CN114075546A - 一种nk细胞扩增组合物及体外扩增培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，公开了一种NK细胞扩增组合物及体外扩增培养方法本发明通过分离获取外周血单个核细胞，在体外经过含高浓度IL‑2的A组培养液预处理和经过含有CD3、CD52单抗的B组培养液激活后，再使用C组培养液进行自然杀伤细胞体外扩增，最终制备获得足量且高纯度的自然杀伤细胞。使用本发明的方法扩增的NK细胞，在体外可以有效杀伤K562细胞，杀伤效率超过80％，NK细胞扩增倍数高达550倍。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种NK细胞扩增组合物及NK细胞体外扩增培养方法。
背景技术
2000年国际肿瘤生物治疗及基因治疗年会中指出“免疫细胞疗法是现代科技中唯一有可能彻底治愈癌症的方法”。经过几十年研究，免疫细胞治疗已经取得了突飞猛进的发展。目前嵌合抗原受体-T(Chimeric Antigen Receptor-T,CAR-T)细胞免疫疗法在血液系统肿瘤治疗中展现出非常良好的应用前景，全球已有两款CAR-T细胞产品上市，但CAR-T细胞免疫疗法对于实体瘤的应用尚未取得突破性进展。
自然杀伤(Natural Killer,NK)细胞同属于免疫细胞的一种，对于人体内的癌细胞、衰老细胞以及被病毒感染细胞均有非常强的杀伤清除作用。NK细胞发挥杀伤作用主要有四种途径，第一：释放细胞质颗粒(如穿孔素和颗粒酶)，第二：死亡受体(FasL,TRAIL,TNF-α)诱导凋亡，第三：产生效应分子(IFN-γ,NO)，招募其他类型免疫细胞参与杀伤作用，第四：抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody dependent cell-mediatedcytotoxicity,ADCC)。
癌症患者的免疫功能降低主要表现在体内NK细胞活性的降低和NK细胞的减少，不足以对体内的癌细胞产生杀伤效果，因此采用体外激活NK细胞并大量扩增的方法来重构NK细胞的抗肿瘤能力，得到了广泛的关注。当前已经有非常多的关于NK细胞治疗各类癌症的临床研究，但最终的结果却不尽如人意。主要表现在两个方面，第一：NK细胞临床级数量扩增问题，即如何能在短时间内获得足量的NK细胞数量；第二：NK细胞质量问题，即NK细胞在体外经过培养扩增后的杀伤效率能否得到有效的提升。虽然目前开发了以肿瘤细胞K562为滋养层细胞进行NK细胞的体外扩增方法，且可以获得纯度较高的临床级细胞，但该方法获得的细胞的安全性问题始终无法确切知晓，所以我们需要一种能够有效提高NK细胞体外扩增的数量和质量的细胞制备方法。
发明内容
为了克服现有技术中安全性问题，NK细胞数量及质量问题，本发明提供一种NK细胞扩增组合物及体外扩增培养方法。
本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种NK细胞扩增组合物，包括：
A组：T细胞培养液，IL-2；
B组：CD3单抗溶液，CD52单抗溶液；
C组：T细胞培养液，IL-2，IL-15，自体灭活血浆。
作为优选的实施方式，A组中，IL-2的浓度为1000IU/mL～4000IU/mL。
作为优选的实施方式，CD3单抗溶液和CD52单抗溶液的浓度分别独立地为5μg/mL～20μg/mL。
作为优选的实施方式，C组中，IL-2的浓度为200IU/mL～2000IU/mL，IL-15的浓度为2ng/mL～30ng/mL。
本发明还提供了一种NK细胞体外扩增方法，包括以下步骤：
(1)提取外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞加入到A组培养液中培养，所述A组培养液为T细胞培养液+1000IU/mL～4000IU/mL IL-2。
(2)将步骤(1)处理后的外周血单个核细胞转入到5μg/mL～20μg/mLCD3单抗溶液和5μg/mL～20μg/mLCD52单抗溶液预处理的培养瓶中培养；
(3)将步骤(2)得到的细胞转入C组培养液中培养，所述C组培养液为T细胞培养液+200IU/mL～2000IU/mL IL-2+2ng/mL～30ng/mL IL-15+1～5％体积分数的自体灭活血浆。
作为优选的实施方式，步骤(1)和步骤(2)细胞培养的时间分别独立地为2～7小时。
作为优选的实施方式，步骤(2)所述培养瓶预处理的方法为：在培养瓶中加入5μg/mL～20μg/mL CD3单抗溶液和5μg/mL～20μg/mL CD52单抗溶液，在4℃下包被孵育20～30小时。
作为优选的实施方式，步骤(3)所述细胞培养的天数为15天。
进一步优选的，步骤(3)细胞培养的密度为1～3×106cell/mL。
更进一步的，步骤(3)细胞在培养过程中，将细胞分离，并补充C组培养液。
本发明带来的有益效果：
本发明的NK细胞扩增组合物，包括三组培养液，其中A组为T细胞培养液中添加IL-2；B组为CD3单抗溶液和CD52单抗溶液，C组为T细胞培养液中添加IL-2、IL-15和自体灭活血浆。本发明通过分离获取外周血单个核细胞，在体外经过含高浓度IL-2的A组培养液预处理和经过CD3、CD52单抗激活后，再使用C组培养液进行自然杀伤细胞体外扩增，最终制备获得足量且高纯度的自然杀伤细胞。使用本发明的方法扩增的NK细胞，在体外可以有效杀伤K562细胞，杀伤效率超过80％，NK细胞扩增倍数高达550倍。
附图说明
为使本发明的目的、技术方案和有点更加清楚，下面结合附图对本发明的技术方案进行详细描述。
图1为实施例4流式细胞术检测15天时NK细胞表型；
图2为对比例1流式细胞术检测15天时NK细胞表型；
图3为对比例2流式细胞术检测15天时NK细胞表型；
图4为实施例4及对比例1、对比例2的培养细胞对K562细胞的杀伤率；
图5为实施例4及对比例1、对比例2培养上清液中IFN-γ的含量；
图6为实施例4及对比例1、对比例2培养上清液中TNF-α的含量；
图7为实施例4及对比例1、对比例2培养细胞的扩增倍数。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明所用试剂均为商业购买。
以下实施例中，T细胞培养液选自PRIME-XV NK CELL CDM，Irvine Scientific公司，货号：91215。
实施例1
NK细胞扩增组合物，包括三组培养液：
A组：T细胞培养液+2000IU/mL IL-2；
B组：10μg/mLCD3单抗溶液，10μg/mLCD52单抗溶液；
C组：T细胞培养液+1000IU/mL IL-2+10ng/mL IL-15+2％(体积分数)自体灭活血浆。
实施例2
NK细胞扩增组合物，包括三组培养液：
A组：T细胞培养液+1000IU/mL IL-2；
B组：5μg/mLCD3单抗溶液，5μg/mLCD52单抗溶液；
C组：T细胞培养液+500IU/mL IL-2+5ng/mL IL-15+1％(体积分数)自体灭活血浆。
实施例3
NK细胞扩增组合物，包括三组培养液：
A组：T细胞培养液+4000IU/mL IL-2；
B组：20μg/mLCD3单抗溶液，20μg/mLCD52单抗溶液；
C组：T细胞培养液+2000IU/mL IL-2+30ng/mL IL-15+5％(体积分数)自体灭活血浆。
实施例4
应用实施例1中的NK细胞扩增组合物进行NK细胞体外扩增
Day1：在T75培养瓶中加入3ml 10μg/mL的CD3单抗和3ml 10μg/mL的CD52单抗溶液，使其能够全部覆盖T75培养瓶底，置于4℃冰箱中包被孵育24小时。
Day2：抽取一定量的外周血，使用Ficoll分离液提取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)；
将PBMC按照2×106cell/mL的密度接种至A组培养液(基础培养液+2000IU/mL IL-2)中培养4小时；
将PBMC转入第一天包被了抗体的培养瓶中，维持2×106cell/mL的密度继续培养4小时；
最后再将全部细胞转移至C组培养液(基础培养液+1000IU/mL IL-2+10ng/mL IL-15+2％自体灭活血浆)中，并置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
对光查看培养液，培养液有发黄时考虑补液。在Day3、Day7、Day10、Day13补液C组培养液，并观察细胞，在Day7等分细胞并补液，Day13再次等分细胞并补液，等分后的细胞密度应维持在3×106cell/mL。在Day15收集全部培养瓶中的细胞。
流式细胞术检测检测Day15收集的细胞表型。细胞表型占比越高，NK细胞的纯度越高。图1中本实施例培养的NK细胞CD3-CD56+占比91.7％。
计算细胞扩增倍数。
在培养期间统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，计算NK细胞扩增倍数。如图7所示，第15天后细胞扩增542倍。
对比例1
采用北京同立海源生物生产的AMMS NK细胞扩增试剂盒套装作为对照1组，完全按照套装使用说明书中推荐的试验步骤进行操作培养NK细胞，在Day15收集细胞。具体过程如下：
包被(-1天)：NK试剂A和D-PBS混匀，加入175cm2培养瓶中，平放晃匀铺满，4℃冰箱平放过夜。次日种瓶前吸弃包被液。
种瓶(第0天)：室温下离心15min，取离心上清作为血浆。56℃灭活半小时，置于4℃冰箱半小时，取出在室温下离心10min，取上清备用。等体积的生理盐水与血细胞沉淀混匀，加到Ficoll层上使分层保持清晰，室温下离心25min。吸取PBMC层，加生理盐水吹打混匀，室温下离心5min，再次洗涤细胞。弃上清，用少量完全培养基重悬细胞，吸取少量细胞计数，调整细胞密度不超过2×106个/mL。吸弃包被液，将细胞悬液加入NK试剂B中，灭活血浆1.25ml，转入培养瓶内，培养终体积约25ml，剩余血浆4℃密封保存备用。
培养：第一次补液(第3天)。显微镜下观察细胞，确定是否可以补液。瓶底贴壁的克隆团达到瓶底面积的30％以上，颜色与初始培养液比偏黄，如无法判断，可推迟一天补液。补液操作：加入NK试剂C和2.5ml灭活血浆，再加入约47.5ml完全培养基，培养终体积为75ml。
第二次补液(第5天)。加入NK试剂D，和8.75ml灭活血浆，再加入约166.25ml完全培养基，培养终体积定容到250ml。
装袋：第三次补液(第7天)。把NK试剂E盒剩余血浆(不超过15ml)加入培养瓶，再将培养瓶中的细胞悬液转入细胞培养袋中，随后补液(约500ml完全培养基)，培养终体积定容到750ml。
分袋：第四次补液(第9-10天)。配置另一瓶NK完全培养基。将培养袋中的细胞悬液分出一半加入新的培养袋，随后每袋再补入375ml完全培养基。培养终体积为1500ml。第五次补液(第12天)。将剩余的约500ml完全培养基均分到2个培养袋中，每袋终体积约1000ml。
检验：细胞培养第13天，用5ml注射器分别从袋内抽取少量细胞悬液进行细菌、内毒素、支原体检测。
收获：正常情况下，第14、15天各收获1000ml细胞悬液。
流式细胞术检测检测Day15收集的细胞表型，见图2。CD3-CD56+占比72.5％。
计算细胞扩增倍数。
在培养期间统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，计算NK细胞扩增倍数。如图7所示，第15天后细胞扩增177倍。
对比例2
采用友康恒业生物科技有限公司生产的NK细胞无血清培养基(3.0)套装产品作为对照2组，完全按照套装使用说明书中推荐的试验步骤进行操作培养NK细胞，在Day15收集细胞。具体过程如下：
1.第0天
1.1血浆提取取外周血50ml，分装于2支50ml离心管中，于室温下650g离心15min，取上层淡黄色血浆至新的50ml离心管中，于56℃水浴锅中灭活30min，然后900g离心10min，取上清，置于-20℃，15min，再次900g离心10min，取上清，置于4℃保存。
1.2单个核细胞的分离
取上一步血浆提取中得到的下层红色液体用生理盐水等体积稀释，颠倒混匀，备用。
另取2支新的50ml离心管，根据稀释血液的体积，按照1:1的比例加入淋巴细胞分离液。
将稀释后的血液加入到淋巴细胞分离液的离心管中，使血液和淋巴细胞分离液形成一个明显的分层。
轻轻吸取白膜层以及它下面一半的淋巴细胞分离液并转移至新的50ml离心管内，加入等体积生理盐水，室温650g离心10min，弃上清，再次用40ml生理盐水清洗细胞，260g离心10min，弃上清。用预温后的培养基重选细胞，同时取少量细胞悬液进行台盼蓝染色计数，备用。
1.3单个核细胞接种T175培养瓶包被，先将10ml PBS加入T175瓶中，再将YC00A一支添加于T175瓶中，充分混匀后37℃孵育2H，弃上清，并用10ml PBS清洗两次，弃清洗液后备用。
2.第3天补加100ml培养基B，添加5％自体血浆。
3.第5天，根据实际情况进行以下操作
根据计数密度进行补液，补液后密度控制在0.4-0.5×106个/ML，补加培养基B并添加5％自体血浆。如密度达不到补液要求，第5天补液加1％自体血浆后延迟至6天补液，如果可以1:1补液就不需要延迟补液。
4.第7天根据密度补液，补加培养基B即5％血浆，补液后密度维持在0.5-0.6×106个/ML。
5.第9天根据密度补液，如有剩余血浆可以补加(比例不超过5％)，补加培养基B，如果培养基B不足，则使用培养基A，补液后密度维持在0.5-0.6×106个/ML。
6.第11-12天根据密度补液，补加培养基A，补液后密度维持在0.5-0.6×106个/ML，如培养液剩余较少，可不参考密度。
7.第15天收获细胞。
流式细胞术检测检测Day15收集的细胞表型，见图3。CD3-CD56+占比:77.5％。
在培养期间统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，计算NK细胞扩增倍数。如图7所示，第15天后细胞扩增237倍。
实施例5
采用CCK8试剂盒检测评估实施例4及对比例1、对比例2培养的NK细胞对K562细胞的杀伤率。
所用试剂盒厂家为上海碧云天生物技术有限公司，Cell Counting Kit-8，货号:C0038。
具体过程如下：
取对数生长期的K562细胞，用培养液制成细胞悬液，并调整细胞密度为1×105个/ml，接种于96孔板。取实施例4及对比例1、对比例2培养完成的NK细胞，用培养液制成细胞悬液，并调整细胞密度为1×106个/ml。按照效靶比10:1加入NK细胞和K562细胞，同时设置对照组，每组各设3个平行孔。将培养板移入37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中孵育4h后，每孔加入CCK8溶液20μl，继续于恒温箱中培养。培养2h后中止，立即用酶标仪在450nm波长检测各孔的吸光度值(OD值)。记录结果并计算杀伤率。
细胞生长率(％)＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％
细胞杀伤率(％)＝(1-细胞生长率)×100％
结果见图4。由图4可以看出，本发明实施例4培养的NK细胞对K562细胞的杀伤效率超过80％，而对比例1及对比例2对K562细胞的杀伤效率在50％左右。说明本发明的方法在体外培养的NK细胞活性好。
实施例6
ELISA检测实施例4及对比例1、对比例2培养上清液中IFN-γ和TNF-α含量
所用试剂盒厂家为上海碧云天生物技术有限公司，Human IFN-γELISA Kit，货号：PI511；Human TNF-αELISA Kit，货号：PT518。
ELISA检测方法如下：
取出所需板条放置在96孔框架内。每次实验都需配制标准品并绘制出标准曲线，同时建议设置本底较正孔，即空白孔，设置方法为该孔只加TMB溶液和终止液。
分别将培养上清和不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育120分钟。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
加入生物素化抗体100μl/孔。用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育60分钟。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin 100μl/孔。用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20分钟。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
加入显色剂TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20分钟。
加入终止液50μl/孔，混匀后立即测量A450值。
绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。
细胞因子IFN-γ和TNF-α是由NK细胞分泌，含量越高说明NK细胞活性越强。由图5和6说明，本发明体外扩增培养NK细胞的方法培养的NK细胞上清液中，IFN-γ和TNF-α的含量均高于对比例1和对比例2，说明本发明体外扩增培养NK的细胞活性高。
实施例7
应用实施例2中的NK细胞扩增组合物进行NK细胞体外扩增
Day1：在T75培养瓶中加入10ml 5μg/mL的CD3单抗和10ml 5μg/mL的CD52单抗溶液，使其能够全部覆盖T75培养瓶底，置于4℃冰箱中包被孵育24小时。
Day2：抽取一定量的外周血，使用Ficoll分离液提取外周血单个核细胞(PBMC)；
将PBMC按照3×106cell/mL的密度接种至A组培养液中培养4小时；
将PBMC转入第一天包被了抗体的培养瓶中，维持3×106cell/mL的密度继续培养4小时；
最后再将全部细胞转移至C组培养液中，并置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
对光查看培养液，培养液有发黄时考虑补液。在Day3、Day7、Day10、Day13补液C组培养液，并观察细胞，在Day7等分细胞并补液，Day13再次等分细胞并补液，等分后的细胞密度应维持在3×106cell/mL。在Day15收集全部培养瓶中的细胞。
实施例8
应用实施例3中的NK细胞扩增组合物进行NK细胞体外扩增
Day1：在T75培养瓶中加入2ml 20μg/mL的CD3单抗和2ml 20μg/mL的CD52单抗溶液，使其能够全部覆盖T75培养瓶底，置于4℃冰箱中包被孵育24小时。
Day2：抽取一定量的外周血，使用Ficoll分离液提取外周血单个核细胞(PBMC)；
将PBMC按照1×106cell/mL的密度接种至A组培养液中培养4小时；
将PBMC转入第一天包被了抗体的培养瓶中，维持1×106cell/mL的密度继续培养4小时；
最后再将全部细胞转移至C组培养液中，并置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
对光查看培养液，培养液有发黄时考虑补液。在Day3、Day7、Day10、Day13补液C组培养液，并观察细胞，在Day7等分细胞并补液，Day13再次等分细胞并补液，等分后的细胞密度应维持在3×106cell/mL。在Day15收集全部培养瓶中的细胞。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种NK细胞扩增组合物，其特征在于，包括：
A组：T细胞培养液，IL-2；
B组：CD3单抗溶液，CD52单抗溶液；
C组：T细胞培养液，IL-2，IL-15，自体灭活血浆。
2.根据权利要求1所述的NK细胞扩增组合物，其特征在于，A组中，IL-2的浓度为1000IU/mL～4000IU/mL。
3.根据权利要求1所述的NK细胞扩增组合物，其特征在于，CD3单抗溶液和CD52单抗溶液的浓度分别独立地为5μg/mL～20μg/mL。
4.根据权利要求1所述的NK细胞扩增组合物，其特征在于，C组中，IL-2的浓度为200IU/mL～2000IU/mL，IL-15的浓度为2ng/mL～30ng/mL。
5.一种NK细胞体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取外周血单个核细胞，将外周血单个核细胞加入到A组培养液中培养，所述A组培养液为T细胞培养液+1000IU/mL～4000IU/mL IL-2。
(2)将步骤(1)处理后的外周血单个核细胞转入到5μg/mL～20μg/mLCD3单抗溶液和5μg/mL～20μg/mLCD52单抗溶液预处理的培养瓶中培养；
(3)将步骤(2)得到的细胞转入C组培养液中培养，所述C组培养液为T细胞培养液+200IU/mL～2000IU/mLIL-2+2ng/mL～30ng/mLIL-15+1～5％体积分数的自体灭活血浆。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)细胞培养的时间分别独立地为2～7小时。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述培养瓶预处理的方法为：在培养瓶中加入5μg/mL～20μg/mL CD3单抗溶液和5μg/mL～20μg/mL CD52单抗溶液，在4℃下包被孵育20～30小时。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述细胞培养的天数为15天。
9.根据权利要求5或8所述的方法，其特征在于，步骤(3)细胞培养的密度为1～3×106cell/mL。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)细胞在培养过程中，将细胞分离，并补充C组培养液。
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