CN111849893A - 一种体外培养自然杀伤细胞的试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种体外培养自然杀伤细胞的试剂盒及其使用方法和应用。所述试剂盒包括包被液、孵育液和无血清培养基1、无血清培养基2、无血清培养基3和无血清培养基4。其中，所述无血清培养基1、无血清培养基2和无血清培养基3为包含白细胞介素2、白细胞介素15、白细胞介素18、白细胞介素21和自体血浆的无血清培养基；所述无血清培养基4为包括白细胞介素2、白细胞介素15、白细胞介素18和白细胞介素21的无血清培养基。本发明通过合理搭配各培养基中的自体血浆、白细胞介素的种类以及浓度，在种子细胞较少的且未分选纯化的情况下，能够高效制备高产量和高纯度的NK细胞。

Description

一种体外培养自然杀伤细胞的试剂盒及其使用方法和应用

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种自然杀伤细胞的体外培养方法，尤其涉及一种体外培养自然杀伤细胞的试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。近年来，NK细胞因其细胞杀伤活性高，起效快，且不受MHC限制等优点，相对于αβT细胞，γδT细胞和CIK等其它用于免疫治疗的细胞NK细胞受到了更广泛的关注和临床应用。

但是由实验结果显示，NK细胞数量较少，在外周血中仅占淋巴细胞不到1％，正常人体外周血中NK细胞含量远远不能满足临床治疗的需要。NK细胞的数量和纯度是临床疗效的重要影响因素，NK细胞数量太少不能达到治疗的效果，纯度低则会影响对肿瘤的杀伤作用。因此，如何分离制备得到高质量高纯度的NK细胞成为其临床应用中亟待解决的问题。

目前，国内外已经有大量的研究者进行了人NK细胞的培养和生物治疗方面的研究，但培养得到的NK细胞存在数量较少、或纯度较低等问题，不能满足实际应用的需要。

CN102268405A公开了一种自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基。该方法是利用成套的培养基培养并同时添加饲养细胞体外活化扩增自体NK细胞。虽然可在体外大量扩增NK细胞，但是安全性问题和回输到体内后并无饲养层细胞，体内和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀伤活性的影响是其无法回避的问题。

CN104928242A公开了一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)从人外周血或脐带血中分离单个核细胞；(2)将单个核细胞接种到适合淋巴细胞培养的培养基中，加入CD3单克隆抗体，重组人白细胞介素2和自体血浆，培养3-5天；(3)加入重组人白细胞介素2和自体血浆，培养；(4)收获NK细胞。然而，培养15天后，NK细胞仅扩增139.5倍，数量仍较少，而且杀伤活性较低。

CN103627672A公开了一种NK细胞体外培养方法，用PBS稀释的赫赛汀与用PBS稀释人免疫球蛋白，合并后均匀铺满培养瓶底，过夜；另取外周血行密度梯度离心，吸取单个核细胞，加入无血清培养基，调整细胞浓度为1.0×106/mL-3.0×106/mL；然后加入细胞因子IL-2、IL-15，加入到用赫赛汀包被的培养瓶中，孵箱培养。这样在保证了各个细胞亚群扩增倍数的基础上，促进NK细胞的生长和增殖，增强了淋巴细胞的杀伤活性，无血清培养基替代含血清的完全培养基，所得培养产物的数目和细胞活性相当，实现对NK细胞体外大规模培养，用于NK细胞的临床生物治疗，可以增加其临床应用的安全性。得到的培养产物中，NK细胞仅扩增102.81±94.06倍，而且采用传统的Ficoll法密度梯度离心法分离NK细胞，数量和纯度不佳。

因此，急需对NK细胞的制备方法进一步改进，以高效制备高产量、高纯度的NK细胞。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种体外培养自然杀伤细胞的试剂盒及其使用方法和应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种体外培养自然杀伤细胞(NK细胞)的试剂盒，所述试剂盒包括包被液、孵育液和无血清培养基1、无血清培养基2、无血清培养基3和无血清培养基4。

其中，所述无血清培养基1、无血清培养基2和无血清培养基3为包含白细胞介素2、白细胞介素15、白细胞介素18、白细胞介素21和自体血浆的无血清培养基；所述无血清培养基4为包括白细胞介素2、白细胞介素15、白细胞介素18和白细胞介素21的无血清培养基。

本发明中，所述试剂盒包括包被液、孵育液和无血清培养基1～4，其中，无血清培养基1～4均为无血清培养基，且均包含白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素18(IL-18)和白细胞介素21(IL-21)。白细胞介素在传递信息、激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化中起重要作用，本发明中选用IL-2、IL-15、IL-18和IL-21四种白介素作为NK细胞培养基的成分，在NK细胞的增殖过程中，不仅能够促进白细胞转化为NK细胞，还给NK细胞提供大量增殖所需要的营养；

同时，无血清培养基1～3中还包含自体血浆，所述自体血浆指与所取NK细胞为同一个体的、经过56℃30min后灭活后的血浆，为NK细胞分离中的副产物，血浆中存在微量元素与活性蛋白。在培养基1～3添加自体血浆，能够进一步帮助NK细胞快速适应培养环境以获得快速增殖的可能。利用本发明提供的试剂盒，仅需要少量的种子细胞，便可以扩增细胞总量达1000倍以上，且无需对细胞进行分选纯化，同时本发明中使用的细胞因子量较少，培养一段时间后可以获得较高纯度的NK细胞。

作为本发明优选的技术方案，所述包被液包括重组人纤连蛋白和/或人源化抗人CD3单克隆抗体(Humanized anti-human CD3monoclonal antibody)。

优选地，所述包被液中重组人纤连蛋白的质量浓度为8～12μg/mL，例如可以是8.5μg/mL、9μg/mL、9.5μg/mL、10μg/mL、10.5μg/mL、11μg/mL或11.5μg/mL等。

优选地，所述包被液中人源化抗人CD3单克隆抗体的质量浓度为8～12μg/mL，例如可以是8.5μg/mL、9μg/mL、9.5μg/mL、10μg/mL、10.5μg/mL、11μg/mL或11.5μg/mL等。

作为本发明优选的技术方案，所述孵育液包括胎牛血清和/或人源化抗人CD3单克隆抗体。

优选地，所述孵育液中胎牛血清的体积浓度为10～30％，例如可以是12％、15％、16％、18％、20％、22％、24％、25％、26％或28％等，优选为20％。

优选地，所述孵育液中人源化抗人CD3单克隆抗体的质量浓度为2～3μg/mL，例如可以是2.1μg/mL、2.2μg/mL、2.3μg/mL、2.4μg/mL、2.5μg/mL、2.6μg/mL、2.7μg/mL、2.8μg/mL或2.9μg/mL等。

本发明中，包被液的主要作用为包被细胞培养基质面，促进细胞贴合培养基质面，促进细胞聚团生长，孵育液的主要作用为短时修复因分离提纯对细胞造成的物理伤害，增强细胞活力。与无血清培养基1～4配合使用，能够大幅度降低因子使用量，并能增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，使得到的NK细胞浓度和纯度都更高。

同时，本发明中根据不同培养基的使用阶段不同，对培养基中各组分的浓度进行了合理地搭配。其中，IL-15、IL-18和IL-21的浓度在无血清培养基1～4中逐渐递减，主要是因为NK细胞激活转化主要在于前期，后期只需要少量因子量维持NK细胞表型；同时，IL-2的浓度在无血清培养基1～3中逐渐递减，而在无血清培养基4中的浓度较高，主要是因为IL-2因子为白细胞扩增的重要因子成分，后期细胞量大，但扩增体积固定，单位体积内细胞量大，所需求的IL-2因子大，增加IL-2的浓度以补偿培养体系的不足。

作为本发明优选的技术方案，所述无血清培养基1中白细胞介素2的终浓度为1000～1500U/mL。

优选地，所述无血清培养基1中白细胞介素15的质量浓度为8～12μg/mL，例如可以是8.5μg/mL、9μg/mL、9.5μg/mL、10μg/mL、10.5μg/mL、11μg/mL或11.5μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基1中白细胞介素18的质量浓度为8～12μg/mL，例如可以是8.5μg/mL、9μg/mL、9.5μg/mL、10μg/mL、10.5μg/mL、11μg/mL或11.5μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基1中白细胞介素21的质量浓度为8～12μg/mL，例如可以是8.5μg/mL、9μg/mL、9.5μg/mL、10μg/mL、10.5μg/mL、11μg/mL或11.5μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基1中自体血浆的体积浓度为8～12％，例如可以是8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％或11.5％等。

作为本发明优选的技术方案，所述无血清培养基2中白细胞介素2的终浓度为800～1200U/mL，例如可以是850U/mL、900U/mL、950U/mL、1000U/mL、1050U/mL、1100U/mL或1150U/mL等。

优选地，所述无血清培养基2中白细胞介素15的质量浓度为4～6μg/mL，例如可以是4.2μg/mL、4.4μg/mL、4.5μg/mL、4.6μg/mL、4.8μg/mL、5μg/mL、5.2μg/mL、5.4μg/mL、5.5μg/mL、5.6μg/mL或5.8μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基2中白细胞介素18的质量浓度为4～6μg/mL，例如可以是4.2μg/mL、4.4μg/mL、4.5μg/mL、4.6μg/mL、4.8μg/mL、5μg/mL、5.2μg/mL、5.4μg/mL、5.5μg/mL、5.6μg/mL或5.8μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基2中白细胞介素21的质量浓度为4～6μg/mL，例如可以是4.2μg/mL、4.4μg/mL、4.5μg/mL、4.6μg/mL、4.8μg/mL、5μg/mL、5.2μg/mL、5.4μg/mL、5.5μg/mL、5.6μg/mL或5.8μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基2中自体血浆的体积浓度为8～12％，例如可以是8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％或11.5％等。

作为本发明优选的技术方案，所述无血清培养基3中白细胞介素2的终浓度为400～600U/mL，例如可以是420U/mL、450U/mL、480U/mL、500U/mL、520U/mL、550U/mL或580U/mL等。

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素15的质量浓度为2～3μg/mL，例如可以是2.1μg/mL、2.2μg/mL、2.3μg/mL、2.4μg/mL、2.5μg/mL、2.6μg/mL、2.7μg/mL、2.8μg/mL或2.9μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素18的质量浓度为2～3μg/mL，例如可以是2.1μg/mL、2.2μg/mL、2.3μg/mL、2.4μg/mL、2.5μg/mL、2.6μg/mL、2.7μg/mL、2.8μg/mL或2.9μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素21的质量浓度为2～3μg/mL，例如可以是2.1μg/mL、2.2μg/mL、2.3μg/mL、2.4μg/mL、2.5μg/mL、2.6μg/mL、2.7μg/mL、2.8μg/mL或2.9μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基3中自体血浆的体积浓度为2～8％，例如可以是3％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％或7％等，优选为5％。

作为本发明优选的技术方案，所述无血清培养基4中白细胞介素2的终浓度为2000～3000U/mL，例如可以是2100U/mL、2200U/mL、2300U/mL、2400U/mL、2500U/mL、2600U/mL、2700U/mL、2800U/mL或2900U/mL等。

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素15的质量浓度为0.8～1.2μg/mL，例如可以是0.85μg/mL、0.9μg/mL、0.95μg/mL、1μg/mL、1.05μg/mL、1.1μg/mL或1.15μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素18的质量浓度为0.8～1.2μg/mL，例如可以是0.85μg/mL、0.9μg/mL、0.95μg/mL、1μg/mL、1.05μg/mL、1.1μg/mL或1.15μg/mL等。

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素21的质量浓度为0.8～1.2μg/mL，例如可以是0.85μg/mL、0.9μg/mL、0.95μg/mL、1μg/mL、1.05μg/mL、1.1μg/mL或1.15μg/mL等。

示例性地，本发明提供的试剂盒中各溶液包含如下组分：

1、包被液是5mL DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)，添加终浓度为10μg/mL的重组人纤粘连蛋白和10μg/mL的人源化抗人CD3单克隆抗体；

2、孵育液为20ml DPBS，添加比例为20％的灭活过滤后的胎牛血清和2.5μg/mL的人源化抗人CD3单克隆抗体；。

3、无血清培养基1是在无血清培养基中，添加终浓度为1200U/mL的IL-2、终浓度为10μg/mL的IL-15、10μg/mL的IL-18、10μg/mL的IL-21和终浓度为10％的自体血浆；

4、无血清培养基2是在无血清培养基中，添加终浓度为1000U/mL的IL-2、终浓度为5μg/mL的IL-15、5μg/mL的IL-18、5μg/mL的IL-21和终浓度为10％的自体血浆；

5、无血清培养基3是在无血清培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2、终浓度为2.5μg/mL的IL-15、2.5μg/mL的IL-18、2.5μg/mL的IL-21和终浓度为5％的自体血浆；

6、无血清培养基4是在无血清培养基中，添加终浓度为2500U/mL的IL-2、终浓度为1.0μg/mL的IL-15、1.0μg/mL的IL-18、1.0μg/mL的IL-21；

需要注意的是，本发明中所指的无血清培养基为淋巴细胞培养用无血清培养基，即适合淋巴细胞生长的无血清培养基；所述淋巴细胞培养用无血清培养基可选用Alys-505N、GT T551或GT T551-H3培养基。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：

采集自然杀伤细胞，用孵育液孵育后转移至包被液处理的培养器具中，而后按培养时间依次分别加入无血清培养基1、无血清培养基2、无血清培养基3和无血清培养基4，培养15～20天(例如可以是16天、17天、18天或19天等)后收集得到自然杀伤细胞。

优选地，所述孵育的时间为40～80min，例如可以是45min、50min、55min、60min、65min、70min或75min等，温度为36～37.5℃，例如可以是36.2℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.1℃、37.2℃或37.4℃等。

优选地，所述使用方法包括如下步骤：

(1)采集自然杀伤细胞，使用孵育液对所述自然杀伤细胞进行孵育；

(2)使用包被液包被培养器具，而后孵育后的自然杀伤细胞转移至所述培养器具中，并加入无血清培养基1；

(3)以加入无血清培养基1时为培养第1天，在培养第4天时，添加无血清培养基1，培养第6天时，分瓶培养并添加无血清培养基2，培养第8天时，转袋培养并添加无血清培养基3，培养第10天时，添加无血清培养基3，培养第12天时，添加无血清培养基4，培养第16天时，收集自然杀伤细胞。

本发明中，在使用所述试剂盒培养NK细胞时，应该在适宜的时间点按顺序添加不同的无血清培养基，保证其培养效果达到最好。

第三方面，本发明还提供一种如权利要求第一方面所述的体外培养自然杀伤细胞的试剂盒在培养自然杀伤细胞中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供一种体外培养自然杀伤细胞的试剂盒，所述试剂盒包括包被液、孵育液和无血清培养基1～4，通过合理搭配各培养基中的白细胞介素的种类以及浓度，所得到的试剂盒仅需少量的种子细胞，且无需对细胞进行分选纯化，即可扩增细胞总量达到1000倍以上；

(2)本发明提供的试剂盒中使用的各成分的总量较少，在白细胞介素总量较少的情况下，按照本发明中设置的浓度制备的培养基，在正确地培养16天后均能够得到比例为42.36～61.71％的NK细胞，最高可达61.71％，远高于目前体外培养NK细胞时所能达到的百分比，即所述试剂盒能够高效制备高产量、高纯度的NK细胞。

附图说明

图1为试验例1中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图2为试验例2中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图3为试验例3中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图4为试验例4中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图5为试验例5中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图6为试验例6中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图7为试验例7中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图8为对比试验例1中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图9为对比试验例2中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图10为对比试验例3中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图11为对比试验例4中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图12为对比试验例5中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图13为对比试验例6中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图14为对比试验例7中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

图15为对比试验例8中培养得到的细胞的流式细胞检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

实施例1

本实施例提供一种体外培养自然杀伤细胞的试剂盒，具体包括：

1、10mL包被液：含有终浓度为10μg/mL的重组人纤粘连蛋白和10μg/mL的人源化抗人CD3单克隆抗体的DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)；

2、50mL孵育液：含有体积比为20％的灭活过滤后的胎牛血清和2.5μg/mL的人源化抗人CD3单克隆抗体的DPBS；

3、60mL无血清培养基1：在Alys-505N培养基中，添加终浓度为1200U/mL的IL-2、终浓度为10μg/mL的IL-15、10μg/mL的IL-18、10μg/mL的IL-21和终浓度为10％的自体血浆；

4、140mL无血清培养基2：在Alys-505N培养基中，添加终浓度为1000U/mL的IL-2、终浓度为5μg/mL的IL-15、5μg/mL的IL-18、5μg/mL的IL-21和终浓度为10％的自体血浆；

5、1000mL无血清培养基3：在Alys-505N培养基中，添加终浓度为500U/mL的IL-2、终浓度为2.5μg/mL的IL-15、2.5μg/mL的IL-18、2.5μg/mL的IL-21和终浓度为5％的自体血浆；

6、800mL无血清培养基4：在Alys-505N培养基中，添加终浓度为2500U/mL的IL-2、终浓度为1.0μg/mL的IL-15、1.0μg/mL的IL-18、1.0μg/mL的IL-21。

实施例2

本实施例提供一种体外培养自然杀伤细胞的试剂盒，具体包括：

1、10mL包被液：含有终浓度为8μg/mL的重组人纤粘连蛋白和8μg/mL的人源化抗人CD3单克隆抗体的DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)；

2、50mL孵育液：含有体积比为10％的灭活过滤后的胎牛血清和2μg/mL的人源化抗人CD3单克隆抗体的DPBS；

3、60mL无血清培养基1：在GT T551培养基中，添加终浓度为1000U/mL的IL-2、终浓度为8μg/mL的IL-15、8μg/mL的IL-18、8μg/mL的IL-21和终浓度为8％的自体血浆；

4、140mL无血清培养基2：在GT T551培养基中，添加终浓度为800U/mL的IL-2、终浓度为4μg/mL的IL-15、4μg/mL的IL-18、4μg/mL的IL-21和终浓度为8％的自体血浆；

5、1000mL无血清培养基3：在GT T551培养基中，添加终浓度为400U/mL的IL-2、终浓度为2μg/mL的IL-15、2μg/mL的IL-18、2μg/mL的IL-21和终浓度为2％的自体血浆；

6、800mL无血清培养基4：在GT T551培养基中，添加终浓度为2000U/mL的IL-2、终浓度为0.8μg/mL的IL-15、0.8μg/mL的IL-18、0.8μg/mL的IL-21。

实施例3

本实施例提供一种体外培养自然杀伤细胞的试剂盒，具体包括：

1、10mL包被液：含有终浓度为12μg/mL的重组人纤粘连蛋白和12μg/mL的人源化抗人CD3单克隆抗体的DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)；

2、50mL孵育液：含有体积比为30％的灭活过滤后的胎牛血清和3μg/mL的人源化抗人CD3单克隆抗体的DPBS；

3、60mL无血清培养基1：在Alys-505N培养基中，添加终浓度为1500U/mL的IL-2、终浓度为12μg/mL的IL-15、12μg/mL的IL-18、12μg/mL的IL-21和终浓度为8％的自体血浆；

4、140mL无血清培养基2：在Alys-505N培养基中，添加终浓度为1200U/mL的IL-2、终浓度为6μg/mL的IL-15、6μg/mL的IL-18、6μg/mL的IL-21和终浓度为8％的自体血浆；

5、1000mL无血清培养基3：在Alys-505N培养基中，添加终浓度为600U/mL的IL-2、终浓度为3μg/mL的IL-15、3μg/mL的IL-18、3μg/mL的IL-21和终浓度为8％的自体血浆；

6、800mL无血清培养基4：在Alys-505N培养基中，添加终浓度为3000U/mL的IL-2、终浓度为1.2μg/mL的IL-15、1.2μg/mL的IL-18、1.2μg/mL的IL-21。

实施例4

与实施例1的区别在于，本实施例中无血清培养基4中包含自体血浆，其余组分与实施例1保持一致。

实施例5

与实施例1的区别在于，本实施例中无血清培养基1和2中IL-2、IL-15、IL-18和IL-21的浓度相同，均为10μg/mL，其余组分与实施例1保持一致。

实施例6

与实施例1的区别在于，本实施例中无血清培养基3和4中IL-2、IL-15、IL-18和IL-21的浓度相同，均为2.5μg/mL，其余组分与实施例1保持一致。

实施例7

与实施例1的区别在于，本实施例中无血清培养基4中IL-2的浓度为500U/mL，其余组分与实施例1保持一致。

对比例1

与实施例1的区别在于，无血清培养基1、2、3中不包含自体血浆，其余组分与实施例1保持一致。

对比例2

与实施例1的区别在于，将无血清培养基1、2、3中包含的自体血浆替换为终浓度相同的胎牛血清，其余组分与实施例1保持一致。

对比例3

与实施例1的区别在于，所述试剂盒中不包含无血清培养基1，其余组分与实施例1保持一致。

对比例4

与实施例1的区别在于，所述试剂盒中不包含无血清培养基2，其余组分与实施例1保持一致。

对比例5

与实施例1的区别在于，所述试剂盒中不包含无血清培养基3，其余组分与实施例1保持一致。

对比例6

与实施例1的区别在于，所述试剂盒中不包含无血清培养基4，其余组分与实施例1保持一致。

对比例7

与实施例1的区别在于，所述试剂盒中的无血清培养基1～4中不包含IL-21；

相应的，各组分中IL-15和IL-18的浓度等比例增加，使IL-15和IL-18的总浓度与实施例1中IL-15、IL-18和IL-21的总浓度相同，其余组分与实施例1保持一致。

试验例1

本试验例中，采用实施例1提供的试剂盒在体外培养NK细胞。

(1)包被(记为D0)：

确认细胞培养前一天，使用包被液对T75培养瓶进行包被，并使用封口膜对瓶子进行密封封装，并置于37.0℃、5.0％CO₂浓度、饱和湿度的二氧化碳培养箱进行包被处理。

(2)采集种子细胞(记为D1)：

采集种子细胞可采用本领域常用的技术手段进行，本试验例中采用如下方法采集自然杀伤细胞，具体包括步骤如下：

将收集到的血样无菌转移到离心管中，室温下离心400G，10min，离心间隙，取50mL离心管，加入15mL淋巴细胞分离液；分离血清，并向离心管中剩余液体中添加注射液至50mL，混匀。

将稀释后的外周血缓慢加入淋巴细胞分离液中，每次吸取稀释的外周血之前吹打均匀后再吸取；每支管加满，大约加35mL，加满后小心轻放于酒精灯左侧，继续添加下一支；

稀释的外周血悬液全部加到淋巴细胞分离液上后，常温下离心800G，25min；离心结束后，离到白膜层，用10mL移液管轻轻将上清吸出弃掉，至上清距离白膜层大约1cm处时，开始吸取离心管中上清与下层淋巴细胞分离液之间的夹层白色单个核细胞，转移到50mL离心管中，每支离心管加入生理盐水至50mL；室温下离心400G，5min，获得单个核细胞，离心结束后，收集底部的细胞即为培养的种子细胞。

(3)细胞孵育(D1)：

将种子细胞转移进新的T75培养瓶，添加细胞孵育液10mL，平面晃动培养瓶使得细胞平均分布在培养面上，并置于37.0℃、5.0％CO₂浓度，饱和湿度的二氧化碳培养箱进行孵育60min；

(4)激活培养瓶准备(D1)：

提前10min将包被的T75培养瓶移出，倒出包被液，并用20mL无血清培养基缓慢润洗培养面，使用10mL移液管尽量全部抽出无血清培养基，10mL移液管切勿接触、刮花包被的培养面；

(5)细胞激活(D1)：

将孵育好的细胞收集至50mL离心管，室温下离心300G，5min，且升速为9，降速为9，去除上清，调整细胞密度至2×10⁶个/mL，使用无血清培养基1充分重悬混匀种子细胞，转移至激活培养瓶中，并置于37.0℃、5.0％CO₂浓度、饱和湿度的二氧化碳培养箱进行激活培养，期间每日观察细胞生长情况；

(6)二度细胞激活培养(D4)：

向培养瓶中添加无血清培养基1，使得培养总体积为60mL，并置于37.0℃、5.0％CO₂浓度、饱和湿度的二氧化碳培养箱进行激活培养2天，期间每日观察细胞生长情况；

(7)首次传代培养(D6)：

准备好两个T175培养瓶，将激活好的细胞混匀，各转移30mL细胞悬液至T175培养瓶中，并向T175培养瓶各自添加70mL无血清培养基2，培养总体系200mL，并置于37.0℃、5.0％CO₂浓度、饱和湿度的二氧化碳培养箱进行激活培养2D，期间每日观察细胞生长情况；

(8)扩增培养(D8)：

准备好两个1000mL一次性无菌悬浮细胞培养袋，各自将T175瓶中的细胞全部转移进1000mL一次性无菌悬浮细胞培养袋中，并各自向培养袋中添加200mL无血清培养基3，培养总体系600mL，并置于37.0℃、5.0％CO₂浓度、饱和湿度的二氧化碳培养箱进行激活培养，期间每日观察细胞生长情况；

(9)持续扩增加液(D10)

各自向培养袋中添加300mL无血清培养基3，培养总体系1200mL，并置于37.0℃、5.0％CO₂浓度、饱和湿度的二氧化碳培养箱进行激活培养2天，期间每日观察细胞生长情况；

(10)维持扩增加液(D12)

各自向培养袋中添加400mL无血清培养基4，培养总体系2000mL，并置于37.0℃、5.0％CO₂浓度、饱和湿度的二氧化碳培养箱进行激活培养，期间每日观察细胞生长情况。

(11)收集细胞(D16)

收集获得NK细胞，并对细胞进行细菌、真菌、支原体、内毒素和流式细胞分型检测；

流式细胞分型检测的结果如图1所示。

试验例2～7

与试验例1的区别在于，将试验例1中使用的实施例1中的试剂盒替换为实施例2～7中提供的试剂盒，其余步骤与试验例1相同；

流式细胞分型检测的结果如图2(试验例2)、图3(试验例3)、图4(试验例4)、图5(试验例5)、图6(试验例6)和图7(试验例7)所示。

对比试验例1～2

与试验例1的区别在于，将试验例1中使用的实施例1中的试剂盒替换为对比例1～2中提供的试剂盒，其余步骤与试验例1相同；

流式细胞分型检测的结果如图8(对比试验例1)和图9(对比试验例2)所示。

对比试验例3

与试验例1的区别在于，本对比试验例中，使用对比例3中提供的培养基，其中，在培养过程中，若试验例1中使用的是无血清培养基1，则统一替换为对比例1中提供的无血清培养基2，其余步骤与试验例1相同；

流式细胞分型检测的结果如图10所示。

对比试验例4

与试验例1的区别在于，本对比试验例中，使用对比例4中提供的培养基，其中，在培养过程中，若试验例1中使用的是无血清培养基2，则统一替换为对比例1中提供的无血清培养基3，其余步骤与试验例1相同；

流式细胞分型检测的结果如图11所示。

对比试验例5

与试验例1的区别在于，本对比试验例中，使用对比例5中提供的培养基，其中，在培养过程中，若试验例1中使用的是无血清培养基3，则统一替换为对比例1中提供的无血清培养基2，其余步骤与试验例1相同；

流式细胞分型检测的结果如图12所示。

对比试验例6

与试验例1的区别在于，本对比试验例中，使用对比例6中提供的培养基，其中，在培养过程中，若试验例1中使用的是无血清培养基4，则统一替换为对比例1中提供的无血清培养基3，其余步骤与试验例1相同；

流式细胞分型检测的结果如图13所示。

对比试验例7

与试验例1的区别在于，本对比试验例中，使用对比例7中提供的培养基，其余步骤与试验例1相同；

流式细胞分型检测的结果如图14所示。

对比试验例8

与试验例1的区别在于，培养步骤中改变培养基的添加时间，具体为：

培养第1天：使用孵育液对种子细胞进行37℃孵育60min，孵育完成后收集细胞至离心管，室温下离心400G，5min，收集底部细胞于包被好的瓶中，添加20mL无血清培养基1进行激活培养；

培养第2天：添加40mL无血清培养基1；

培养第4天：分瓶并添加70mL无血清培养基2；

培养第6天：转袋并添加200mL无血清培养基3；

培养第8天：添加300mL无血清培养基3；

培养第14天：添加400mL无血清培养基4；

培养第16天：收集细胞进行检测；流式细胞分型检测的结果如图15所示。

最终各试验例与对比试验例的检测结果如表1所示：

表1

编号	NK细胞百分比(％)
		试验例1	61.71
试验例2	42.36
		试验例3	44.79
试验例4	51.17
		试验例5	20.54
试验例6	22.83
		试验例7	25.55
对比试验例1	8.36
		对比试验例2	4.46
对比试验例3	23.38
		对比试验例4	18.89
对比试验例5	48.86
		对比试验例6	52.66
对比试验例7	31.90
		对比试验例8	28.39

由上表结合图1～15分析实验结果，由试验例1和试验例5和6比较可知，各培养基中白介素的浓度较为重要，试验例1的各培养基中白介素的浓度按梯度设置不同大小，而试验例5和试验例6中白激素的浓度均相同，分别取10μg/mL和2.5μg/mL，所得细胞中NK细胞的百分比明显低于试验例1；

由试验例1～3比较可知，各培养基中的细胞因子浓度要把控在合适的浓度，过低会影响NK细胞比例，过高不但影响细胞因子比例，还会造成因子的浪费，因此试验例1中的浓度最为合适；

由试验例1和4比较可知，在培养基4中也添加自体血浆，会影响NK细胞的百分比，因此，额外添加其他的培养基组分，虽然也能获得较多的NK细胞，但是效果较试验例1会较差；因此，由试验例1、4和对比试验例7比较可知，无血清培养基4中无需添加自体血浆，且IL-2的浓度应较高，才能获得较多的NK细胞；

由试验例1和对比试验例1比较可知，灭活后的自体血浆对NK细胞的比例有非常大的影响，只有添加自体灭活血浆才能得到更高的NK细胞比例；由试验例1和对比试验例1～2比较可知，胎牛血清不能替代自体灭活血浆；由试验例1和对比例试验例3～6比较可知，NK细胞培养过程中，无血清培养基1和2是重点，后面的培养基3和4的添加主要维持细胞分型和扩增。虽然对培养基的分类进行了删减，但是在不改变成分的基础上，仍然获得了较多的NK细胞，但是其效果劣于试验例1，可见后期再添加NK细胞转化因子有一定的必要性；由试验例1和对比试验例7比较可知，培养基中各白介素的存在都有意义，不能随意删减白介素的种类；

由试验例1和对比试验例8比较可知，培养基添加的时间也一定程度上会影响细胞的分型和分化，对比试验例8中由于过早的加入了无血清培养基3，导致无血清培养基1和2激活培养和首次传代的时间较短，导致NK细胞的百分比较少。

综上所述，本发明提供的体外培养自然杀伤细胞的试剂盒，通过合理搭配各培养基中的白细胞介素的种类以及浓度，所得到的试剂盒仅需少量的种子细胞，且无需对细胞进行分选纯化，且培养16天后能够得到比例均在20％以上的NK细胞，培养基组分按比例设置时均在40％以上，最高可达61.71％。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种体外培养自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被液、孵育液和无血清培养基1、无血清培养基2、无血清培养基3和无血清培养基4；

其中，所述无血清培养基1、无血清培养基2和无血清培养基3为包含白细胞介素2、白细胞介素15、白细胞介素18、白细胞介素21和自体血浆的无血清培养基；

所述无血清培养基4为包括白细胞介素2、白细胞介素15、白细胞介素18和白细胞介素21的无血清培养基。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被液包括重组人纤连蛋白和/或人源化抗人CD3单克隆抗体；

优选地，所述包被液中重组人纤连蛋白的质量浓度为8～12μg/mL；

优选地，所述包被液中人源化抗人CD3单克隆抗体的质量浓度为8～12μg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述孵育液包括胎牛血清和/或人源化抗人CD3单克隆抗体；

优选地，所述孵育液中胎牛血清的体积浓度为10～30％，优选为20％；

优选地，所述孵育液中人源化抗人CD3单克隆抗体的质量浓度为2～3μg/mL。

4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述无血清培养基1中白细胞介素2的终浓度为1000～1500U/mL；

优选地，所述无血清培养基1中白细胞介素15的质量浓度为8～12μg/mL；

优选地，所述无血清培养基1中白细胞介素18的质量浓度为8～12μg/mL；

优选地，所述无血清培养基1中白细胞介素21的质量浓度为8～12μg/mL；

优选地，所述无血清培养基1中自体血浆的体积浓度为8～12％。

5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述无血清培养基2中白细胞介素2的终浓度为800～1200U/mL；

优选地，所述无血清培养基2中白细胞介素15的质量浓度为4～6μg/mL；

优选地，所述无血清培养基2中白细胞介素18的质量浓度为4～6μg/mL；

优选地，所述无血清培养基2中白细胞介素21的质量浓度为4～6μg/mL；

优选地，所述无血清培养基2中自体血浆的体积浓度为8～12％。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述无血清培养基3中白细胞介素2的终浓度为400～600U/mL；

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素15的质量浓度为2～3μg/mL；

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素18的质量浓度为2～3μg/mL；

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素21的质量浓度为2～3μg/mL；

优选地，所述无血清培养基3中自体血浆的体积浓度为2～8％，优选为5％。

7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述无血清培养基4中白细胞介素2的终浓度为2000～3000U/mL；

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素15的质量浓度为0.8～1.2μg/mL；

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素18的质量浓度为0.8～1.2μg/mL；

优选地，所述无血清培养基3中白细胞介素21的质量浓度为0.8～1.2μg/mL。

8.一种如权利要求1～7任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：

采集自然杀伤细胞，用孵育液孵育后转移至包被液处理的培养器具中，而后按培养时间依次分别加入无血清培养基1、无血清培养基2、无血清培养基3和无血清培养基4，培养16～20天后收集得到自然杀伤细胞。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，所述孵育的时间为40～80min，温度为36～37.5℃；

优选地，所述使用方法包括如下步骤：

(1)采集自然杀伤细胞，使用孵育液对所述自然杀伤细胞进行孵育；

(2)使用包被液包被培养器具，而后孵育后的自然杀伤细胞转移至所述培养器具中，并加入无血清培养基1；

(3)以加入无血清培养基1时为培养第1天，在培养第4天时，添加无血清培养基1，培养第6天时，分瓶培养并添加无血清培养基2，培养第8天时，转袋培养并添加无血清培养基3，培养第10天时，添加无血清培养基3，培养第12天时，添加无血清培养基4，培养第16天时，收集自然杀伤细胞。

10.如权利要求1～7任一项所述的体外培养自然杀伤细胞的试剂盒在培养自然杀伤细胞中的应用。

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