WO2020231205A1 - 자연 살해 세포의 배양용 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

자연 살해 세포의 배양용 조성물 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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natural killer
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곽규범
오수연
이해종
심정민
임재준
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차의과학대학교 산학협력단
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Definitions

  • cancer immunotherapy which has recently emerged, is a treatment that more specifically removes cancer cells by minimizing damage to normal cells by utilizing the body's own immune system, and has various fields (antibody therapy, immune cell therapy, virus). Immunotherapy, nanotechnology immunotherapy, etc.) are being actively researched.
  • immune cell therapy is a natural killer cell (NK cell), natural killer T cell, T cell, B cell, and dendritic cell among lymphocytes obtained from the patient's blood.
  • NK cells are important cells responsible for innate immunity, and have the function of self-identifying and killing abnormal cells such as virus-infected cells or tumor cells. In addition, it can recognize tumors and cells infected with viruses that T cells do not recognize, and has excellent safety characteristics compared to T cells. Accordingly, for the past 10 years, tumor immunotherapy using the patient's immune system has been steadily developed, and cell therapy products using the same have been commercialized.
  • NK cells In order to develop cell therapy products using NK cells, it is necessary to strengthen, activate, cultivate, and expand the functions of NK cells. For culture or expansion of conventional NK cells, donor cells are required during culture. Cells such as K562 are used as conventional donor cells, which are unsuitable for clinical use as cancer cells.
  • One aspect provides a composition for culturing natural killer cells.
  • Another aspect provides a method of culturing natural killer cells using the composition for culturing natural killer cells.
  • One aspect provides a composition for culturing natural killer cells.
  • the composition for culturing natural killer cells is a magnetically activated receptor ligand, an inhibitory receptor ligand, a costimulatory receptor ligand, a cytokine, a cytokine receptor, an immune checkpoint ligand, a blocking antibody, or a combination thereof attached to at least one surface. It may be a composition for culturing natural killer cells including particles.
  • natural killer cell refers to large granular lymphocytes (LGL), which is a type of lymphocyte, and has excellent ability to kill infected viruses and tumor cells, and most normal cells Has the property of not killing.
  • LGL large granular lymphocytes
  • natural killer cells play an important role in the early stages of viral infection or tumorigenesis before large quantities of active cytotoxic T lymphocytes are produced. For example, when a natural killer cell comes into contact with a target cell, some molecules lyse the cell by forming a hole in the target cell's membrane, while another molecule enters the target cell and increases the fragmentation of nuclear DNA, causing necrosis ( necrosis), Apotosis, or Programmed cell death.
  • the natural killer cells may be derived from, for example, mammals, humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice or rabbits.
  • the natural killer cells may be obtained from a normal person or a cancer patient.
  • the natural killer cells may be isolated from blood or peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the composition comprises magnetic particles to which an activating receptor ligand, an inhibitory receptor ligand, a costimulatory receptor ligand, a cytokine, a cytokine receptor, an immune checkpoint ligand, a blocking antibody, or a combination thereof is attached to at least one surface thereof, Natural killer cells compared to a composition for culturing natural killer cells containing a soluble activated receptor ligand, an inhibitory receptor ligand, a costimulatory receptor ligand, a cytokine, a cytokine receptor, an immune checkpoint ligand, a blocking antibody, or a combination thereof The effect of activating, proliferating, expanding or inhibiting is increased.
  • the activating receptor ligand is a protein expressed in solid cancer or transformed cells including blood cancer cells, virus infected cells, and stressed cells. , It may refer to a substance capable of inducing activation and actuating functions of NK cells through binding with the aforementioned NK cell receptor.
  • the activating receptor ligand may include ligands for the natural cytotoxicity receptor (NCR) family, the NKG2 family, and the killer cell immunoglobulin like receptor (KIR) family, which are three classifications according to the structure of the NK cell activation receptor.
  • the activating receptor ligand is, for example, one selected from the group consisting of BAG6, AICL, MICA, MICB, CADM1, IgG, CD48, NTB-A/SLAMF6, CD70, CD155, CD319, C8, C9, and CS1. It can be more than that.
  • activating receptor ligand may refer to a substance capable of activating a receptor by binding to a specific site of the receptor.
  • the inhibitory receptor ligand is, for example, HLA-A, HLA-B, HLA-BW4, HLA-C1, HLA-C2, HLA-E, HLA-G, CD112/Nectin-2 , CD112/Nectin-3, cadherin, collagen, OCIL, and CLEC2D may be one or more selected from the group consisting of.
  • inhibitory receptor ligand may refer to a substance capable of inhibiting a receptor by binding to a specific site of the receptor.
  • the co-stimulatory receptor ligand may include a TNF family (Tumor necrosis factor family) ligand, a TLR family (Toll-like receptor family) ligand, and a virus related glycoprotein ligand.
  • the co-stimulatory receptor ligand may be, for example, at least one selected from the group consisting of 4-1BB ligand, CD28 ligand, NTBA, TLRL, PVR/Nectin-2, and PVR.
  • co-stimulatory receptor ligand is a protein/glycoprotein expressed in most nucleated cells and viruses, and may refer to a ligand capable of binding to co-stimulatory receptors.
  • the co-stimulatory receptor ligand is a material that mediates a secondary signal, and may refer to a material that enhances the activation and actuating functions of NK cells by enhancing the primary signal of NK cells upon binding to the co-stimulatory receptor.
  • the cytokine is IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 , IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, and may be one or more selected from the group consisting of IL-27.
  • the cytokine receptor may be IL-2R ⁇ , IL-15R ⁇ , or a combination thereof.
  • the immune checkpoint ligand may include the B7 family, the galectin family, and the PVR family.
  • the immune checkpoint ligand may be, for example, one or more selected from the group consisting of PD-L1, BTLA-4 ligand, CTLA-4 ligand (CD80), Tim-3 ligand, IDO, A2AR, and TIGIT ligand. .
  • immune checkpoint ligand may refer to a protein that modulates the immune system for self-tolerance.
  • the blocking antibody is anti-KIR2DL1 monoclonal antibody (mAb), anti-KIR2DL2 mAb, anti-KIR2DL3 mAb, anti-KIR2DL5A mAb, anti-KIR2DL5B mAb, anti-KIR3DL1 mAb, anti-KIR3DL2 mAb, anti-KIR2DL4 mAb, anti-CD94/NKG2A mAb, anti-CD94/NKG2B mAb, anti-CD96 mAb, anti-CEACAM-1 mAb, anti-ILT2/LILRB mAb, anti-KLRG1 mAb, anti-LAIR1 mAb, It may be one or more selected from the group consisting of anti-NKRP1A mAb, anti-Siglec3 mAb, anti-Siglec7 mAb, and anti-Siglec9 mAb.
  • mAb monoclonal antibody
  • anti-KIR2DL2 mAb anti-KIR
  • blocking antibody can refer to an immunoglobulin protein that does not react when binding to an antigen, but prevents other existing antibodies from binding to the antigen.
  • the blocking antibody is a Y-shaped protein, consisting of two light chains and two heavy chains by disulfide bonds, and has a constant region and a variable region. Depending on the difference in the constant region of the heavy chain, it can have IgA, IgD, IgM, IgE, and IgG isotypes, and can inhibit binding between multiple proteins through modification of the amino acid sequence in the variable region.
  • the above-mentioned blocking antibody may be directed against a receptor/ligand that acts as an activation, inhibitory, co-stimulatory, immune checkpoint of NK cells.
  • At least one surface of the surface of the magnetic particle may be coated with protein G or protein A.
  • the protein G or protein A is not limited in its type as long as it has excellent binding affinity with immunoglobulin and can be coated on magnetic particles.
  • the activating receptor ligand, inhibitory receptor ligand, costimulatory receptor ligand, cytokine, cytokine receptor, immune checkpoint ligand, and blocking antibody may be in a form fused with human immunoglobulin.
  • the IL-15R may be interleukin-15 receptor ⁇ (IL-15R ⁇ ).
  • the IL-15R is an IL-15 receptor expressed in NK cells, and may be involved in the function of promoting growth and differentiation of NK cells.
  • IL-15R ⁇ can perform not only classic signaling, but also trans-signaling.
  • the trans-signaling is an activation signal by cross-linking into trans-cells even if the cell does not express IL-15 R ⁇ , when IL-15 R ⁇ is expressed on the surface of neighboring cells and IL-15 binds to the receptor. May refer to being delivered.
  • the biological mechanism of receptors capable of trans-signaling as described above can be grafted into the composition for culture according to an aspect.
  • the 4-1BB ligand is known as a molecule involved in the expansion of natural killer cells.
  • the human immunoglobulin may be human immunoglobulin G.
  • the magnetic particles may include any particles as long as they have magnetism.
  • the magnetic particles are iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), manganese (Mn), bismuth (Bi), zinc (Zn), strontium (Sr), lanthanum (La), cerium ( Ce), praseodymium (Pr), neodymium (Nd), promethium (Pm), samarium (Sm), europium (Eu), gadolinium (Gd), terbium (Tb), dysprosium (Dy), holmium (Ho) , Erbium (Er), thulium (Tm), ytterbium (Yb), ruthenium (Lu), copper (Cu), silver (Ag), gold (Au), cadmium (Cd), mercury (Hg), aluminum (Al) , Gallium (Ga), indium (In), thallium (Tl), calcium (Ca), barium (Ba),
  • the magnetic particles may be manufactured and used through a known method, or may be purchased and used commercially.
  • the magnetic particles may be selected from all magnetic particles to which protein G or protein A may be attached to the surface.
  • the magnetic particles may be magnetic particles having an average particle diameter of about 500 nm to about 10 ⁇ m, about 550 nm to about 9 ⁇ m, about 600 nm to about 8 ⁇ m, about 650 nm to about 7 ⁇ m, and about 600 nm to about 6 ⁇ m, but are not limited thereto. .
  • the magnetic particles have a small particle size, so that individual particles have a single magnetic zone, and thus exhibit superparamagnetism having magnetic properties only in the presence of an external magnetic field. Magnetic particles exhibiting superparamagnetic properties can be separated simply and quickly by applying an external magnetic field. Separation of magnetic particles by application of a magnetic field is not affected by the surrounding environment such as pH, temperature, ions, etc., and thus has excellent stability and sensitivity.
  • magnetic particles to which an activating receptor ligand, an inhibitory receptor ligand, a costimulatory receptor ligand, a cytokine, a cytokine receptor, an immune checkpoint ligand, a blocking antibody, or a combination thereof are attached to at least one surface May serve as a feeder cell, which has been conventionally used to cultivate natural killer cells to improve proliferation capacity of natural killer cells and expand natural killer cells.
  • Supporting cells that have been conventionally used, for example K562 are cancer cell lines and are difficult to be used clinically because they adversely affect the human body. Therefore, when the magnetic particles are used instead of supporting cells, clinically safe natural killer cells can be cultured and used in cell therapy products.
  • the culture may be for proliferation or activation or expansion of natural killer cells.
  • the proliferation of the natural killer cells means an increase in the number of cells, and may be mixed with growth.
  • the activation of the natural killer cells may mean that the aforementioned natural killer cells perform their functions.
  • the activation of the natural killer cells can be confirmed through a phenomenon in which the aggregation of natural killer cells or PBMCs including the same increases.
  • the culture may be for inducing a dominant environment of natural killer cells in PBMC.
  • the induction of a predominant environment of natural killer cells may mean that the percentage of natural killer cells and the number of natural killer cells in the cultured PBMC increase compared to the case where natural killer cells are cultured by the composition.
  • the culture may be for inhibition of natural killer cells.
  • the culture may be for inducing the secretion of interferon by natural killer cells.
  • the natural killer cells cultured by the composition may be natural killer cells having an improved function of secreting interferon, for example, interferon gamma, compared to other cases.
  • the culture may be for improving cytotoxicity and apoptosis of natural killer cells.
  • Natural killer cells cultured by the above composition can be usefully used in the treatment of diseases, for example, cancer, since they have improved apoptosis ability.
  • the culture may be for changing the receptor expression of natural killer cells.
  • the culture may be for increasing or decreasing the expression of the activation receptor of natural killer cells.
  • the culture may be for increasing or decreasing the expression of inhibitory receptors on natural killer cells.
  • the surface antigen properties have the same meaning as immunological properties, and cell surface labeling (e.g., staining cells with tissue-specific or cell-label-specific antibodies) using techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry. ), or by observing cell surface markers using an optical microscope or confocal microscope, or by using techniques well known in the art such as polymerase chain reaction (PCR), or gene-expression profiles. It can be confirmed by measuring changes in gene expression.
  • cell surface labeling e.g., staining cells with tissue-specific or cell-label-specific antibodies
  • PCR polymerase chain reaction
  • the "positive or +" may mean that the label is present in a larger amount or higher concentration when compared to other cells for which the label is a reference.
  • a cell can be positive for a label if it can be used to distinguish the cell from one or more other cell types because a label is present inside or on the surface of the cell.
  • the cell has the label in an amount sufficient to emit a signal at a value greater than the background value, for example, a signal from a cell measuring device.
  • a control eg, background value
  • negative or - may mean that even when an antibody specific for a specific cell surface label is used, the label cannot be detected compared to a background value. For example, if a cell cannot be detectably labeled with an antibody specific for CD3.
  • the cells may be referred to as “negative for CD3" or "CD3-”.
  • the natural killer cells may be in a form contained in a peripheral blood mononuclear cell (PBMC).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • the PBMC may be autologous-derived, allogeneic-derived PBMC, or may be a PBMC derived from a healthy individual or a patient.
  • the medium refers to a material that enables the medium to support growth and survival of cells in vitro.
  • the medium is not particularly limited as long as it can be used for cell culture, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10 , F-12, DMEM/F12, MEM- ⁇ (Minimal Essential Medium- ⁇ ), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A medium, AmnioMax complete medium, AminoMax II complete medium , EBM (Endothelial Basal Medium) medium, and may include one or more selected from the group consisting of Chang's Medium medium.
  • kits for culturing natural killer cells including a composition for culturing natural killer cells and a culture dish according to one aspect.
  • composition, natural killer cells, and culture are as described above.
  • the culture dish refers to a cell culture container, and includes a cell culture container regardless of the material, size, and shape of the culture dish.
  • Another aspect provides a method of culturing natural killer cells using the composition for culturing natural killer cells.
  • the method of culturing the natural killer cells includes activating receptor ligands, inhibitory receptor ligands, costimulatory receptor ligands, cytokines, cytokine receptors, immune checkpoint ligands, blocking antibodies, or their It includes; culturing in a medium containing a composition for culturing natural killer cells comprising magnetic particles to which the combination is attached.
  • obtaining peripheral blood monocytes may further include.
  • it may further include the step of separating the natural killer cells from the obtained peripheral blood monocytes.
  • a method of separating blood, a method of separating and obtaining PBMCs therefrom, and a method of separating NK cells therefrom may be performed by known methods such as using a specific antibody.
  • removing the magnetic particles from the medium may further include.
  • the culture may be performed for about 6 to 21 days, about 6 to 20 days, about 6 to 18 days, or about 6 to 15 days.
  • the culture may be for proliferation or activation or expansion of natural killer cells.
  • the culture may be for inhibition of natural killer cells.
  • Another aspect provides a natural killer cell produced by the method of culturing the natural killer cell.
  • composition for preventing or treating cancer comprising natural killer cells prepared by culturing the natural killer cells.
  • the cancer may be solid cancer, lung cancer, liver cancer, breast cancer, uterine cancer, blood cancer, etc., but is not limited thereto.
  • These natural killer cells in cancer patients are lung cancer (Carrega P, et al., Cancer, 112, 863-875, 2008), liver cancer (Jinushi M, et al., J Hepatol., 43, 1013-1020, 2005), Breast cancer (Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 33, 119-124, 2003.), uterine cancer (Mocchegiani E., et al., Br j Cancer., 79, 244-250, 1999), hematologic cancer. (Tajima F., et al, Lekemia, 10, 478-482, 1996) has been reported to be closely related to the occurrence of such diseases.
  • the composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “acceptable carrier” refers to a substance, generally an inert substance, used in combination with an active ingredient to aid in the application of the active ingredient.
  • the carrier may be an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, a diluent, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be sodium starch glycolate, anhydrous calcium monohydrogen phosphate, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • Another aspect provides a method of treating cancer comprising administering to an individual a therapeutically or pharmaceutically effective amount of natural killer cells prepared by the method of culturing the natural killer cells.
  • the “administration” means introducing a predetermined substance to an individual by any suitable method, and the route of administration of the substance may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, or rectal administration may be, but are not limited thereto.
  • administration can be carried out by any device capable of moving to the target cells.
  • the dosage may be appropriately selected depending on the type of cancer, the route of administration, the age and sex of the patient, and the severity of the disease, but in the case of an average adult, it may be administered at about 1 ⁇ 10 6 to about 1 ⁇ 10 11 cells.
  • the "therapeutically effective amount” means an amount sufficient to exhibit a therapeutic effect when administered to an individual or cell in need of treatment.
  • Treatment means treating a disease or medical condition in an individual, eg, a mammal, including humans, which includes: (a) preventing the occurrence of the disease or medical condition, ie, prophylactic in the patient cure; (b) alleviation of the disease or medical condition, ie, causing elimination or recovery of the disease or medical condition in the patient; (c) inhibition of the disease or medical condition, ie slowing or stopping the progression of the disease or medical condition in the subject; Or (d) alleviating the disease or medical condition in the subject.
  • composition for culturing natural killer cells according to an aspect, and a method for culturing natural killer cells using the same, in culturing natural killer cells from peripheral blood mononuclear cells, activating receptor ligands, inhibitory receptor ligands, auxiliary Cultured in a medium containing a composition for culturing natural killer cells containing magnetic particles to which stimulating receptor ligands, cytokines, cytokine receptors, immune checkpoint ligands, blocking antibodies, or combinations thereof are attached, and proliferate in large quantities It can activate or inhibit natural killer cells, and promote the expansion of natural killer cells. Therefore, natural killer cells cultured using this can be usefully used as an immune cell therapy.
  • magnetic particles can be easily separated from the medium, they are convenient, economical and safe magnetic particles are used, so clinical safety is excellent.
  • soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), magnetic particles to which soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc are attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is a photomicrograph (x40) in which the shape of PBMC was observed after culturing for 5 days using magnetic particles (d) attached thereto.
  • soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is the result of counting cells using a hemocytometer on the 6th and 12th days of culture using magnetic particles (d) attached thereto.
  • Figure 3 is soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is a graph confirming the results of counting cells using a hemocytometer on the 6th and 12th days of culture with magnetic particles (d) attached thereto with a paired t-test.
  • FIG. 4 is a cultivation day 0 (a), cultivation day 12 (b), cultivation day 12 using soluble IL-15 (c), soluble IL-15 and cultivation day 12 using magnetic particles to which no specific molecule is attached (d ), Day 12 of culture using magnetic particles with soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc (e), and Day 12 of culture with magnetic particles with soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-15R ⁇ _IgG1Fc (f) It is a diagram showing the results of FACS staining with CD3 and CD56 markers.
  • FIG. 5 shows soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-
  • the results of FACS staining with CD3 and CD56 markers on the 12th day of culture using 15R ⁇ _IgG1Fc-attached magnetic particles (d) were compared between 5 donors.
  • Figure 6 is soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is a graph showing the result of calculating the number of NK cells in each donor on the 6th and 12th days of culture using magnetic particles (d) attached thereto.
  • Figure 7 is soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-
  • Figure 8 is soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is a graph showing the result of comparing the evaluation of the apoptosis ability of PBMCs between four donors on the 12th day of culture using magnetic particles (d) attached to R ⁇ _IgG1Fc.
  • soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is a diagram showing the result of detecting IFN- ⁇ by ELISA in the culture supernatant of PBMC on the 12th day of culture using magnetic particles (d) attached to R ⁇ _IgG1Fc.
  • FIG. 10 shows (a) soluble IL-15; (b) culture using magnetic particles to which soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc are attached; (c) An overlay histogram analyzing the expression of receptors on the surface of NK cells in PBMCs in culture using magnetic particles to which soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-15R ⁇ _IgG1Fc are attached.
  • FIG. 11 shows (a) soluble IL-15; (b) culture using magnetic particles to which soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc are attached; (c) soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-15R ⁇ _IgG1Fc is a result of statistically analyzing the receptor expression of NK cells in PBMC by a paired t-test in the culture using the attached magnetic particles.
  • FIG. 12 is a diagram schematically illustrating a method of culturing NK cells using a composition for culturing NK cells according to an aspect.
  • Example 1 NK cell culture using magnetic particles for NK cell culture
  • magnetic particles that can serve as feeder cells during NK cell culture magnetic particles to which 4-1BB ligand or IL-15R ⁇ are attached were prepared.
  • magnetic particles coated with protein G Protein G
  • protein G Since protein G has a very high binding affinity with human immunoglobulin, using a specific protein fused with human immunoglobulin allows a specific protein to be attached to magnetic particles through the binding between protein G and immunoglobulin.
  • IL-15R ⁇ interleukin-15 receptor alpha
  • 4-1BB ligand 4-1BB ligand: 4-1BBL
  • an immunoglobulin-tag in which IL-15R ⁇ is fused ( tagged) protein hereinafter'IL-15Ra_IgG1Fc', R&D systems, Minneapolis, MN, USA
  • 4-1BBL fused immunoglobulin-tagged protein hereinafter '4-1BBL_IgG1Fc', ACRObiosystems, Newark, DE, USA
  • the immunoglobulin-tagged protein and the magnetic particles coated with protein G are reacted in a cold room for about 1 hour, and the supernatant is removed from the MagneSphere magnetic stand (Promega, Madison, USA) using a buffer solution to culture NK cells. Magnetic particles' were prepared.
  • NK cells were obtained by culturing from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • IRB Institutional Bioethics Committee
  • the collected whole blood was diluted with phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBMC were separated from the blood sample diluted with PBS with a SepMate steam tube (STEMCELL Technologies, Inc., Vancouver, Canada).
  • PBMC separation was performed by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation using Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK cells were cultured by culturing NK cells in PBMCs using the entire PBMC obtained in Example 1.2, and the experimental groups used in the experiment are as follows: 1 soluble form of IL-15R ⁇ or 4- 1 Cultivated in a medium containing BBL 2 Cultivated in a medium containing magnetic particles of Example 1.2 3 Cultivated in a medium containing magnetic particles to which no specific molecule is attached.
  • the NK cell proliferation efficiency was evaluated when the magnetic particles for NK cell culture prepared in Example 1.1 were used.
  • flow cytometry was performed every 6 days (day 0, day 6 and day 12) for the three experimental groups.
  • PBMC proliferation was measured with a hemocytometer. After PBMC counting, some samples were used for flow cytometry.
  • a CD3 PE antibody (Thermo Fisher Scientific) and a CD56 FITC antibody (Thermo Fisher Scientific) were treated with PBMC samples and stained. From the PBMCs obtained through staining of these two antibodies, populations of NK cells, NKT cells, T cells, B cells and monocytes can be distinguished.
  • soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), magnetic particles to which soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc are attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is a photomicrograph (x40) in which the shape of PBMC was observed after culturing for 5 days using magnetic particles (d) attached thereto.
  • NK cells aggregate to form clusters during culture is that activation of NK cells is enhanced. Therefore, in the case of culturing PBMC using magnetic particles to which 4-1BBL or IL-15R ⁇ is attached according to an aspect, it can be seen that NK cells are activated because PBMCs aggregate well.
  • soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is the result of counting cells using a hemocytometer on the 6th and 12th days of culture using magnetic particles (d) attached thereto.
  • Figure 3 is soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is a graph confirming the results of counting cells using a hemocytometer on the 6th and 12th days of culture with magnetic particles (d) attached thereto with a paired t-test.
  • PBMCs were stained with respective CD markers (CD3, CD56), and then the cell population was confirmed by flow cytometry.
  • NK cell marker CD3 PE antibody (Thermo Fisher Scientific) and CD56 FITC antibody (BD PharmingenTM) were used to determine the ratio of NK cells in PBMCs on days 0, 6 and 12 of culture using flow cytometry analyzer CytoFLEX (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA).
  • Figure 4 is a culture day 0 (a), culture day 12 (b), culture using soluble IL-15 day 12 (c), culture using soluble IL-15 and magnetic particles to which specific molecules are not attached, day 12 (d ), Day 12 of culture using magnetic particles with soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc (e), and Day 12 of culture with magnetic particles with soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-15R ⁇ _IgG1Fc (f)
  • the x-axis represents CD56 and the y-axis represents CD3.
  • NK cells As shown in Fig. 4, before culture (a), the average proportion of NK cells was 15.58 ⁇ 4.40% (range, 7.29-32.10). As a result of culturing according to each condition, the ratio of NK cells in FIGS. 4C and 4D was 11.73 ⁇ 0.93% (range, 5.05-18.4) or 19.19 ⁇ 2.35% (range, 6.70-35.70), respectively. On the other hand, the ratio of NK cells in the magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc or 4-1BBL_IgG1Fc is attached and the cultured PBMCs (Figs. , 9.00-79.20), it was confirmed that the expression of NK cell markers was significantly increased (p ⁇ 0.001).
  • FIGS. 4 and 5 show soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-
  • the results of FACS staining with CD3 and CD56 markers on the 12th day of culture using 15R ⁇ _IgG1Fc-attached magnetic particles (d) were compared between 5 donors. As shown in FIGS. 4 and 5, it was confirmed that the proportion of NK cells in PBMCs was statistically significantly increased in the group cultured with magnetic particles to which a specific molecule was attached.
  • the percentage of NK cells obtained by antibody staining was multiplied by the number of each PBMC obtained in FIG. 2. The number of NK cells in each donor was then plotted according to the experimental conditions.
  • Figure 6 is soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is a graph showing the result of calculating the number of NK cells in each donor on the 6th and 12th days of culture using magnetic particles (d) attached thereto.
  • sIL-15 (control) sIL-15+ magnetic particle sIL-15 + magnetic particle (4-1BBL) sIL-15 + magnetic particles (4-1BBL, IL-15R ⁇ )
  • Total PBMC 1 ⁇ 0.21 1.32 ⁇ 0.25 2.07 ⁇ 0.88 2.27 ⁇ 0.88 NK cells 1 ⁇ 0.25 1.42 ⁇ 0.31 4.90 ⁇ 2.81* 6.08 ⁇ 2.20*
  • NKT cells 1 ⁇ 0.30 1.91 ⁇ 1.09 1.48 ⁇ 0.30 1.97 ⁇ 0.69 T cells 1 ⁇ 0.46 0.93 ⁇ 0.69 1.06 ⁇ 0.24 1.13 ⁇ 0.42
  • PBMCs cultured for 12 days were treated as described above for the leukemia cell line K562.
  • CFSE staining was performed to distinguish between the target cell K562 and the effector cell, PBMC.
  • NK cells effector cells
  • 7-AAD staining was performed to detect dead K562 cells.
  • the stained 7-AAD value was detected to determine what% of the target cells were killed. The killed cells were selected based on the K562 dot plot.
  • Figure 7 is soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-
  • the y-axis is 7-AAD, and the cells stained on the line were actually dead cells.
  • CSFE is used for the purpose of distinguishing NK cells and K562 cells, and is widely stained in the cytoplasm.
  • 7-AAD is used for staining dead cells, and when DNA break occurs, it binds to the base and stains.
  • Figure 8 is soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is a graph showing the result of comparing the evaluation of the apoptosis ability of PBMCs between four donors on the 12th day of culture using magnetic particles (d) attached to R ⁇ _IgG1Fc.
  • data were expressed as mean ⁇ standard deviation (* P ⁇ 0.05).
  • IFN- ⁇ which is closely related to cytotoxic function, and is highly secreted from activated NK cells, in order to evaluate whether there is an effect of enhancing interferon secretion of PBMC when using the magnetic particles for culturing NK cells prepared in Example 1.1. An experiment was performed to quantify the amount of.
  • IFN- ⁇ was detected by the ELISA (enzyme-linked immune-specific assay) method using an antibody-coated IFN- ⁇ capture plate.
  • soluble IL-15 (a), soluble IL-15 and magnetic particles (b), soluble IL-15 and magnetic particles to which 4-1BBL_IgG1Fc is attached (c), soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL- 15R ⁇ _IgG1Fc is a diagram showing the result of detecting IFN- ⁇ by ELISA in the culture supernatant of PBMC on the 12th day of culture using magnetic particles (d) attached to R ⁇ _IgG1Fc. Data are expressed as mean ⁇ standard deviation (*** P ⁇ 0.001).
  • IFN- ⁇ was significantly detected in the culture supernatant of the PBMC group cultured with soluble IL-15_IgGFc and 4-1BB_IgGFc and IL-15R ⁇ -attached magnetic particles.
  • samples obtained from three donors for each group described above were cultured for 12 days, and then identified using antibodies against six types of receptor molecules.
  • the receptor molecules used were DNAM1, CD27, NKG2A, NKG2D, CD69 and CD16.
  • the experimental groups used are as follows. (a) soluble IL-15; (b) culture using magnetic particles to which soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc are attached; (c) Culture using magnetic particles to which soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-15R ⁇ _IgG1Fc are attached.
  • FIG. 10 shows (a) soluble IL-15; (b) culture using magnetic particles to which soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc are attached; (c) An overlay histogram analyzing the expression of receptors on the surface of NK cells in PBMCs in culture using magnetic particles to which soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-15R ⁇ _IgG1Fc are attached.
  • FIG. 11 shows (a) soluble IL-15; (b) culture using magnetic particles to which soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc are attached; (c) soluble IL-15 and 4-1BBL_IgG1Fc and IL-15R ⁇ _IgG1Fc in culture using magnetic particles attached to the receptor expression of NK cells in PBMC was statistically analyzed by a paired t-test. Data are expressed as mean ⁇ standard deviation. (*P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.005, ***P ⁇ 0.001)
  • the NK cell inhibitory receptor, NKG2A was slightly expressed in the soluble IL-15 group (a), but decreased in the group using magnetic particles according to one aspect to which a specific molecule was attached.
  • the activation receptors NKG2D, CD69, and CD16 were found to have increased expression percentage in the group using magnetic particles according to one aspect.
  • the inhibitory receptor decreased and the receptor activation increased in the NK cells by the culture using the magnetic particles.

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Abstract

자연 살해 세포의 배양용 조성물, 키트 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 자연 살해 세포 배양용 조성물, 및 이를 이용한 자연 살해 세포 배양 방법에 따르면 말초혈액 단핵구에서 자연 살해 세포를 배양함에 있어서, 자연 살해 세포를 적어도 일면에 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 블로킹 (blocking) 항체, 또는 이들의 조합이 부착된 자성 입자를 포함하는 자연 살해 세포 배양용 조성물을 함유하는 배지에서 배양하여, 대량으로 증식시키고 자연 살해 세포의 활성화 또는 억제, 자연 살해 세포의 확장을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 이를 이용하여 배양된 자연 살해 세포를 면역세포 치료제로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 자성 입자는 배지로부터 쉽게 분리할 수 있어 간편하고, 경제적이며 안전한 자성 입자를 사용하기 때문에 임상적으로 안전성이 우수하다.

Description

자연 살해 세포의 배양용 조성물 및 이를 이용한 방법
자연 살해 세포의 배양용 조성물, 키트 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다. 본 출원은 2019년 5월 15일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0057136호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
현재 암의 일반적인 치료법은 외과적 수술(surgery), 방사선 요법(radiation therapy), 항암화학요법(chemotherapy) 등이 있으며, 암의 종류 및 병기에 따라 단독 혹은 복합적으로 사용되고 있지만, 환자들에게 심한 부작용과 고통을 수반하고, 기존 치료법은 정상 세포에 어느 정도 손상을 미치는 점에서 한계가 있다. 최근 부각되고 있는 암 면역치료법(cancer immunotherapy)은 인체 고유의 면역 시스템을 활용하여 정상 세포의 손상을 최소화하여 암세포를 보다 특이적으로 제거하는 치료법으로, 여러 세부 분야(항체 치료법, 면역세포 치료법, 바이러스 면역치료법, 나노 기술 면역치료법 등)의 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 중 면역세포 치료는 환자의 혈액에서 얻어진 림프구(lymphocyte) 중, 자연 살해 세포(natural killer cell: NK 세포), 자연살생 T 세포(natural killer T cell), T 세포, B 세포, 수지상 세포(dendritic cell) 등의 세포 수를 늘리고, 체외(in vitro) 에서 기능을 강화하여, 이를 다시 환자 몸에 되돌림으로써, 암을 치료하는 방법이다. 이러한 면역세포를 이용한 치료법은 면역 반응 조절 치료에 좋은 효과를 보이고, 독성 및 안전성 면에서 우수하다고 평가된다.
이 중 NK 세포는 선천면역(innate immunity)을 담당하는 중요한 세포로, 바이러스에 감염된 세포나 종양세포 등 비정상 세포를 스스로 식별하여 사멸시키는 기능을 가진다. 또한 T 세포가 인식하지 못하는 종양 및 바이러스에 감염된 세포를 인식할 수 있고, T 세포에 비해 안전성이 우수한 특징이 있다. 이에 지난 10 여 년 동안 환자들의 면역 시스템을 이용한 종양 면역치료가 꾸준히 발전되어 왔고, 이를 이용한 세포 치료제(cell therapy product)도 상업화되고 있다.
NK 세포를 이용한 세포치료제 개발을 위해, NK 세포의 기능 강화 및 활성화, 배양, 확장이 필요하다. 종래 NK 세포의 배양 또는 확장을 위해 배양 시 공여자 세포가 필요하다. 종래 공여자 세포로 K562와 같은 세포가 사용되는데, 이는 암 세포로 임상에 사용하기 부적합하다.
따라서, 암과 같은 난치성 질환의 치료를 위한 세포치료제로서 면역 거부 반응을 해소할 수 있으며, 환자 맞춤형 세포 치료를 제공할 수 있는, NK 세포를 대량으로 증식하는 방법 및 활성이 강화 또는 억제된 NK 세포를 배양하는 방법에 대한 연구가 필요하다.
일 양상은 자연 살해 세포 배양용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 자연 살해 세포 배양용 조성물을 이용하여 자연 살해 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
일 양상은 자연 살해 세포 배양용 조성물을 제공한다.
상기 자연 살해 세포 배양용 조성물은 적어도 일면에 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 블로킹(blocking) 항체, 또는 이들의 조합이 부착된 자성 입자를 포함하는 자연 살해 세포(natural killer cell) 배양용 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "자연 살해 세포(natural killer cell: NK cell)"는 림프구의 일종인 거대 과립형 림프구(Large granular lymphocytes: LGL)로서, 감염된 바이러스 및 종양세포를 죽이는 능력이 뛰어나고, 대부분의 정상 세포는 죽이지 않는 특성을 가진다. 따라서, 자연 살해 세포는 활성 세포 독성 T 림프구가 다량으로 생성되기 전에 바이러스 감염 혹은 종양 형성 초기 단계에서 중요한 역할을 한다. 예를 들면, 자연 살해 세포가 표적 세포와 접촉하는 경우, 몇몇 분자는 표적 세포의 막에 구멍을 형성하여 세포를 용해시키며, 또 다른 분자는 표적 세포에 들어가서 핵 DNA의 분절을 증가시켜, 괴사(necrosis), 세포사멸(Apotosis) 또는 세포 예정사(Programmed cell death)를 야기한다.
상기 자연 살해 세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 자연 살해 세포는 정상인 또는 암환자로부터 수득한 것일 수 있다. 상기 자연 살해 세포는 혈액, 말초혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)로부터 분리된 것일 수 있다. 혈액을 분리하는 방법, 이로부터 PBMC를 분리하는 방법, 이로부터 자연 살해 세포를 분리하는 방법은 공지된 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
상기 조성물은 적어도 일면에 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 블로킹 (blocking) 항체, 또는 이들의 조합이 부착된 자성 입자를 포함함으로써, 용해성 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 블로킹(blocking) 항체, 또는 이들의 조합을 포함하는 자연 살해 세포 배양용 조성물에 비해 자연 살해 세포를 활성화, 증식, 확장 또는 억제하는 효과가 증가한다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 활성화 수용체 리간드는 고형암, 또는 혈액 암세포를 포함하는 변형된 세포(transformed cells), 바이러스 감염세포(virus infected cells), 및 스트레스성 세포(stressed cells)에서 발현하는 단백질로서, 상기 언급된 NK세포 수용체와의 결합을 통해 NK세포의 활성화 및 작동 기능을 유발 가능한 물질을 지칭할 수 있다. 상기 활성화 수용체 리간드는 NK세포 활성화 수용체 구조에 따른 3가지 분류인 natural cytotoxicity receptor(NCR) family, NKG2 family, killer cell immunoglobulin like receptor(KIR) family에 대한 리간드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 활성화 수용체 리간드는 예를 들어, BAG6, AICL, MICA, MICB, CADM1, IgG, CD48, NTB-A/SLAMF6, CD70, CD155, CD319, C8, C9, 및 CS1로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
용어 "활성화 수용체 리간드"는 수용체의 특정 부위게 결합하여 수용체를 활성화할 수 있는 물질을 지칭할 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 억제성 수용체 리간드는 예를 들어, HLA-A, HLA-B, HLA-BW4, HLA-C1, HLA-C2, HLA-E, HLA-G, CD112/Nectin-2, CD112/Nectin-3, 카드헤린(cadherin), 콜라겐, OCIL, 및 CLEC2D로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
용어 "억제성 수용체 리간드"는 수용체의 특정 부위에 결합하여 수용체를 억제할 수 있는 물질을 지칭할 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 보조자극 수용체 리간드는 TNF 패밀리(Tumor necrosis factor family) 리간드, TLR 패밀리(Toll-like receptor family) 리간드, virus related glycoprotein 리간드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 보조자극 수용체 리간드는 예를 들어, 4-1BB 리간드, CD28 리간드, NTBA, TLRL, PVR/Nectin-2, 및 PVR로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
용어, "보조자극 수용체 리간드"는 대부분의 유핵세포와 바이러스에서 발현하는 단백질/당단백질로서, 보조자극 수용체에 결합 가능한 리간드를 지칭할 수 있다. 또한, 상기 보조자극 수용체 리간드는 2차 신호를 매개하는 물질로서, 보조자극 수용체와 결합시 NK세포 1차 신호의 강화를 통해 NK세포의 활성화 및 작동기능을 증강시키는 물질을 지칭할 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 사이토카인은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, 및 IL-27로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 사이토카인 수용체는 IL-2Rα, IL-15Rα또는 이들의 조합일 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 면역관문 리간드는 B7 family, galectin family, PVR family를 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역관문 리간드는 예를 들어, PD-L1, BTLA-4 리간드, CTLA-4 리간드 (CD80), Tim-3 리간드, IDO, A2AR, 및 TIGIT 리간드로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
용어 "면역관문 리간드"는 자기 관용(Self-tolerance)을 위해 면역체계를 조절하는 단백질을 지칭할 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 블로킹 항체는 항-KIR2DL1 모노클로날 항체(mAb), 항-KIR2DL2 mAb, 항-KIR2DL3 mAb, 항-KIR2DL5A mAb, 항-KIR2DL5B mAb, 항-KIR3DL1 mAb, 항-KIR3DL2 mAb, 항-KIR2DL4 mAb, 항-CD94/NKG2A mAb, 항-CD94/NKG2B mAb, 항-CD96 mAb, 항-CEACAM-1 mAb, 항-ILT2/LILRB mAb, 항-KLRG1 mAb, 항-LAIR1 mAb, 항-NKRP1A mAb, 항-Siglec3 mAb, 항-Siglec7 mAb, 및 항-Siglec9 mAb로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
용어 "블로킹 항체"는 항원과 결합할 때 반응이 없지만, 다른 기존의 항체가 항원과 결합하는 것을 방지하는 immunoglobulin 단백질을 지칭할 수 있다. 구체적으로, 상기 블로킹 항체는 Y자형의 단백질로서 2개의 경사슬과 2개의 중사슬 2개가 이황화 결합을 하여 이루어져 있으며, 불변영역과 가변영역을 지닌다. 중쇄의 불변영역의 차이에 따라 IgA, IgD, IgM, IgE, IgG isotype을 지닐 수 있고, 가변영역 내 아미노산 서열의 변형을 통하여 다수 단백질간의 결합을 억제할 수 있다. 상기 언급된 블로킹 항체는 NK세포의 활성화, 억제성, 보조자극, 면역관문 역할을 수행하는 수용체/리간드에 대한 것일 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 자성 입자 표면의 적어도 일면은 단백질 G(protein G) 또는 단백질 A(protein A)로 코팅된 것일 수 있다. 상기 단백질 G 또는 단백질 A는 면역글로불린과 결합 친화력이 우수한 것으로서 자성 입자에 코팅될 수 있는 것이라면 그 종류가 제한되는 것은 아니다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 및 블로킹 (blocking) 항체는 인간 면역글로불린과 융합된 형태일 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 IL-15R은 인터루킨-15 수용체 α(interleukin-15 receptor α: IL-15Rα)일 수 있다.
상기 IL-15R은 NK 세포에서 발현되는 IL-15 수용체로서, NK 세포의 성장과 분화를 증진시키는 기능에 관여할 수 있다. 이러한 수용체들 중에서, 예를 들어, IL-15Rα는 전형적 신호전달(classic signaling) 뿐만 아니라, 트랜스-신호전달 (trans-signaling) 역시 수행할 수 있다. 상기 트렌스-신호전달은 세포가 IL-15 Rα를 발현하지 않을지라도, 이웃 세포 표면에 IL-15 Rα가 발현되고 IL-15가 상기 수용체가 결합할 경우, 세포간 트랜스로 cross-linking되어 활성화 신호가 전달되는 것을 지칭할 수 있다. 상기와 같이 트랜스-신호전달을 수행할 수 있는 수용체들의 생물학적 메커니즘은 일 양상에 따른 배양용 조성물에 접목할 수 있다.
상기 4-1BB 리간드는 자연 살해 세포의 확장에 관여하는 분자로 알려져 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 인간 면역글로불린은 인간 면역글로불린 G일 수 있다.
본 명세서에서 상기 자성 입자는 자성을 가지고 있는 입자이면 어느 것이나 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 자성 입자는 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi), 아연(Zn), 스트론튬(Sr), 란타넘(La), 세륨(Ce), 프라셰오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 프로메튬(Pm), 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 테르븀(Tb), 디스프로슘(Dy), 홀뮴(Ho), 에르븀(Er), 툴륨(Tm), 이테르븀(Yb), 루테늄(Lu), 구리(Cu), 은(Ag), 금(Au), 카드뮴(Cd), 수은(Hg), 알루미늄(Al), 갈륨(Ga), 인듐(In), 탈륨(Tl), 칼슘(Ca), 바륨(Ba), 라듐(Ra), 백금(Pt), 및 납(Pd)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 자성 원소를 포함할 수 있다. 상기 자성 입자는 산화되거나 표면 개질된 것일 수 있다. 구체적으로, 단백질 G 또는 단백질 A로 개질된 것일 수 있다. 상기 개질에 의해 자성 입자가 면역글로불린과의 결합 친화력이 향상될 수 있다.
상기 자성 입자는 공지된 방법을 통해 제조해서 사용할 수 있고, 상업적으로 구입해서 사용할 수도 있다.
상기 자성 입자는 표면에 단백질 G 또는 단백질 A가 부착될 수 있는 모든 자성 입자들 중에서 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 자성 입자는 평균 입경이 약 500nm 내지 약 10μm, 약 550nm 내지 약 9μm, 약 600nm 내지 약 8μm, 약 650nm 내지 약 7μm, 약 600nm 내지 약 6μm인 자성 입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 자성 입자는 작은 입자 크기를 가짐으로써 개별 입자가 단일자기구역을 갖게 되고, 이로 인해 외부 자기장이 존재 시에만 자성의 특성을 갖는 초상자성(superparamagnetism)을 나타낸다. 초상자성을 나타내는 자성 입자는 외부 자기장 인가에 의해 간단하고 빠르게 분리될 수 있다. 자기장 인가에 의한 자성 입자의 분리는 pH, 온도, 이온 등과 같은 주변 환경에 영향을 받지 않으므로 안정성 및 민감성이 우수하다.
일 양상에 따른 조성물에서, 적어도 일면에 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 블로킹 (blocking) 항체, 또는 이들의 조합이 부착된 자성 입자는 종래 자연 살해 세포를 배양하여 자연 살해 세포의 증식능을 향상시키고 자연 살해 세포를 확장하기 위해 사용되어 온 지지 세포(feeder cell)의 역할을 할 수 있다. 종래 사용되어 온 지지 세포, 예를 들면 K562는 암 세포주로 인체에 좋지 않은 영향을 주기 때문에 임상적으로는 사용되기 어렵다. 따라서, 지지 세포 대신 상기 자성 입자를 사용하는 경우 임상적으로 안전한 자연 살해 세포를 배양하여 세포치료제에 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 배양은 자연 살해 세포의 증식 또는 활성화 또는 확장을 위한 것일 수 있다. 상기 자연 살해 세포의 증식은 세포 수의 증가를 의미하며, 성장과 혼용될 수 있다. 상기 자연 살해 세포의 활성화는 전술한 자연 살해 세포가 제 기능을 수행하는 것을 의미할 수 있다. 상기 자연 살해 세포의 활성화는 자연 살해 세포 또는 이를 포함하는 PBMC의 응집(aggregation)이 증가하는 현상을 통해 확인할 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 배양은 PBMC 내에서 자연 살해 세포의 우위 환경을 유도하기 위한 것일 수 있다. 자연 살해 세포의 우위 환경 유도란, 상기 조성물에 의해 자연 살해 세포를 배양하는 경우 그렇지 않은 경우에 비하여 배양된 PBMC 내에서 자연 살해 세포의 백분율, 자연 살해 세포의 수가 증가하는 것을 의미할 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 배양은 자연 살해 세포의 억제를 위한 것일 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 배양은 자연 살해 세포의 인터페론 분비를 유도하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물에 의해 배양된 자연 살해 세포는 그렇지 않은 경우에 비해 인터페론, 예를 들어 인터페론 감마를 분비하는 기능이 향상된 자연 살해 세포일 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 배양은 자연 살해 세포의 세포독성, 세포사멸능을 향상시키기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물에 의해 배양된 자연 살해 세포는 세포사멸능이 향상된 특징을 갖기 때문에 질병, 예를 들면 암 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 배양은 자연 살해 세포의 수용체 발현을 변화시키기 위한 것일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 배양은 자연 살해 세포의 활성화 수용체의 발현을 증가 또는 감소시키기 위한 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 배양은 자연 살해 세포의 억제 수용체의 발현을 증가 또는 감소시키기 위한 것일 수 있다.
본 명세서에서 상기 표면 항원 특성은 면역학적 특성과 동일한 의미이며, 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지 (예를 들면, 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함), 또는 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포 표면 표지를 관찰함으로써, 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 또는 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.
상기 "양성 또는 +" 는 세포 표지(마커)와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 세포와 비교하였을 때 더 많은 양 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면, 그 표지에 대하여 양성이 될 수 있다. 또한, 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들면, 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미하는 것일 수 있다. 예를 들면, 세포를 CD56에 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지 할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들면, 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면, 그 세포는 "CD56에 대해 양성" 또는 "CD56+"으로 나타낼 수 있다. 용어, "음성 또는 -"는 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 의미하는 것일 수 있다. 예를 들면, CD3에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지할 수 없으면. 그 세포는 "CD3에 대해 음성" 또는 "CD3-"으로 나타낼 수 있다.
일 양상에 따른 조성물에서, 상기 자연 살해 세포는 말초 혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)에 포함된 형태일 수 있다. 상기 PBMC는 자가(Autologous) 유래, 동종이계(allogeneic) 유래의 PBMC일 수 있고, 건강한 개체 또는 환자인 개체로부터 유래된 PBMC일 수 있다.
상기 배지는 상기 배지는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 물질을 의미한다. 상기 배지는 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, MEM-α (Minimal Essential Medium-α), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax Ⅱ complete 배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, 및 Chang's Medium 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 자연 살해 세포 배양용 조성물 및 배양 접시를 포함하는 자연 살해 세포 배양용 키트를 제공한다.
상기 조성물, 자연 살해 세포, 배양은 전술한 바와 같다.
상기 배양 접시는 세포 배양 용기를 말하고, 배양 접시의 재질, 크기, 및 모양과 관계없이 세포 배양 용기를 포함한다.
다른 양상은 상기 자연 살해 세포 배양용 조성물을 이용하여 자연 살해 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
상기 자연 살해 세포를 배양하는 방법은 자연 살해 세포를 적어도 일면에 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 블로킹 (blocking) 항체, 또는 이들의 조합이 부착된 자성 입자를 포함하는 자연 살해 세포 배양용 조성물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계;를 포함한다.
일 양상에 따른 방법에서, 상기 배양하는 단계 전에, 말초 혈액 단핵구를 수득하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 수득된 말초 혈액 단핵구로부터 자연 살해 세포를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
혈액을 분리하는 방법, 이로부터 PBMC를 분리, 수득하는 방법, 이로부터 NK 세포를 분리하는 방법은 특정 항체를 이용하는 등의 공지된 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 방법에서, 상기 배양하는 단계 후에, 상기 자성 입자를 배지로부터 제거하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 방법에서, 상기 배양은 약 6일 내지 21일, 약 6 내지 20일, 약 6 내지 18일, 또는 약 6 내지 15일 동안 수행되는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 방법에서, 상기 배양은 자연 살해 세포의 증식 또는 활성화 또는 확장을 위한 것일 수 있다.
일 양상에 따른 방법에서, 상기 배양은 자연 살해 세포의 억제를 위한 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 자연 살해 세포를 배양하는 방법에 의하여 제조된 자연 살해 세포를 제공한다.
다른 양상은 상기 자연 살해 세포를 배양하는 방법에 의하여 제조된 자연 살해 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 암은 고형암, 폐암, 간암, 유방암, 자궁암, 혈액암 등인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 암환자에서 이러한 자연 살해 세포가 폐암(Carrega P, et al., Cancer, 112, 863-875, 2008), 간암(Jinushi M, et al., J Hepatol., 43, 1013-1020, 2005), 유방암(Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 33, 119-124, 2003.), 자궁암(Mocchegiani E., et al., Br j Cancer., 79, 244-250, 1999), 혈액암(Tajima F., et al, Lekemia, 10, 478-482, 1996) 등의 질환의 발생과 깊은 연관이 있는 것으로 보고되어 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "허용가능한 담체"는 활성 성분의 적용을 돕기 위하여 활성 성분과 조합되어 사용되는 물질, 일반적으로 불활성 물질을 나타낸다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 희석제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
다른 양상은 상기 자연 살해 세포를 배양하는 방법에 의하여 제조된 자연 살해 세포의 치료학적 또는 약제학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 또는 직장내 투여인 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 투여는 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 수행될 수 있다. 투여량은 암의 유형, 투여 경로, 환자의 나이 및 성별, 및 질병의 정도에 따라 적절히 선택될 수 있으나, 평균 성인의 경우, 약 1x106 내지 약 1x1011 세포로 투여할 수 있다.
상기 "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체 또는 세포에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. "치료"는 개체, 예를 들면 사람을 포함한 포유동물에서 질환 또는 의학적 증상을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 의학적 증상의 발생을 예방, 즉, 환자의 예방적 치료; (b) 질환 또는 의학적 증상의 완화, 즉, 환자에서 질환 또는 의학적 증상의 제거 또는 회복 야기; (c) 질환 또는 의학적 증상의 억제, 즉, 개체에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는 (d) 개체에서 질환 또는 의학적 증상을 경감.
일 양상에 따른 자연 살해 세포 배양용 조성물, 및 이를 이용한 자연 살해 세포 배양 방법에 따르면 말초혈액 단핵구에서 자연 살해 세포를 배양함에 있어서, 자연 살해 세포를 적어도 일면에 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 블로킹 (blocking) 항체, 또는 이들의 조합이 부착된 자성 입자를 포함하는 자연 살해 세포 배양용 조성물을 함유하는 배지에서 배양하여, 대량으로 증식시키고 자연 살해 세포의 활성화 또는 억제, 자연 살해 세포의 확장을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 이를 이용하여 배양된 자연 살해 세포를 면역세포 치료제로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 자성 입자는 배지로부터 쉽게 분리할 수 있어 간편하고, 경제적이며 안전한 자성 입자를 사용하기 때문에 임상적으로 안전성이 우수하다.
도 1은 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용하여 5일 동안 배양한 후 PBMC의 형태를 관찰한 현미경 사진(x40)이다.
도 2는 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 6일, 12일차에 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 세포를 계수한 결과이다.
도 3은 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 6일, 12일차에 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 세포를 계수한 결과를 대응 표본(paired t-test)으로 확인한 그래프이다.
도 4는 배양 0일차(a), 배양 12일차(b), 용해성 IL-15를 이용한 배양 12일차(c), 용해성 IL-15 및 특정 분자가 부착되지 않은 자성 입자를 이용한 배양 12일차(d), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양 12일차(e), 및 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양 12일차(f)에 CD3, CD56 마커로 염색한 FACS 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 12일차에 CD3, CD56 마커로 염색한 FACS 결과를 5명의 공여자 사이에서 비교한 결과이다.
도 6은 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 6일차 및 12일차에 각 공여자에서 NK 세포의 수를 계산할 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 12일차에 PBMC의 세포사멸능을 평가하기 위해 CFSE 및 7-AAD 염색에 의한 FACS 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 12일차에 PBMC의 세포사멸능 평가를 4명의 공여자 사이에서 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 12일차에 PBMC의 배양 상층액에서 IFN-γ를 ELISA에 의해 검출한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 (a) 용해성 IL-15; (b) 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양; (c) 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양에서 PBMC 내 NK 세포 표면 상 수용체 발현을 분석한 overlay histogram이다.
도 11은 (a) 용해성 IL-15; (b) 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양; (c) 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양에서 PBMC 내 NK 세포의 수용체 발현을 대응 표본(paired t-test)에 의해 통계적으로 분석한 결과이다.
도 12는 일 양상에 따른 NK 세포 배양용 조성물을 이용한 NK 세포 배양 방법을 도식화한 그림이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: NK 세포 배양용 자성 입자를 이용한 NK 세포 배양
1.1 NK 세포 배양용 자성 입자의 제조
NK 세포 배양시 지지 세포(feeder cell)의 역할을 할 수 있는 자성 입자로, 4-1BB 리간드 또는 IL-15Rα가 부착된 자성 입자를 제조하였다. 자성 입자에 특정 단백질(4-1BB 리간드 또는 IL-15Rα)을 부착시키기 위해, 단백질 G(Protein G)로 코팅된 자성 입자를 사용하였다. 단백질 G는 인간 면역글로불린과 매우 높은 결합 친화성을 갖기 때문에, 인간 면역글로불린과 융합된 특정 단백질을 사용하면 단백질 G와 면역글로불린 사이의 결합을 통해 특정 단백질을 자성 입자에 부착시킬 수 있다.
구체적으로, 단백질 G로 코팅된 자성 입자인 Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, Novex 쪠)를 구입하였다. 특정 단백질로는 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha: IL-15Rα)와 4-1BB 리간드(4-1BB ligand: 4-1BBL)를 사용하였고, IL-15Rα가 융합된 면역글로불린-태그(tagged) 단백질(이하 'IL-15Ra_IgG1Fc', R&D systems, Minneapolis, MN, USA) 및 4-1BBL이 융합된 면역글로불린-태그 단백질(이하 '4-1BBL_IgG1Fc', ACRObiosystems, Newark, DE, USA)을 구입하였다.
상기 면역글로불린-태그 단백질 및 단백질 G가 코팅된 자성 입자를 약 1시간 동안 차가운 방에서 반응시키고, 상층액은 완충액 흡입을 사용하여 MagneSphere 자기 스탠드(Promega, Madison, USA)로부터 제거함으로써 'NK 세포 배양용 자성 입자'를 제조하였다.
1.2 NK 세포의 배양
NK 세포는 말초 혈액 단핵구 (Peripheral blood mononuclear cells: PBMCs)로부터 배양하여 얻었다. CHA 의과학 대학교에서 기관 생명윤리위원회(IRB)의 승인 (1044308-201701-BR-005)하에 건강한 5명의 혈액 기증자로부터 PBMC를 수득하였다. 채혈된 전혈을 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline: PBS)로 희석하였다. PBS로 희석한 혈액 시료로부터 SepMate 쪠 튜브 (STEMCELL Technologies, Inc., Vancouver, Canada)로 PBMC를 분리하였다. PBMC 분리는 Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 사용하여 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심 분리에 의해 수행하였다.
수득한 PBMC의 배양은 24 웰에서 1Х106 PBMC/웰의 밀도로 수행하였다. 배지의 일부는 PBMC 형태에 따라 매 2-4 일마다 변경되거나 추가하였으며, 세포 계수는 매 6 일 (6 일 및 12 일)마다 수행하였다. PBMC는 10%의 열-불활성화 FBS (Gibco, Thermo Fisher, USA), 베타-메르캅토에탄올 50μM 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(P/S)으로 보충된 basic RPMI-1640 (Hyclone, Logan, USA) 에스)에서 유지하였다.
이하에서, NK 세포는 실시예 1.2에서 수득한 전체 PBMC를 사용하여 PBMC 중의 NK 세포를 배양하는 방식을 통해 배양하였고, 실험에 사용된 실험군은 다음과 같다: ① 용해성 형태인 IL-15Rα 또는 4-1BBL을 포함한 배지에 배양 ② 실시예 1.2의 자성 입자를 포함한 배지에 배양 ③ 특정 분자가 부착되지 않은 자성 입자를 포함한 배지에 배양.
실험예 1: NK 세포 배양용 자성 입자를 이용한 NK 세포 증식 평가
상기 실시예 1.1에서 제조한 NK 세포 배양용 자성 입자를 이용하는 경우의 NK 세포 증식 효율을 평가하였다. NK 세포 증식을 측정하기 위해, 상기 실험군 3종에 대하여 매 6 일마다 (0 일, 6 일 및 12 일째) 유세포 분석을 수행하였다. PBMC의 증식은 혈구 계수기로 측정하였다. PBMC 계수 후, 일부 시료를 유세포 분석에 사용하였다. CD3 PE 항체 (Thermo Fisher Scientific) 및 CD56 FITC 항체 (Thermo Fisher Scientific)를 PBMC 시료에 처리하여 염색하였다. 이 두 항체의 염색을 통해 수득된 PBMC에서 NK 세포, NKT 세포,T 세포, B 세포 및 단핵구의 개체군을 구별할 수 있다.
도 1은 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용하여 5일 동안 배양한 후 PBMC의 형태를 관찰한 현미경 사진(x40)이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 용해성 IL-15를 이용하여 배양한 경우에 비해, 4-1BBL 또는 IL-15Rα이 부착된 일 양상에 따른 NK 세포 배양용 자성 입자를 이용하여 배양한 PBMC 군에서 세포들이 더 잘 응집된 것을 확인하였다.
배양 시 NK 세포가 응집되어 클러스터를 형성하는 현상은 NK 세포의 활성화가 강화되는 것임이 공지되어 있다. 따라서, 일 양상에 따른 4-1BBL 또는 IL-15Rα이 부착된 자성 입자를 이용하여 PBMC를 배양하는 경우 PBMC가 잘 응집하므로 NK 세포가 활성화되는 것을 알 수 있다.
도 2는 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 6일, 12일차에 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 세포를 계수한 결과이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 모든 군에서 PBMC의 수는 12일차에 전반적으로 증가한 것을 확인하였다. 그러나, 특히 일 양상에 따른 4-1BBL 및/또는 IL-15Rα가 부착된 NK 세포 배양용 자성 입자를 이용하여 PBMC를 배양한 경우 세포 수가 크게 증가한 것을 확인하였다.
도 3은 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 6일, 12일차에 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 세포를 계수한 결과를 대응 표본(paired t-test)으로 확인한 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 용해성 IL-15 형태로 처리된 PBMC 수와 실험군을 비교한 결과 용해성 IL-15와 자성 입자를 처리한 PBMC 수는 유의한 차이가 없었다. 반면, 4-1BBL_IgG1Fc 또는 IL-15Rα_IgG1Fc이 부착된 자성 입자를 이용하여 PBMC를 배양한 경우의 세포 수가 유의적으로 증가한 것을 확인하였고, 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 모두 부착된 자성 입자를 이용한 경우에 NK 세포 수가 가장 많이 증가하였다.
실험예 2: NK 세포 배양용 자성 입자의 이용에 따른 PBMC 내 NK 세포 구성 비율 평가
상기 실시예 1.1에서 제조한 NK 세포 배양용 자성 입자를 이용하는 경우 PBMC 내의 NK 세포 구성 비율이 변화하는지 평가하였다. PBMC를 각 CD 마커(CD3, CD56)로 염색한 후 세포 집단을 유세포 분석법으로 확인하였다.
구체적으로는, NK 세포 마커 CD3 PE 항체 (Thermo Fisher Scientific) 및 CD56 FITC 항체 (BD PharmingenTM)를 사용하여 배양 0 일, 6 일 및 12 일차에 PBMC에서의 NK 세포의 비율을 유세포 계측 분석기 CytoFLEX (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA)를 통해 측정하였다.
도 4는 배양 0일차(a), 배양 12일차(b), 용해성 IL-15를 이용한 배양 12일차(c), 용해성 IL-15 및 특정 분자가 부착되지 않은 자성 입자를 이용한 배양 12일차(d), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양 12일차(e), 및 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양 12일차(f)에 CD3, CD56 마커로 염색한 FACS 결과를 나타낸 도이다. FACS 데이터에서, x축은 CD56을 나타내고, y축은 CD3을 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 배양 전(a) 평균 NK 세포의 비율은 15.58±4.40% (범위, 7.29-32.10)이었다. 각 조건에 따라 배양한 결과, 도 4c 및 도 4d에서 NK 세포의 비율은 각각 11.73±0.93% (범위, 5.05-18.4) 또는 19.19±2.35% (범위, 6.70-35.70)이었다. 반면, 4-1BBL_IgG1Fc 또는 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자와 배양된 PBMC(도 4e 및 도 4f)에서 NK 세포의 비율은 각각 46.74±6.45% (범위, 4.53-74.70) 및 49.59±6.43% (범위, 9.00-79.20)로 NK 세포 마커 발현이 크게 증가한 것을 확인하였다(p <0.001).
도 5는 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 12일차에 CD3, CD56 마커로 염색한 FACS 결과를 5명의 공여자 사이에서 비교한 결과이다. 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 일 양상의 특정 분자가 부착된 자성 입자와 함께 배양된 군에서 PBMC 내 NK 세포의 비율은 통계적으로 유의하게 증가된 것을 확인하였다.
또한, 배양 후 NK 세포 수의 변화를 확인하기 위해, 항체 염색에 의해 얻어진 NK 세포의 백분율에 도 2서 얻은 각각의 PBMC 수를 곱하였다. 이후 각 공여자에서의 NK 세포의 수를 실험 조건에 따라 플롯팅하였다.
도 6은 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 6일차 및 12일차에 각 공여자에서 NK 세포의 수를 계산할 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, NK 세포의 수가 다른 두 대조군에 비해 특정 분자가 부착된 자성 입자와 함께 배양되었을 때 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.
또한, NK 세포(CD3-, CD56+)의 백분율 데이터 이외에 T 세포(CD3+, CD56-) 및 NKT 세포(CD3+, CD56+), B 세포 및 단핵구(CD3-, CD56-)에 관한 데이터 또한 CD3, CD56 항체를 이용하여 동일한 방법으로 얻었다. NK 세포(CD3-, CD56-)를 포함하는 전체 PBMC의 비율에 있어 배율 변화(fold change)를 측정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1은 NK 세포, T 세포 및 NKT 세포를 포함하는 전체 PBMC의 증가율의 배율 변화를 도표화한 결과이다. 대응 표본(paired t-test)에 의해 통계적 분석을 수행하였다.
sIL-15(대조군) sIL-15+자성입자 sIL-15+자성입자(4-1BBL) sIL-15+자성입자(4-1BBL, IL-15Rα)
총 PBMC 1±0.21 1.32±0.25 2.07±0.88 2.27±0.88
NK 세포 1±0.25 1.42±0.31 4.90±2.81* 6.08±2.20*
NKT 세포 1±0.30 1.91±1.09 1.48±0.30 1.97±0.69
T 세포 1±0.46 0.93±0.69 1.06±0.24 1.13±0.42
(*P<0.05)따라서, NK 세포의 백분율과 수 모두 특정 분자가 부착된 자성 입자와 함께 배양된 경우에 유의적으로 증가하였기 때문에, 특정 분자가 부착된 자성 입자와 함께 PBMC를 배양하는 경우 PBMC 내 환경이 NK 세포 우세 환경으로 유도되는 것을 알 수 있다.
실험예 3: NK 세포 배양용 자성 입자의 이용에 따른 PBMC 매개된 세포사멸능평가
상기 실시예 1.1에서 제조한 NK 세포 배양용 자성 입자를 이용하는 경우 PBMC 내에서 NK 세포의 수가 증가되는 효과 이외에, NK 세포의 면역 세포 기능 향상을 평가하기 위해 K562에 대한 PBMC 매개된 세포사멸능 평가를 수행하였다.
구체적으로, 백혈병 세포주인 K562에 대해 상기한 바와 같이 12 일 동안 배양된 PBMC를 처리하였다. 먼저, 유세포 분석에서 표적 세포인 K562와 작용 세포(effector cell)인 PBMC를 구별하기 위해 CFSE 염색을 수행하였다. 이처럼 작동 세포(NK 세포)만을 게이팅하여 K562와 함께 4 시간 동안 배양한 후, 사멸된 K562 세포를 검출하기 위해 7-AAD 염색을 수행하였다. 여기서 공배양은 E:T = 10:1 비율로 수행하였다. 염색된 7-AAD 값을 검출하여 표적 세포 중 몇%가 사멸되었는지 확인하였다. 사멸된 세포는 K562 도트 플롯(dot plot)에 기초하여 선택하였다.
도 7은 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 12일차에 PBMC의 세포사멸능을 평가하기 위해 CFSE 및 7-AAD 염색에 의한 FACS 결과를 나타낸 도이다. FACS 데이터에서 y축은 7-AAD이고, 선상에서 염색된 세포는 실제로 사멸된 세포였다. CSFE는 NK 세포, K562 세포를 구분하기 위한 목적으로 사용되며, 세포질에 광범위하게 염색된다. 7-AAD는 사멸된 세포를 염색하기 위한 목적으로 사용되며, DNA break가 일어나면 염기에 결합하여 염색된다.
도 8은 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 12일차에 PBMC의 세포사멸능 평가를 4명의 공여자 사이에서 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 유세포 분석 결과에 대하여 대응 표본(paired t-test)에 의한 통계적 분석의 결과로, 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다(* P <0.05).
도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 면역 세포의 K562에 대한 세포사멸 기능은 특정 분자가 부착된 자성 입자로 처리한 경우에 증가한 것을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 따른 자성 비드와 함께 배양한 PBMC군에서 K562에 대한 세포 사멸능이 향상되기 때문에, 세포의 수뿐만 아니라 세포 독성 기능 또한 향상된 것을 알 수 있다.
실험예 4: NK 세포 배양용 자성 입자의 이용에 따른 PBMC의 인터페론 분비 평가
상기 실시예 1.1에서 제조한 NK 세포 배양용 자성 입자를 이용하는 경우 PBMC의 인터페론 분비가 향상되는 효과가 있는지 평가하기 위해 세포 독성 기능과 밀접하게 관련되어 있고, 활성화된 NK 세포에서 높게 분비되는 IFN-γ의 양을 정량화하는 실험을 수행하였다.
상기 기재된 것과 같은 각 실험 조건 하에서 12 일 동안 배양한 상층액을 이용하였다. IFN-γ는 항체가 코팅 된 IFN-γ를 포획한 플레이트를 사용하여 ELISA (enzyme-linked immune-specific assay) 방법으로 검출하였다.
도 9는 용해성 IL-15(a), 용해성 IL-15 및 자성 입자(b), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(c), 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자(d)를 이용한 배양 12일차에 PBMC의 배양 상층액에서 IFN-γ를 ELISA에 의해 검출한 결과를 나타낸 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다 (*** P <0.001).
도 9에 나타낸 바와 같이, 용해성 IL-15_IgGFc과 4-1BB_IgGFc 및 IL-15Rα가 부착된 자성입자와 함께 배양한 PBMC 군을 배양한 배양 상층액에서 IFN-γ가 유의적으로 높게 검출되었다.
실험예 5: NK 세포 배양용 자성 입자의 이용에 따른 NK 세포 수용체의 발현 변화 평가
상기 실시예 1.1에서 제조한 NK 세포 배양용 자성 입자를 이용하는 경우 NK 세포 및 PBMC 매개 세포 독성의 증식 및 백분율이 증가하였기 때문에, NK 세포 수용체에는 어떠한 발현 변화가 나타나는지 분석하였다.
구체적으로, 상기 기재된 각 군별로 3 명의 공여자로부터 얻은 시료를 12일 동안 배양한 다음, 6 가지 종류의 수용체 분자에 대한 항체를 사용하여 동정하였다. 사용된 수용체 분자는 DNAM1, CD27, NKG2A, NKG2D, CD69 및 CD16이다. 사용된 실험군은 다음과 같다. (a) 용해성 IL-15; (b) 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양; (c) 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양.
도 10은 (a) 용해성 IL-15; (b) 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양; (c) 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양에서 PBMC 내 NK 세포 표면 상 수용체 발현을 분석한 overlay histogram이다.
또한, 상기 NK 세포 수용체 발현에 대한 데이터를 표로 작성하고 통계 처리하였다. 대응 표본(paired t-test)은 각 공여자의 NK 세포 수용체 발현율 데이터를 사용하여 수행하였다.
도 11은 (a) 용해성 IL-15; (b) 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양; (c) 용해성 IL-15 및 4-1BBL_IgG1Fc 및 IL-15Rα_IgG1Fc가 부착된 자성 입자를 이용한 배양에서 PBMC 내 NK 세포의 수용체 발현을 대응 표본(paired t-test)에 의한 통계적으로 분석한 결과이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. (*P<0.05, **P<0.005, ***P<0.001)
도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, NK 세포 억제 수용체인 NKG2A는 용해성 IL-15 군(a)에서 약간 발현하였지만, 특정 분자가 부착된 일 양상에 따른 자성 입자를 이용한 군에서는 감소하였다. 반면, 활성화 수용체인 NKG2D, CD69 및 CD16은 일 양상에 따른 자성 입자를 이용한 군에서 발현 백분율이 증가한 것을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 따른 자성 입자를 이용한 NK 세포 배양 시 상기 자성 입자를 이용한 배양에 의해 NK 세포에서 억제 수용체는 감소하고 수용체 활성화는 증가한 것을 확인하였다.

Claims (18)

  1. 적어도 일면에 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 블로킹 (blocking) 항체, 또는 이들의 조합이 부착된 자성 입자를 포함하는 자연 살해 세포(natural killer cell) 배양용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 활성화 수용체 리간드가 NCR family 리간드, NKG2 family 리간드, KIR family 리간드, BAG6, AICL, MICA, MICB, CADM1, IgG, CD48, NTB-A/SLAMF6, CD70, CD155, CD319, C8, C9, 및 CS1로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 억제성 수용체 리간드가 HLA-A, HLA-B, HLA-BW4, HLA-C1, HLA-C2, HLA-E, HLA-G, CD112/Nectin-2, CD112/Nectin-3, 카드헤린(cadherin), 콜라겐, OCIL, 및 CLEC2D로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 보조자극 수용체 리간드가 TNF family 리간드, TLR family 리간드, 4-1BB 리간드, CD28 리간드, NTBA, TLRL, PVR/Nectin-2, 및 PVR로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, 및 IL-27로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 사이토카인 수용체가 IL-2Rα, IL-15Rα, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 면역관문 리간드가 B7 family, galectin family, PVR family, PD-L1, BTLA-4 리간드, CTLA-4 리간드 (CD80), Tim-3 리간드, 및 TIGIT 리간드로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 블로킹 항체가 항-KIR2DL1 모노클로날 항체(mAb), 항-KIR2DL2 mAb, 항-KIR2DL3 mAb, 항-KIR2DL5A mAb, 항-KIR2DL5B mAb, 항-KIR3DL1 mAb, 항-KIR3DL2 mAb, 항-KIR2DL4 mAb, 항-CD94/NKG2A mAb, 항-CD94/NKG2B mAb, 항-CD96 mAb, 항-CEACAM-1 mAb, 항-ILT2/LILRB mAb, 항-KLRG1 mAb, 항-LAIR1 mAb, 항-NKRP1A mAb, 항-Siglec3 mAb, 항-Siglec7 mAb, 및 항-Siglec9 mAb로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 자성 입자 표면의 적어도 일면은 단백질 G 또는 단백질 A로 코팅된 것인 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 및 블로킹 (blocking) 항체는 인간 면역글로불린과 융합된 형태인 것인 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 인간 면역글로불린은 인간 면역글로불린 G인 것인 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 자성 입자의 크기는 500nm 내지 10μm인 것인 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 배양은 자연 살해 세포의 증식 또는 활성화를 위한 것인 조성물.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 자연 살해 세포는 말초 혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)에 포함된 형태인 것인 조성물.
  15. 자연 살해 세포를 적어도 일면에 활성화 수용체 리간드, 억제성 수용체 리간드, 보조자극 수용체 리간드, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 면역관문 리간드, 블로킹 (blocking) 항체, 또는 이들의 조합이 부착된 자성 입자를 포함하는 자연 살해 세포 배양용 조성물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 자연 살해 세포를 배양하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 배양하는 단계 전에, 말초 혈액 단핵구를 수득하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 배양하는 단계 후에, 상기 자성 입자를 배지로부터 제거하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 배양은 6일 내지 21일 동안 수행되는 것인 방법.
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