CN104651310B - 一种体外诱导扩增nk细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种体外诱导扩增NK细胞的方法，包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml~9.76μg /ml，所述的三叶青提取物为三叶青总提取物Th‑t、水煮脱糖部位Th‑w3、石油醚部位Th‑p或水部位脱糖部位Th‑w2；本方法可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK 细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标，同时该方法操作简便，成本低，适用于大规模应用；利用本方法所获得的NK细胞，在细胞数量、纯度、杀伤活性、细胞因子分泌水平均有显著提高，利用本方法培养，细胞数量提高了几千倍。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及利用三叶青提取物的一种体外诱导扩增NK细胞的方法。
背景技术
近年来，肿瘤的生物治疗已经成为肿瘤治疗领域研究的热点。NK细胞是一类独立的淋巴细胞群，NK细胞主要通过细胞毒活性而显示生物学效应，可直接杀伤肿瘤细胞、病毒感染的细胞，胞内寄生菌等。NK细胞可以识别自身正常细胞和异常组织细胞，其仅杀伤异常细胞而对宿主正常组织细胞没有细胞毒作用。此外，NK细胞通过分泌多种细胞因子，在免疫调节和某些免疫细胞分化中发挥重要作用。NK细胞主要以组织相容性复合物(majorhistocompatibility complex，MHC)非限制性方式识别肿瘤，通过颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素(perforin)等途径杀伤肿瘤细胞，而T细胞表面的CD107aPb分子，与T细胞活化以后脱颗粒过程相关，其比值可以直接反应该效应细胞具有的特异性杀伤活性。
同时，NK细胞还能与其它固有免疫细胞和适应性免疫细胞相互作用，协同发挥抗肿瘤作用。目前NK细胞已经成为肿瘤患者过继免疫治疗的重要效应细胞。由此可见，为满足生物学功能研究和临床过继细胞免疫治疗需要，扩增出高效和较多数量的NK细胞是许多学者共同研究的课题。
现阶段体外扩增NK细胞主要采取饲养层细胞共培养法和免疫磁珠分选法，但饲养层细胞共培养是将NK细胞添加到经改造后的肿瘤细胞株，这样改造在临床上应用的安全性没有得到保障，而免疫磁珠分选法操作过程繁琐，成本高，不适合临床大规模应用。
发明内容：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种体外诱导扩增NK细胞的方法，可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标。
为实现该发明目的，本发明采用的技术方案为：一种体外诱导扩增NK细胞的方法，包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml～9.76μgg/ml。
更具体的，本发明的体外诱导扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：
(1)单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上下混匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液分离单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞；
(2)细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至NK细胞浓度为2×105～1×106/ml，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养；
(3)细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为4×104～6×104/mL，NK细胞培养至第7天，向培养液中添加三叶青提取物，浓度为0.00625μg/ml～9.76μg/ml，此后继续培养；
(4)细胞收集：培养3至21天，收集培养的NK细胞。
优选的，步骤(2)中的rhIL-2的浓度为500U/ml。
优选的，步骤(2)中NK细胞浓度为3.5×105ml。
优选的，步骤(3)中调整细胞密度为5×104/ml。
优选的，步骤(3)中三叶青提取物的浓度为0.01μg/ml～2.44μg/ml。
优选的，所述的三叶青提取物为三叶青总提取物，其制备方法为用乙醇溶液加热回流三叶青而提取得到的。
优选的，所述的三叶青提取物为水煮脱糖部位Th-w3，其制备方法为经有机溶剂提取后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干。
优选的，所述的三叶青提取物为石油醚部位Th-p，取三叶青总提取物，用石油醚进行分步萃取得到。
优选的，所述的三叶青提取物为水部位脱糖部位Th-w2，其制备方法为三叶青总提取物的水部位除去糖分，用30％乙醇水洗脱溶液蒸干后得到。
本发明通过向NK细胞培养液中加入三叶青提取物扩增自然杀伤细胞的方法的在于：
三叶青的有效成分主要为含黄酮类化学成份，其性凉，味辛、苦，无毒，具有清热解毒、活血止痛、祛风化痰、活血止痛等功效，常用于高热惊厥，小儿感冒发热、喉痒肿痛、咳嗽、肺炎、肝炎、肠炎、痢疾等疾病。现代药理研究表明，三叶青提取物具有较好的抗肿瘤、抗炎、镇痛及解热作用等。本发明人通过对三叶青的成分进行提取分离和鉴定分析,发现不同部位的三叶青提取物，只要很低的剂量即能明显促进人NK细胞增殖，提高NK细胞的杀瘤活性。
本发明从大规模生产的可操作性，临床应用安全性以及有效性角度出发，优化出三叶青提取物诱导NK细胞的最佳方案，与其他方法相比，本发明有以下优点：
1.本方法可在体外培养条件下获得大量的、应用安全的、纯度较高的以及杀伤活性强的NK细胞，从而使得该细胞达到能够安全有效的应用于临床的质量指标，同时该方法操作简便，成本低，适用于大规模应用；
2.利用本发明所获得的NK细胞，在细胞数量、纯度、杀伤活性、细胞因子分泌水平均有显著提高，利用本方法培养，细胞数量提高了几千倍。
附图说明
图1.三叶青提取技术路线图；
图2.不同浓度三叶青提取物TH-t对NK细胞增殖影响图；
图3.不同浓度三叶青提取物TH-p对NK细胞增殖影响图；
图4.不同浓度三叶青提取物TH-a对NK细胞增殖影响图；
图5.不同浓度三叶青提取物TH-b对NK细胞增殖影响图；
图6.不同浓度三叶青提取物TH-w对NK细胞增殖影响图；
图7.不同浓度三叶青提取物TH-w1对NK细胞增殖影响图；
图8.不同浓度三叶青提取物TH-w2对NK细胞增殖影响图；
图9.不同浓度三叶青提取物TH-w3对NK细胞增殖影响图；
图10.浓度0.62μg/ml的三叶青提取物Th-t对NK细胞增殖影响图；
图11.浓度0.62μg/ml三叶青提取物Th-p对NK细胞增殖影响图；
图12.浓度0.166μg/ml三叶青提取物Th-W2对NK细胞增殖影响图；
图13.浓度0.62μg/ml三叶青提取物Th-W3对NK细胞增殖影响图；
图14.三叶青总提取物诱导的NK细胞对三株肿瘤细胞杀伤活性图；
图15.0.15μg/ml三叶青总提取物(TH-t)诱导后的NK细胞颗粒酶、穿孔素和CD107a的表达图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：三叶青药材提取分离实验
提取液分组：根据提取时所选用的制剂将提取液分为9组，分别命名为：TH-t、TH-p、TH-a、TH-b、TH-w、TH-w1、TH-w2、TH-w3和TH-w4；
各组三叶青提取物的提取方法：参照文献[杨阳.甘西鼠尾草及头花蓼化学成分研究.第二军医大学硕士学位论文.上海：第二军医大学，2009]分离纯化得到，经高效液相色谱(HPLC)检查。可参考图1关于三叶青提取技术路线图。
TH-t部分：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得总提取物TH-t 21.6g，得率10.8％。TH-p部分：取此总提取，加水混悬，分别采用10倍体积的石油醚(水饱和)进行分步萃取。分别得到石油醚部位TH-p 0.15g，得率0.075％。
TH-a部分：乙酸乙酯部位TH-a 0.58g，得率0.29％
TH-b部分：正丁醇部位TH-b 2g，得率1％
TH-w部分：以及水部位TH-w 18.9g，得率9.45％
TH-w1部分：取水部位进行大孔吸附树脂色谱，先使用纯水进行洗脱，除去糖分，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶液分别依次洗脱。其中，10％乙醇水洗脱溶液减压回收蒸干后得到水部位脱糖流分TH-w1 0.14g,得率0.07％
TH-w2部分：取水部位进行大孔吸附树脂色谱，先使用纯水进行洗脱，除去糖分，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶液分别依次洗脱。其中，30％乙醇水洗脱溶液蒸干后得到水部位脱糖流分TH-w1 0.3g,得率0.15％
TH-w3部分：将上述经有机溶剂提取后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干，获得脱水物2.1克。
TH-w4部分：将上述经有机溶剂提取后的三叶青药材用减压回收蒸干脱水，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶液分别依次脱糖，其中，获得了10％乙醇水部位脱糖流分。
可参考图1关于三叶青提取技术路线图。
实施例2：不同浓度的三叶青提取物对NK细胞增殖的影响实验
NK细胞培养及鉴定：
取健康献血者外周抗凝血10ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含500U/mlrhIL-2的NK培养基调整细胞密度为3.5×105/mL，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养，每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5×105/mL，收集培养7天的NK细胞，加入PE标记的CD3、FITC标记的CD56进行细胞表面标志检测。
CCK8法检测不同三叶青提取物对人NK细胞生长的影响：
取培养7天的NK细胞配成5×104/mL的细胞悬液，加入96孔细胞培养板，200μl/孔。实验组：共设11个浓度组，分别加入5×104/mL的NK细胞，180μl/孔。然后加入不同浓度的三叶青提取物(终浓度分别为0.000625、0.0025、0.01、0.039、0.155、0.62、2.44、9.76、39、156μg/ml)每组设5个复孔，同时高末加药物空白对照组：于培养箱中培养24h、48h、72h。培养结束前4个小时每孔加入CCK8 20μl，继续培养4h后于酶标仪450nm处检测各孔吸光值(OD)记录结果。增殖率(％)＝(实验OD值)—(对照OD值)/(对照OD值)×100％。
各阶段三叶青提取物对NK细胞生长影响：
各提取阶段三叶青提取物对NK细胞生长影响有较大差异，在药物浓度相同条件下，以水煮脱糖部位(Th-w3)时促NK细胞生长活性最强；总提取物(Th-t)、石油醚部位(Th-p)和水部位脱糖部位(Th-w2)次之，与对照组比较均有统计学差异(p＜0.05)。其他结果均有一定的促NK细胞增殖作用。提取物Th-w4部分对NK细胞生长无明显影响。各三叶青提取物对NK细胞生长均有时间依赖性，药物诱导时间越长，促进细胞增殖越明显，组与组之间比较均有统计学差异(p＜0.05)，最佳的提取物浓度范围为0.01μg/ml至2.44μg/ml，结果见图2～图9。
实施例3：对扩增产物进行NK细胞扩增倍数检测
四种三叶青提取物对NK细胞增殖影响：
在试验中发现，各三叶青提取物对NK细胞生长均有浓度窗现象，并且其中一些提取物(Th-t、Th-p、Th-w2和Th-w3)促进NK细胞增殖更明显。因此，本项试验选择这四种提取物对NK细胞进行长时间增殖实验。经这四种提取物诱导培养的NK细胞数各时间段均高于对照组；至培养至第16天时，提取物Th-t、Th-p、Th-w2和Th-w3诱导的NK细胞增殖倍数分别为2468倍、1646倍、6334倍和5373倍，显著高于对照组的(263倍)，相比较均有统计学差异(p＜0.05)，以水煮脱糖部位(Th-w3)结果最显著，结果见图10-13。
实施例4：扩增产物NK细胞对三株肿瘤细胞的杀伤活性检测
NK细胞培养及扩增：
取健康献血者外周抗凝血10ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含500U/mlrhIL-2的NK培养基调整细胞密度为3.5×105/mL，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养，每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5×105/mL，收集培养7天的NK细胞，加入PE标记的CD3、FITC标记的CD56进行细胞表面标志检测。
实验组：共设11个浓度组，加入不同浓度的三叶青总提取物(终浓度分别为0.000625、0.0025、0.01、0.039、0.155、0.62、2.44、9.76、39、156μg/ml)每组设5个复孔，效应细胞；对数生长期的胃癌MKN45、肺癌A-549和肝癌SMMC-7721细胞分别配成2×108/L，作为靶细胞；将效靶细胞各取0.5ml等量混合(效靶细胞比例＝10:1)，同时设置不加三叶青提取物为对照组。置37℃、5％CO2培养箱中孵育6h后，轻轻混匀，重悬细胞，1500r/min离心10min，收集上清液。LDH试剂盒按说明书要求操作，340nm波长下Encore自动生化分析仪测定LDH的活性单位(U/L)。每检测样本设3个复管，重复3遍，取平均值。
NK细胞的杀伤活性＝(测定管LDH单位－效应细胞自然释放LDH管)/(靶细胞最大释放LDH管－靶细胞自然释放LDH管)×100％。
实验结果显示，浓度为2.44～0.01μg/ml三叶青总提取物(TH-t)作用72h后的NK细胞细胞，对胃癌MKN45、肺癌A-549和肝癌SMMC-7721细胞的杀伤活性显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
在0.125μg/ml时杀伤活性达最高(分别为66.4％、75.1％和79.7％)，与对照组(分别为38.4％、41.8％和41.2％)比较差异有统计学意义(P＜0.05)。三叶青浓度高于2.44μg/ml时，杀伤活性随浓度增高逐渐降低，当浓度为59mg/L时，可抑制NK细胞对3株肿瘤细胞的杀伤活性(P＜0.05)，结果见图14。
实施例5：对扩增产物NK细胞的穿孔素、CD107a和颗粒酶B的表达
NK细胞培养及扩增
取健康献血者外周抗凝血10ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含500U/mlrhIL-2的NK培养基调整细胞密度为3.5×105/mL，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养，每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5×105/mL，收集培养7天的NK细胞，加入PE标记的CD3、FITC标记的CD56进行细胞表面标志检测。
实验组：共设9个浓度组，加入不同浓度的三叶青总提取物(终浓终浓度分别为0、39、9.76、2.44、0.62、0.155、0.039、0.01和0.0025μg/ml的三叶青提取物，每组3个复孔。于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。收集细胞并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，每管加入anti-CD3-和CD56+TCR-FITC 20μl，避光孵育30min。加入100μl固定液室温避光孵育15min，PBS洗涤1次。每管加100μl破膜液，100μl anti-Perforin抗体及anti-granzyme B-PE抗体和APC标记的CD107a抗体，室温避光孵育15min，PBS洗涤后，重悬于0.5ml的PBS溶液中，分别用流式细胞术检测穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达。
采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，检验水准α＝0.05，P≤0.05有统计学意义。
与0μg/ml对照组相比，5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml的三叶青提取物作用NK细胞48h后，其穿孔素和颗粒酶B阳性表达均明显升高，在5μg/ml～40μg/ml浓度时，具有一定的剂量依赖性。其中，40μg/ml三叶青提取物组的穿孔素和颗粒酶B阳性表达率达到最高值，分别为71.70％±2.31％和82.16％±1.29％，而浓度超过40μg/ml时穿孔素和颗粒酶B阳性表达率有所下降，结果见图15。
实施例6：加三叶青总提取物(Th-t)扩增NK细胞
(1)单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上下混匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液分离单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞；
(2)细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至细胞浓度为3.5×105，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养；
(3)细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5×104/mL，NK细胞培养至第7天，向培养液中添加三叶青总提取物(Th-t)，浓度为0.00625μg/ml，此后继续培养；
(4)细胞收集：培养16天，收集培养的NK细胞。
实施例7：加三叶青总提取物(Th-t)扩增NK细胞
(1)单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上下混匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液分离单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞；
(2)细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至细胞浓度为1×106，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养；
(3)细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为6×104/mL，NK细胞培养至第7天，向培养液中添加三叶青总提取物(Th-t)，浓度为0..62μg/ml，此后继续培养；
(4)细胞收集：培养21天，收集培养的NK细胞。
按实施例6的所述的步骤方法进行三叶青提取物扩增NK细胞
| 实施例 | 三叶青提取物种类 | 提取物浓度 |
| 实施例8 | 三叶青总提取物(Th-t) | 9.76μg/ml |
| 实施例9 | 三叶青总提取物(Th-t) | 0.15μg/ml |
| 实施例10 | 三叶青总提取物(Th-t) | 2.44μg/ml |
| 实施例11 | 三叶青总提取物(Th-t) | 0.62μg/ml |
| 实施例12 | 三叶青提取物(Th-p) | 0.62μg/ml |
| 实施例13 | 三叶青提取物(Th-p) | 2.44μg/ml |
| 实施例14 | 三叶青提取物(Th-p) | 9.76μg/ml |
| 实施例15 | 三叶青提取物(Th-p) | 0.01μg/ml |
| 实施例16 | 三叶青提取物(Th-w2) | 0.166μg/ml |
| 实施例17 | 三叶青提取物(Th-w2) | 2.44μg/ml |
| 实施例18 | 三叶青提取物(Th-w2) | 0.155μg/ml |
| 实施例19 | 三叶青提取物(Th-w2) | 9.76μg/ml |
| 实施例20 | 三叶青提取物(Th-w3) | 0.0025μg/ml |
| 实施例21 | 三叶青提取物(Th-w3) | 0.62μg/ml |
| 实施例22 | 三叶青提取物(Th-w3) | 0.039μg/ml |
| 实施例23 | 三叶青提取物(Th-w3) | 2.44μg/ml |
Claims (6)
1.一种体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于包括向NK细胞培养液中添加三叶青提取物，所述的三叶青提取物的浓度为0.00625μg/ml～9.76μg/ml；所述三叶青提取物为三叶青总提取物，其制备方法为取三叶青干燥药材，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得三叶青总提取物；
或者，
所述三叶青提取物为水煮脱糖部位Th-w3，其制备方法为：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，除去提取液后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干，获得脱水物2.1克；
或者，
所述三叶青提取物为石油醚部位Th-p，取三叶青总提取物，加水混悬，采用10倍体积的水饱和石油醚进行萃取，得到石油醚部位TH-p；
或者，
所述三叶青提取物为Th-w2，其制备方法为：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80％乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得总提取物TH-t 21.6g，取此总提取，加水混悬，采用10倍体积的水饱和石油醚，进行萃取，得到石油醚部位TH-p 0.15g，用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部位TH-a 0.58g，用正丁醇萃取得到正丁醇部位TH-b 2g，以及水部位TH-w，取水部位TH-w进行大孔吸附树脂色谱，先使用纯水进行洗脱，除去糖分，再使用10％、30％、60％、95％乙醇水溶液分别依次洗脱，其中，30％乙醇水洗脱溶液蒸干后得到水部位脱糖流分TH-w2。
2.根据权利要求1所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)单个核细胞分离：静脉穿刺采集患者外周血，转移至含肝素钠的抗凝瓶中，上下混匀，将外周血样本移至离心管进行离心，弃上层血浆，生理盐水稀释血样，淋巴分离液分离单个核细胞，生理盐水重悬单个核细胞，离心收集单个核细胞；
(2)细胞种瓶：将上述单个核细胞用含rhIL-2的NK细胞培养液稀释至细胞浓度为2×105～1×106/ml，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养；
(3)细胞扩增：每2天半量换液1次，并调整细胞密度为4×104～6×104/mL，NK细胞培养至第7天，向培养液中添加三叶青提取物，浓度为0.00625μg/ml～9.76μg/ml，此后继续培养；
(4)细胞收集：培养3至21天，收集培养的NK细胞。
3.根据权利要求2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述步骤(2)中的rhIL-2的浓度为500U/ml。
4.根据权利要求2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述步骤(2)中NK细胞浓度为3.5×105ml。
5.根据权利要求2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)中调整细胞密度为5×104/ml。
6.根据权利要求1或2所述的体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于所述三叶青提取物的浓度为0.01μg/ml～2.44μg/ml。
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