CN115058393A - 一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法，涉及细胞培养技术领域；所述包被刺激物包括MICA、anti‑CD16和第三组分；所述第三组分包括Anti‑CD52、4‑1BBL、OX40L和Anti‑CD137中的一种或几种。本发明的包被刺激物能够用于构建从PBMC直接扩增培养的因子刺激的无滋养细胞扩增体系，可刺激从外周血中分离的PBMC细胞直接培养得到NK细胞，在培养的初始阶段，加入本发明的包被刺激物，能提高NK细胞的扩增倍数，实现NK细胞的高效扩增，提高NK细胞的比例和数量，同时还能提高NK细胞对肿瘤靶细胞的杀伤能力。

Description

一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural killer，NK)是主要的天然免疫成员，在防御疾病包括恶性肿瘤第一防线中能发挥重要作用。与获得性免疫系统的细胞(例如T细胞)相比，NK细胞无需预先刺激或致敏即可启动细胞毒活性，从而提供即时的自然反应。NK细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素又可通过FAS配基。NK细胞可以产生TNF-α、IFN-γ和IL-1，这些细胞因子在NK细胞抗癌反应以及调动T淋巴细胞中有十分重要地位。由于NK细胞具有快速的杀伤作用和广泛的靶细胞，提示NK细胞可以用于治疗恶性肿瘤。研究证明，过继转输体外活化、扩增自体或同种异体NK细胞对治疗多种白血病和实体瘤有效。
NK细胞用于肿瘤治疗是通过体外制备对肿瘤具有杀伤功能的NK细胞，然后回输给患者，在患者体内试验对肿瘤细胞的杀伤，达到治疗效果。获得足够数量的、杀伤性强、质量稳定的NK细胞，是实现NK细胞临床应用的关键。但是由于来源于外周血的NK细胞难易在体外大量扩增，而且从外周血分离纯化NK细胞有一定的技术难度，难易避免T淋巴细胞的污染，无法获取大量均一的NK细胞并达到临床所需的标准，故NK细胞还不能广泛应用于临床；另外，在有些病例中，NK细胞介导的抗肿瘤反应弱，可能与NK细胞杀伤能力、在体内存活能力差或向肿瘤部位迁移受限等因素有关。
NK细胞的体外培养主要包括滋养层细胞法和纯因子培养法。滋养层细胞法利用人细胞系，经过基因工程改造后与单个核细胞进行共培养，以激活诱导NK细胞。使用白血病细胞系CTV-1细胞增殖方面作用较小，使用EBV-LCL培养21天后，细胞数量增加了平均约490倍，使用表达4-1BBL和膜结合的IL-15的滋养细胞K562系，培养NK细胞3周后，NK细胞数量增加了平均227倍数，并在体外和体内呈现高细胞毒性，但是显示出细胞死亡导致的有限的增殖。在用MICA、4-1BBL和IL-15转染的K562细胞系中培养NK细胞3周后，NK细胞数量增加了平均350倍，使用膜结合的IL-21转染的K562细胞系培养NK细胞2周同时每隔7天刺激NK细胞时，NK细胞数量增加了平均21000倍。然而，由于使用了所有癌细胞系，因此采用了不适合保证对临床应用非常重要的安全性的方法。此外，由于使用特定的癌细胞作为滋养细胞，因此生产的NK细胞对特定的癌细胞具有启动特异性。纯因子培养法仅需选择不同配比的细胞因子，即可实现NK细胞的激活和扩增，相比之下，操作更加简单便捷。
目前市面上在售的NK细胞试剂盒多采用纯因子培养法，广泛使用的因子包括IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和TNFα等。目前市场上已有的试剂盒大多存在NK细胞增殖速度缓慢、扩增效率较低，或者NK细胞纯度较低(30％～70％)等不足之处。申请人在之前的生产过程中，分别使用过国内多个公司的NK培养试剂盒，结果发现实际培养并未达到其宣传的效果，培养后的CD3-/CD56+细胞比率偏低且差异较大，所以有必要研发更高效的NK细胞培养试剂盒，可提高NK细胞的比例和数量。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法，本发明能够高效扩增自然杀伤细胞，可提高NK细胞的比例和数量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种包被刺激物，包括MICA、anti-CD16和第三组分；所述第三组分包括重组人纤维连接片断、Anti-CD52、4-1BBL、OX40L和Anti-CD137中的一种或几种。
优选的，所述第三组分包括、Anti-CD52、4-1BBL、OX40L和Anti-CD137中的一种。
优选的，所述MICA、Anti-CD16和第三组分的质量比为：(1～5)：(0.5～5)：(1～30)。
本发明还提供了一种自然杀伤细胞的培养试剂盒，包括上述方案所述的包被刺激物、诱导培养基和扩增培养基。
优选的，所述诱导培养基以RPMI 1640为基础培养基，包括以下浓度的组分：体积浓度为10％的FBS、100×GlutaMAXTM添加剂、IL-250～300IU/mL、IL-155～30ng/mL和OK4320.5～5μg/mL。
优选的，所述扩增培养基以RPMI 1640为基础培养基，包括以下浓度的组分：体积浓度为10％的FBS、100×GlutaMAXTM添加剂、IL-2200～1000IU/mL和IL-1510～50ng/mL。
本发明还提供了一种自然杀伤细胞的培养方法，包括以下步骤：
采用上述方案所述的包被刺激物包被6孔培养板，得到包被好的6孔培养板；
将诱导培养基和外周血单个核细胞加入到所述包被好的6孔培养板中，进行诱导培养，得到诱导培养细胞；
将所述诱导培养细胞接种到扩增培养基中，进行扩增培养，得到自然杀伤细胞。
优选的，所述包被刺激物中MICA的工作浓度为1～5μg/mL；所述Anti-CD16的工作浓度为0.5～5μg/mL。
优选的，当所述第三组分包括Anti-CD52时，所述Anti-CD52的工作浓度为1～20μg/mL；当所述第三组分包括4-1BBL时，所述4-1BBL的工作浓度为1～20μg/mL；当所述第三组分包括OX40L时，所述OX40L的工作浓度为1～15μg/mL；当所述第三组分包括Anti-CD137时，所述Anti-CD137的工作浓度为1～20μg/mL。
优选的，所述外周血单个核细胞的初始细胞浓度为1×106～9×106cells/mL。
有益效果：本发明提供了一种包被刺激物，包括MICA、Anti-CD16和第三组分；所述第三组分包括Anti-CD52、4-1BBL、OX40L和Anti-CD137中的一种或几种。本发明的包被刺激物能够用于构建从PBMC直接扩增培养的因子刺激的无滋养细胞扩增体系，可刺激外周血中分离的PBMC细胞直接培养得到NK细胞，在培养的初始阶段，加入本发明的包被刺激物，能提高NK细胞的扩增倍数，实现NK细胞的高效扩增，提高NK细胞的比例和数量，同时还能提高NK细胞对肿瘤靶细胞的杀伤能力。
附图说明
图1为实施例1中NK细胞扩增曲线图；
图2为实施例1中培养前D0和体外培养后D21天NK细胞比例流式图；
图3为实施例1培养过程中NK细胞比例变化；
图4为实施例1培养过程NK细胞中CD16+细胞比例变化；
图5为实施例1中SNK细胞对肠癌DLD-1靶细胞的杀伤；
图6为实施例1中SNK细胞对肺癌H358靶细胞的杀伤；
图7为实施例1中SNK细胞对胃癌AGS靶细胞的杀伤；
图8为实施例2中不同浓度Anti-CD52包被培养中SNK细胞活率的影响；
图9为实施例2中不同浓度Anti-CD52包被培养中总细胞扩增倍数；
图10为实施例2中不同浓度Anti-CD52包被培养中NK细胞扩增倍数；
图11为实施例2中不同浓度Anti-CD52包被培养中NK细胞变化；
图12为实施例2中不同浓度Anti-CD52包被培养中NK中CD16+细胞比例变化；
图13为实施例2中不同浓度Anti-CD52包被培养中NKT细胞比例变化；
图14为实施例2中不同浓度Anti-CD52包被培养中T细胞的变化；
图15为实施例2中不同浓度Anti-CD52包被培养中NK+NKT细胞的变化；
图16为实施例2中对肠癌DLD-1的杀伤效率；
图17为实施例2中不同浓度Anti-CD52包被培养中SNK细胞对H358的杀伤效率；
图18为实施例2中不同浓度Anti-CD52包被培养中SNK细胞对AGS的杀伤效率变化；
图19为实施例2中CD69+细胞占NK细胞比值；
图20为实施例2中CD336+细胞占NK细胞比值；
图21为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中SNK细胞活率变化(％)；
图22为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中总细胞扩增倍数；
图23为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中NK细胞扩增倍数；
图24为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中NK细胞比例变化；
图25为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中NK中CD16+细胞比例变化；
图26为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中NKT细胞比例变化；
图27为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中NKT中CD16+细胞比例变化；
图28为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中T细胞比例变化；
图29为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中NK+NKT细胞比例变化；
图30为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中SNK细胞对DLD-1的杀伤效率变化；
图31为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中SNK细胞对H358的杀伤效率变化；
图32为实施例3中不同浓度4-1BBL包被培养中SNK细胞对AGS的杀伤效率变化；
图33为实施例3中CD69+细胞占NK细胞比值；
图34为实施例3中CD336+细胞占NK细胞比值；
图35为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中SNK细胞活率变化；
图36为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中总细胞扩增倍数的变化；
图37为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中NK细胞扩增倍数变化；
图38为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中NK细胞比例变化；
图39为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中NK中CD16+细胞比例变化；
图40为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中NKT细胞比例变化；
图41为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中NKT中CD16+细胞比例变化；
图42为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中T细胞比例变化；
图43为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中NK+NKT细胞比例变化；
图44为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中SNK细胞对DLD-1的杀伤效率变化；
图45为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中SNK细胞对H358的杀伤效率变化；
图46为实施例4中不同浓度OX40L包被培养中SNK细胞对AGS的杀伤效率变化；
图47为实施例4中CD69+细胞占NK细胞比值；
图48为实施例4中CD336+细胞占NK细胞比值；
图49为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中SNK细胞活率变化；
图50为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中总细胞扩增倍数；
图51为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中NK细胞扩增倍数变化；
图52为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中NK细胞比值变化；
图53为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中NK中CD16+细胞比例变化；
图54为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中NKT细胞比例变化；
图55为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中NKT中CD16+细胞比例变化；
图56为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中T细胞比例变化；
图57为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中NK+NKT细胞比例变化；
图58为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中SNK细胞对DLD-1的杀伤效率变化；
图59为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中SNK细胞对H358的杀伤效率变化；
图60为实施例5中不同浓度Anti-CD137包被培养中SNK细胞对AGS的杀伤效率变化；
图61为实施例5中CD69+细胞占NK细胞比值；
图62为实施例5中CD336+细胞占NK细胞比值。
具体实施方式
本发明提供了一种包被刺激物，包括MICA、Anti-CD16和第三组分；所述第三组分包括Anti-CD52、4-1BBL、OX40L和Anti-CD137中的一种或几种。
在本发明中，MICA是NK细胞表面激活受体NKG2D的配体，其与NKG2D结合后激活NK细胞。
在本发明中，CD16单抗与其它刺激物联用，体外培养NK细胞，可以获得高的NK细胞比例及扩增倍数。
在本发明中，包被的CD137单抗能够与NK细胞表面的CD137分子结合，激活CD137共刺激信号通路，促进NK细胞的活化和增殖。CD137单抗能够促进NK细胞的活化和增殖，又有效抑制因细胞扩增引起的细胞凋亡。
在本发明中，CD52单抗可通过抗体领带的作用溶解T细胞，同时其FC与NK细胞表面的CD16结合激活NK细胞。
在本发明中，4-1BBL与NK细胞表面的4-1BB结合后，激活NK细胞，增强NK细胞ADCC作用，并促进IFN-γ的分泌。
在本发明中，OX40L能够增强NK细胞的扩增。不同刺激物联合使用具有协同作用。
在本发明中，所述第三组分优选的包括重组人纤维连接片断、Anti-CD52、4-1BBL、OX40L和Anti-CD137中的一种。
在本发明中，所述MICA、anti-CD16和第三组分的质量比优选为：(1～5)：(0.5～5)：(1～30)，更优选为(2～3)：(1～3)：(5～10)。
本发明还提供了一种自然杀伤细胞的培养试剂盒，包括上述方案所述的包被刺激物、诱导培养基和扩增培养基。在本发明中，所述诱导培养基以RPMI 1640为基础培养基，优选的包括以下浓度的组分：体积浓度为10％的FBS、100×GlutaMAXTM添加剂、IL-250～300IU/mL、IL-155～30ng/mL和OK4320.5～5μg/mL；所述IL-2的浓度进一步优选为100～200IU/mL；所述IL-15的浓度进一步优选为10～20ng/mL；所述OK432的浓度进一步优选为1～3μg/mL。其中，GlutaMAXTM添加剂是L-谷氨酰胺的替代品，具有更好的稳定性，可显著减少有毒氨的积累，改善细胞活力和生长情况。OK-432可以活化中性粒细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞。IL-2能够增强NK细胞IFN-γ的分泌，上调穿孔素的分泌和表达，增强NK细胞的细胞毒性。IL-15促进NK的分化和存活，且IL-2与IL-15具有协同作用。在本发明中，所述扩增培养基以RPMI 1640为基础培养基，优选的包括以下浓度的组分：体积浓度为10％的FBS、100×GlutaMAXTM添加剂、IL-2200～1000IU/mL和IL-1510～50ng/mL；所述IL-2的浓度进一步优选为400～600IU/mL；所述IL-15的浓度进一步优选为20～30ng/mL。在本发明中，所述扩增培养基优选的还包括IL-21；所述IL-21的浓度优选为25ng/mL；所述IL-21优选的于收细胞前3～4d加入。
在本发明中，所述培养试剂盒优选的还包括ddH2O、磷酸缓冲盐溶液(PBS)和6孔培养板。在本发明中，所述磷酸缓冲盐溶液以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：8.0g/LNaCl、0.2g/LKCl、1.44g/LNa2HPO4和0.24g/LKH2PO4；所述磷酸缓冲盐溶液的pH值为7.4。
本发明还提供了一种自然杀伤细胞的培养方法，包括以下步骤：
采用上述方案所述的包被刺激物包被6孔培养板，得到包被好的6孔培养板；
将诱导培养基和外周血单个核细胞加入到所述包被好的6孔培养板中，进行诱导培养，得到诱导培养细胞；
将所述诱导培养细胞接种到扩增培养基中，进行扩增培养，得到自然杀伤细胞。
本发明首先采用上述方案所述的包被刺激物包被6孔培养板，得到包被好的6孔培养板。
在本发明中，所述包被刺激物中的各个组分优选的采用PBS溶解后，采用PBS稀释到工作浓度。
在本发明中，采用上述方案所述的包被刺激物包被6孔培养板优选的包括将溶解有包被刺激物的溶液加入到6孔培养板中，进行包被，所述包被的时间优选为9～16h，更优选为12h；所述包被的温度优选为0～4℃。
在本发明中，所述包被刺激物中MICA的工作浓度优选为1～5μg/mL，更优选为3μg/mL；在本发明中，所述MICA的储存浓度优选为2mg/mL，所述MICA的添加量优选为1mL/孔。
在本发明中，所述Anti-CD16的工作浓度优选为0.5～5μg/mL，更优选为1～3μg/mL；在本发明中，所述Anti-CD16的储存浓度优选为1mg/mL。
在本发明中，当所述第三组分包括Anti-CD52时，所述Anti-CD52的工作浓度优选为1～20μg/mL，更优选为5～10μg/mL；所述Anti-CD52的储存浓度优选为1mg/mL。
在本发明中，当所述第三组分包括4-1BBL时，所述4-1BBL的工作浓度优选为1～20μg/mL，更优选为5～10μg/mL。
在本发明中，当所述第三组分包括OX40L时，所述OX40L的工作浓度优选为1～15μg/mL，更优选为5～10μg/mL。
在本发明中，当所述第三组分包括Anti-CD137时，所述Anti-CD137的工作浓度优选为1～20μg/mL，更优选为5～15μg/mL，最优选为10μg/mL；所述Anti-CD137的储存浓度优选为1～15mg/mL，更优选为5～10mg/mL；所述Anti-CD137的添加量优选为1mL/孔。
在本发明中，当所述第三组分包括Anti-CD52时，所述Anti-CD52的工作浓度优选为1～20μg/mL，更优选为5～10μg/mL。在本发明中，当所述第三组分包括Anti-CD137时所述Anti-CD137的工作浓度优选为1～20μg/mL，更优选为5～10μg/mL。
在本发明中，采用上述方案所述的包被刺激物包被6孔培养板后，优选的还包括将包被好的6孔培养板中的包被液去除，并用PBS进行清洗，以便去除未包被的刺激物；所述清洗的次数优选为2次。
得到包被好的6孔培养板后，本发明将诱导培养基和外周血单个核细胞加入到所述包被好的6孔培养板中，进行诱导培养，得到诱导培养细胞。在本发明中，所述外周血单个核细胞的初始细胞浓度优选为1×106～9×106cells/mL；所述诱导培养基和外周血单个核细胞的总接种量优选为2mL/孔。在本发明具体实施过程中，在PBMC细胞计数后，用诱导培养基将其稀释到1×106～9×106cells/mL。在本发明中，所述诱导培养的时间优选为5～7d。在所述诱导培养过程中，优选的还包括根据细胞生长情况补加细胞因子和诱导培养基，37℃、5％CO2温箱中培养。
得到诱导培养细胞后，本发明将所述诱导培养细胞接种到扩增培养基中，放入37℃、5％CO2温箱中培养进行扩增培养，得到自然杀伤细胞。在本发明中，所述扩增培养优选的于培养瓶或者培养袋中进行；所述扩增培养的时间优选为11～14d；所述扩增培养的D6后开始细胞计数，记录细胞密度和细胞活力，并且根据实际情况隔天处理细胞，补因子和补液。
本发明的自然杀伤细胞的培养方法采用无滋养细胞的高效扩增方式，临床使用更安全；细胞培养后NK细胞的纯度高，可异体回输使用；细胞扩增后具有更强的功能，对靶细胞的杀伤能力强。
术语解释：
自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK cells)，是人体天然免疫细胞中的重要组分，NK细胞可以通过表面TCR和相关的CD3分子的缺失，以及CD56的表达来鉴定，在宿主抗肿瘤免疫中具有重要作用。
SNK细胞，即经过体外培养诱导扩增，呈激活状态，对多种肿瘤靶细胞有较强杀伤功能的自然杀伤细胞。
下面结合实施例对本发明提供的一种自然杀伤细胞培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
主要试剂：
(1)培养基RPMI 1640(gibco；LOT：2235028；REF：11875-093；)
(2)IL-2(双鹭药业；国药准字s19991010；批号20210302)
(3)IL-12(Novoprotein，货号：GMP-CI58；Lot No：0332040-3835)
(4)Recombinant Human IL-15(novoprotein；货号：GMP-C016；LOT No：0332176KC25)
(5)Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein(R&D Systems；Catalog：9124-IL-050/CF)
(6)Recombinant Human OX40L(novoprotein；货号：CJ45)
(7)Recombinant Human IL-21(peprotech；Lot No：0332091JL16)
(8)GlutaMAXTM添加剂(100×)(gibco；REF：35050-061；LOT：2248972)
(9)Recombinant Human MICA(C-Fc)(novoprotein，Catalog：CG11)
(10)Recombinant Human4-1BBL(C-6His)(novoprotein，Catalog：CH04；)
(11)重组人Anti-CD137单抗(Biolegend，Cat：309841；Lot：B318585)
(12)重组人Anti-CD52单抗(Alemtuzumab)(AbMole；目录号：M3847)
(13)重组人Anti-CD16单抗(同立海源，货号：GMP-TL201)
(14)FBS(gibco；货号10099-141；LOT：2254375CP；REF：10099-141C)
(15)流式3所用抗体如表1：
表1
名称 品牌 货号 批号 规格
FITC Anti-human CD3 BioLegend 344804 B322367 100ug，500ul
PE Anti-human CD4 BioLegend 344606 B314920 100ug，500ul
BV510 Anti-human CD8 BioLegend 344732 B315894 100ug，500ul
APC Anti-human CD56 BioLegend 362504 B307337 100ug，500ul
PE/Cyanine 7 Anti-human CD16 BioLegend 302016 B310460 100ug，500ul
(16)检测细胞表面受体所用抗体如表2：
表2
名称 品牌 货号 批号 规格
APC Anti-human CD56 BiiLegend 362504 B307337 100ug，500ul
BV510 Anti-human CD3 BioLegend 300448 B303950 100ug，500ul
PE Anti-human CD57 BioLegend 322311 B263696 100ug，500ul
PE Anti-human CD69 BioLegend 310905 B258745 100ug，500ul
PE Anti-human CD94 BioLegend 305506 B277652 100ug，500ul
PE Anti-human CD314 BioLegend 320805 B266059 100ug，500ul
PE Anti-human CD336 BioLegend 325107 B290956 100ug，500ul
PE Mouse IgG1，k isotype Ctrl BioLegend 400114 B278607 100ug，500ul
PE Mouse IgM，k isotype Ctrl BioLegend 401611 B266559 100ug，500ul
。
实施例1
培养方法：
1.细胞培养
(1)配制培养基
①诱导培养基：RPMI 1640+体积浓度为10％的FBS+GlutaMAXTM添加剂(100×)+IL-2(100IU/mL)+15(10ng/mL)+OK432(1μg/mL)；
②扩增培养基：RPMI 1640+体积浓度为10％的FBS+GlutaMAXTM添加剂(100×)+IL-2(400IU/mL)+15(20ng/mL)+IL-21(25ng/mL收细胞前3～4天加入)；
(2)包被刺激物
①MICA(50μg)用25μLPBS溶解，储存浓度分别为2mg/mL；
anti-CD52和MICA包被用量：用PBS分别将其稀释到包被浓度，加入到6孔板，1mL/孔，4℃包被过夜；
②Anti-CD16(储存浓度：1mg/mL)；Anti-CD52(储存浓度：1mg/mL)；
抗体包被用量：分别用PBS稀释到包被浓度，加入到6孔板，1mL/孔，4℃包被过夜；
③包被6孔板：用PBS将刺激物稀释到包被浓度，1mL/孔，4℃包被过夜；
(3)复苏PBMC
PBMC细胞计数后，用诱导培养基将其稀释到1×106cells/mL；
(4)将包被好的6孔板从冰箱拿出，弃去包被液，并用PBS洗两遍，以便去除未包被的刺激物；
(5)将稀释好的PBMC加入到包被好的6孔板中，2mL/孔，诱导培养5～7天，根据细胞生长情况补加细胞因子和诱导培养基；
(6)诱导培养7天后，改用扩增培养基，且D6后开始细胞计数，记细胞密度和细胞活力，并且根据实际情况隔天处理细胞，补因子和补液；
(7)D7、D10，D14，D18、D21和D24流式检测细胞表面受体(CD57、CD69、CD94、CD314和CD336)表达情况和流式3检测CD3、CD4、CD8、CD56和CD16；
(8)D18、D21和D24细胞因子检测和杀伤检测。
2、实验结果：
(1)SNK细胞扩增倍数
PBMC细胞前10天细胞处于诱导刺激阶段，之后开始慢慢扩增，到D25天，细胞中NK细胞的扩增倍数约为14000倍。参见图1。
(2)细胞表型
从外周血中分离的PBMC，初始细胞中NK细胞的含量为13.84％，经过体外刺激扩增培养，NK细胞大量增殖，到培养的第21天，NK细胞的含量增殖到88.40％。NK细胞中CD16+细胞的比例从D14天起，已达到90％以上。参见图2～图4。
(3)细胞功能
SNK细胞D21天体外检测对各种肿瘤靶细胞具有较强的杀伤能力，结果显示，当效靶比在5：1时，对肠癌DLD-1和肺癌H358细胞系的杀伤效率达到60％以上，对胃癌细胞AGS的杀伤效率为40％以上。参见图5～图7。
实施例2
1.细胞培养
(1)配制培养基
①诱导培养基：RPMI 1640+体积浓度为10％的FBS+GlutaMAXTM添加剂(100×)+IL-2(100IU/mL)+15(10ng/mL)+OK432(1μg/mL)；
②扩增培养基：RPMI 1640+体积浓度为10％的FBS+GlutaMAXTM添加剂(100×)+IL-2(400IU/mL)+15(20ng/mL)；
(2)包被刺激物
①MICA(50μg)用25μLPBS溶解，储存浓度分别为2mg/mL；
Anti-CD52和MICA包被用量：用PBS分别将其稀释到包被浓度，加入到6孔板，1mL/孔，4℃包被过夜；
②Anti-CD16(储存浓度：1mg/mL)；Anti-CD52(储存浓度：1mg/mL)；
抗体包被用量：分别用PBS稀释到包被浓度，加入到6孔板，1mL/孔，4℃包被过夜；
③包被6孔板：用PBS将刺激物稀释到包被浓度，1mL/孔，4℃包被过夜；
(3)复苏的PBMC
PBMC细胞计数后，用诱导培养基将其稀释到1×106cells/mL；
(4)将包被好的6孔板从冰箱拿出，弃去包被液，并用PBS洗两遍，以便去除未包被的刺激物；
(5)将稀释好的PBMC加入到包被好的6孔板中，2mL/孔，诱导培养5～7天，根据细胞生长情况补加细胞因子和诱导培养基；
(6)诱导培养7天后，改用扩增培养基，且D6后开始细胞计数，记细胞密度和细胞活力，并且根据实际情况隔天处理细胞，补因子和补液；
(7)D7、D10，D14，D18、D21和D24流式检测细胞表面受体(CD57、CD69、CD94、CD314和CD336)表达情况和流式3检测CD3、CD4、CD8、CD56和CD16；
(8)D18、D21和D24细胞因子检测和杀伤检测。
外周血种分离出的单个核细胞PBMC，直接用细胞因子和蛋白刺激培养，其中Anti-CD 52能显著提高自然杀伤细胞的扩增倍数。
2.实验结果：
(1)对细胞活力的影响
由细胞活率的变化(8)可知，细胞培养过程中，从细胞培养的Days 0至Days 6，细胞活率逐渐降低(细胞活率从94％左右降至70％左右)；从细胞培养的Days 6之后，细胞活率逐渐升高，直至保持稳定，达到90％左右；细胞培养的Days 26，部分组SNK的细胞活率降低。
(2)对总细胞扩增倍数的影响
由总细胞扩增情况(图9)可知，与PBS组(MICA+CD16组)相比，Anti-CD5210μg/mL组总细胞扩增倍数最高(平均达到2737.0倍)，Anti-CD5220μg/mL组次之，而Anti-CD525μg/mL组无显著区别。
(3)对NK细胞扩增倍数的影响
由NK细胞扩增情况(图10)可知，与PBS组(MICA+CD16组)相比，Anti-CD52组NK细胞扩增倍数明显增高，且Anti-CD5210μg/mL组NK细胞扩增倍数最高(平均达到9711.5倍)，Anti-CD525μg/mL组和Anti-CD5220μg/mL组次之。
(4)对细胞表型的影响
1)对NK细胞比值的影响
由流式结果(图11)可知，与PBS组相比，Anti-CD525μg/mL组NK比值较高，但无显著差异；细胞培养过程中，细胞培养的Days 10至Days 18，NK细胞比值逐渐增加；Days18之后，NK细胞比值保持稳定；细胞培养的Days 25，各组NK细胞比值均降低。
2)对NK中CD16+细胞比值的影响
由流式结果(图12)可知，NK中CD16+细胞的比值Anti-CD52组与PBS组无显著差异；细胞培养过程中，细胞培养的Days 10至Days 18，NK中CD16+细胞所占比值逐渐增加；从细胞培养的Days 18至Days 25，NK细胞比值保持稳定，达到95％左右。
3)对NKT细胞比值的影响
由流式结果(图13)可知，与PBS组相比，Anti-CD52组NKT比值较低；细胞培养的过程中，各组NKT细胞比值逐渐增加。
4)对T细胞比值的影响
由流式结果(图14)可知，细胞培养过程中，Anti-CD52组T细胞比值与PBS组无显著区别，且各组T细胞比值逐渐降低。
5)对NK+NKT细胞比值的影响
由流式结果(图15)可知，细胞培养的Days 10至Days 18，PBS组和Anti-CD52组NK+NKT细胞比值逐渐增加；细胞培养的Days 18至Days 25，各组NK+NKT细胞比值保持稳定，达到91％左右。
(5)对靶细胞杀伤的影响
1)对靶细胞DLD-1杀伤的影响
由杀伤结果(图16)可知，效靶比10:1时，细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞DLD-1的杀伤作用较好，且与PBS组相比，Anti-CD5210μg/mL组对DLD-1的杀伤作用较强，Anti-CD525μg/mL组和Anti-CD5220μg/mL组次之。
2)对靶细胞H358杀伤的影响
由杀伤结果(图17)可知，效靶比10:1时，细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞H358的杀伤作用较好，而PBS组和Anti-CD52组对H358的杀伤作用无差异；细胞培养的Days 18和Days25，与PBS组相比，Anti-CD52组对H358的杀伤作用较弱。
3)对靶细胞AGS杀伤的影响
由杀伤结果(图18)可知，效靶比10:1时，细胞培养的过程中，各组SNK对靶细胞AGS的杀伤作用逐渐增加，且与PBS组相比，Anti-CD52组对AGS的杀伤作用较弱。
(6)对NK细胞表面功能Marker的影响
1)对NK细胞表面功能Marker CD69的影响
由流式检测结果(如图19)可知，细胞培养过程中，各个组CD69+细胞占NK细胞比值逐渐升高，且Days 18之后，Anti-CD525μg/mL组CD69+细胞占NK细胞比值高于PBS组。
2)对NK细胞表面功能Marker CD336的影响
由流式检测结果(如图20)可知，细胞培养的Days 14至Days 21，各个组CD339+细胞占NK细胞比值逐渐升高，且PBS组与Anti-CD52组无差异；细胞培养的Days 25，Anti-CD525μg/mL组CD336+细胞占NK细胞比值高于PBS组，且PBS组CD336+细胞占NK细胞比值降低。
综上所述，细胞培养Days 28，Anti-CD52组NK细胞表面CD69和CD336的表达均高于PBS组；细胞培养过程中，NK细胞表面CD69和CD336的表达逐渐升高，而后期降低。
小结
(1)Anti-CD52组总细胞扩增倍数高于PBS组，且Anti-CD5210μg/mL组总细胞扩增倍数最高(平均达到2737.0倍)。
(2)Anti-CD52组NK细胞扩增倍数显著高于PBS组，Anti-CD5210μg/mL组NK细胞扩增倍数最高，平均达到9711.5倍；nti-CD52组扩增的细胞NK细胞比例大于80％。
(3)与PBS组相比，Anti-CD525μg/mL组NK比值较高，但无显著差异。
(4)细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞DLD-1和H358的杀伤作用较好，Anti-CD5210μg/mL组对DLD-1的杀伤作用较强，而对H358和AGS的杀伤作用与PBS组无差异；当效靶比为10：1时，D21细胞对肠癌细胞DLD-1的杀伤效率大于80％，肺癌细胞H358的杀伤效率大于70％，对胃癌AGS的杀伤效率大于50％。
(5)细胞培养Days 25，Anti-CD525μg/mL组NK细胞表面CD69和CD336的表达均高于PBS组，且细胞培养过程中，CD69和CD336的表达逐渐升高，而后期降低。
实施例3
1.细胞培养
(1)配制培养基
①诱导培养基：RPMI 1640+体积浓度为10％的FBS+GlutaMAXTM添加剂(100×)+IL-2(100IU/mL)+15(10ng/mL)+OK432(1μg/mL)；
②扩增培养基：RPMI 1640+体积浓度为10％的FBS+GlutaMAXTM添加剂(100×)+IL-2(400IU/mL)+15(20ng/mL)；
(2)包被刺激物
①MICA(50μg)用25μLPBS溶解，储存浓度分别为2mg/mL；
4-1BBL和MICA包被用量：用PBS分别将其稀释到包被浓度，加入到6孔板，1mL/孔，4℃包被过夜；
②Anti-CD16(储存浓度：1mg/mL)；；Anti-CD52(储存浓度：1mg/mL)；
抗体包被用量：分别用PBS稀释到包被浓度，加入到6孔板，1mL/孔，4℃包被过夜；
③包被6孔板：用PBS将刺激物稀释到包被浓度，1mL/孔，4℃包被过夜；
(3)复苏的PBMC
PBMC细胞计数后，用诱导培养基将其稀释到1×106cells/mL；
(4)将包被好的6孔板从冰箱拿出，弃去包被液，并用PBS洗两遍，以便去除未包被的刺激物；
(5)将稀释好的PBMC加入到包被好的6孔板中，2mL/孔，诱导培养5～7天，根据细胞生长情况补加细胞因子和诱导培养基；
(6)诱导培养7天后，改用扩增培养基，且D6后开始细胞计数，记细胞密度和细胞活力，并且根据实际情况隔天处理细胞，补因子和补液；
(7)D7、D10，D14，D18、D21和D24流式检测细胞表面受体(CD57、CD69、CD94、CD314和CD336)表达情况和流式3检测CD3、CD4、CD8、CD56和CD16；
(8)D18、D21和D24细胞因子检测和杀伤检测。
外周血中分离的PBMC细胞，直接刺激培养，培养起始阶段添加4-1BBL包被能显著提高NK细胞扩增倍数。
1.对细胞活力的影响
由细胞活率的变化(图21)可知，细胞培养过程中，从细胞培养的Days 0至Days 6，细胞活率降低(细胞活率从94％左右降至72％左右)；从细胞培养的Days 6之后，细胞活率逐渐升高，直至保持稳定，达到91％左右；细胞培养的Days 26，部分组SNK的细胞活率降低。
2.对总细胞扩增倍数的影响
由总细胞扩增情况(图22)可知，细胞培养过程中，与PBS组(MICA+CD16组)相比，4-1BBL 1μg/mL组总细胞扩增倍数最高(平均达到2662.0倍)，4-1BBL 5μg/mL组次之，而4-1BBL 10μg/mL组无差异。
3.对NK细胞扩增倍数的影响
由NK细胞扩增情况(图23)可知，与PBS组(MICA+CD16组)相比，4-1BBL 1μg/mL组NK细胞扩增倍数最高(平均达到9656.4倍)，4-1BBL 5μg/mL组次之(平均达到8102.3倍)，而4-1BBL 10μg/mL组无差异。
4.对细胞表型的影响
(1)对NK细胞比值的影响
由流式结果(图24)可知，4-1BBL组NK细胞比值与PBS组无差异；细胞培养过程中，从培养的Days 10至Days 18，NK细胞比值逐渐增加；Days18之后，NK细胞比值保持稳定，达到80％左右；细胞培养的Days 25，PBS组和4-1BBL组的NK细胞比值均降低。
(2)对NK中CD16+细胞比值的影响
由流式结果(图25)可知，NK中CD16+细胞的比值4-1BBL组与PBS组无显著差异；细胞培养过程中，从细胞培养的Days 10至Days 18，NK中CD16+细胞比值逐渐增加；从细胞培养的Days 18至Days 25，NK细胞比值保持稳定，达到95％左右。
(3)对NKT细胞比值的影响
由流式结果(图26)可知，细胞培养的Days 21至Days 25，与PBS组相比，4-1BBL组NKT比值较低；培养的Days 10至Days 25，4-1BBL组和PBS组NKT细胞比值均逐渐增加。
(4)对NKT中CD16+细胞比值的影响
由流式结果(图27和表3)可知，细胞培养的Days 10至Days 25，4-1BBL组和PBS组NKT中CD16+细胞比值均逐渐增加；培养的Days 10至Days 18，4-1BBL组和PBS组NKT中CD16+细胞比值无差异；培养的Days 21至Days 25，4-1BBL组组NKT中CD16+细胞比值高于PBS组。
表3不同浓度4-1BBL包被培养中NKT中CD16+细胞比值(％)
Figure BDA0003743867940000131
(5)对T细胞比值的影响
由流式结果(图28)可知，细胞培养过程中，PBS组和4-1BBL组T细胞比值均逐渐降低，且各组间T细胞比值无差异。
(6)对NK+NKT细胞比值的影响
由流式结果(图29)可知，细胞培养的Days 10至Days 18，PBS组和4-1BBL组NK+NKT细胞比值均逐渐增加；细胞培养的Days 18至Days 25，PBS组和4-1BBL组NK+NKT细胞比值保持稳定，达到90％左右。
5.对靶细胞杀伤的影响
(1)对靶细胞DLD-1杀伤的影响
由杀伤结果(图30)可知，效靶比10:1时，细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞DLD-1的杀伤作用较好，且与PBS组相比，4-1BBL 1μg/mL组对DLD-1的杀伤作用较强，4-1BBL5μg/mL组和4-1BBL 10μg/mL组无差异。
(2)对靶细胞H358杀伤的影响
由杀伤结果(图31)可知，效靶比10:1时，细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞H358的杀伤作用较好，且4-1BBL 1μg/mL组对H358的杀伤作用强与PBS组，而PBS组对H358的杀伤作用显著强于4-1BBL 10μg/mL组；细胞培养的Days 18和Days 25，PBS组对H358的杀伤作用强于4-1BBL组。
(3)对靶细胞AGS杀伤的影响
由杀伤结果(图32)可知，效靶比10:1时，细胞培养的过程中，PBS组对靶细胞AGS的杀伤作用逐渐增加，且细胞培养的Days 18和Days 25，PBS组对AGS的杀伤作用强于4-1BBL组。
6.对NK细胞表面功能Marker的影响
(1)对NK细胞表面功能Marker CD69的影响
由流式检测结果(如图33)可知，细胞培养过程中，4-1BBL 10μg/mL组和PBS组CD69+细胞占NK细胞比值均逐渐升高，且无差异。
(2)对NK细胞表面功能Marker CD336的影响
由流式检测结果(如图34)可知，细胞培养过程中，4-1BBL 10μg/mL组和PBS组CD336+细胞占NK细胞比值逐渐升高，且4-1BBL 10μg/mL组高于PBS组，但无差异；细胞培养的Days21达到最高，而细胞培养的Days 25，CD336+细胞占NK细胞比值均降低。
综上所述，细胞培养过程中，NK细胞表面CD69和CD336的表达逐渐升高，而NK细胞表面CD336的表达后期降低。
小结
(1)4-1BBL 1μg/mL组总细胞扩增倍数最高，平均达到2662.0倍。
(2)4-1BBL组NK细胞扩增倍数高于PBS组，4-1BBL 1μg/mL组NK细胞扩增倍数最高，平均达到9656.4倍。
(3)4-1BBL组扩增的细胞NK细胞比例大于80％。
(4)细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞DLD-1、H358和AGS的杀伤作用较好，4-1BBL1μg/mL组对DLD-1和H358的杀伤作用较强，而PBS组对AGS的杀伤作用强于4-1BBL组；当效靶比为10：1时，D21细胞对肠癌细胞DLD-1和肺癌细胞H358的杀伤效率大于80％，对胃癌AGS的杀伤效率大于50％。
(5)细胞培养过程中，NK细胞表面CD69和CD336的表达逐渐升高，而NK细胞表面CD336的表达后期降低。
实施例4
细胞培养：
(1)配制培养基
①诱导培养基：RPMI 1640+体积浓度为10％的FBS+GlutaMAXTM添加剂(100×)+IL-2(100IU/mL)+15(10ng/mL)+OK432(1μg/mL)；
②扩增培养基：RPMI 1640+体积浓度为10％的FBS+GlutaMAXTM添加剂(100×)+IL-2(400IU/mL)+15(20ng/mL)；
(2)包被刺激物
①MICA(50μg)用25μLPBS溶解，储存浓度分别为2mg/mL；
OX40L和MICA包被用量：用PBS分别将其稀释到包被浓度，加入到6孔板，1mL/孔，4℃包被过夜；
②Anti-CD16(储存浓度：1mg/mL)；Anti-CD52(储存浓度：1mg/mL)；
抗体包被用量：分别用PBS稀释到包被浓度，加入到6孔板，1mL/孔，4℃包被过夜；
③包被6孔板：用PBS将刺激物稀释到包被浓度，1mL/孔，4℃包被过夜；
(3)复苏的PBMC
PBMC细胞计数后，用诱导培养基将其稀释到1×106cells/mL；
(4)将包被好的6孔板从冰箱拿出，弃去包被液，并用PBS洗两遍，以便去除未包被的刺激物；
(5)将稀释好的PBMC加入到包被好的6孔板中，2mL/孔，诱导培养5～7天，根据细胞生长情况补加细胞因子和诱导培养基；
(6)诱导培养7天后，改用扩增培养基，且D6后开始细胞计数，记细胞密度和细胞活力，并且根据实际情况隔天处理细胞，补因子和补液；
(7)D7、D10，D14，D18、D21和D24流式检测细胞表面受体(CD57、CD69、CD94、CD314和CD336)表达情况和流式3检测CD3、CD4、CD8、CD56和CD16；
(8)D18、D21和D24细胞因子检测和杀伤检测。
由外周血分离的PBMC，直接刺激培养SNK细胞，起始培养阶段加入OX40L包被后，能显著提高NK细胞的扩增倍数。
实验结果：
(1)对细胞活力的影响
由细胞活率的变化(图35)可知，细胞培养过程中，从细胞培养的Days 0至Days 6，细胞活率降低(细胞活率从94％左右降至70％左右)；从细胞培养的Days 6之后，细胞活率逐渐升高，直至保持稳定，达到91％左右；细胞培养的Days 26，部分组SNK的细胞活率降低。
(2)对总细胞扩增倍数的影响
由总细胞扩增情况(图36)可知，细胞培养过程中，与PBS组(MICA+CD16组)相比，OX40L 1μg/mL组总细胞扩增倍数最高(平均达到2585.6倍)，OX40L 10μg/mL组次之，OX40L5μg/mL组次次之。
(3)对NK细胞扩增倍数的影响
由NK细胞扩增情况(图37)可知，与PBS组(MICA+CD16组)相比，OX40L组NK细胞扩增倍数明显增高，且OX40L 1μg/mL组NK细胞扩增倍数最高(平均达到9461.9倍)，OX40L10μg/mL组次之(平均达到8068.6倍)，OX40L 1μg/mL组次次之(平均达到7001.1倍)。
(4)对细胞表型的影响
a)对NK细胞比值的影响
由流式结果(图38)可知，与PBS组相比，OX40L 1μg/mL组NK比值较高，但无显著差异；细胞培养的Days 10至Days 18，NK细胞所占比值逐渐增加；从细胞培养的Days18之后，NK细胞比值保持稳定，达到80％左右；细胞培养的Days 25，部分组NK细胞比值稍微降低(从平均值80％左右降至76％左右)。
b)对NK中CD16+细胞比值的影响
由流式结果(图39)可知，NK中CD16+细胞的比值OX40L组与PBS组无显著差异；细胞培养的Days 10至Days 18，NK中CD16+细胞所占比值逐渐增加；从细胞培养的Days 18至Days25，NK细胞比值保持稳定，达到95％左右。
c)对NKT细胞比值的影响
由流式结果(图40)可知，与PBS组相比，OX40L 1μg/mL组NKT比值较低；细胞培养的Days 14至Days 25，各组NKT细胞比值均逐渐增加。
d)对NKT中CD16+细胞比值的影响
由流式结果(图41)可知，细胞培养的Days 10至Days 25，各组NKT中CD16+细胞比值逐渐增加，且各组间无差异。
e)对T细胞比值的影响
由流式结果(图42)可知，细胞培养过程中，PBS组和OX40L组T细胞比值均逐渐降低，且各组间无差异。
f)对NK+NKT细胞比值的影响
由流式结果(图43)可知，细胞培养的Days 10至Days 18，PBS组和OX40L组NK+NKT细胞比值逐渐增加；细胞培养的Days 18至Days 25，PBS组和OX40L组NK+NKT细胞比值保持稳定，达到90％左右。
(5)对靶细胞杀伤的影响
a)对靶细胞DLD-1杀伤的影响
由杀伤结果(图44)可知，效靶比10:1时，细胞培养的Days 18和Days 21，各组SNK对靶细胞DLD-1的杀伤作用无差异；细胞培养的Days25，与PBS组相比，OX40L组对DLD-1的杀伤作用较弱。
b)对靶细胞H358杀伤的影响
由杀伤结果(图45)可知，效靶比10:1时，细胞培养的Days 21，OX40L组对H358的杀伤作用与PBS组无差异；细胞培养的Days 18和Days 25，与PBS组相比，OX40L组对H358的杀伤作用较弱。
c)对靶细胞AGS杀伤的影响
由杀伤结果(图46)可知，效靶比10:1时，细胞培养的Days 21，OX40L组对AGS的杀伤作用与PBS组无差异；细胞培养的Days 18和Days 25，与PBS组相比，OX40L组对AGS的杀伤作用较弱。
(6)对NK细胞表面功能Marker的影响
a)对NK细胞表面功能Marker CD69的影响
由流式检测结果(如图47)可知，随着SNK细胞的培养，各个组CD69+细胞占NK细胞比值逐渐升高，Days 18之后保持稳定，达到75％左右，且PBS组与OX40L 5μg/mL组无差异，而细胞培养的Days 25，CD69+细胞占NK细胞比值均降低。
b)对NK细胞表面功能Marker CD336的影响
由流式检测结果(如图48)可知，随着SNK细胞的培养，各个组CD336+细胞占NK细胞比值逐渐升高，且PBS组明显高于OX40L 5μg/mL组，细胞培养的Days 21达到最高，而细胞培养的Days 25，CD336+细胞占NK细胞比值均降低。
综上所述，PBS组NK细胞表面CD336的表达均高于OX40L 5μg/mL组；细胞培养过程中，NK细胞表面CD69和CD336的表达逐渐升高，而后期降低。
小结
(1)OX40L 1μg/mL组总细胞扩增倍数最高，平均达到2585.6倍；
(2)OX40L组NK细胞扩增倍数显著高于PBS组，OX40L 1μg/mL组NK细胞扩增倍数最高，平均达到9461.9倍；
(3)OX40L 1μg/mL组NK比值较高，比例大于80％；
(4)细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞DLD-1、H358和AGS的杀伤作用较强，OX40L组对DLD-1、H358和AGS的杀伤作用无差异；细胞培养的Days 25，PBS组对DLD-1、H358和AGS的杀伤作用强于OX40L组；当效靶比为10：1时，D21细胞对肠癌细胞DLD-1的杀伤效率大于80％，对肺癌细胞H358细胞的杀伤效率大于70％，对胃癌AGS的杀伤效率大于50％。
(5)PBS组NK细胞表面CD336的表达均高于OX40L 5μg/mL组；细胞培养过程中，NK细胞表面CD69和CD336的表达逐渐升高，而后期降低。
实施例6
1.细胞培养:
(1)配制培养基
①诱导培养基：RPMI 1640+体积浓度为10％的FBS+GlutaMAXTM添加剂(100×)+IL-2(100IU/mL)+15(10ng/mL)+OK432(1μg/mL)；
②扩增培养基：RPMI 1640+体积浓度为10％的FBS+GlutaMAXTM添加剂(100×)+IL-2(400IU/mL)+15(20ng/mL)；
(2)包被刺激物
①MICA(50μg)用25μLPBS溶解，储存浓度分别为2mg/mL；
anti-CD137和MICA包被用量：用PBS分别将其稀释到包被浓度，加入到6孔板，1mL/孔，4℃包被过夜；
②Anti-CD16(储存浓度：1mg/mL)；Anti-CD137(储存浓度：1～15mg/mL)；抗体包被用量：分别用PBS稀释到包被浓度，加入到6孔板，1mL/孔，4℃包被过夜；
③包被6孔板：用PBS将刺激物稀释到包被浓度，1mL/孔，4℃包被过夜；
(3)复苏的PBMC
PBMC细胞计数后，用诱导培养基将其稀释到1×106cells/mL；
(4)将包被好的6孔板从冰箱拿出，弃去包被液，并用PBS洗两遍，以便去除未包被的刺激物；
(5)将稀释好的PBMC加入到包被好的6孔板中，2mL/孔，诱导培养5～7天，根据细胞生长情况补加细胞因子和诱导培养基；
(6)诱导培养7天后，改用扩增培养基，且D6后开始细胞计数，记细胞密度和细胞活力，并且根据实际情况隔天处理细胞，补因子和补液；
(7)D7、D10，D14，D18、D21和D24流式检测细胞表面受体(CD57、CD69、CD94、CD314和CD336)表达情况和流式3检测CD3、CD4、CD8、CD56和CD16；
(8)D18、D21和D24细胞因子检测和杀伤检测。
外周血中分离的PBMC细胞，直接刺激培养NK细胞，在培养的初始阶段，包被无中加入Anti-CD137单抗，能提高NK细胞的扩增倍数和细胞对肿瘤靶细胞的杀伤能力。
2.实验结果：
(1)对细胞活力的影响
由细胞活率的变化(图49)可知，细胞培养过程中，从细胞培养的Days 0至Days 6，细胞活率逐渐降低(细胞活率从95％左右降至70％左右)；从细胞培养的Days 6之后，细胞活率逐渐升高，直至保持稳定，达到91％左右；细胞培养的Days 26，各组SNK细胞活率降低。
(2)对总细胞扩增倍数的影响
由总细胞扩增情况(图50)可知，细胞培养过程中，Anti-CD137组总细胞扩增倍数与PBS组(MICA+CD16组)无差异，总细胞扩增倍数均达到1600倍左右。
(3)对NK细胞扩增倍数的影响
由NK细胞扩增情况(图51)可知，与PBS组(MICA+CD16组)相比，Anti-CD137组NK细胞扩增倍数较高，且Anti-CD1375μg/mL组NK细胞扩增倍数最高(平均达到6650.5倍)，Anti-CD13710μg/mL组和Anti-CD1371μg/mL组无差异。
(4)对细胞表型的影响
a)对NK细胞比值的影响
由流式结果(图52)可知，与PBS组相比，Anti-CD1375μg/mL组NK比值稍高，而其它浓度组无差异；细胞培养过程中，从细胞培养的Days 10至Days 18，NK细胞比值逐渐增加；从细胞培养的Days18之后，NK细胞比值保持稳定，达到80％左右；细胞培养的Days 25，各组NK细胞比值稍微降低。
b)对NK中CD16+细胞比值的影响
由流式结果(图53)可知，NK中CD16+细胞的比值Anti-CD137组与PBS组无差异；细胞培养过程中，从细胞培养的Days 10至Days 14，NK中CD16+细胞所占比值增加；从细胞培养的Days 18至Days 25，NK细胞比值保持稳定，达到96％左右。
c)对NKT细胞比值的影响
由流式结果(图54)可知，与PBS组相比，Anti-CD137组NKT比值较低，且Anti-CD1375μg/mL组最低；细胞培养的Days 10至Days 25，各组NKT细胞比值均逐渐增加。
d)对NKT中CD16+细胞比值的影响
由流式结果(图55)可知，细胞培养的Days 10至Days 25，各组NKT中CD16+细胞比值均逐渐增加，且各组间无差异。
e)对T细胞比值的影响
由流式结果(图56)可知，细胞培养的Days 10至Days 25，Anti-CD137组T细胞比值与PBS组无差异；细胞培养过程中，PBS组和Anti-CD137组T细胞比值均逐渐降低。
f)对NK+NKT细胞比值的影响
由流式结果(图57)可知，细胞培养的Days 10至Days 18，PBS组和Anti-CD137组NK+NKT细胞比值均逐渐增加，各组间无差异；细胞培养的Days 18至Days 25，PBS组和Anti-CD137组NK+NKT细胞比值保持稳定，达到91％左右。
(5)对靶细胞杀伤的影响
a)对靶细胞DLD-1杀伤的影响
由杀伤结果(图58)可知，效靶比10:1时，细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞DLD-1的杀伤作用较好，且与PBS组相比，Anti-CD13720μg/mL组对DLD-1的杀伤作用较强，Anti-CD1375μg/mL组和Anti-CD13710μg/mL组无差异。
b)对靶细胞H358杀伤的影响
由杀伤结果(图59)可知，效靶比10:1时，细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞H358的杀伤作用较好，且与PBS组相比，Anti-CD13720μg/mL组对H358的杀伤作用较强，Anti-CD1375μg/mL组和Anti-CD13710μg/mL组无差异；细胞培养的Days 18和Days 25，与PBS组相比，Anti-CD137组对H358的杀伤作用较弱。
c)对靶细胞AGS杀伤的影响
由杀伤结果(图60)可知，效靶比10:1时，细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞AGS的杀伤作用较好，且各组之间无差异；细胞培养的Days 25，与PBS组相比，Anti-CD137组对AGS的杀伤作用较弱。
(6)对NK细胞表面功能Marker的影响
a)对NK细胞表面功能Marker CD69的影响
由流式检测结果(如图61)可知，随着SNK细胞的培养，各个组CD69+细胞占NK细胞比值逐渐升高，Days 18之后保持稳定，达到75％左右，且PBS组与Anti-CD13710μg/mL组无差异，而细胞培养的Days 25，PBS组CD69+细胞占NK细胞比值降低。
b)对NK细胞表面功能Marker CD336的影响
由流式检测结果(如图62)可知，随着SNK细胞培养，各个组CD336+细胞占NK细胞比值逐渐升高，且细胞培养的Days 21达到最高；细胞培养的Days 25，CD336+细胞占NK细胞比值均降低，且Anti-CD13710μg/mL组高于PBS组。
综上所述，细胞培养过程中，NK细胞表面CD69和CD336的表达逐渐升高，而后期降低。
小结
(1)Anti-CD137组总细胞扩增倍数与PBS组无差异，扩增倍数均达到1600倍左右。
(2)Anti-CD137组NK细胞扩增倍数高于PBS组，Anti-CD1375μg/mL组NK细胞扩增倍数最高，平均达到6650.5倍。
(3)Anti-CD1375μg/mL组NK比值较高，扩增的细胞NK细胞比例大于80％。
(4)细胞培养的Days 21，SNK对靶细胞DLD-1、H358和AGS的杀伤作用较强，Anti-CD13720μg/mL组对DLD-1和H358的杀伤作用较强；细胞培养的Days 25，PBS组对H358和AGS的杀伤作用强于Anti-CD137组。当效靶比为10：1时，D21细胞对肠癌细胞DLD-1的杀伤效率大于80％，对肺癌细胞H358细胞的杀伤效率大于70％，对胃癌AGS的杀伤效率大于50％。
(5)细胞培养过程中，NK细胞表面CD69和CD336的表达逐渐升高，而后期降低。

Claims (10)

1.一种包被刺激物，包括MICA、Anti-CD16和第三组分；所述第三组分包括Anti-CD52、4-1BBL、OX40L和Anti-CD137中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的包被刺激物，其特征在于，所述第三组分包括Anti-CD52、4-1BBL、OX40L和Anti-CD137中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的包被刺激物，其特征在于，所述MICA、Anti-CD16和第三组分的质量比为：(1～5)：(0.5～5)：(1～30)。
4.一种自然杀伤细胞的培养试剂盒，包括权利要求1～3任意一项所述的包被刺激物、诱导培养基和扩增培养基。
5.根据权利要求4所述的培养试剂盒，其特征在于，所述诱导培养基以RPMI 1640为基础培养基，包括以下浓度的组分：体积浓度为10％的FBS、100×GlutaMAXTM添加剂、IL-250～300IU/mL、IL-155～30ng/mL和OK4320.5～5μg/mL。
6.根据权利要求4所述的培养试剂盒，其特征在于，所述扩增培养基以RPMI 1640为基础培养基，包括以下浓度的组分：体积浓度为10％的FBS、100×GlutaMAXTM添加剂、IL-2200～1000IU/mL和IL-1510～50ng/mL。
7.一种自然杀伤细胞的培养方法，包括以下步骤：
采用权利要求1～3任意一项所述的包被刺激物包被6孔培养板，得到包被好的6孔培养板；
将诱导培养基和外周血单个核细胞加入到所述包被好的6孔培养板中，进行诱导培养，得到诱导培养细胞；
将所述诱导培养细胞接种到扩增培养基中，进行扩增培养，得到自然杀伤细胞。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述包被刺激物中MICA的工作浓度为1～5μg/mL；所述Anti-CD16的工作浓度为0.5～5μg/mL。
9.根据权利要求7或8所述的培养方法，其特征在于，
当所述第三组分包括Anti-CD52时，所述Anti-CD52的工作浓度为1～20μg/mL；
当所述第三组分包括4-1BBL时，所述4-1BBL的工作浓度为1～20μg/mL；
当所述第三组分包括OX40L时，所述OX40L的工作浓度为1～15μg/mL；
当所述第三组分包括Anti-CD137时，所述Anti-CD137的工作浓度为1～20μg/mL。
10.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞的初始细胞浓度为1×106～9×106cells/mL。
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