CN111454896B - 一种提高间充质干细胞促进急性髓系白血病分化能力的诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种提高间充质干细胞促进急性髓系白血病细胞分化能力的诱导方法的应用。本发明提供的间充质干细胞为人来源的脐带间充质干细胞(UC‑MSCs)，在经过细胞因子骨形成蛋白6(BMP6)预处理活化后得到的间充质干细胞(pre‑active MSCs)；所述pre‑active MSCs可高效诱导急性髓系白血病细胞分化，该种能力是通过改变UC‑MSCs的IL‑6和IDO的表达量来实现的；所述间充质干细胞为异体间充质干细胞，在经过BMP6处理活化后能够使其分泌能力显著改变，抗AML能力显著增强。该种方法采用BMP6预处理活化MSCs的方法提高了MSCs诱导急性髓系白血病细胞分化的能力，可应用于急性髓系白血病的分化治疗。

Description

一种提高间充质干细胞促进急性髓系白血病分化能力的诱导 方法

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种提高间充质干细胞促进急性髓系白血病分化能力的诱导方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早发现与骨髓中，随后发现间充质干细胞几乎存在于人体生长发育过程中的所有组织中。目前，已能够从骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘和羊膜液等组织中分离和制备间充质干细胞。MSCs不仅具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，还具有免疫调控能力和低的免疫原性等特性，是移植领域应用前景广阔的再生来源细胞，也因此受到越来越多的生物学领域科学家和医学研究人员的青睐。临床上最常用的是骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrow derived MSCs，BM-MSCs)，一般以自体移植为主，可用于治疗多种慢性疾病。但是在急性白血病人中的研究发现，AML病人的BM-MSCs失去了旺盛的自我更新能力，同时也失去了对正常造血干细胞生长和功能的维持作用，转而支持AML细胞的生长和增殖。除此之外，有研究报道了AML病人来源的BM-MSCs还能够保护AML细胞免遭化疗药物的杀伤作用。因此，自体移植BM-MSCs无法达到缓解AML病程的作用，甚至可能加剧AML的病程。

脐带间充质干细胞(Umbilical cord MSCs，UC-MSCs)是一种从新生儿脐带组织中分离获得的间充质干细胞。脐带间充质干细胞采集方便，可用酶消化法等多种成熟的手段从新生儿脐带组织中获得，易于保存和运输，对供者不造成创伤以及无伦理道德制约，生物学特征与其它来源的间充质干细胞基本一致相比于其他成体间充质干细胞。此外，UC-MSCs具备一些独特的优势，例如生长迅速，细胞分泌能力旺盛，免疫原性更低，更强的免疫调节活力，正日益受到人们的关注。目前已在多个国家进行临床研究，成功应用于组织再生和治疗多种自体免疫性疾病。同时，也有一些报道指出UC-MSCs具备一定的抗肿瘤活性。

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一种异质性的血液系统恶性肿瘤，其主要表现为骨髓与血液中大量的积累恶性的原始和幼稚髓性细胞。这些原始白血病细胞停滞在了分化的早期阶段并大量进行克隆性增殖，严重妨碍正在的造血和免疫功能。目前治疗AML的主要手段为大剂量的化疗联合造血干细胞移植(Hematopoietic stemcell transplantation，HSCT)，但由于大剂量化疗的使用，仍然会导致严重的副作用。与此同时，HSCT需要找到合适的配型以避免免疫排斥反应，这也大大限制了HSCT的临床应用。目前急性髓系白血病的分化疗法已经被成功应用于临床。以全反式维甲酸和砷类化合物为代表的促分化小分子药物，已被证明能够促进急性早幼粒白血病(Acute promyelocyticleukemia，APL)跨越分化障碍，促进其向成熟粒细胞分化，进而抑制白血病细胞的增殖并降低其恶性程度。虽然这两类药物能够促进APL细胞分化，但却不具备普适性。更为具有普适性的AML的分化疗法仍有待进一步开发。

骨形成蛋白6(Bone morphogenetic protein 6，BMP6)是TGFβ超家族的一员，BMP家族已被证实可调节间充质干细胞向间充质组织细胞的命运决定。其中，BMP6被证明是间充质干细胞向成骨细胞分化的关键调控因子。在临床研究中，骨形态发生蛋白2和7目前广泛使用于脊柱融合手术中以支持骨再生提高融合率。尽管如此，BMP6在治疗人类疾病中的作用和相关的临床应用还没有得到很好的研究。在此，我们提出了一种有价值的策略，即BMP6可用于脐带间充质干细胞的活化以促进IL6的生成，从而提高脐带间充质干细胞诱导急性髓系白血病细胞分化的能力。

发明内容

本发明目的在于构建一种活化间充质干细胞的诱导方法，用于提高脐带间充质干细胞诱导急性髓系白血病细胞分化的能力，增强其治疗效果。间充质干细胞为异体来源的间充质干细胞，如：新生儿的脐带组织来源的间充质干细胞(UC-MSCs)。

为达到上述发明目的，本发明所采用的脐带间充质干细胞活化方案是：

1.UC-MSCs细胞传代至60mm*15mm皿中，37℃、5％CO₂培养箱内培养过夜，使其密度达到80％。

2.将BMP6加入完全培养基中(终浓度5nM)，培养UC-MSCs并活化UC-MSCs 24小时。骨形成蛋白6(BMP6)可激活间充质干细胞的BMPR-Smad1/5/9信号通路，使其高表达白介素6(IL-6)及吲哚-2，3双加氧酶(IDO)。

3.在活化一天后，弃上清，PBS洗两遍，继续培养以后续使用。

活化后的UC-MSCs的质量控制标准：

流式细胞术鉴定MSCs细胞表面标志物：预处理UC-MSCs，用细胞消化液消化下细胞，重悬细胞，离心弃上清，用PBS洗两遍后，用PBS重悬成1-2×10⁶/ml的单细胞悬液，分别加入荧光标记抗体CD14-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC、IgG1，κ-FITC、IgG2α，κ-FITC，冰上避光染色；PBS洗去未结合的抗体，然后加入500ulPBS重悬，上机检测。

MSCs成脂、成骨和成软骨分化鉴定：采用广州赛业生物的MSCs成骨和成脂分化诱导培养基以及诱导方案进行诱导成脂肪和成骨分化鉴定。

对活化的UC-MSCs促进AML细胞分化能力进行检测。

1.设置两组，预处理活化的UC-MSCs，以及未刺激的UC-MSCs分别以10⁵/孔的数目接种到12孔板中，放到培养箱中细胞贴壁生长12h，弃培养上清，PBS洗2遍，在MSCs孔中直接铺入2×10⁵个人急性单核白血病细胞(THP-1、U937细胞株)，进行体外共培养实验，以单独培养的THP-1和U937细胞株为对照

2.共培养48h后，收取上层THP-1和U937细胞株到1.5ml EP管中，PBS洗两遍，以单独培养的THP-1和U937细胞株为对照，流式细胞术检测THP-1和U937细胞株CD14和CD11b的表达以及吞噬能力的变化。

定量PCR(Q-pcr)检测活化的UC-MSCs，检测UC-MSCs分泌的功能因子白介素6(IL-6)和吲哚胺-2，3加双氧酶(IDO)的表达。

附图说明

图1活化UC-MSCs流式鉴定，流式检测标记物CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45的表达。

图2活化UC-MSCs成骨(A)和成脂(B)诱导分化鉴定

图3活化UC-MSCs体外诱导急性单核白血病细胞分化的能力检测。流式细胞术检测原代AML细胞(A)和AML细胞株(B)分化标志物CD14和CD11b的表达。

图4活化UC-MSCs，IL-6和IDO的表达量。

图5western blot检测活化UC-MSCs中Smad1/5/9磷酸化水平

图6加入SMAD抑制剂DMH-1检测活化UC-MSCs体外诱导急性单核白血病细胞分化的能力的变化。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并未用于限定本发明的范围。

脐带间充质干细胞的分离及传代培养

1.配置组织消化酶(II型胶原酶250U/ml，中性蛋白酶100U/ml，透明质酸酶10U/ml)，37℃溶解于α-MEM培养基，用0.22μm的滤器过滤除菌备用；

2.取新生婴儿的脐带组织，将脐带放入培养皿中用含0.1％青霉素-链霉素双抗的PBS清洗干净，放入α-MEM培养基中，剥离三根血管，将脐带剪碎成1-2mm³的组织块；

3.将剪碎的组织块与配置的组织消化酶溶液按1∶1的体积比例混合于50ml离心管中，37℃，200rpm，消化3h，待组织块基本消化完全即可；

4.将消化后的组织液4℃，300g离心5min，弃上清。PBS重悬于50mlα-MEM培养基中，4℃，300g离心5min，弃上清。PBS洗两次，将沉淀重悬于含有10％胎牛血清、1％双抗的α-MEM培养基中，接种于直径10cm细胞培养皿中，放置在37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中静置贴壁培养；

5. 3天后，半量换液。此后，每两天换液，UC-MSCS沿着贴壁的组织块或者贴壁的细胞长出；

6.待细胞长至80％丰度时，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA细胞消化液消化下细胞；重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清，PBS洗一遍，离心后弃上清，获得的细胞沉淀用新鲜的培养基重悬，然后接种到新的培养皿中，传代细胞。待细胞长至90％融合后，进行下一次传代培养。

UC-MSCs活化方案的优化1

1.BMP6溶于PBS(pH＝7.4)中，浓度为5μM。

2.将5μM浓度生物BMP6以1∶1000比例加入完全培养基中，至终浓度5nM。

3.UC-MSCs长至70-80％丰度后，加入含有5nM BMP6的培养基，培养24小时。

4.活化24小时的UC-MSCs，弃上清，用pH 7.4的PBS洗两遍，用含10％FBS的α-MEM培养基继续培养。

UC-MSCs活化方案的优化2

1.BMP6溶于PBS(pH＝7.4)中，浓度为5μM。

2.将5μM浓度生物BMP6以1∶1000比例加入完全培养基中，至终浓度5nM。

3.UC-MSCs长至70-80％丰度后，加入含有5nM BMP6的培养基，培养48小时。

4.活化48小时的UC-MSCs，弃上清，用pH 7.4的PBS洗两遍，用含10％FBS的α-MEM培养基继续培养。

活化MSCs的评估：

1.Western Blot检测活化MSC中BMPR-Smad1/5/9信号通路的磷酸化水平。

2.实时定量PCR(RT-qPCR)测定MSCs中白介素6(IL-6)、吲哚-2，3双加氧酶(IDO)的表达。与预处理前相比，MSCs的IL-6及IDO的表达量需提高2倍以上。

3.将活化的MSCs分别与人源白血病细胞系(THP-1与U937细胞系)共培养，流式细胞术评价AML细胞CD14和CD11b的表达。相对于处理前，CD11b、CD14双阳性表达程度应上调至少50％。

以上实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。对于本领域的技术人员来说，在不背离本发明精神和实质的情况下对本发明方法、步骤或条件所做的修改和替换，均属于本发明的范围。

Claims (6)

1.一种活化的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，该细胞的制备过程如下：利用含有1-100ng/ml骨形成蛋白6(BMP6)的培养液通过激活BMPR-Smad1/5/9信号通路活化间充质干细胞，使其高表达白介素6(IL-6)及吲哚-2，3双加氧酶(IDO)，诱导急性髓系白血病细胞的分化能力增强；该制备方法的步骤为：

1)MSCs细胞传代至60mm*15mm皿中，使用含有10％FBS的α-MEM完全培养基，37℃、5％CO2培养箱内培养过夜，使其密度达到80％；

2)将BMP6加入完全培养基中，使其在培养液中的终浓度为1-5nM；在此条件下，培养并活化MSCs 24小时，弃上清，PBS洗两遍，更换新鲜的含有10％FBS的α-MEM完全培养基继续培养MSCs以供后续使用。

2.如权利要求1所述的活化的 间充质干细胞的制备方法，其特征在于可使用异体来源的间充质干细胞。

3.如权利要求1所述的活化的 间充质干细胞的制备方法，其特征在于可使用新生儿的脐带组织来源的间充质干细胞。

4.如权利要求1所述的活化的 间充质干细胞的制备方法，其特征在于以CD11b、CD14双阳性表达为分化程度的判定依据，间充质干细胞诱导白血病细胞的分化程度应上调至少50％。

5.如权利要求1所述一种活化的间充质干细胞的制备方法在用于非诊断和治疗目的的提高间充质干细胞诱导髓系白血病细胞分化能力中的用途，其特征在于，以所述方法制备的活化的间充质干细胞可用于影响髓系白血病的生长和分化过程。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于：髓系白血病是急性髓系白血病或慢性髓系白血病。

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