CN114874985A - 一种nk细胞的高纯度高效率扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：向GT‑T551H3培养液中添加自体血浆、150‑250IU/mLIL‑2、1‑5μg/mL紫草提取物得到培养基组A；向GT‑T551H3培养液中添加自体血浆、150‑250IU/mLIL‑2、10‑30ng/mLIL‑15、50‑100ng/mLIL‑21、1‑5μg/mL紫草提取物，得到培养基组B；从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中培养3天，细胞浓度为2‑4×106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
Description
技术领域
本发明涉及NK细胞扩增技术领域，尤其涉及一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法。
背景技术
肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法。近年来自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。
NK细胞除对靶细胞具有溶解杀伤作用外，NK细胞还在机体免疫反应中具有重要功能。NK细胞可通过对MФ、粒细胞、树突状细胞的调节作用而控制天然免疫力。NK细胞可以作用于CD4+T细胞和CD8+T细胞以强化获得性免疫。
文献(朱敬,两种中草药提取物调控结肠癌细胞自噬的作用及机制研究:[D],北京工业大学,2020.06.01)公开了紫草中紫草素通过下调YAP参与调节结肠癌细胞的侵袭与自噬，明确了紫草素在预防与治疗结肠癌的可能机制。
目前，NK扩增的主要方法为单纯细胞因子刺激扩增法，其扩增效率及纯度较低，同时存在重复性差的缺点，目前还未发现采用紫草提取物对NK扩增，并提高扩增效率与纯度的研究。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法。
一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：
S1、向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、150-250IU/mL IL-2、1-5μg/mL紫草提取物得到培养基组A；
向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、150-250IU/mL IL-2、10-30ng/mL IL-15、50-100ng/mL IL-21、1-5μg/mL紫草提取物，得到培养基组B；
S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中培养3天，细胞浓度为2-4×106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
优选地，S1中，自体血浆在培养基组A所占体积分数为1-10％。
优选地，S1中，自体血浆在培养基组B所占体积分数为1-10％。
优选地，S1的培养基组A中，IL-2浓度为180-220IU/mL，紫草提取物的浓度为2-4μg/mL。
优选地，S1的培养基组B中，IL-2浓度为180-220IU/mL，IL-15浓度为15-25ng/mL，IL-21浓度为60-80ng/mL，紫草提取物浓度为2-4μg/mL。
优选地，S1中，紫草提取物采用如下具体操作制取：将将紫草加入至乙醇水溶液浸泡20-26h后，加热回流提取2-3次，每次40-60min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干得到紫草提取物。
优选地，S2中，将单个核细胞悬浮于培养基组A中置于培养培养箱中3天，培养箱参数为：温度37℃、6-10％二氧化碳。
紫草提取物中含有：乙酰紫草素、β-羟基异戊酰紫草素、紫草素、β,β’-二甲基丙烯酰紫草素等。具有凉血，活血，解毒透疹的功能。用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤。
紫草素，是一种存在于紫草根中的萘醌类化合物，有研究显示紫草素可以通过不同的分子机制抑制肝癌、宫颈癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的死亡。这些研究结果表明紫草素是一种很有潜力的、可以用于癌症治疗的天然中草药提取物。申请人通过对紫草进行提取，发现只要很低的剂量即能明显促进人NK细胞增殖，提高NK细胞的杀瘤活性。
本发明的技术效果如下所示：
(1)本发明以脐血或自体外周血为细胞来源，培养过程中无需滋养细胞，扩增效率高，所得NK细胞的纯度高。
(2)本发明向培养基组A中添加IL-2并与紫草提取物复配，通过体外培养条件下获得纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，且应用安全性高；培养基组B中，进一步与IL-2、IL-15、IL-21配合，经过扩增后，扩增倍数可达1200倍，且经流式细胞仪检测，NK细胞纯度在90％以上，并且本发明对不同的人体血液都有相同的结果，稳定性很好，
(3)本发明方法简单、高效、有利于规模化生产。
附图说明
图1为实施例5和对比例的扩增倍数对比图。
图2为实施例5扩增方法培养14天的NK细胞稀释120倍后的照片及分析结果图。
图3为实施例5的细胞流式散点图。
图4为实施例5和对比例的纯度对比图。
图5为实施例5和对比例对K562细胞杀伤活性的对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：
S1、向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、150IU/mL IL-2、1μg/mL紫草提取物得到培养基组A，自体血浆在培养基组A所占体积分数为1％；
向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、150IU/mL IL-2、10ng/mL IL-15、50ng/mLIL-21、1μg/mL紫草提取物，得到培养基组B，自体血浆在培养基组B所占体积分数为1％；
紫草提取物采用如下具体操作制取：将5份将紫草加入至50份质量分数为50％的乙醇水溶液浸泡20h后，加热回流提取2次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干得到紫草提取物；
S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中在温度37℃、6％二氧化碳的培养箱中培养3天，细胞浓度为2×106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
实施例2
一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：
S1、向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、250IU/mL IL-2、5μg/mL紫草提取物得到培养基组A，自体血浆在培养基组A所占体积分数为10％；
向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、250IU/mL IL-2、30ng/mL IL-15、100ng/mLIL-21、5μg/mL紫草提取物，得到培养基组B，自体血浆在培养基组B所占体积分数为10％；
紫草提取物采用如下具体操作制取：将10份将紫草加入至100份质量分数为80％的乙醇水溶液浸泡26h后，加热回流提取3次，每次60min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干得到紫草提取物；
S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中在温度37℃、10％二氧化碳的培养箱中培养3天，细胞浓度为4×106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
实施例3
一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：
S1、向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、180IU/mL IL-2、4μg/mL紫草提取物得到培养基组A，自体血浆在培养基组A所占体积分数为3％；
向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、220IU/mL IL-2、15ng/mL IL-15、80ng/mLIL-21、2μg/mL紫草提取物，得到培养基组B，自体血浆在培养基组B所占体积分数为8％；
紫草提取物采用如下具体操作制取：将7份将紫草加入至90份质量分数为60％的乙醇水溶液浸泡25h后，加热回流提取2次，每次55min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干得到紫草提取物；
S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中在温度37℃、7％二氧化碳的培养箱中培养3天，细胞浓度为3.5×106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
实施例4
一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：
S1、向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、220IU/mL IL-2、2μg/mL紫草提取物得到培养基组A，自体血浆在培养基组A所占体积分数为8％；
向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、180IU/mL IL-2、25ng/mL IL-15、60ng/mLIL-21、4μg/mL紫草提取物，得到培养基组B，自体血浆在培养基组B所占体积分数为3％；
紫草提取物采用如下具体操作制取：将9份将紫草加入至70份质量分数为70％的乙醇水溶液浸泡23h后，加热回流提取3次，每次45min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干得到紫草提取物；
S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中在温度37℃、9％二氧化碳的培养箱中培养3天，细胞浓度为2.5×106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
实施例5
一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：
S1、向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、200IU/mL IL-2、3μg/mL紫草提取物得到培养基组A，自体血浆在培养基组A所占体积分数为5％；
向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、200IU/mL IL-2、20ng/mL IL-15、70ng/mLIL-21、3μg/mL紫草提取物，得到培养基组B，自体血浆在培养基组B所占体积分数为5％；
紫草提取物采用如下具体操作制取：将8份将紫草加入至80份质量分数为65％的乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取3次，每次50min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干得到紫草提取物；
S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中在温度37℃、8％二氧化碳的培养箱中培养3天，细胞浓度为3×106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
对比例
一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，包括如下步骤：
S1、向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、200IU/mL IL-2得到培养基组A，自体血浆在培养基组A所占体积分数为5％；
向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、200IU/mL IL-2、20ng/mL IL-15、70ng/mLIL-21，得到培养基组B，自体血浆在培养基组B所占体积分数为5％；
S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中在温度37℃、8％二氧化碳的培养箱中培养3天，细胞浓度为3×106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
采用实施例5和对比例的方法扩增NK细胞，配制0.4％台盼蓝溶液，调节其pH值至7.0～7.2，取第14天培养的细胞。取50μLNK细胞悬液，加入50μL台盼蓝混合，细胞染色4min，细胞计数板计数细胞总数量。
如图1所示，采用实施例5的方法扩增NK细胞能大幅提高扩增倍数。这是由于实施例5向培养基组A中添加IL-2并与紫草提取物复配，通过体外培养条件下获得纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，且应用安全性高；培养基组B中，进一步与IL-2、IL-15、IL-21配合，经过扩增后，扩增倍数可达1200倍。采用实施例5扩增方法培养14天，将所收集的NK细胞稀释120倍后进行拍照、分析，如图2所示。
分别取实施例5和对比例方法培养的NK细胞，采用流式检测仪进行细胞纯度检测，具体操作如下：
(1)单细胞悬液的制备：将1×105-1×107的细胞放入1.5mL离心管中3000r/min转速下离心5分钟，弃去上清，加入FACS缓冲液100μL悬浮细胞；
(2)荧光抗体20μL，避光30分钟；
(3)洗细胞去除游离的荧光抗体；加入FACS缓冲液350μL，轻轻混匀，于3000r/min条件下离心5分钟，弃上清；
(4)上样前处理：取100μL仪器缓冲液加入步骤(3)获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。
结果如图3和图4所示，采用实施例5方法扩增的NK细胞纯度远高于对比例。本发明向培养基组A中添加IL-2并与紫草提取物复配，通过体外培养条件下获得纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，且应用安全性高；培养基组B中，进一步与IL-2、IL-15、IL-21配合，扩增后经流式细胞仪检测，NK细胞纯度在90％以上，
采用96孔平底培养板，设实验孔、单纯效应细胞孔、单纯靶细胞孔各3个，并设空白孔。于实验孔及单纯靶细胞孔，加入K562。在实验孔及单纯效应细胞孔中分别加入实施例1和对比例培养14天的NK细胞，效靶比设为1：1、1：10、1：20和1：50四组，培养24h。加入20μLWST，继续培养4h，酶标仪检测OD值。
杀伤活性(％)＝[1-(实验组OD值-单纯效应细胞组OD值)×单纯靶细胞OD值]×100％。
如图5所示，采用实施例5的方法扩展所得NK细胞可有效提高NK杀伤能力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种NK细胞的高纯度高效率扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、150-250IU/mL IL-2、1-5μg/mL紫草提取物得到培养基组A；
向GT-T551H3培养液中添加自体血浆、150-250IU/mL IL-2、10-30ng/mL IL-15、50-100ng/mL IL-21、1-5μg/mL紫草提取物，得到培养基组B；
S2、从外周血或脐带血中分离单个核细胞；将单个核细胞悬浮于培养基组A中培养3天，细胞浓度为2-4×106/mL，补加培养基组A，继续培养至第7天；然后补加培养基组B，连续培养至第14天，培养过程中每隔一天补加培养基组B，得到扩增的NK细胞。
2.根据权利要求1所述NK细胞的高纯度高效率扩增方法，其特征在于，S1中，自体血浆在培养基组A所占体积分数为1-10％。
3.根据权利要求1所述NK细胞的高纯度高效率扩增方法，其特征在于，S1中，自体血浆在培养基组B所占体积分数为1-10％。
4.根据权利要求1所述NK细胞的高纯度高效率扩增方法，其特征在于，S1的培养基组A中，IL-2浓度为180-220IU/mL，紫草提取物的浓度为2-4μg/mL。
5.根据权利要求1所述NK细胞的高纯度高效率扩增方法，其特征在于，S1的培养基组B中，IL-2浓度为180-220IU/mL，IL-15浓度为15-25ng/mL，IL-21浓度为60-80ng/mL，紫草提取物浓度为2-4μg/mL。
6.根据权利要求1-5任一项所述NK细胞的高纯度高效率扩增方法，其特征在于，S1中，紫草提取物采用如下具体操作制取：将将紫草加入至乙醇水溶液浸泡20-26h后，加热回流提取2-3次，每次40-60min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干得到紫草提取物。
7.根据权利要求6所述NK细胞的高纯度高效率扩增方法，其特征在于，S2中，将单个核细胞悬浮于培养基组A中置于培养培养箱中3天，培养箱参数为：温度37℃、6-10％二氧化碳。
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