KR100702862B1 - 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 이용한조혈모세포/전구세포의 체외 성장 및 증식방법 - Google Patents

제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 이용한조혈모세포/전구세포의 체외 성장 및 증식방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조혈모세포/전구세포 배양시 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 하여 공동배양하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법을 제공한다.
본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법은 별도의 싸이토카인을 사용하지 않고 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 하여 공동배양함으로써, 조혈모세포/전구세포 배양시 전체 세포에 대한 CD34+ 세포의 비율을 높게 유지하며, 여러 콜로니 형성 세포(CFC, colony forming cells)의 수가 다른 배양조건에 비해 월등히 높은 효과를 나타낸다. 또한, 고가의 싸이토카인을 가하지 않으므로 경제적이고, 싸이토카인에 의한 원치 않는 과분화의 역효과를 배제할 수 있으며, 보다 다량의 안정한 조혈모세포/전구세포를 수득할 수 있는 장점이 있다.
따라서 본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법으로 배양된 조혈모세포/전구세포를 이식에 사용할 경우 효율적인 치료효과를 나타낸다.

Description

제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 이용한 조혈모세포/전구세포의 체외 성장 및 증식방법{Method for ex vivo growth and expansion of hematopoietic stem/progenitor cells using umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells as a cell feeder layer}
도 1은 제대혈 유래 간엽줄기세포의 형태와 분화특성을 관찰한 도로,
a)는 21일 배양 후, b)는 15회 계대 배양 후 관찰한 도,
c)는 ALP (alkaline phosphatase) 발현 관찰을 통한 골아세포로의 분화를 확인한 도,
d)는 세포외 칼슘매질형성 관찰을 통한 골아세포로의 분화를 확인한 도,
e)는 황화 프로테오글리칸 관찰을 통한 연골세포로의 분화를 확인한 도,
f)는 제 2형 콜라겐 면역염색을 통한 연골세포로의 분화를 확인한 도,
g)는 지질 액포 염색을 통한 지방세포로의 분화를 확인한 도이다.
도 2는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 이용하여 배양한 경우, 전체 세포 및 CD34+세포의 체외증식을 관찰한 도로,
a)는 배양 0일, 배양조건 A인 세포, b)는 배양 0일, 배양조건 E인 세포,
c)는 배양 0일, 배양조건 C인 세포, d)는 배양 7일, 배양조건 A인 세포,
e)는 배양 7일, 배양조건 E인 세포, f)는 배양 7일, 배양조건 C인 세포,
g)는 배양 14일, 배양조건 A인 세포, h)는 배양 14일, 배양조건 E인 세포,
i)는 배양 14일, 배양조건 C인 세포이고,
j)는 배양 14일 동안 배양 조건 A, B, C, D, E, 그리고 F에서 전체 세포 수를 비교한 도이고,
k)는 배양 14일 동안 배양 조건 A, C, 그리고 E에서 전체 세포 수를 비교한 도이며,
l)는 배양 14일 동안 배양 조건 A, B, C, D, E, 그리고 F에서 CD34+ 세포 수를 비교한 도이다.
(●: 배양조건 A, ○: B, ▼: C, △: D, ■: E, □: F)
도 3은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 이용하여 배양한 경우, 조혈전구세포의 배양조건, 배양일수에 따른 콜로니 계수 결과를 나타낸 도로서,
a)는 CFU-GM (colony forming unit-granulocyte, macrophage), b)는 CFU-GEMM (colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, macrophage, megakaryocyte), c)는 BFU-E (burst forming unit-erythrocyte), d)는 CFU-E (colony forming unit-erythrocyte)의 계수 결과이다.
(●: 배양조건 A, ○: B, ▼: C, △: D)
도 4는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 이용하여 배양한 경우, CFU-Mk (colony forming unit-megakaryocyte)의 체외증식을 관찰한 도로,
a)는 배양조건 A, 배양 7일인 세포, b)는 배양조건 A, 배양 14일인 세포,
c)는 배양조건 B, 배양 7일인 세포, d)는 배양조건 B, 배양 14일인 세포,
e)는 배양조건 C, 배양 7일인 세포, f)는 배양조건 C, 배양 14일인 세포,
g)는 배양조건 D, 배양 7일인 세포, h)는 배양조건 D, 배양 14일인 세포,
i)는 배양조건, 배양일수에 따른 CFU-Mk 콜로니 계수 결과를 나타낸 도이다.
(●: 배양조건 A, ○: B, ▼: C, △: D)
도 5는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 이용하여 배양한 경우, 자갈 모양 유사영역(cobble stone-like area)과 세포영양막 점착성 세포의 특징을 관찰한 도로,
a)는 배양조건 C에서의 자갈모양 유사영역을 현미경으로 관찰한 도이고,
b) 및 c)는 세포영양막 점착성 세포를 CD45 및 CD44 항체로 유세포 분석한 도이고,
d) 및 e)는 세포영양막 점착성 세포에서의 거핵세포/혈소판 전구세포를 각각 7일째, 14일째에 관찰한 것이고,
f)는 상기 d), e) 관찰결과 104 세포당 GP(glycoprotein) Ⅱb/Ⅲa 항체에 양성인 세포의 빈도를 나타낸 도이다.
도 6은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 이용하여 배양한 경우 증식된 조혈모세포의 유세포 분석결과로, 각 배양조건 및 유세포 분석내용은 다음과 같다.
a) 및 b)는 배양조건 B, CD33/CD34로 유세포 분석한 결과,
c) 및 d) : 배양조건 C, CD33/CD34, e) 및 f) : 배양조건 D, CD33/CD34,
g) 및 h) : 배양조건 B, CD38/CD34, i) 및 j) : 배양조건 C, CD38/CD34,
k) 및 l) : 배양조건 D, CD38/CD34, m) : 배양조건 B, CD13/CD34,
n) : 배양조건 C, CD13/CD34, o) : 배양조건 D, CD13/CD34,
a), c), e), g), i), k)는 배양 7일째, b), d), f), h), j), l), m), n), o)는 배양 14일째의 결과도이다.
도 7은 제대혈 유래 간엽줄기세포에서 조혈성 싸이토카인들의 발현을 확인한 도로,
a)는 제대혈 유래 간엽줄기세포에서, b)는 골수 유래 간엽줄기세포에서 여러 싸이토카인의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과이고,
c)는 제대혈(a) 또는 골수(b)유래의 간엽줄기세포에서 IL-1β 및 GM-CSF를 면역블롯 분석한 도이다.
본 발명은 조혈모세포/전구세포의 체외 성장 및 증식방법에 관한 것이다.
인간의 골수(bone marrow)는 조혈모세포이식(hematopoietic stem cell transplantation)을 위한 자원으로 가장 잘 알려져 있지만, 적합한 조직적합성항원 (human leukocyte antigen, HLA)이 일치하는 기증자를 찾기 어렵고, 골수 채취시 관혈적 수술로 인한 통증(invasiveness) 때문에 많은 연구자들이 조혈모세포이식을 위한 다른 공급원을 찾고자 연구를 진행하고 있다.
제대혈(umbilical cord blood, UCB)은 이식 가능한 조혈모세포(hematopoietic stem cells, HSCs)의 확실한 자원으로 십여 년 전부터 그 중요성이 증대되고 있다 [Broxmeyer HE, et al. (1989) Proc Natl Acad Sci U S A 86: 3828-3832]. 이전에 보고된 연구 결과들은 제대혈과 골수에서 확인된 조혈모세포를 자세히 비교하여 아래와 같은 몇몇 중요한 차이를 보고하였다.
1) 골수에서보다 제대혈에서 CFU-GEMM(colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, macrophage, megakaryocyte) 수가 현저히 높다 [Mayani H, et al. (1998) Stem Cells 16: 127-135].
2) 골수에서보다 제대혈에서 BFU-E(burst forming unit-erythroid)가 더 높은 빈도를 보인다 [Mayani H, et al. (1998) Stem Cells 16: 127-135; Hows JM, et al. (1992) Lancet 340: 73-76; Steen R, et al. (1994) J Hematother 3: 253-262].
3) 골수에서보다 제대혈에서 CFU-Mk(colony forming unit-megakaryocyte)가 높은 빈도를 보인다 [Hows JM, et al. (1992) Lancet 340: 73-76].
따라서 위와 같은 보고들을 종합해 볼 때, 제대혈이 어른 골수보다 미성숙한 조혈모세포/전구세포의 비율이 높다고 할 수 있다 [Mayani H, Lansdorp PM (1998) Stem Cells 16: 153-165]. 또한, 제대혈의 조혈모세포는 비혈연 골수 이식의 경우에 비하여 비혈연 제대혈 이식에서 공여자와 수여자간의 급성 혹은 만성 이식편대숙주 질환(graft-versus-host disease, GVHD)의 빈도가 낮기 때문에, 조직적합성항원이 불일치하는 경우에도 사용이 용이하다 [Kurtzberg J, et al. (1996) N Engl J Med 335: 157-166; Gluckman E (2000) Exp Hematol 28: 1197-1205].
그럼에도 불구하고, 한 공여자의 제대혈에서 획득 가능한 제대혈 유래 조혈모세포의 전체 수가 한정적이므로 대부분의 수여자는 소아들에 국한된다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위한 수단으로 제대혈 유래 조혈모세포의 체외증식(ex vivo expansion)이 대량의 제대혈 유래 조혈모세포를 얻기 위하여 제시되고 있다 [Broxmeyer HE, et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89: 4109-4113].
예를 들면, 제대혈 유래 조혈모세포와 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cells, HPCs)들은, 재조합 싸이토카인이 첨가된 상태에서 세포영양막(cell feeder layer)과 함께 공동배양하면 충분히 체외 증식이 가능하다는 보고들이 있다 [Slovick FT, et al. (1984) Exp Hematol 12: 327-338 ; Kohler T, et al. (1999) Stem Cells 17: 19-24; McNiece IK, et al. (2002) Exp Hematol 30: 612-616]. 이러한 목적에 사용된 재조합 싸이토카인들로 Flk-2/Flt-3 ligand (FL), stem cell factor (SCF), thrombopoietin (TPO), granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), megakaryocyte growth and development factor (MGDF), interleukin-3 (IL-3), and interleukin-6 (IL-6)이 있다 [Petzer AL, et al. (1996) J Exp Med 183: 2551-2558; McNiece I, et al. (2000) Exp Hematol 28: 1181-1186; Conneally E, et al. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94: 9836-9841; Ueda T, et al. (2000) J Clin Invest 105: 1013-1021].
그러나, 이러한 체외 증식에 사용되는 싸이토카인들은 조혈모세포를 하부 계열의 성숙한 혈액세포로 불필요하게 분화시킬 수 있는 잠재성과 이로 인하여 치료효과를 감소시킬 가능성이 있다 [Ye ZQ, et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91: 12140-12144].
또한, 싸이토카인에 의한 장기간 착상(long-term engrafting) 세포의 감소 [McNiece IK, et al. (2002) Exp Hematol 30: 612-616] 등은 여전히 과연 그러한 체외증식에 재조합 싸이토카인을 사용하는 것이 어떠한 부정적인 영향을 미치는가 하는 의문을 남기고 있으며, 이에 더하여 조혈모세포/전구세포 배양시 사용하는 싸이토카인은 임상적으로 이식시 그 부작용으로 인한 감염의 위험성이나 종양발생에 대한 여러 가지 문제점을 갖고 있다.
반면에, 체외증식을 위해 재조합 싸이토카인 없이 세포영양막만을 사용한 한 보고에서는 조혈모세포의 수적인 증가에 긍정적인 결과를 얻지 못하기도 하였다[Chivu M, et al. (2004) J Cell Mol Med 8: 223-231].
또한, 재조합 싸이토카인의 첨가와 함께 인간 태반, 골수 또는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 영양막으로 이용한 조혈모세포의 체외증식에 대한 보고들은 있으나[Zhang Y, et al. (2004) Exp Hematol 32: 657-664; Wang JF, et al. (2004) Haematologica 89: 837-844], 이들은 세포영양막과 재조합 싸이토카인의 동시사용에 의한 것으로 최대 증식을 위한 양적인 시너지 효과에만 중점을 둘 뿐이다.
이에 본 발명은 싸이토카인을 인위적으로 가하지 않는 상태로 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 사용하여 조혈모세포/전구세포를 체외증식시킴으로써 CD34+ 세포 뿐만 아니라 각종 조혈전구세포가 유의하게 높게 증식됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 싸이토카인을 인위적으로 가하지 않고, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 사용하여 조혈모세포/전구세포를 배양함으로써 조혈모세포/전구세포를 체외 성장 및 증식시키는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 하여 공동배양하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법을 제공한다.
본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법은,
1) 제대혈, 골수 또는 말초혈액으로부터 조혈모세포/전구세포를 분리하는 단계; 2) 제대혈로부터 단핵구세포를 분리하여 배양하는 단계; 3) 상기 2)단계의 배양된 세포로부터 간엽줄기세포를 분리하는 단계; 4) 상기 3)단계에서 분리된 간엽줄기세포를 따로 배양한 후 이를 불활성화하는 단계; 5) 상기 4)단계의 간엽줄기세포를 세포영양막으로 하여 배양하면서 상기 1)단계의 세포를 첨가하여 공동배양하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법을 제공한다.
1) 제대혈, 골수 또는 말초혈액으로부터 조혈모세포/전구세포 특이 항원에 대한 항체와 반응시켜 세포 분리기에서 조혈모세포/전구세포를 분리하는 단계; 2) 제대혈로부터 단핵구세포를 분리하여 배양하는 단계; 3) 상기 2)단계의 배양한 세포를 간엽줄기세포 특이항원에 대한 항체와 반응시켜 세포분리기에서 간엽줄기세포를 분리하는 단계; 4) 상기 3)단계에서 분리된 간엽줄기세포를 배양 후 불활성화시키는 단계; 5) 불활성화시킨 간엽줄기세포에 상기 1)단계에서 분리된 조혈모세포/전구세포를 가하여 공동배양하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 "제대혈"은 포유동물에서 태반과 태아를 연결하는 탯줄로부터 수집된 혈액으로 정의된다. 본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법에서는 인간의 제대혈을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "조혈모세포/전구세포"라 함은 적혈구, 백혈구, 혈소판을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만, 생리적으로 혹은 여러 조작을 통해서 말초혈액 혹은 출생 후 제대혈에서 채취할 수 있는 세포를 의미한다.
본 발명에서 "간엽줄기세포"라 함은 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지 만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다.
본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법에서 세포의 배양은 동일한 배양기에서 지속적으로 세포를 유지해야 한다.
본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법 1) 단계에서 사용하는 조혈모세포/전구세포 특이 항원에 대한 항체는 CD34, HLA-DR, CD38, CD45RA, CD71, Thy-1(CD90), c-kit(CD117), FLT(CD135), CD133 등에서 선택된 하나 이상의 항원에 대한 항체를 의미한다. 이 항체와 반응시킨 다음, 세포분리기를 이용하여 해당 항체와 결합한 세포들을 분리하여 본 발명의 조혈모세포/전구세포를 수득할 수 있다. 수득된 세포는 상기 해당 조혈모세포/전구세포 특이 항원 양성인 면역표현형을 갖는다. 이와 같은 조혈모세포/전구세포는 제대혈 뿐만 아니라, 골수, 말초혈액으로부터 채취, 분리되어 본 발명의 방법에 적용할 수 있다.
본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법 3) 단계에서 사용하는 간엽줄기세포 특이 항원에 대한 항체는 CD73, CD29, CD44, CD13, CD105 등에서 선택된 하나 이상의 항원에 대한 항체를 의미한다. 이 항체와 반응시킨 다음 세포 분리기를 이용하여 해당 항체와 결합한 세포들을 분리하여 본 발명의 간엽줄기세포 를 수득할 수 있다. 또한, 플라스틱 세포 배양 용기에 대한 특이적인 점착성을 이용하여 분리하거나, 위 두 가지 방법을 병행하여 수득할 수 있다.
수득된 세포는 CD73+, CD45-, CD34-, CD14-, HLA-DR-, CD29+, CD31-, CD44+, CD13+, CD51/61-, CD90-의 표현형을 보인다.
상기에서 수득된 본 발명의 제대혈 유래 간엽줄기세포는 특정 분화조건 하에서 정상적인 간엽줄기세포의 분화능을 나타내고, 구체적으로 골아세포, 연골세포, 지방세포로의 다분화능을 보유하고 있다. 또한, IL-1α, IL-6, IL-7, LIF (leukemia inhibitory factor), FL, TPO, SCF, c-kit, M-CSF, IL-1β 및 GM-CSF을 포함한 다양한 조혈성 싸이토카인을 자체적으로 발현하고, 특히 골수와 같이 유래가 다른 간엽줄기세포와는 상이하게 IL-1β 및 GM-CSF를 발현한다. 제대혈 유래 간엽줄기세포는 세포영양막으로 사용됨으로써 조혈성 미세환경과 싸이토카인을 제공하여 조혈모세포/전구세포의 체외증식을 가능케 한다.
본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법 4) 단계에서, 제대혈 유래 간엽줄기세포는 적정 배양조건에서 계대배양한다.
또한, 조혈모세포/전구세포와 공동배양하기 전에, 배양한 간엽줄기세포가 배양용기에 채워질 정도로(confluently) 증식시 마이토마이신 C로 간엽줄기세포를 불활성시킨다.
본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법 5) 단계에서는, 조 혈모세포/전구세포 배양시 싸이토카인을 인위적으로 가하지 않고, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 사용하며, 또한, 상기 불활성화된 간엽줄기세포에 조혈모세포/전구세포를 가하여 배양한다.
본 발명에서 사용하는 조혈모세포/전구세포 및 제대혈 유래 간엽줄기세포의 비율은 1:5에서 1:20 이고 1:7이 바람직하다.
본 발명에서 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 하여 조혈모세포/전구세포를 배양하는 기간은 3 ~ 10일이 될 수 있으며, 5 ~ 8일이 바람직하며, 7일이 가장 바람직하다. 또한, 배양시에는 간엽줄기세포 배양을 시작한 동일한 배양기에서 지속적으로 세포를 유지하고, 3 ~ 4일에 한 번씩 배지의 일정량, 바람직하게는 1/5 ~ 1/3, 더욱 바람직하게는 1/4 정도만 제거하고 이에 대응하는 양만큼 새로운 배지를 넣어줌으로써 조건화된 배지(conditioned media)를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 체외 성장 및 증식방법에서는, 배양시 세포영양막 위에 자갈모양 유사영역(cobble stone-like area)이 형성되는 것이 관찰된다. 이러한 영역은 세포영양막에 점착성인 세포들에 의한 것이며, 이들 자체도 조혈모세포/전구세포의 활성도가 매우 높을 뿐 아니라, 이들로부터 계속적으로 높은 증식과 성장이 이루어지고, 특히 CFU-Mk가 이러한 세포영양막 점착성 세포에 의존적 증식양상을 나타낸다.
이렇게 본 발명의 체외 성장 및 증식방법에 따라 배양하여 수득된 조혈모세포/전구세포는, 콜로니 형성 세포(CFC), 즉 CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, CFU-E, CFU- Mk 이 증가되어 빈도가 높게 나타난다.
콜로니 형성 세포는 이식 이후에 체내에서 분화되어 실질적인 조혈모세포/전구세포 이식효과를 나타낼 수 있는 세포로서, 콜로니 형성 세포의 빈도가 높을수록 이식으로 인한 치료효과가 뛰어나게 된다. 따라서, 본 발명의 체외 성장 및 증식방법에 따라 배양하여 수득된 조혈모세포/전구세포를 사용하여 이식시 치료효과의 향상이 기대된다.
또한, 본 발명의 체외 성장 및 증식방법에 따라 배양하여 수득된 조혈모세포/전구세포는, CD33-CD34+, CD38+CD34+ 및 CD13+CD34+ 세포에 대하여 높은 빈도를 나타낸다.
본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법은 배양시 싸이토카인을 세포영양막과 병용하는 경우에 비하여, 전체 세포증가배수에 대한 CD34+세포 증가배수에서 높은 수치를 나타내며, 조혈모세포/전구세포의 콜로니 형성 세포의 빈도를 증가시키는 결과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 골수 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 사용한 경우보다 본 발명에서의 제대혈 유래 간엽줄기세포를 사용한 경우가 전체세포 및 CD34+ 세포수 증가에 뛰어난 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 체외 성장 및 증식방법에서와 같이 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 사용하고 싸이토카인을 사용하지 않는 경우(실시예 배양조건 C)는 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 사용하고 싸이토카인을 사용하는 경우(실시예 배양조건 D)에 비하여, 전체 세포 증가 배수에 대한 CD34+세포 증가배 수에서 높은 수치를 나타내며, 조혈모세포/전구세포에서 콜로니 형성 세포 (CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, CFU-E, CFU-Mk)의 빈도가 증가하는데 탁월하다.
또한, 본 발명의 체외 성장 및 증식방법에 따라 조혈모세포/전구세포를 배양함으로써 모든 조혈모세포/전구세포, 즉, CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, CFU-E, CFU-Mk의 빈도가 탁월하게 상승되며, 이 중 CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, CFU-E는 배양 7일째에 최고의 콜로니수를 나타내고, 이후에 감소하는 양상을 나타낸다. CFU-Mk의 경우 배양 7일째에 가장 증가하고 배양 14일째까지 다른 전구세포에 비해 지속적으로많은 콜로니수를 유지하는 양상을 보인다. 본 발명의 체외성장 및 증식방법은 CFU-Mk에 대하여 우수한 체외증식능을 나타낸다.
또한, 본 발명의 체외성장 및 증식방법에 따라 배양된 조혈모세포/전구세포는 배양 7일 및 14일째에 CD33-CD34+, CD38+CD34+ 및 CD13+CD34+ 세포의 높은 빈도를 나타내며, CD33-CD34+세포들이 더 잘 유지되는 양상을 나타낸다.
본 발명의 1) 단계 및 3) 단계에서 사용하는 세포분리기는 형광세포분리기 또는 마그네틱 세포분리기를 사용할 수 있고, 세포를 분리할 때 사용하는 세포특이적 항원에 대한 항체는 세포분리기의 특성에 따라 적절한 표식 물질을 부착하여 사용한다. 구체적으로, 마그네틱 세포분리기를 사용할 때에는 마그네틱 미세비드(magnetic microbead)가 부착된 항체를 사용하고, FACsorter를 사용할 때에는 FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), PerCP 등의 형광물질이 부착된 항체를 사용한다.
또한, 본 발명에서 세포배양은 세포의 종류에 따라 적절한 세포배양배지를 사용하여 일정시간 및 통상적인 배양조건(온도, 습도, CO2, 무균환경 등) 하에서 배양한다. 세포배양배지로 DMEM, α-MEM(minimum essential medium), Iscove's modified Dulbecco's 배지(IMDM), Iscove's MEM, 메틸셀룰로스 배지, McCoys 5A 배지, Eagle's basal 배지, CMRL 배지, Glasgow 최소 필수 배지, Ham's F-12 배지, Liebovitz' L-15 배지, RPMI 1640 배지 등 일반적으로 사용되는 세포배양용 배지 중 선택된 하나를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하는 세포배양 배지는 상기 성분 이외에도 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 그 예로, 우태혈청(fetal bovine serum, FBS), 우혈청알부민(bovine albumin serum, BSA) 또는 배지의 오염을 막기 위한 항생제(antibiotics) 및 항진균제(anti-fungal agent)가 있고, 구체적으로 페니실린 G(penicillin G), 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), 암포테리신 B(amphotericin B), 젠타마이신(gentamycin), 또는 니스타틴(nystatin) 등을 추가할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 제대혈 유래 조혈모세포/전구세포는 제대혈에서 분리 후에 사용하며, 제대혈 유래 간엽줄기세포는 α-MEM 배지가 바람직하며, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 하여 제대혈 유래 조혈모세포/전구세포를 체외증식할 때에는 IMDM 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외 성장 및 증식방법은 별도의 싸이토카인을 사용하지 않고, 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 하여 공동배양함으로써 싸이토카인에 의한 원치 않는 과분화의 역효과를 배제할 수 있고, 조혈모세포/전구세포 배양시 전체 세포에 대한 CD34+ 세포의 비율을 높게 유지하며, 여러 콜로니형성세포(CFC)의 수가 다른 배양조건에 비해 월등히 높은 효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 체외 성장 및 증식방법으로 배양된 조혈모세포/전구세포를 이식에 사용할 경우, 기존의 배양방법으로 제조된 동량의 세포에 비하여 이용가능한 조혈모세포/전구세포의 실질적인 수가 많으므로 이식의 효율적인 치료효과를 나타낸다.
또한, 본 발명은 조혈모세포/전구세포의 체외 성장 및 증식시, 고가의 싸이토카인을 가하지 않으므로 경제적이며, 이식시 문제를 발생시킬 수 있는 싸이토카인과 같은 성장인자 및 호르몬의 첨가를 배제함으로써 보다 다량의 안정한 조혈모세포/전구세포를 수득할 수 있는 장점이 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예1 ] 제대혈 유래 조혈모세포/전구세포 및 간엽줄기세포의 준비
(1-1) 제대혈 유래 조혈모세포/전구세포의 제조
인간 제대혈은 보통 만기 임신의 출산에서 산모의 서면동의를 얻은 후 취하였다.
제대혈 유래 조혈모세포/전구세포를 얻기 위하여 먼저 제대혈을 3000 rpm으로 30분간 원심분리하여 백혈구층을 분리한 다음, 이를 2mM EDTA 및 2% FBS가 포함된 PBS에 현탁하고, 히스토팩(Histopaque, 1.077g/㎖, Sigma-Aldrich사, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 30~35분 동안 400 g로 밀도기울기 원심분리기를 이용하여 단핵세포를 분리하였다.
분리한 단핵세포로부터 CD34+ 농축된 세포들(CD34+ enriched cells)은 MACS 시스템 (automagnetic activated cell sorting system, Miltenyi Biotec)을 제조회사의 사용설명서에 따라 분리하였다. 이 결과로 수득된 CD34+ 농축된 세포들에서 CD34+ 세포들의 평균비율은 유세포분석기 (flow cytometric analysis)에서 보통 95% 이상의 비율을 보였다.
(1-2) 제대혈 유래 간엽줄기세포의 제조
간엽줄기세포는 양 등의 방법(Yang SE, et al. (2004) Mesenchymal stem/progenitor cells developed in cultures from UC blood. Cytotherapy 6: 476-486)에 의해 인간 제대혈로부터 배양되어 분리하였다.
간단하게는, 상기 (1)의 제대혈에서 분리한 단핵세포를 단층배양하여 얻은 세포들을 간엽줄기세포의 특이적 성질인 플라스틱 배양 용기에의 점착성을 이용하여 분리한 후, 간엽줄기세포 특이 항원 CD105에 대한 항체와 반응시키고, 세포분리 기를 이용하여 해당 항체와 결합한 세포들을 분리하여 제대혈 유래 간엽줄기세포를 수득하였고, 이를 배양하였다.
PoieticsTM 골수 유래 인간 간엽줄기세포는 캠브렉스사(Cambrex Inc., Walkersville, MD, USA)에서 구입하였으며 제대혈 유래 간엽줄기세포와의 비교에 사용되었다.
이후 실험에서 세포영양막으로 사용하기 위해, 제대혈 유래 (또는 골수유래, 비교용) 간엽줄기세포를 1 × 104/cm2 농도로 6-웰 플레이트에서 배양하였다(37 ℃, humidified CO2 incubator).
배지는 10%, 열에 의해 불활성화된 우태혈청(Gibco사)과 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, 100 unit/㎖, Gibco사)이 포함된 α-MEM(α-minimum essential medium, Gibco사, Grand Island, CA, USA)을 사용하였으며, 세포가 웰의 90%이상 채워졌을 때 계대 배양하였다.
간엽줄기세포의 불활성화는 10 ㎍/㎖ mitomycin C (Sigma-Aldrich사)에서 37 ℃, 2.5시간 반응시켜 수행하였다.
세포영양막으로 사용하기 위하여 분리해 둔 CD34+ 세포들은 혈청이 없는 IMDM(Iscove's modified Dulbecco's media, Gibco사)으로 두 번 씻은 후 사용하였다.
하기 실시예에서 세포 배양은 당업계에 통상적인 세포배양조건인 37 ℃, humidified CO2 incubator에서 수행되었다.
또한, 이하 실시예의 결과는 평균값 또는 평균값 ± 표준편차값으로 표시하였다. 다른 그룹에 대한 통계적 유의성을 비교하기 위해서 paired t-test를 수행하였다. 95% 의 신뢰도로 선택하였고, P < 0.05는 ANOVA 분석에 의해 통계적인 유의성으로 인정하였다.
(1-3) 제대혈 유래 간엽줄기세포의 다양한 계통 분화 잠재능 확인
본 발명의 제대혈 유래 간엽줄기세포의 분화 가능성을 확인하기 위해, 골아세포, 연골세포와 지방세포를 포함한 다양한 세포 형태로의 분화 잠재능을 양 등의 방법(Yang SE, et al. (2004) Cytotherapy 6: 476-486)을 이용하여 분석하였다.
상기 (2)의 제대혈 유래 간엽줄기세포를 21일 배양 및 15번 계대 배양시키고 하기와 같은 특정 조건하에서 세포를 자극한 후, 세포형태와 면역조직화학적 방법으로 분석하였다.
골아세포로의 분화능을 확인하기 위해서, 덱사메타손(dexamethasone), β-글리세롤 포스페이트, 아스코르브산(ascorbic acid), 10% 우태혈청이 첨가된 배지조건에서 4주간 배양하여, von Kossa's 염색과 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)의 발현으로 확인하였다.
연골세포로의 분화능을 확인하기 위해서는, 분화유도전에 세포를 원심분리하여 세포덩어리를 만든 후, 우태혈청이 없는 배지조건하에서 TGF-β, BMP-6등을 첨 가하여 6주간 배양하였고, 사프라닌-O(safranin-O) 염색과 제2형 콜라겐의 발현으로 확인하였다.
지방세포로의 분화능을 확인하기 위해서는, IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine), 덱사메타손, 인슐린, 인도메타신(indomethacin), 10% 우태혈청이 첨가된 배지조건하에서 4주간 배양하였고, 오일 레드 O (Oil red O) 염색을 통해 확인하였다.
도 1의 결과를 보면, 간엽줄기세포는 양극성의 섬유아세포 형태로, 21일 배양 (도 1a)과 15회까지 계대 배양 (도 1b)하여도 형태학적으로 차이를 보이지 않았다 (200X 확대).
골아세포 분화 조건에서 배양된 간엽줄기세포는 4주 후에 ALP 발현(붉은 색)을 나타내었고 (도 1c, 100X 확대), von Kossa's 염색에 의하여 세포외 칼슘기질 (extracellular calcium matrix) 형성 (검은색) 증가를 확인함으로써 (도 1d, 100X 확대), 골아세포로 분화함을 알 수 있었다.
연골세포로의 분화 조건에서 배양된 간엽줄기세포는 6주 후에 분화된 세포에서 사프라닌 O 염색에 의하여 황화 프로테오글리칸 (sulfated proteoglycan) 축적(붉은 색)과 제2형 콜라겐 면역염색(오렌지색)에 의해 분화를 확인할 수 있었다 (도 1e, 1f, 200X 확대).
지방세포로의 분화 조건에서 배양된 간엽줄기세포는 분화 후, 세포 내 지방소포가 관찰되었고, 이 지방소포는 오일 레드 O 염색에 의해 세포내 지질이 풍부한 액포의 축적(붉은 색)으로 확인됨으로써 분화를 확인하였다 (도 1g, 200X 확대).
이러한 결과들을 통해, 본 발명의 체외 성장 및 증식방법에 사용된 제대혈 유래 간엽줄기세포가 다분화능을 보유하고 있음을 확인하였다.
이러한 제대혈 유래 간엽줄기세포가 전체 조혈모세포/전구세포와 CD34+세포의 증식을 지지할 수 있는지 확인하기 위해, 여러 조건에서 조혈모세포/전구세포를 배양하여 비교하였다.
(1-4) 다양한 배양조건에서의 전체 혈구세포수와 CD34+ 세포수 증가 확인
상기 실시예 (1-1)에서 수득된 1.2 ×105 CD34+ 농축된 세포를 1 ×104 cells/㎖ 농도로 아래와 같은 6가지 배양 조건에서 IMDM 배지로 14일간 체외 증식, 배양되었다.
(a) 배양조건 A (대조군) : 세포영양막과 재조합 싸이토카인 (100ng/㎖ 재조합 인간(rh) SCF, 100ng/㎖ rh IL-6, 50ng/㎖ rh FL, 10ng/㎖ rh TPO로 구성)없이 배양한 것.
(b) 배양조건 B (비교군) : 세포영양막 없이 상기 재조합 싸이토카인들을 첨가하여 배양한 것.
(c) 배양조건 C (본 발명의 실시예 군) : 재조합 싸이토카인 첨가없이 세포영양막으로 제대혈 유래 간엽줄기세포를 사용한 것.
(d) 배양조건 D (비교군) : 재조합 싸이토카인 첨가해서 세포영양막으로 제 대혈 유래 간엽줄기세포를 사용한 것.
(e) 배양조건 E (비교군) : 재조합 싸이토카인 첨가없이 세포영양막으로 골수 유래 간엽줄기세포를 사용한 것.
(f) 배양조건 F (비교군) : 재조합 싸이토카인 첨가해서 세포영양막으로 골수 유래 간엽줄기세포를 사용한 것.
조혈모세포/전구세포 일정 개수 1×104 cells/㎖ 에 대한 세포영양막의 세포수는 1:5에서 1:20의 비율 (1:7의 비율이 가장 바람직함)에 해당되는 간엽줄기세포를 5~10일전에 선배양하여 불활성화 처리 후, c, d, e, f의 경우는 세포영양막으로 사용하였다.
조혈모세포와 간엽줄기세포를 배양하기 전, 먼저 간엽줄기세포를 먼저 6 혹은 12 웰 플레이트에서 배양하고 각 웰이 세포로 채워지면 10㎍/㎖의 마이토마이신 C을 2.5시간 동안 처리하여 간엽줄기세포를 불활성화시켰다. 그 다음, 불활성화된 간엽줄기세포에 CD34+ 세포를 웰 당 2×104 세포를 넣어주어 공동배양하였다.
세포배양은 시작과 동일한 배양기에서 지속적으로 세포를 유지하면서 배지를 일부분 새로운 배지로 교환해주는 방법을 사용하였다.
재조합 싸이토카인을 첨가하는 b, d, f의 경우는, 배양시 3, 4일마다 10% 우태혈청과 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 IMDM에 재조합 싸이토카인을 함유하는 배양액을 가해주었다.
a, c, e의 경우는 신선한 배양액(10% 우태혈청과 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 IMDM)을 배양시 3, 4일마다 기존 배양액의 4분의 1의 양 만큼 교환해 주면서 배양하였다.
배양 시작 전이나 4, 7, 10, 14일 배양 후, 전체 세포수를 측정하고, MACS 분리기를 사용하여 CD34+ 세포를 분리하였다. 분리 후, CD34+ 세포의 평균 비율은 98.7% 였다.
또한, 확장 배수는 배양 시작 전 계수한 세포수와 일정 기간 배양한 후의 계수된 세포수를 비교하여 산출하였다.
그 결과, 재조합 싸이토카인을 사용하여 배양한 배양조건 B, D, F 에서는, 세포영양막의 유무에 상관없이 1.2 × 105개의 세포를 14일간 배양시 A, C, E와 비교하여 전체 세포수를 300배까지 증가시킬 수 있었다 (도 2 j).
재조합 싸이토카인이 없는 배양조건인 A, C, E를 좀더 정확히 평가하기 위해, Y축에서 다른 범위를 갖는 도 2k를 도 2j에서 그래프화하였다.
재조합 싸이토카인의 사용에 의해 큰 폭으로 전체 세포수가 증가되었지만, 배양조건 C, E에서도 재조합 싸이토카인 없이 제대혈 또는 골수 유래 간엽줄기세포로 이루어진 세포영양막만으로도 배양조건 A와 비교하여 각각 15.2 × 105 (약 12.6배) 및 8.6 × 105 (약 7.17배)로 전체 세포수가 증가되었다 (n=6)(도 2a, 2d, 2g: 배양조건 A; 도 2b, 2e, 2h: 배양조건 E; 도 2c, 2f, 2i: 배양조건 C, 도 2k).
또한, 14일간 배양한 후에 CD34+ 세포를 MACS를 이용하여 분리하였을 때, CD34+ 세포수는 배양조건 C, E에서 각각 2.25배 (n=2), 2.0배(n=2) 증가하였고, 배 양조건 B, D, F에서 CD34+ 세포의 증가율은 배양조건 C, E 보다 높았다 (도 2l). 배양조건 A에서 CD34+ 세포수는 계속적으로 감소하였다(n=6) (도 2a, 2b, 2c: 배양 0일, 2d, 2e, 2f: 배양 7일, 2g, 2h, 2i: 배양 14일, 도 2j, 2k, 2l).
[실시예 2] 전체 혈구세포수 증가 배수에 대한 CD34+ 세포의 증가 배수 비교
실시예 (1-4)의 배양조건 C에서 조혈모세포/전구세포의 비-CD34+ 세포로의 원치않는 분화의 확인[Ye ZQ, et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91: 12140-12144] 및 이를 재조합 싸이토카인을 사용한 배양조건 D의 결과와 비교하기 위해서, 전체세포의 증가 배수에 대한 CD34+ 세포의 증가 배수라는 수치를 확인하였다. 이는 세포들이 증가될 때 CD34+ 세포들이 전체 세포에 대해서 얼마나 잘 증식되는지를 나타낸다.
도 2의 결과를 보면, 본원발명의 전체 세포 중 CD34+ 세포가 차지하는 비율은 배양조건 D에서의 0.76% (전체세포 367배 증가와 CD34+ 세포 2.78배 증가)에 비하여, 배양조건 C에서는 17.8% (전체세포 12.6배 증가와 CD34+세포 2.25배 증가)로 배양조건 C에서 유의하게 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 2k, 2l). 반면, 세포영양막의 존재에 상관없이 전체 세포수를 크게 증가시켰던 재조합 싸이토카인은 CD34+ 세포의 증가율에 영향을 미치지는 않았다 (도 2j, 2l).
이 결과는 재조합 싸이토카인에 의해서 비 CD34+세포로의 분화가 촉진되는 현상을 보여주는 것이다 (도 2j, 2l).
[실시예 3] 콜로니형성세포의 체외 증식능 확인
(3-1) 제대혈 간엽줄기세포 위에서 조혈전구세포의 체외증식
본 발명의 방법에 따른 조혈모세포/전구세포 체외증식능을 시험하기 위해, 콜로니 형성세포 (colony forming cell, CFC) 어세이를 수행하였다.
상기 (1)에서 제조된 1.5 ×103 CD34+ 농축된 세포는 상기 배양 조건 A~D에서 각각 배양되었고, 배양 0, 4, 7, 10, 14일에 CFC 어세이를 수행하였다 (각 배양 조건에 따라 n=4).
형성된 CFU 콜로니를 계수하기 위해서, 각 배양일 후에 취해진 세포들은 30% 우태혈청, 1% 우혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA), 10-4M 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol), 2 mM L-글루타민(L-glutamine), 50 ng/㎖ rh SCF, 10 ng/㎖ rh GM-CSF (granulocyte, macrophage-colony stimulating factor), 10 ng/㎖ rh IL-3 및 3 units/㎖ rh EPO (erythropoietin)이 포함되어 있는 메틸셀룰로스 배지(methylcellulose medium, Stem Cell Technologies사, Vancouver, Canada)에 섞어 35mm 조직 배양용 용기를 이용, 37 ℃, 5% CO2 대기 그리고 습도가 유지되는 상황으로 14일간 더 배양되어 다양한 형태의 조혈전구세포들로 유도되었다.
배양 결과로 형성된 CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E 및 CFU-E는 광학현미경을 사용하여 계수하였고, 결과는 1×104 세포당 콜로니 수로 표현하였다. *는 배양 전에 형 성할 수 있는 CFC 수에 대비해서 통계적으로 유의한 것을 나타낸다 (P<0.05, ANOVA 분석).
도 3a의 결과를 보면, 상기 CD34+ 농축된 세포들은 배양시작 전에 104 세포당 2.27×103 ± 69.3의 CFU-GM을 형성하였다. 배양조건 A에서 CFU-GM은 배양기간 동안 감소하였고, 10일, 14일에는 관찰할 수 없었다. 배양조건 C에서 CFU-GM 콜로니는 배양 7일에 104 세포당 7.87×103 ± 256.2까지 증가하였다. 배양조건 B, D에의 배양 7일에 CFU-GM 값은 104 세포당 1.60×103 ± 187.4, 그리고 2.20×103 ± 149.4였다.
상기 결과를 통해, 재조합 싸이토카인은 CFU-GM 세포수 증가에는 영향을 미치지 않으며, 제대혈 간엽줄기세포 영양막과 재조합 싸이토카인을 동시에 처리하여 배양시 오히려 CFU-GM 세포수를 억제시킴을 알 수 있다. 그러므로, 본원 발명 (배양 조건 C)의 체외 성장 및 증식 방법이 CFU-GM 세포수 증가에 효과가 탁월함을 알 수 있다 (도 3a).
또한, 좀 더 미분화된 원시 조혈모세포/전구세포에 대한 증식능을 확인하기 위해, CFU-GEMM을 관찰하였다. 도 3b의 결과를 보면, 배양 전 104 세포당 46.6 ± 14.9로 관찰되었던 CGU-GEMM은 배양조건 A에서 배양 4일부터는 관찰할 수 없었다. 하지만, 배양조건 C에서 CFU-GEMM은 7일에 104 세포당 458.9 ± 47.0으로 증가되었다 (n=4). 배양조건 B, D에서 배양 7일에 CFU-GEMM 수는 각각 26.6 ± 13.3, 16.6 ± 14.5로 관찰되었다 (도 3b).
또한, BFU-E의 결과로 도 3c을 보면, 배양하기 전 104 세포당 379.1 ± 66.1의 BFU-E 콜로니는 배양 7일에 배양조건 A에서 0개로 감소하였다. 반면, 배양조건 C에서는 배양 7일에 104 세포당 1.38×103 ± 124.5로 증가하였고, 10일, 14일에는 748.1 ± 33.1, 103.1 ± 5.8까지 유지되었다. 배양조건 B, D에서는 7일째에 104 세포당 69.8 ± 19.7, 93.1 ± 18.8로 관찰되었다(n=4) (도 3c).
또한, CFU-E의 결과로 도 3d을 보면, 배양 전에 104 세포당 212.8 ± 54.2의 CFU-E는 배양조건 A에서 점점 감소하여 배양 4일에 0이 되었다. 반면, 배양조건 C에서는 배양 7일에 104 세포당 432.3 ± 36.4까지 증가하였다. 배양조건 B, D에서는 배양 7일에 각각 104 세포당 46.6 ± 20.0, 69.8 ± 5.8로 관찰되었다 (n=4)(도 3d).
또한, 배양조건 C에서 모든 종류의 조혈전구세포의 빈도는 4, 7, 10, 14일의 4가지 배양일 중 배양 7일에 최고 수준에 도달했다.
본 발명의 체외 성장 및 증식방법에 따른 조혈모세포/전구세포 배양은 모든 조혈전구세포의 빈도를 탁월하게 상승시킴을 알 수 있었다.
(3-2) 제대혈 유래 간엽줄기세포 위에서 CFU-Mk의 체외증식능 확인
본 발명의 체외 성장 및 증식방법에 따른 거핵세포 전구세포(megakaryocyte progenitor cells)의 체외증식능을 배양 0일에서 14일까지 비교하였다.
거핵세포성 콜로니(megakaryocytic colony)를 비교하기 위해서, 1.25×103 CD34+ 농축된 세포를 상기 배양 조건 A~D에서 0, 4, 7, 10, 14일 동안 배양하고, 이후에 세포들을 아래의 콜라겐 기본 배지(collagen-based medium)에서 다시 배양하여 CFU-Mk 콜로니들을 분석하였다 (각 배양조건에 따라 n=4).
형성된 CFC 콜로니들을 계수하기 위해서, 세포는 1.1mg/㎖ 콜라겐, 1% BSA, 10 ㎍/㎖ rh 인슐린, 2mM L-글루타민, 10-4M 2-머캅토에탄올, 50 ng/㎖ rh 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 10 ng/㎖ rh IL-6, 그리고 10ng/㎖ rh IL-3 이 포함되고, 우태혈청이 없는 Iscove's MEM(stem Cell Technologies사)에서 배양하였다.
배양 후 12일째에 CFU-Mk 콜로니가 형성된 것은 항-인간 글리코프로테인(glycoprotein, GP) IIb/IIIa 항체를 사용하여 붉은색으로 염색, 계수하였다. 형성된 CFU-Mk 콜로니는 수를 세고 1×104 세포당 콜로니 수로 표현하였다. 증폭 배수는 배양 전에 CFCs와 일정 기간 배양 후 얻어진 CFCs를 비교하여 산출하였다. *는 배 양 전에 형성할 수 있는 CFC 수에 대비해서 통계적으로 유의한 것을 나타낸다(P<0.05, ANOVA 분석).
도 4의 결과를 보면, CFU-Mk 콜로니는 붉은색으로 염색되었고, CFU-Mk 콜로니가 아닌 세포들은 푸른색으로 염색되었다 (도 4a-h, 200X 확대).
배양조건 A 에서는 배양 초에 104 세포당 80.0 ± 26.9개 형성되었던 콜로니가 배양 7일에는 0에 가깝게 급격히 감소하였다 (도 4a: 7일째, b: 14일째, 도 4i). 그러나, 배양조건 C에서 CFU-Mk 는 배양 7일에 104 세포당 566.0 ± 35.5까지 증가되었고, 14일까지 비교적 잘 유지되었다 (n=4) (도 4e: 7일째, f: 14일째, 도 4i). 배양조건 B, D에서는 배양 7일에 각각 104 세포당 149.0 ± 30.5, 68.0 ± 17.4였다(도 4i).
따라서, 본 발명의 체외 성장 및 증식방법은 조혈모세포/전구세포에서 거핵세포 전구세포(megakaryocyte progenitor cells)의 수를 탁월하게 증가시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
상기 (3-1) 및 (3-2)의 결과에서는 세포 수 증가, 배양조건 C에서 보여지는 조혈전구세포들의 2.03~9.85배의 증가(CFU-GM: 3.46배; CFU-GEMM: 9.85배; BFU-E: 3.64배; CFU-E: 2.03배; 그리고 CFU-Mk: 7.08배)를 나타낸다.
CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, CFU-E 및 CFU-Mk 분석에서 콜로니 수는 계속적으로 증가하여 7일째 최고조에 달했으며, CFU-Mk을 제외하고 (도 4), 그 이후 배양일 이 계속 늘어나는 동안 감소하는 양상을 나타내었다(도 3).
특히 배양 14일에, 배양조건 C에서 CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, 및 CFU-E 콜로니들이 세포 배양 개시 전보다 낮아졌으나, 전체 혈구세포수, 그리고 CD34+ 세포수는 꾸준히 증가하였기 때문에, CFU-Mk을 제외한 다른 조혈모세포/전구세포들(CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, 및 CFU-E)의 감소는 하위 혹은 비 CD34+ 세포 계열로의 분화로 추정할 수 있다. 또한, 이러한 현상은 7일 배양 이후 자가 재생 활성을 촉진하는 혹은 분화를 억제하는 어떤 인자의 감소에 의한 것으로 예상된다.
따라서, 체외 성장 및 증식시 배양 기준은 10일 이내로 하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
[실시예 4] 제대혈 유래 간엽줄기세포 위에서 자갈모양 유사 영역 (cobble stone-like area) 내 세포 증식확인
상기 실시예에서 제대혈 유래 간엽줄기세포의 조혈모세포/전구세포 체외증식능을 조사하는 동안, 세포영양막과 조혈모세포/전구세포가 물리적, 기능적으로 상호작용하는 자갈모양 유사 영역(cobble stone-like area)이 재조합 싸이토카인이 없는 배양조건 C (도 5a)에서 형성되는 것을 관찰할 수 있었다.
(4-1) 자갈모양 유사 영역의 형태 및 증식 관찰
상기 [실시예 2]에서 배양조건 C로 배양된 세포에서, 세포영양막 위에 형성된 자갈 모양 유사 영역에 붙은 세포들을 2mM EDTA를 포함하고, Ca2+, Mg2+ 가 없는 PBS 완충용액으로 다섯 번 세척한 후에, 현미경으로 검사하였다.
현미경상의 관찰결과, 둥근 모양의 CD34+ 농축된 세포들이 양극성 섬유아세포 모양의 제대혈 유래 간엽줄기세포와 상호작용하고 묻혀있는 형태로 관찰되었다 (도 5a, 400X 확대). 그 상호작용은 상기 PBS 완충용액으로 세척하는 것으로는 끊어지지 않았다. 예상했던 대로, 배양조건 C에서 부유되어 있던 세포를 제거한 후에 새로운 배지를 첨가했을 때, 새로운 세포들이 그 세포영양막 점착성 세포 (cell feeder layer-adherent cells)로부터 계속적으로 증식하였다.
(4-2) 자갈모양 유사 영역의 유세포 분석
상기 배양조건 C에서 배양 7일째에 0.025% 트립신/EDTA를 처리하여 세포영양막 점착성 세포를 분리하고 이 세포에 대하여 유세포 분석을 실시하였다.
분리된 2×105 세포들을 FITC가 결합된 CD45 항체 및 PE가 결합된 CD44 항체 (BD Bioscience사)와 30분간 4℃에서 반응시켰다. PBS 세척 후 세포는 1% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich사)로 고정시켜 FACSCaliber(BD Bioscience사)를 사용하여 유세포 분석하였다.
분석 결과, 세포영양막 점착성 세포들에서 CD44+CD45+ 세포의 비율은 FACS에서 28.8%로 분석되었다(도 5b 및 5c).
(4-3) CFU-Mk의 증식능과 세포영양막 점착성 세포의 연관성 확인
추가적으로 상기 (3-2)의 결과에서, CFU-Mk 콜로니 수가 다른 조혈전구세포 종류들보다 배양 7일에서 14일까지 더욱 잘 보존되었으므로(도3, 4), 거핵세포/혈소판(megakaryocyte/platelet) 전구세포에 대한 면역염색을 통해 CFU-Mk의 증식능과 세포영양막 점착성 세포의 연관성을 확인하였다.
배양조건 C에서 배양 7일, 14일째에 세포영양막 점착성 세포들을 항 GPⅡb/Ⅲa 항체로 30분간 반응시킨 후, 순차적으로 바이오틴(biotin)이 붙은 2차 항체로 상온에서 30분간 반응시켰다. 그 후 세포영양막에 아비딘(avidin)이 붙은 알카라인 포스파타제와 이의 기질로 반응시키고, Evan's blue solution을 가지고 대조염색을 하였다(Stem Cell Technologies사).
그 결과, CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, 그리고 CFU-E 같은 다른 조혈전구세포들과는 달리, 거대세포/혈소판 전구세포는 세포영양막 점착성 세포 내에서 배양 7일 보다 배양 14일에 더 높은 수로 관찰되었고, 이는 거핵세포/혈소판 전구세포에 대한 세포영양막의 특이적 체외 증식능를 제시해 주는 것이다(도 5d; 7일째, e: 14일째, 200X 확대). 도 5f는 104 세포당 GP Ⅱb/Ⅲa 양성 세포들의 빈도를 막대 그래프로 나타낸 것이다(n=3). *는 배양 7일째와 대조하여 통계적으로 유의함을 나타낸다(P<0.05, ANOVA 분석).
상기 결과를 통해, CFU-Mk의 증식능이 세포영양막 점착성 세포들에 의존적임을 알 수 있었다.
또한, 동일한 세포영양막 점착성 세포에서 다른 조혈전구세포들, 즉 CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, 그리고 CFU-E은 배양 14일째보다 배양 7일째에서 현저히 높은 수로 관찰되었으며, 부유된 세포들을 이용한 CFC 분석에서의 증식 형태와 큰 차이가 없었다.
상기 결과들은 이러한 체외증식능이 그 세포영양막 점착성 세포들과 매우 밀접한 연관관계에 있으며, 상이한 종류의 조혈모세포/전구세포들의 생장, 증식, 그리고 분화에 상이한 역할이 있음을 보여주는 것이다.
[실시예 5] 제대혈 유래 간엽줄기세포 위에서 체외증식된 조혈모세포/전구세포의FACS 분석
본 발명의 체외 성장 및 증식방법의 원시적 전구세포에 대한 체외증식능을 확인하기 위해, 유세포(FACS) 분석을 실시하였다.
상기 실시예 2에서 배양조건 B, C, D로 체외증식된 조혈모세포/전구세포 중, CD33/CD34 및 CD38/CD34 세포들에 대한 유세포 분석을 배양 7일과 14일째에, CD13/CD34 세포들에 대한 유세포 분석은 배양 14일째에 수행하였다.
배양조건 B, C, D에서 체외증식된 조혈모세포/전구세포 2×105 개 세포를 FITC가 결합한 CD34, PE가 결합한 CD33, CD38 또는 CD13 (BD Bioscience사)와 함께 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS 세척 후, 세포를 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, Sigma-Aldrich사)로 고정시켰다. FACSCaliber (BC Bioscience사)를 분석에 사용하였고, 1회 분석에 최소 10,000 개 이상의 세포를 이용하였다.
배양 전에, 실험에 사용된 CD34+ 농축된 세포들은 CD33-CD34+는 1.21%, CD33+CD34+는 93.86%, CD38-CD34+는 0.73%, CD38+CD34+는 93.28%, CD13+CD34+는 94.41%였다.
이를 14일간 배양한 후, 배양조건 C에서 관찰된 CD33-CD34+ 세포는 배양 7일에 4.44%, 14일에 0.55% 였다(도 6c 및 d).
배양조건 C에서 CD38-CD34+ 세포는 증식이 지지되지는 않았지만, CD38+CD34+ 세포는 배양조건 C에서 14일까지 15.74%로 (도 6i 및 j), 배양조건 B (도 6g 및 h) 그리고 D (도 6k 및 l)에서보다 더 잘 지지되었다.
CD13+CD34 세포의 비율은 역시 배양조건 C에서 14일에 15.72%로 가장 높게 관찰되었다 (도 6m-o).
결과적으로, CD33-CD34+, CD38+CD34+, 그리고 CD13+CD34+ 세포의 빈도가 다른 배양조건들보다 배양조건 C에서 배양 7일째 및 14일째 높게 유지됨을 알 수 있었다.
[실시예 6] 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 조혈성 싸이토카인들의 발현 확인
본 발명에서 세포영양막으로 사용되는 제대혈 유래 간엽줄기세포로부터 조혈성 싸이토카인들의 발현을 확인하기 위하여, 역전사중합효소 연쇄반응(RT-PCR)과 면역블롯팅(Immunoblotting)을 수행하여 골수 유래 간엽줄기세포에서의 발현과 비교하였다.
RNA는 Trizol 용액(Gibco사)을 사용하여 추출하였다. 각 0.5㎍ RNA는 올리고 -dT 프라이머와 역전사효소 (Invitrogen사, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 역전사 하였으며, 이를 가지고 Taq polymerase(Invitrogen사)로 cDNA화 하였다. 각각의 싸이토카인들에 대한 특이적인 프라이머는 표 1에 나타내었다. RT-PCR로 얻어진 유전자 산물들은 1.5% 아가로스 젤에서 전기영동하여 분리하여, EtBr 염색 및 UV 빛으로 관찰하였다.
프라이머 유전자 시퀀스 예상산물크기 서열번호
GAPDH 5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC -3' 452 bp 1
5'- TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3' 2
IL-1 alpha 5'- GTCTCTGAGTATCTCTGAAACCTC -3' 513bp 3
5'- AAGAGGAGGTTGGTCTCACTAC -3' 4
IL-1 beta 5'- AGATGATAAGCCCACTCTACAGC -3' 500bp 5
5'- CTTTAAGTGAGTAGGAGAGGTGAG -3' 6
IL-2 5'- CTCACATTAACCTCAACTCCTG -3' 442bp 7
5'- CTACAATGGTTGCTGTCTCATC -3' 8
IL-3 5'- AAGGACCAGAACAAGACAGAGT -3' 443bp 9
5'- CAGATAGAACGTCAGTTTCCTC -3' 10
IL-5 5'- TTGAGTTTGCTAGCTCTTGGAG -3' 442bp 11
5'- GCAGTAAAATGTCCTTCTCCTC -3' 12
IL-6 5'- GGTATACCTAGAGTACCTCCAGAA -3' 648bp 13
5'- AGTCTACTCCCTGCTGTCTGAATA -3' 14
IL-7 5'- GAGTGTTCTAATGGTCAGCATC -3' 533bp 15
5'- GGTGCATTCAGTAACTTCTAGG -3' 16
IL-11 5'- GTCATACATATCCACTTGAGGG -3' 574bp 17
5'- GTACTGTTGATCACAGGGTGACT -3' 18
LIF 5'- CTAGGTGAGATATAGGGGTGTG -3' 608bp 19
5'- CTCTATCTCTTCCTTCCCTAGTGT -3' 20
FL 5'- TGG AGC CCA ACA ACC TAT CTC -3' 333bp 21
5'- TGG TTT ACA CGG AAA GTC GGG -3' 22
TPO 5'- GTGGACTTTAGCTTGGGAGAAT -3' 570bp 23
5'- CAAGAGTTCGTGTATCCTGTTC -3' 24
SCF 5'- GAGACAGCCAAGTCTTACAAGG -3' 437bp 25
5'- ATGGTACATGCAGTCTGAGACAC -3' 26
C-kit 5'- CTCTTCTCAACCATCTGTGAGT -3' 667bp 27
5'- CGTTGAGTACACAGAACTAGACAC -3' 28
IL-6 receptor 5'- CCTGGAACTCATCTTTCTACAG -3' 394bp 29
5'- TATCTGGGGAAGAAGTAGTCTG -3' 30
GM-CSF 5'- CCTGAACCTGAGTAGAGACACT -3' 382bp 31
5'- CCATCCTGAGTTTCTAGCTCTT -3' 32
M-CSF 5'- CAGTGTAGAGGGAATTCTAAGACC -3' 648bp 33
5'- GACTGAAAAGACAGTCAGAAGG -3' 34
또한, 면역블롯팅 분석을 위해 각각 제대혈 또는 골수 유래 간엽줄기세포의 단백질 30 ㎍ 씩을 15% SDS-PAGE에서 전기영동으로 분리하였고, 나이트로셀룰로스막(nitrocellulose (NC) membrane)에 전기적으로 이동시켰고, IL-1β 및 GM-CSF의 특이적 일차 항체(Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 일반적인 실험 방법에 준하여 수행하였다.
도 7a와 b의 RT-PCR 결과를 보면, 모든 RT-PCR 산물들은 예상되는 위치로 이동하여 정확한 크기를 나타내었다. 제대혈 그리고 골수 유래 간엽줄기세포들은 IL-1α, IL-6, IL-7, LIF, FL, TPO, SCF, C-kit, M-CSF를 공통적으로 발현하였다.
특이하게, IL-1β 및 GM-CSF가 제대혈 유래 간엽줄기세포에서만 발현되었다.
이러한 결과는 면역블롯팅 분석에 의해서도 재차 확인되었다 (도 7c). 제대혈 유래 간엽줄기세포(lane 1)에서만 IL-1β 및 GM-CSF를 발현하고 및 골수 유래 간엽줄기세포(lane 2)에서는 그렇지 않음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 제대혈 및 골수 유래 간엽줄기세포에서 공통적으로 다양한 조혈성 싸이토카인을 발현하나, 특히, 제대혈 유래 간엽줄기세포는 IL-1β 및 GM-CSF와 같은 독특한 싸이토카인을 발현함을 알 수 있었다.
GM-CSF는 다양한 과립구 (granulocyte) 그리고 대식세포 (macrophage) 전구세포들의 증식과 발달에 중요하므로, 이 GM-CSF가 제대혈 유래 간엽줄기세포에서 근본적으로 발현된다는 것은 골수보다 제대혈에서 더욱 많은 조혈전구세포들이 존재하는 현상[Mayani H, et al. (1998) Stem Cells 16: 127-135; Hows JM, et al. (1992) Lancet 340: 73-76; Steen R, et al. (1994) J Hematother 3: 253-262]에 연관되는 것으로 보이며, 제대혈 유래 간엽줄기세포에서의 특이적 싸이토카인의 발현을 통해 다른 역할과 활성을 보유할 수 있을 것으로 사료된다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법은 별도의 싸이토카인을 사용하지 않고 제대혈 유래 간엽줄기세포를 세포영양막으로 하여 공동배양함으로써, 조혈모세포/전구세포 배양시 전체 세포에 대한 CD34+ 세포의 비율을 높게 유지하며, 여러 콜로니 형성 세포(CFC)의 수가 다른 배양조건에 비해 월등히 높은 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명은 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식시, 고가의 싸이토카인을 인위적으로 가하지 않으므로 경제적이고, 싸이토카인에 의한 원치 않는 과분화의 역효과를 배제할 수 있고, 이식시 문제를 발생시킬 수 있는 싸이토카인과 같은 성장인자 및 호르몬의 첨가를 배제함으로써, 보다 다량의 안정한 조혈모세포/전구세포를 수득할 수 있는 장점이 있다.
따라서 본 발명의 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법으로 배양된 조혈모세포/전구세포를 이식에 사용할 경우 효율적인 치료효과를 나타낸다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (19)

  1. 하기 단계를 포함하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법;
    1) 제대혈, 골수 또는 말초혈액으로부터 조혈모세포/전구세포를 분리하는 단계; 2) 제대혈로부터 단핵구세포를 분리하여 배양하는 단계; 3) 상기 2)단계의 배양된 세포로부터 간엽줄기세포를 분리하는 단계; 4) 상기 3)단계의 간엽줄기세포를 따로 배양한 후 이를 불활성화하는 단계; 5) 상기 4)단계의 간엽줄기세포를 세포영양막으로하여 배양하면서 상기 1)단계의 세포를 첨가하여 3~10일간 공동배양하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 3단계에서 간엽줄기세포 분리시 간엽줄기세포 특이항원에 대한 항체와 반응시켜 분리하는 방법 또는 플라스틱 세포 배양 용기에 대한 특이적인 점착성을 이용하여 분리하는 방법 또는 이들 분리방법을 병행함을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  3. 하기 단계를 포함하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법;
    1) 제대혈, 골수 또는 말초혈액으로부터 조혈모세포/전구세포 특이 항원에 대한 항체와 반응시켜 세포 분리기에서 조혈모세포/전구세포를 분리하는 단계; 2) 제대혈로부터 단핵구세포를 분리하여 배양하는 단계; 3) 상기 2)단계의 배양한 세포를 간엽줄기세포 특이항원에 대한 항체와 반응시켜 세포 분리기에서 간엽줄기세포를 분리하는 단계; 4) 상기 분리된 간엽줄기세포를 배양 후 불활성화시키는 단계; 5) 불활성화시킨 간엽줄기세포에 상기 1)단계에서 분리된 조혈모세포/전구세포를 가하여 3~10일간 공동배양하는 단계.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 1단계의 조혈모세포/전구세포 특이 항원에 대한 항체는 CD34, HLA-DR, CD38, CD45RA, CD71, Thy-1(CD90), c-kit(CD117), FLT(CD135), CD133 중에서 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 3단계에서 간엽줄기세포 분리시 간엽줄기세포 특이항원에 대한 항체와 반응시켜 분리하는 방법과 플라스틱 세포 배양 용기에 대한 특이적인 점착성을 이용하여 분리하는 방법을 병행함을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  6. 제 2항, 제 3항, 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3단계의 간엽줄기세포 특이 항원에 대한 항체는 CD73, CD29, CD44, CD13, CD105 중에서 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  7. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제3단계에서 분리된 간엽줄기세포는 다양한 조혈성 싸이토카인을 자체적으로 발현함을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 조혈성 싸이토카인은 IL-1α, IL-6, IL-7, LIF, FL, TPO, SCF, C-kit, M-CSF, IL-1β 및 GM-CSF을 포함함을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  9. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제4단계의 간엽줄기세포의 불활성화 단계는 조혈모세포/전구세포와 공동배양하기 전에 수행함을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  10. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제4단계의 간엽줄기세포의 불활성화 단계는 간엽줄기세포가 배양용기에 채워질 정도로(confluently) 증식시 수행함을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 간엽줄기세포의 불활성화 단계는 마이토마이신 C로 수행함을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  12. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제5단계의 조혈모세포/전구세포와 간엽줄기세포의 공동배양시 비율은 1 : 5~20 임을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  13. 삭제
  14. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제5단계의 조혈모세포/전구세포와 간엽줄기세포의 공동배양시 간엽줄기세포 배양을 시작한 동일한 배양기에서 지속적으로 세포를 유지함을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  15. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제5단계의 조혈모세포/전구세포와 간엽줄기세포의 공동배양시 3~4일에 한 번씩 배지의 일정량을 제거하고 이에 대응하는 양만큼 새로운 배지로 교체함을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 배지 제거량 또는 교체량은 배지의 1/5 ~ 1/3 정도임을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 배지 제거량 또는 교체량은 배지의 1/4 정도임을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  18. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제5단계에서 조혈모세포/전구세포와 간엽줄기세포를 공동배양하여 수득된 조혈모세포/전구세포 중 CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E, CFU-E, CFU-Mk의 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
  19. 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제5단계에서 조혈모세포/전구세포와 간엽줄기세포를 공동배양하여 수득된 조혈모세포/전구세포 중 CD33-CD34+, CD38+CD34+, 및 CD13+CD34+ 세포의 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조혈모세포/전구세포의 체외성장 및 증식방법.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10617721B2 (en) 2013-10-24 2020-04-14 Ospedale San Raffaele S.R.L. Methods for genetic modification of stem cells

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