-12由IL-12A和IL-12B组成，所述IL-12B为跨膜IL-12B。

一些具体实施例中，所述基因工程细胞为表达IL21、CD4和CD137L蛋白的滋养细胞。进一步的，滋养细胞为K562细胞，所述基因工程细胞为IL21-CD4-CD137L-K562。

一些实施方案中，所述NK细胞基础培养基为KBM581。

一些实施方案中，组分1和组分2中，所述NK细胞无血清培养基还包括抗生素。

其中，所述培养体系中抗生素的浓度为20～100U/ml。一些具体实施例中，抗生素的浓度为80U/ml。

一些具体实施例中，所述组分1包括KBM581培养基和：

所述组分2包括KBM581培养基和200U/mL IL-2、5％v/v白蛋白、80U/mL庆大霉素。

一些实施方案中，所述抗生素选自庆大霉素、卡那霉素或青霉素中的至少一种。一些具体实施例中，所述抗生素为庆大霉素。

一些实施方案中，本发明还提供了本发明培养体系在扩增NK细胞中的应用。

本发明还提供了一种NK细胞的培养方法，包括：

步骤1：将PBMC细胞或NK细胞接种至本发明所述培养体系的组分1中，培养；

步骤2：将培养第3天的培养液离心，取细胞沉淀，加入本发明所述培养体系的组分2再培养；

步骤3：第4～6天向培养基中补加组分2；第7天补加基因工程细胞，定期补加组分2，培养第13～15天收集NK细胞。

一些实施方案中，所述NK细胞或PBMC细胞的接种密度为2_×10³-2_×10¹⁰。一些具体实施例中，所述NK细胞或PBMC细胞的接种密度为2×10⁷Cell/ml。

一些实施方案中，所述基因工程细胞与所述PBMC细胞的细胞数之比为1:1。

一些实施方案中，所述基因工程细胞与所述NK细胞的细胞数之比为1:1。

一些实施方案中，所述培养方法中的培养步骤均在37℃，5％CO₂条件下进行。

本发明中，步骤3中，所述定期补加组分2具体为：

在第7天补加基因工程细胞后补充组分2至细胞浓度为1.0×10⁵～1.0×10⁷Cell/ml。补加培养基后，当培养体系的体积大于300ml时转移至培养袋培养。

第8～11天补加组分2至细胞浓度为1.0×10⁵～1.0×10⁷Cell/ml，优选为1.0×10⁶Cell/ml。

第12～14天补加组分2至细胞浓度为2.0×10⁵～2.0×10⁶Cell/ml。一些具体实施例中，补加组分2至细胞浓度为2.0×10⁶Cell/ml。

在本发明上述步骤2和步骤3中加入组分2时，组分2中的白蛋白成分后加，即先向培养体系中加入不含白蛋白的组分2，然后再加入白蛋白成分。在培养的第1～7天补加组分2时，先加入不含白蛋白的组分2，再加入5v/v％的白蛋白。在第8天以后的培养中，补加组分2时，先加入不含白蛋白的组分2，再加入1v/v％的白蛋白。

一些实施方案中，所述培养方法还包括收集NK细胞的步骤。

按照本发明培养体系及培养方法培养PBMC细胞或NK细胞，通常情况下，在培养的第13d～15d收集NK细胞，此时细胞处于对数生长期，且细胞状态最佳。

与现有技术相比，本发明至少具有如下效果之一：

1、与血清培养方法相比：(1)本发明培养体系组成明确，可避免血清不同批次带来的质量变动，提高可重复性。(2)避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染风险。(3)避免血清不明组分对实验研究的影响。(4)有利于体外培养细胞的分化。(5)可提高细胞产物的表达水平并易于纯化。

2、与利用因子刺激法进行NK细胞培养的方法相比，本发明主要是利用滋养细胞法进行NK细胞的筛选扩增，两者所培养出来的NK细胞质量差距极大，培养14天，前者的效应细胞纯度仅能达到30-50％，扩增倍数不会超过500倍((专利CN103756963B 21天纯度达到91.93％，21天仅扩增约155.85倍，14天时仅扩增约78.43倍)，而本发明培养体系培养14天可获得90％以上的效应细胞，扩增倍数约11000倍。

附图说明

图1示不同扩增方法获得的NK细胞的扩增倍数；

图2示培养PBMC细胞到第14天时NK细胞的纯度；

图3示不同浓度白细胞介素2对NK细胞扩增的影响；

图4示不同浓度白蛋白对NK细胞扩增的影响；

图5示不同浓度庆大霉素对NK细胞扩增的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种NK细胞的培养体系及培养方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明培养体系

组分1：NK无血清培养基和灭活的基因工程细胞；

其中，NK无血清培养基包含KBM581培养液和5v/v％白蛋白、200U/ml IL2、80U/ml庆大霉素；基因工程细胞为表达IL21-CD4-CD137L的K562细胞，即IL21-CD4-CD137L-K562细胞。

配制：取KBM581培养液加入IL2和庆大霉素，在培养NK细胞时再加入白蛋白和灭活的基因工程细胞。

组分2：NK细胞无血清培养基；

其中，NK无血清培养基包含KBM581培养液和5v/v％白蛋白、200U/ml IL2和80U/ml庆大霉素。

配制：取KBM581培养液加入IL2和庆大霉素，在培养NK细胞时再加入白蛋白。

实施例2扩增NK细胞

(1)PBMC提取：将新鲜血液于合适的离心速度下离心以分离血细胞和血浆(优选为2000转/分离心10分钟)，去除上层淡黄色血浆，将下层血细胞层用生理盐水以合适的比例(优选为1：1)稀释混匀，加至装有适量(优选为12ml)Ficoll(聚蔗糖)的离心管中，不能破坏液体分界面。适当速度离心(优选为400g离心30min)。吸取中间的白细胞层，PBS清洗(优选两次)并计数。

(2)起始培养：将PBMC(2×10⁷Cell/ml)接种至30ml实施例1不加白蛋白和基因工程细胞的组分1，然后加入1.5ml白蛋白、1ml基因工程细胞，在75cm²培养瓶中混合，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。其中，基因工程细胞的体积为去除冻存液的体积。

4、第3天离心换液：离心后的细胞沉淀加入组分2继续培养；

(3)第4-6每天观察细胞，根据细胞悬液颜色或细胞量补加组分2，每次添加体积不宜超过现有体积一倍。(注：补液时先加入不含白蛋白的组分2，然后将组分2中5％v/v的白蛋白成分加入到所述培养体系中，下同)

(4)第7天计数，添加基因工程细胞(4ml，需离心去除冻存液)；加液(组分2)使细胞浓度在1.0×10⁶Cell/ml。

(5)当培养体系的体积大于300ml则转移至培养袋培养。

(6)第8-11天每天观察或计数，根据培养液颜色变化或细胞浓度添加培养液，初次用该方法培养者最好通过计数添加组分2。(注：按组分2中1％v/v添加白蛋白，具体为：先加入不含白蛋白的组分2，然后将组分2中5％v/v的白蛋白成分加入到所述培养体系中，下同)，使得细胞浓度在1.0×10⁶Cell/ml。

(7)第12-14天每天观察或计数，根据培养液颜色变化或细胞浓度添加组分2，初次用该方法培养者最好通过计数添加，使得细胞浓度低于2.0×10⁶Cell/ml。当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存，一般情况在第13-15天收集细胞。

以因子培养细胞的方法作为对照，准备工作如下：

(1)NK细胞活化培养基：添加一支1ml激活因子-1，混匀备用。

(2)NK细胞扩增培养基：取1000ml扩增培养基添加一支1mlNK细胞扩增因子，再添加人血白蛋白(用量：5g/L)，混匀备用。0-5天加活化培养基，7-11天加扩增培养基。

具体培养方法包括：

1、在T75cm²培养瓶中加入1ml包被因子1，添加9ml生理盐水，室温静置1-2h；

2、提取PBMC，加入36mlNK细胞活化培养基重悬，将T75cm²培养瓶中包被液移除，加入细胞悬液，细胞密度为1.0-1.5*10⁶个/ml；

3、添加4ml自体血浆(10％)；

4、第3天加18mlNK细胞活化培养基，添加2ml自体血浆；

5、第5天转至2个T175cm2培养瓶中培养，各补加63mlNK细胞活化培养基，各并添加7ml自体血浆(10％)；

6、第7天，计数，一半转入培养袋，一半丢弃，添加NK细胞扩增培养基200ml；

7、第9天，添加350mlNK细胞扩增培养基；

8、第11天，添加450mlNK细胞扩增培养基。

9、第13～15天收集NK细胞。

其中，本实验中对照组采用的因子培养方法及其产品为目前市场上流通的培养效果最好的因子方法之一。按照本发明培养方法和对照方法培养PBMC细胞，采用自动细胞计数仪对扩增的NK细胞进行计数，并绘制曲线，结果见图1。通过流式细胞仪检测NK细胞的纯度，结果见图2。

结果显示，培养第7天开始至14天，实验组NK细胞的扩增倍数远远高于对照组。其中，实验组NK细胞数量在7天时进入对数生长期，14天时约增长了约11000倍，NK细胞纯度为95.03％。

实施例3不同NK细胞基础培养基对NK细胞扩增的影响

(1)考察不同浓度的白细胞介素2对NK细胞扩增的影响，培养方法同实施例2，培养时间为14天，结果见表1和图3。

表1不同浓度的白介素2对NK细胞培养方法的影响

结果显示，当IL2浓度为200U/ml时，NK细胞的扩增倍数(数量)和存活率明显高于其它浓度，纯度略高于其它浓度。

(2)考察不同浓度的白蛋白对NK细胞扩增的影响

培养方法同实施例2，培养时间为14天，结果见表2和图4。

表2不同白蛋白浓度对NK细胞培养方法的影响

结果表明：当白蛋白浓度为5％时，NK细胞扩增倍数(数量)和存活率明显远高于其它浓度，但是对纯度的影响不大。

(3)考察不同浓度的庆大霉素对NK细胞扩增的影响

培养方法同实施例2，培养时间为14天，结果见表3和图5。

表3不同庆大霉素浓度对NK细胞培养方法的影响

结果显示，当庆大霉素浓度为80U/ml时，NK细胞的存活率远高于其它浓度，但是对纯度及扩增倍数(数量)没有实际影响。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种NK细胞的培养体系，其特征在于，包括组分1和组分2；

所述组分1包括NK细胞无血清培养基和灭活的基因工程细胞；

所述组分2为NK细胞无血清培养基；

所述组分1和组分2中，NK无血清培养基包括IL2、白蛋白和NK细胞基础培养基；

所述基因工程细胞为表达(Ⅰ)和(Ⅱ)所示蛋白的滋养细胞：

(Ⅰ)CD4、CD8、CD137L中至少一种；

(ⅠI)IL21和IL12的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，

所述组分1包括NK细胞基础培养基和：

灭活的基因工程细胞 1×10⁵～1×10⁷cell cell/mL；

IL-2 100～500U/mL；

白蛋白 1～9％v/v；

所述组分2包括NK细胞基础培养基和100～500U/mL IL-2、1～9％v/v白蛋白。

3.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述IL-21为跨膜IL-21；所述IL-12由IL-12A和IL-12B组成，所述IL-12B为跨膜IL-12B。

4.根据权利要求1～3任一项所述的培养体系，其特征在于，所述基因工程细胞的滋养细胞为K562细胞；所述NK细胞基础培养基为KBM581。

5.根据权利要求1～4任一项所述的培养体系，其特征在于，所述NK无血清培养基还包括抗生素；所述抗生素选自庆大霉素、卡那霉素或青霉素中的至少一种。

6.权利要求1～5任一项所述的培养体系在扩增NK细胞中的应用。

7.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包括：

步骤1：将PBMC细胞或NK细胞接种至权利要求1～5任一项所述培养体系的组分1中，培养；

步骤2：将培养第3天的培养液离心，取细胞沉淀，加入权利要求1～5任一项所述培养体系的组分2再培养；

步骤3：第4～6天向培养基中补加组分2；第7天补加基因工程细胞，定期补加组分2，培养第13～15天收集NK细胞。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述PBMC细胞或NK细胞的接种密度为2×10³-2×10¹⁰Cell/ml。

9.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述基因工程细胞与所述PBMC细胞或NK细胞的细胞数之比为1:1。

10.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，步骤1～3中所述培养的步骤均在37℃，5％CO₂条件下进行。

Images