KR20220063446A

KR20220063446A - 말초혈액 단핵세포로부터 자연살해세포로의 분화과정 중 분화 또는 증식을 증진시키는 방법

Info

Publication number: KR20220063446A
Application number: KR1020200149299A
Authority: KR
Inventors: 고용곤; 김용일; 박요셉
Original assignee: 주식회사 티제이씨라이프
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2022-05-17

Abstract

말초혈액 단핵세포로부터 자연살해세포로의 분화 또는 증식을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 말초혈액 단핵세포의 자연살해세포로의 분화 및 증식을 증진시킬 수 있는 방법에 의하면 배양액에 추가적인 첨가물을 첨가하지 않고 계대배양 시기 및 횟수에 따라 자연살해세포로의 높은 분화 효율이 유도되고, 동시에 확보될 수 있는 자연살해세포의 총 세포수가 효과적으로 증진될 수 있다. 따라서, 세포 증식 및 분화를 효과적으로 조절할 수 있다. 아울러 일 양상의 방법은 자연살해세포로의 증식 및 분화를 촉진시킬 수 있어, 세포독성 활성이 증가된 자연살해세포를 안정적으로 제공할 수 있다. 또한 이에 따라 제조된 자연살해세포는 항암 치료 등 질병 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

말초혈액 단핵세포로부터 자연살해세포로의 분화과정 중 분화 또는 증식을 증진시키는 방법{Method of promoting differentiation or proliferation during the differentiation process of peripheral blood mononuclear cells into natural killer cells}

말초혈액 단핵세포로부터 자연살해세포로의 분화 또는 증식을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

면역세포치료법에 이용되고 있는 자연살해세포(natural killer cell, 이하 "NK 세포"라 칭함)는 형태학적으로 세포질에 큰 과립을 가지는 세포로, 혈액 내 림프구의 약 5 ~ 15%를 차지한다. 현재까지 밝혀진 NK 세포의 주요기능으로는 종양세포를 살해할 수 있는 능력, 바이러스 감염세포에 대한 세포독성, 및 세균과 진균을 살해하는 능력 등이 있다. 특히, T 세포 및 B 세포와 같은 타 면역세포와 달리 NK 세포는 표면에 발현되는 여러 수용체를 통해 암세포 및 병원균에 감염된 세포를 직접 공격하여 살해할 수 있는 능력을 가진다. 따라서, NK 세포는 항종양, 면역 및 미생물에 대한 보호면역에 대하여 중요한 역할을 수행한다.

그러나, NK 세포는 줄기세포(stem cell)와 달리 체외에서 장기 배양을 할 수 없는 세포로, 체외에서 장기적인 분화 및 증식에 어려움을 갖는다. 이러한 어려움을 해결하고자 interleukin-2 (IL-2)를 주요인자로 하여 NK 세포를 체외에서 증식시킬 수 있는 방법이 고안되었고, 현재 여러 연구자들의 연구로 IL-2를 포함한 IL-12, IL-15, IL-18 등 여러 사이토카인(cytokine)들 뿐만 아니라 지지세포(feeder cell)와 항체(antibody)를 사용하는 배양 방법을 통해 체외에서 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, 이하 "PBMC"라 칭함)를 NK 세포로 분화 및 증식시키고 있다. 하지만, 배양에 사용되는 첨가 물질의 증가는 NK 세포 체외 배양 비용의 증가를 야기한다.

이러한 이유로, NK 세포를 체외 배양함에 있어 배양액에 첨가되는 추가적인 첨가물에 의존도를 낮추면서도, 세포를 효율적으로 증식 및 분화 시킬 수 있는 방법에 대한 개발이 필요한 상황이다.

일 양상은 말초혈액 단핵세포로부터 자연살해세포로의 분화 또는 증식을 증진시키는 방법을 제공한다.

일 양상은 a) 개체의 생물학적 시료로부터 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell : PBMC)을 수득하는 단계; b) 수득된 말초혈액 단핵세포를 접종하고 배양액에서 배양하는 단계; 및 c) 배양 10일 내지 16일차에 2 내지 5회의 계대배양을 수행하는 단계를 포함하는 말초혈액 단핵세포로부터 자연살해세포 (natural killer cell : NK) 로의 분화 또는 증식을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "세포 증식"은 세포가 일련의 세포 분열 단계를 거쳐 배양물에서 세포의 수가 증가하거나 또는 세포가 분화하는 것을 의미한다. 용어 "자연살해세포 증식"은 일련의 세포 분열 단계를 거쳐 배양물에서 NK 세포의 수가 증가하거나 또는 미성숙 혈액 세포, 예컨대 말초혈액 단핵세포에서 NK 세포로의 분화에 의해 NK 세포의 수가 증가하는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 상기 "자연살해세포 증식"은 NK 세포수의 증가, 또는 미분화된 림프구 세포, 예컨대 말초혈액 단핵세포가 NK세포의 형질을 획득하여 NK 세포로 분화 또는 NK 세포가 미성숙 상태에서 성숙 NK 세포로 되는 상태를 포함할 수 있다.

상기 자연살해세포 증식은 예를 들면 말초혈액 단핵세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 용어 "말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear 세포, PBMC)"는 포유동물, 바람직하게는 사람의 말초혈액으로부터 분리된 단핵의 세포로서, 주로 B 세포, T 세포, 자연살해 세포와 같은 면역세포, 및 호염구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil)와 같은 과립구 등을 포함한다. 상기 PBMC는 생체에서 채취한 말초혈액으로부터 통상의 제조방법에 의해 준비될 수 있다. 바람직하게 상기 PBMC는 피콜(Ficoll)을 이용한 밀도구배 원심분리법을 이용하여 말초혈액으로부터 분리할 수 있다.

상기 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 생물로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 혈액, 조직, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 혈액은 NK 세포를 포함하는 혈액이라면 본 발명의 NK 세포 증식 방법에 적용하기 위한 NK 세포 공급원으로 PBMC를 수득하기 위하여 이용가능하며, 예를 들면 제대혈액, 골수, 또는 말초혈액일 수 있다.

또한 상기 말초혈액 단핵세포는 치료를 필요로 하는 개체로부터 얻어지는 것, 즉 자가(autologous) 말초혈액 단핵세포일 수 있다. 상기 말초혈액 단핵세포가 자가 말초혈액 단핵세포일 경우, 증식된 NK 세포 집단에서 일부 T 세포가 존재하더라도, 모든 세포가 환자 본인 유래이기 때문에 T 세포를 제거할 필요가 없다는 장점이 있다.

또한 본 발명의 방법에 이용되는 말초혈액 단핵세포는 동결되어 보존된 것일 수 있다. 상기 말초혈액 단핵세포는 혈액에서 분리한 후, 동결시킨 다음 이를 다시 해동시켜 NK 세포 증식에 이용할 수 있다. 상기 동결은 종래의 공지된 방법을 이용할 수 있다. 이 경우, 각 동결단계는 온도 범위 내의 여러 불연속적 온도에서 순차적으로 일정시간 시료를 유지시킴으로써, 각 동결단계의 온도 범위의 상한선 또는 하한선까지 온도를 상승 또는 하강시킬 수 있다. 상기 동결보존된 말초혈액 단핵세포는 해동 후 본 발명에 따른 NK 세포의 배양 및 증식에 제공될 수 있으며, 동결과정을 거침으로써 환자로부터 혈액을 채취한 후 원하시는 시기에 배양 및 증식과정을 거쳐 사용할 수 있다는 장점을 가진다. 대부분의 면역세포 치료제는 임상에서 효과적인 세포수를 생산하기 위하여 배양기간을 2주간 설정함에 따라, 배양기간을 고려하여 환자가 2주마다 채혈을 해야 하는 부담이 있으며, 환자의 컨디션에 따라 세포배양에 영향을 미칠 수 있다. 그러나 본 발명은 높은 생존율을 유지하며, 활성화된 NK 세포의 배양방법에 효과적으로 적용할 수 있는 말초혈액 단핵세포의 동결방법과 해동방법을 제공할 수 있다. 이에 따라, 환자의 컨디션이 좋은 때에 많은 양의 혈액을 확보하여 분리 후 동결하여 보관해 놓을 수 있어, 환자의 컨디션에 상관없이 규칙적으로 NK 세포의 생산 및 투여를 가능하게 한다.

상기 배양액은 인 비트로(in vitro) 상에서 말초혈액 단핵세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지로서, 말초혈액 단핵세포 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지액을 모두 포함할 수 있다. 배양에 사용되는 배양액은 NK MACS ® 배양액, 또는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM) 에 IL-2 (500 Unit/mL), 인간 AB 혈청(5%, v/v), NK MACS 보충액 (1%, v/v), 및 NK MACS 최소 배지를 포함한 용액일 수 있다. 상기 세포 배양 최소 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있으며, 이런 세포 배양 최소 배지에는 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 IMEM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 배양액은 혈장 또는 혈청을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양액에 포함되는 혈장 또는 혈청은 NK 세포 배양을 위해 이용되는 PMBC를 분리시킨 말초혈액으로부터 얻을 수 있다. 상기 혈장의 농도는 전체 배양액에 대해 1~20 v/v%, 1~15 v/v%, 2~15 v/v%, 5~15 v/v%, 또는 5~10 v/v% 일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 말초혈액 단핵세포의 배양은 통상의 세포배양 조건 즉, 약 37℃, CO2 배양기에서 수행될 수 있으며, c) 단계 이후 1 내지 2회에 상기 배양액을 첨가하여 세포를 배양하는 d)단계를 더 포함할 수 있다. 상기 배양액은 2일 혹은 3일에 한 번씩 첨가해 주면서 계속적으로 배양할 수 있다. 상기 c) 단계의 계대배양은 1 내지 5일 간격을 두고 수행되는 것일 수 있다. b) 단계에서 접종 말초 혈액 단핵세포의 밀도는 4 X 10⁵ 세포/ mL 내지 8 X 10⁵ 세포/ mL인 것일 수 있다. 또한, 이후 c) 단계에서 계대배양시 접종된 PBMC의 농도는 생존세포 수 기준 4 X 10⁵ 세포/ mL 내지 8 X 10⁵ 세포/mL의 밀도의 범위일 수 있다. 배양기간은 예를 들면 7~25일, 8~24일, 10~23일, 10~22일 또는 10~21일 동안 수행될 수 있고, 총 배양일수는 배양 초기부터 20 내지 25일간 세포를 배양시키는 것일 수 있다. 배양 용기는, 상업적으로 입수 가능한 디쉬, 플라스크, 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 배양백을 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 말초 혈액 단핵 세포로부터 자연살해세포로의 분화를 증진시키는 방법은 b) 단계 이후 배양 6 내지 8일차에 배양액을 첨가하고 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 이와 같은 방법은 배양 6 내지 8일차, 바람직하게는 7일차의 배양이 계대배양이 아닌 단순한 배양액만이 첨가되어 배양되는 것일 수 있다. 또한 상기 말초혈액 단핵세포로부터 자연살해세포로의 분화를 증진시키는 방법은 전체 배양 과정 중 계대배양을 총 2번 수행하는 것일 수 있다.

또한 상기 방법에 있어서, 상기 말초혈액 단핵세포로부터 자연살해세포로의 증식을 증진시키는 방법은 b) 단계 이후 배양 6 내지 8일차, 바람직하게는 7일차에 1회의 계대배양을 수행하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 전체 배양과정에서 계대배양을 총 3번 수행하는 것일 수 있다. 일 구체예에서는 계대배양을 수행하여 계대배양을 수행하지 않은 그룹 대비 총 세포수의 양이 약 6배이상 증진된 것을 확인하였다.

한편, NK 세포를 최대한 증식시키기 위하여 배양은 각 단계별로 배양될 수 있다. 또한 본 발명은 배양 기간 동안, 플라스크 내에 2~3일 간격으로 배양조성물(또는 배양액)을 추가하여 배양하는 것을 특징으로 하며, 이로써 NK 세포의 배양이 효과적으로 이루어지도록 도와주는 역할을 한다. 또한 각 배양 단계의 배양액에는 NK 세포를 증폭시키는 효과를 해치지 않는 것을 조건으로, 적절한 단백질, 사이토카인, 항체, 화합물 그 외의 성분이 포함될 수 있다.

상기 방법을 통해 분화 또는 증식이 유도된 자연살해세포는 CD56을 발현하고, CD3은 발현하지 않는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 발현은 증식 전의 말초혈액 단핵세포 또는 세포 집단, 또는 증식 전의 자연살해세포 또는 세포 집단에 비해 상기 인자를 더 많이 발현하는 것일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 증식된 자연살해세포를 포함하는 말초혈액 단핵세포 또는 세포 집단, 또는 증식된 자연살해세포 또는 세포 집단은 전체 세포 중 또는 전체 세포 집단 중 상기 인자를 적어도 70% 이상, 적어도 80%이상, 적어도 90%이상, 적어도 95%이상, 적어도 96%이상, 적어도 97%이상, 적어도 99%이상, 또는 100% 발현하는 것일 수 있다. 상기 "% 발현" 또는 "발현율"은 시료 내 총 세포 수 대비 상기 인자 중 하나 이상을 발현하는 NK 세포의 백분율을 의미하는 것일 수 있다. 상기 세포 또는 세포 집단 중 상기 인자의 발현 또는 발현율은 유세포분석기를 이용하여 검출한 값에 의해 판단할 수 있다.

일 양상의 방법은 상기 방법에 의하여 증식된 NK 세포를 덱스트란 및 알부민을 포함하는 용액에 현탁하여 상기 NK 세포를 보관하는 단계를 더 포함하여 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

일 양상에 따른 말초혈액 단핵세포의 자연살해세포로의 분화 및 증식을 증진시킬 수 있는 방법에 의하면 배양액에 추가적인 첨가물을 첨가하지 않고 계대배양 시기 및 횟수에 따라 자연살해세포로의 높은 분화 효율이 유도되고, 동시에 자연살해세포로 증식이 효과적으로 증진될 수 있다. 아울러 일 양상의 방법은 자연살해세포로의 증식 및 분화를 촉진시킬 수 있어, 세포독성 활성이 증가된 자연살해세포를 안정적으로 제공할 수 있다. 또한 이에 따라 제조된 자연살해세포는 항암 치료 등 질병 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 말초혈액으로부터 분리된 초기 PBMC의 표현형을 분석한 결과를 나타난 도이다.
도 2는 계대배양 실시 여부에 따라 나뉘는 각 실험의 일정을 간단히 도식화한 도이다.
도 3은 배양 7일차에 계대배양 실시한 그룹(그룹 1) 또는 미실시한 그룹 (그룹 2)에 따른 배양 14일차 및 21일차에서의 그룹 당 총 세포수를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 배양 7일차에 계대배양 실시한 그룹(그룹 1) 또는 미실시한 그룹 (그룹 2)에 따라 배양을 수행한 0일, 10일, 14일 및 21일차의 총 세포수의 증식 곡선을 나타내는 결과이다.
도 5는 배양 7일차에 계대배양 실시한 그룹(그룹 1) 또는 미실시한 그룹 (그룹 2)에 따라, 분화된 각 그룹 세포의 배양 14일차 및 21일차의 표현형을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 배양 7일차에 계대배양 실시한 그룹(그룹 1) 또는 미실시한 그룹 (그룹 2)에 따라, 배양 14일차 및 21일차에 증식된 각 그룹의 증식된 총 NK 세포수 및 분화된 NK 세포의 비율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.

구성요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.

본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우 '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 말초혈액으로부터 PBMC의 분리

EDTA를 포함한 진공채혈관을 이용하여 건강한 공여자로부터 말초혈 30 mL을 수득하였다. 상기 수득된 혈액을 15 mL 튜브로 옮기고 3000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 혈청분리관을 이용하여 원심분리 이후 총 3개의 층으로 나뉜 분리층 중 중간에 위치한 세포층을 새로운 15 mL 튜브로 옮겼다. 옮겨진 세포층을 PBS 및 EDTA가 포함된 0.5% BSA 용액을 사용하여 분리한 세포층과 0.5% BSA 용액을 1:3의 비율로 희석하였다. 희석된 세포층을 새로운 15 mL 튜브에 준비된 4 mL의 Ficoll^®-Paque PREMIUM 용액 위로 흘려 올린 후, 원심분리기의 브레이크를 해제한 상태로 4000 rpm에서 30분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 혈청분리관을 이용해 Ficoll^®-Paque층과 혈청층 사이에 위치한 PBMC층을 분리하고, 새로운 50 mL 튜브로 분리된 PBMC 옮겼다. 이후, PBMC를 포함한 튜브에 0.5% BSA 용액을 가득 채우고 세포를 현탁시킨 후 1500 rpm에서 5분간 원심분리를 실시하였고, 원심분리 후 상층액을 제거하는 세척 작업을 2회 실시하였다. PBMC를 이후 다시 0.5% BSA 용액을 이용하여 현탁시킨 후, 현탁액의 일부와 트리판 블루 용액을 혼합하고 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 세포수를 측정하였다. 세포수 측정을 마친 세포를 세포 면역표현형 확인을 위해 0.5 X 10⁶ 개씩 총 6개의 EP-튜브에 분주하였다. 나머지 PBMC는 다시 원심분리 하여 상층액을 제거하고 세포 배양액에 현탁시켜 이후 실시예에서 활용하였다.

실시예 2. 분리된 PBMC의 표현형 확인

0.5 X 10⁶ 개의 PBMC가 분주된 EP-튜브에 1 mL의 0.5% BSA 용액을 첨가 후 1500 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 100 μL의 0.5% BSA 용액을 첨가하여 아래 표 1과 같은 조건으로 항체를 첨가하고, 볼텍싱을 수행하였다.

튜브 1	항체 처리 X (음성 대조군)
튜브 2	FITC 마우스 IgG1 K 이소타입 대조군(BD Pharmingen, 555748)
튜브 3	PE 마우스 IgG1 K 이소타입 대조군 (BD Pharmingen, 555749)
튜브 4	FITC 마우스 항-인간 CD3 (BD Pharmingen, 555332)
튜브 5	PE 마우스 항-인간 CD56 (BD Pharmingen, 555516)
튜브 6	FITC 마우스 항-인간 CD3 (BD Pharmingen, 555332), PE 마우스 항-인간 CD56 (BD Pharmingen, 555516)

항체가 첨가된 각 튜브들을 빛 차단을 위해 호일로 감싼 후 30분간 상온에서 방치하여 염색시켰다. 이후, 각 튜브에 1 mL의 0.5% BSA 용액을 첨가하고 1500 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 다시 1 mL의 0.5% BSA 용액을 첨가하여 1500 rpm에서 5분간 원심분리 함으로써 세척하였다. 세척 후 상층액을 제거하고 0.5 mL의 0.5% BSA 용액을 첨가하여 세포를 현탁시켜, 5 mL FACS 튜브(Falcon, 352052)로 세포를 옮긴 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 이용하여 면역표현형을 확인하였고, 이의 면역표현형을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인한 바와 같이, 분리된 PBMC에는 CD3^-CD56⁺표현형을 가진 NK 세포가 약 20.49%, CD3⁺CD56⁺ 표현형을 가진 NKT 세포가 약 2.83%, CD3⁺CD56^- 표현형을 가진 T 세포가 약 48.46%, 및 CD3^-CD56^- 표현형을 세포가 약 28.38%를 차지하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 계대배양 여부에 따른 PBMC 세포 증식 효과의 확인

실시예 1의 PBMC를 IL-2 (500 Unit/mL), 인간 AB 혈청(5%, v/v), NK MACS 보충액 (1%, v/v), 및 NK MACS 최소 배지로 이루어진 NK MACS ® 배양액을 사용하여 체외 배양하였다. PBMC를 하기 표 2에 나타난 바와 같이 두 그룹으로 나누고, 37°C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 총 21일간 배양하였고, 이의 배양과정을 도 2에 도시하였다.

그룹	접종된 세포 수	7일차 계대 배양 여부
1	2.4 X 10⁶ 세포/4 mL/T25 플라스크 (3 X 10⁵ 세포/500 μL)	계대배양 O
2	2.4 X 10⁶ 세포 /4 mL/T25 플라스크 (3 X 10⁵ 세포/500 μL)	계대배양 X

도 2에 도시된 바와 같이, 그룹 1 및 그룹2 모두, 초기 배양실시(Day 0) 후 6일간 추가적인 배양액 첨가 없이 배양하였다. 배양 7일차에, 그룹 1의 세포를 회수하고 1500 rpm에서 5분간 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하고 NK MACS 배양액으로 현탁 시킨 후 그 중 일부를 트리판 블루 용액과 혼합하여 세포수를 측정하였다. 세포수 측정은 혈구계산판을 이용하여 측정하였다. 세포 수 측정을 마친 세포를 NK MACS 배양액을 이용하여 생존 세포수 기준 5 X 10⁵ 세포/mL로 현탁하고, T75 플라스크에 배양하였다.

그룹 2의 세포는 초기 세포 배양을 진행한 배양액 4 mL의 절반인 2 mL의 NK MACS 배양액을 첨가하여 배양하였다.

배양 10일차에 그룹 1 및 그룹 2 각각의 세포를 회수하고 1500 rpm에서 5분간 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하고 NK MACS 배양액으로 현탁시킨 후, 세포의 일부를 트리판 블루 용액과 혼합하고 혈구계산판을 이용하여 세포수를 측정하였다. 세포수 측정을 마친 그룹 1 및 그룹 2의 세포는 NK MACS 배양액을 이용하여 생존 세포수 기준 5 X 10⁵ 세포 /mL로 현탁하고, T75 플라스크에 배양하였다.

배양 14일차에 그룹 1 및 그룹 2 각각의 세포를 회수하고 1500 rpm에서 5분간 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하고 NK MACS 배양액으로 현탁시킨 후, 세포의 일부를 트리판 블루 용액과 혼합하고 혈구계산판을 이용하여 세포수를 측정하였다. 세포수 측정을 마친 그룹 1 및 그룹 2의 세포는 NK MACS 배양액을 이용하여 생존 세포수 기준 5 X 10⁵ 세포/mL로 현탁하고, T75 플라스크에 배양하였다.

세포수 측정 및 계대배양을 마치고 남은 그룹 1 및 그룹 2의 잔여 세포를 세포 면역표현형 분석에 사용하였다. 이후, 배양 17일차에 세포를 배양한 배양액의 절반에 해당하는 만큼의 NK MACS 배양액을 그룹 1 및 그룹 2에 각각 첨가하였다.

배양 21일차에 각 세포를 회수하고 1500 rpm에서 5분간 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하고 NK MACS 배양액으로 현탁시킨 후, 세포의 일부를 트리판 블루 용액과 혼합하고 혈구계산판을 이용하여 세포수를 측정하였다. 세포수 측정을 마치고 남은 최종 그룹 1 및 그룹 2의 잔여 세포를 세포 면역표현형 분석에 활용하였다.

7일차에 계대 배양을 수행한 그룹 1과 계대배양을 수행하지 않은 그룹 2의 14일 및 21일 차의 세포 수를 비교한 결과를 도 3에 나타내고, 그룹 1과 그룹 2의 배양을 수행한 0일, 10일, 14일 및 21일차의 총 세포수를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 3에서 확인한 바와 같이, 7일차에 계대배양을 수행한 그룹 1은 배양 14일차에는 세포수가 약 6.0 X 10⁸ 개로 나타났으나, 7일차에 계대배양을 수행하지 않은 그룹 2는 배양 14일에 그룹 1 대비 세포 수가 약 1/12배 수준으로 나타나 현저히 적은 것을 확인할 수 있었다. 이는 배양 21일차도 마찬가지로, 배양 7일차에 계대배양을 수행했던 그룹 1의 세포수는 배양 7일차에 계대배양을 실시하지 않은 그룹 2 대비 약 6배이상 많은 것을 확인하였다.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 총 21일간의 배양기간 동안 측정된 각 시점인 배양 0일, 10일, 14일 및 21일차의 총 세포수 결과를 확인한 결과, 7일차에 계대배양을 수행한 그룹 1은 배양 10일 이후부터 세포수가 증가하고, 배양 14일 이후부터 현저하게 증가된 것을 확인하였고, 반면 그룹 2는 매 측정 시 마다 배양된 총 세포수가 그룹 1 대비 현저하게 적은 것을 확인하였다.

이와 같은 결과를 통해, 세포 배양일 기준 7일차에 계대배양을 실시하는 경우, 배양된 세포의 수가 현저하게 증가되므로, 최종적으로 더 많은 수의 세포를 획득할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 계대배양에 따른 PBMC 세포의 NK세포로의 분화효율 증진 효과의 확인

실시예 3의 배양 14일 및 21일차에서 세포를 계수하고, 남은 잔여 세포의 면역표현형을 분석하는 실험을 수행하였다. 세포의 면역표현형은 상기 실시예 2와 방법과 동일하게 분석을 진행하였고, 표 1과 같이 항체를 첨가한 후 FACSCalibur로 면역표현형을 분석하였고, 이의 면역표현형을 도 5에 나타내었다. 이의 면역표현형을 확인하고, 배양 14일 및 21일 차의 NK 세포의 수와 NK세포로의 분화율을 나타낸 결과를 도 6에 나타내었다.

도 5에서 확인한 바와 같이, PBMC를 7일차에 계대배양을 수행하여 14일간 배양한 경우(그룹 1), CD3^-CD56⁺ NK 세포가 약 22.40%, CD3⁺CD56⁺ NKT 세포가 약 9.66%, CD3⁺CD56^- T 세포가 약 67.16%, 및 CD3^-CD56^- 세포가 약 0.48%로 분화가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 7일차에 계대배양을 수행하지 않고 배양한 경우, CD3^-CD56⁺ NK 세포로 약 48.58%, CD3⁺CD56⁺ NKT 세포로 약 10.60%, CD3⁺CD56^- T 세포로 약 42.30%, CD3^-CD56^- 세포로 약 0.51%로 분화가 일어나는 것을 확인하였다.

PBMC를 7일차에 계대배양을 수행하여 21일간 배양한 경우, CD3^-CD56⁺ NK 세포로 약 48.59%, CD3⁺CD56⁺ NKT 세포로 약 17.07%, CD3⁺CD56^- T 세포로 약 33.97%, CD3^-CD56^- 세포로 약 0.36%의 비율로 분화가 유도되는 것을 확인하였고, PBMC를 7일차에 계대배양을 수행하지 않고 21일간 배양한 경우 CD3^-CD56⁺ 세포로 약 85.17%, CD3⁺CD56⁺ NKT 세포로 약 6.53%, CD3⁺CD56^- T 세포로 약 8.20%, CD3^-CD56^- 세포로 약 0.11%의 비율로 분화가 유도되었다. 이와 같은 결과를 통하여 세포 배양일 기준 7일차에 계대배양을 실시하지 않을 경우 계대배양을 실시한 실험군과 비교하여 최종적으로 약 2배 이상 높은 분화율로 PBMC가 NK 세포로 분화가 유도되는 것을 확인할 수 있었다.

도 6에서 확인한 바와 같이, PBMC를 7일차에 계대배양을 수행하여 각각 14일 및 21일간 배양한 경우, 분화가 유도된 총 NK세포의 수 자체는 7일차에 계대배양을 수행하는 그룹 1에서 배양 7일차에 계대배양을 수행하지 않은 그룹 2보다 많은 것을 확인할 수 있었다. 이는 계대 배양을 수행한 경우, 배양으로 인하여 증진된 절대적인 총 세포수가 배양 7일차에 계대배양을 수행하는 경우 높기 때문에 나타나게 된 것으로 해석할 수 있다. 다만, NK세포로의 분화율은 배양 7일차에 계대배양을 수행하지 않은 그룹 2가 배양 이후 14일 및 21일에서 모두 그룹 1보다 약 2배정도 높은 것으로 확인되었다.

종합적으로, PBMC의 배양 7일차에 계대배양을 수행하지 않는 경우, PBMC의 NK세포로의 분화 효율의 증진을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었고, PBMC의 배양 7일차에 계대배양을 수행할 경우, 절대적인 총 세포수가 증가하여 최종적으로 확보될 수 있는 NK 세포수가 증가됨을 확인할 수 있었다.

Claims

a) 개체의 생물학적 시료로부터 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood-derived mononuclear cell : PBMC)을 수득하는 단계;
b) 수득된 말초 혈액 단핵 세포를 접종하고 배양액에서 배양하는 단계; 및
c) 배양 10일 내지 16일차에 계대 배양을 2 내지 5회의 계대배양을 수행하는 단계를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포로부터 자연살해세포(natural killer cell : NK cell)세포로의 분화 또는 증식을 증진시키는 방법.
청구항 1에 있어서, c) 단계 이후 d) 1 내지 2회 배양액을 첨가하고 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, c) 단계의 계대배양은 1 내지 5일 간격을 두고 수행되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, b) 단계에서 접종되는 말초 혈액 단핵세포의 밀도는 4 X 10⁵ 세포/ mL 내지 8 X 10⁵ 세포/ mL인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 말초 혈액 단핵 세포로부터 자연살해세포로의 분화를 증진시키는 방법은 b) 단계 이후 배양 6 내지 8일차에 배양액을 첨가하고 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 5에 있어서, 배양 6 내지 8일차에 배양액을 첨가하고 배양하는 단계는 계대배양이 아닌 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 자연살해세포는 표현형이 CD3^-CD56⁺에 해당하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 말초 혈액 단핵 세포로부터 자연살해세포로의 증식을 증진시키는 방법은 b) 단계 이후 배양 6 내지 8일차에 1회의 계대배양을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법은 총 20 내지 25일간 세포를 배양시키는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, c) 단계에서 계대배양시에 세포는 생존세포 수 기준 4 X 10⁵ 세포/ mL 내지 8 X 10⁵ 세포/ mL의 밀도로 현탁되는 것인 방법.