CN111117961B - 一种肿瘤抗原负载的dc-cik细胞培养方法 - Google Patents

一种肿瘤抗原负载的dc-cik细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体地说是一种肿瘤抗原负载的DC‑CIK细胞培养方法。一种肿瘤抗原负载的DC‑CIK细胞培养方法，包括如下步骤：(1)制备肿瘤抗原；(2)CIK细胞培养；(3)DC细胞培养；(4)DC‑CIK细胞培养。本发明的肿瘤抗原负载的DC‑CIK细胞培养方法在DC细胞活化过程中添加患者的肿瘤抗原对DC细胞进行活化，可使活化后的DC细胞具有对此种肿瘤细胞的特异性识别，再结合其它细胞因子的诱导作用，可使最后培养出来的DC‑CIK细胞兼具特异性和非特异性杀瘤作用，对比传统方法培养出来非特异性DC‑CIK细胞更具有临床研究价值。

Description

一种肿瘤抗原负载的DC-CIK细胞培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体地说是一种肿瘤抗原负载的DC-CIK 细胞培养方法。
背景技术
DC-CIK联合治疗是目前肿瘤生物治疗最成熟的治疗方案之一，DC(即树突细胞)能够准确识别肿瘤抗原并将信息传递给人体免疫系统，CIK细胞是人体免疫系统中的天然肿瘤杀伤细胞，可通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤，二者联合就完成了从辨别肿瘤细胞到消灭肿瘤细胞的全过程。两者联合可以显著抑制肿瘤细胞生长、并逐一消灭肿瘤细胞，最大限度调动愚者自身的免疫系统对抗肿瘤。DC-CIK联合治疗的另一大优勢是源源不断的免疫细胞的输入，迅速增强了人体免疫系统，可显改善患者的生活质量，延长肿瘤患者的生存期。但传统方法培养出的DC-CIK仅具有非特异性，不具有特异性。
发明内容
本发明提供了一种肿瘤抗原负载的DC-CIK细胞培养方法，以克服传统方法培养出的DC-CIK仅具有非特异性，不具有特异性的问题。
本发明提供的技术方案为：
一种肿瘤抗原负载的DC-CIK细胞培养方法，包括以下步骤：
(1)制备肿瘤抗原；
(2)CIK细胞培养；
(3)DC细胞培养；
(4)DC-CIK细胞培养。
作为优选，制备肿瘤抗原包括以下步骤：
(1-1)取患者手术切除后的肿瘤组织100g，在无菌条件下用生理盐水清洗干净后用手术剪刀将其剪碎，加入ALys505N-0培养基充分研磨；
(1-2)用4200目过滤网过滤收集单细胞悬浮液，1500r/min离心5min 后用ALys505N-0培养基重悬肿瘤细胞至1-2×107个/mL，装入5mL至冻存管中；
(1-3)充分裂解肿瘤细胞；
(1-4)将肿瘤细胞裂解物加入离心管，3000r/min离心处理10min，收取上清，过滤，所得上清即为肿瘤抗原；将所得肿瘤抗原在-80℃下保存，备用。
作为优选，步骤(1-3)的具体操作为：将冻存管浸入液氮中速冻，10min 后取出放入37°水中速溶5min，如此重复3-5次。
作为优选，CIK细胞培养包括以下步骤：
(2-1)取肿瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴细胞分离密度梯度离心法分离出PBMC；
(2-2)将步骤(2-1)所得PBMC细胞用ALys505N-0培养基洗涤一次，所得PBMC细胞浓度需为3-5×107个/mL；
(2-3)用ALys505N-0培养基将步骤(2-2)所得的PBMC的细胞浓度调整为1-2×106个/mL后置于T175培养瓶中，转移至培养箱中培养；
(2-4)2h后将T175培养瓶从培养箱中拿出，取另外一个T75培养瓶将悬浮细胞收集，加入1000IU/ml IFN-γ培养；
(2-5)24h后添加50ng/ml CD3单克隆抗体和1000IU/ml IL-1α进行增殖培养；
(2-6)每2-3d添加一倍的培养基培养，直至第7d时收获CIK细胞。
作为优选，DC细胞培养包括以下步骤：
(3-1)取步骤(2-4)中的贴壁细胞，加入500-1000IU/ml GM-CSF和500IU/ml IL-4，并用ALys505N-0培养基调整细胞浓度为1-2×106个/mL，放入培养箱中培养；
(3-2)每3d半量换液，并按照步骤(3-1)中浓度补充GM-CSF和IL-4；培养至第5d时，加入所制备的肿瘤抗原对DC进行抗原肽负载；
(3-3)培养至第6d时加入500IU/ml TNF-a诱导DC细胞成熟，在培养的第7d时收获DC细胞。
作为优选，步骤(3-2)中肿瘤抗原的添加量为50mg/mL。
作为优选，DC-CIK细胞培养包括以下步骤：
(4-1)将步骤(2-6)收获的CIK细胞核步骤(3-3)收获的DC细胞按 10：1混合置于含500IU/ml IL-2的ALys50N-0培养基中进行培养，每3d补加含500IU/ml IL-2的ALys50N-0培养基；
(4-2)培养至第15天时收获DC-CIK细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明的肿瘤抗原负载的DC-CIK细胞培养方法在DC细胞活化过程中添加患者的肿瘤抗原对DC细胞进行活化，可使活化后的DC细胞具有对此种肿瘤细胞的特异性识别，再结合其它细胞因子的诱导作用，可使最后培养出来的DC-CIK细胞兼具特异性和非特异性杀瘤作用，对比传统方法培养出来非特异性DC-CIK细胞更具有临床研究价值。
具体实施方式
参考下列实施例将更容易理解本发明，给出的实施例不是限制本发明的范围。
实施例中采用的ALys50N-0培养基为日本CSTI公司的产品。
实施例中的PBMC是指外周血单个核细胞。
GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。 GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC 培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。
IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。
GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80，CD86等)，但不表达CD14。
TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内 MHC II类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面MHC I 类、II类分子和B7家族分子(CD80，CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。
CIK是由多种细胞因子在体外共同诱导培养的细胞群，单一细胞因子对 CIK的增殖及细胞毒活性的作用明显降低或者小于多种细胞因子的联合应用，其主要机制是抗CD3单克隆抗体可特异性地识别T细胞表面的CD3 分子，与CD3分子的ε链特异结合后，经信号传导系统将刺激信号传导到细胞内部，通过启动T细胞表面TCRCD3复合物触发级联反应，导致T细胞活化及扩增；IFN-γ在IL-2加入24h前加入才能提高CIK细胞的细胞毒活性，IL-1α/β能提高CIK细胞的活性。在体外培养时，IL-2可促进CIK 增殖和杀伤活性的提高。在诱导CIK扩增过程中加入IL-2和IFN-γ的次序与CIK细胞毒活性密切相关。因此，在第0天培养CIK细胞时所使用的培养基应为添加IFN-γ的基础培养基制备成的活化培养基，以诱导T细胞活化。
在CIK细胞培养24h后所使用的培养基应为添加抗CD3单克隆抗体、 IL-2、IL-1α的基础培养基制备成的增殖培养基，以提高细胞毒性CIK细胞的含量。在第1d后培养CIK细胞时所使用的培养基应为添加IL-2的基础培养基制备成的扩增培养基，以诱导CIK细胞增殖。
实施例1：
制备肿瘤抗原包括以下步骤：
(1-1)取患者手术切除后的肿瘤组织100g，在无菌条件下用生理盐水清洗干净后用手术剪刀将其剪碎，加入ALys505N-0培养基充分研磨；
(1-2)用4200目过滤网过滤收集单细胞悬浮液，1500r/min离心5min 后用ALys505N-0培养基重悬肿瘤细胞至1-2×107个/mL，装入5mL至冻存管中；
(1-3)将冻存管浸入液氮中速冻，10min后取出放入37°水中速溶5min，如此重复3-5次；
(1-4)将肿瘤细胞裂解物加入离心管，3000r/min离心处理10min，收取上清，过滤，所得上清即为肿瘤抗原；将所得肿瘤抗原在-80℃下保存，备用。
实施例2
CIK细胞培养包括以下步骤：
(2-1)取肿瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴细胞分离密度梯度离心法分离出PBMC；
(2-2)将步骤(2-1)所得PBMC细胞用ALys505N-0培养基洗涤一次，所得PBMC细胞浓度需为3-5×107个/mL；
(2-3)用ALys505N-0培养基将步骤(2-2)所得的PBMC的细胞浓度调整为1-2×106个/mL后置于T175培养瓶中，转移至培养箱中培养；
(2-4)2h后将T175培养瓶从培养箱中拿出，取另外一个T75培养瓶将悬浮细胞收集，加入1000IU/ml IFN-γ培养；
(2-5)24h后添加50ng/ml CD3单克隆抗体和1000IU/ml IL-1α进行增殖培养；
(2-6)每2-3d添加一倍的培养基培养，直至第7d时收获CIK细胞。
于第0d和第7d取样做细胞流式鉴定，结果见表1。
表1本发明CIK细胞培养检测结果
CD3+CD56+(％) CD3+CD8+(％) 细胞成活率(％) 细胞数量(个/mL)
第0d 7.3 29.5 98.3 3.5×10<sup>7</sup>
第7d 23.2 54.6 99.1 2.5×10<sup>8</sup>
从表1可知，采用本发明的培养方法培养CIK细胞7d后，CD3+CD56+、 CD3+CD8+以及细胞数量均明显增加，同时细胞成活率也维持一个较高水平。
实施例3
DC细胞培养包括以下步骤：
(3-1)取实施例2步骤(2-4)中的贴壁细胞，加入500-1000IU/ml GM-CSF 和500IU/ml IL-4，并用ALys505N-0培养基调整细胞浓度为1-2×106个/mL，放入培养箱中培养；
(3-2)每3d半量换液，并按照步骤(3-1)中浓度补充GM-CSF和IL-4；培养至第5d时，加入所制备的肿瘤抗原对DC进行抗原肽负载，肿瘤抗原的添加量为50mg/mL；
(3-3)培养至第6d时加入500IU/ml TNF-a诱导DC细胞成熟，在培养的第7d时收获DC细胞。
按照上述方法进行培养，于第0d和第7d取样做细胞流式鉴定，结果见表2。
表2 本发明DC细胞培养检测结果
CD86+(％) 细胞成活率(％) 细胞数量(个/mL)
第0d 40.3 98.1 1.8×10<sup>6</sup>
第7d 80.7 98.3 1.9×10<sup>6</sup>
从表2可知，采用本发明的培养方法培养DC细胞7d后，CD86+和细胞数量均明显增加，同时细胞成活率也维持一个较高水平。
实施例4
DC-CIK细胞培养包括以下步骤：
(4-1)将实施例2步骤(2-6)收获的CIK细胞核和实施例3步骤(3-3) 收获的DC细胞按10：1混合置于含500IU/ml IL-2的ALys50N-0培养基进行培养，每3d补加含500IU/ml IL-2的ALys50N-0培养基。
(4-2)培养至第15天时收获DC-CIK细胞。
按照上述方法进行培养，于第0d和第7d取样做细胞流式鉴定，结果见表3。
表3本发明DC-CIK细胞培养检测结果
CD3+CD56+(％) CD3+CD8+(％) 细胞成活率(％) 细胞数量(个/mL)
第0d 7.3 29.5 98.3 3.5×10<sup>7</sup>
第7d 55.7 81.9 98.8 8.7×10<sup>9</sup>
从表3可知，采用本发明的培养方法培养DC-CIK细胞15d后， CD3+CD56+、CD3+CD8+以及细胞数量均明显增加，同时细胞成活率也维持一个较高水平。
综上所述，本发明的肿瘤抗原负载的DC-CIK细胞培养方法可以提高细胞数量，使细胞保持一个较高水平的成活率。另外本发明的肿瘤抗原负载的 DC-CIK细胞培养方法在DC细胞活化过程中添加患者的肿瘤抗原对DC细胞进行活化，可使活化后的DC细胞具有对此种肿瘤细胞的特异性识别，再结合其它细胞因子的诱导作用，可使最后培养出来的DC-CIK细胞兼具特异性和非特异性杀瘤作用。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (3)

1.一种肿瘤抗原负载的DC-CIK细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备肿瘤抗原；
（2）CIK细胞培养；
（3）DC细胞培养；
（4）DC-CIK细胞培养；
其中，制备肿瘤抗原包括以下步骤：
（1-1）取患者手术切除后的肿瘤组织100g，在无菌条件下用生理盐水清洗干净后用手术剪刀将其剪碎，加入ALys505N-0 培养基充分研磨；
（1-2）用4200目过滤网过滤收集单细胞悬浮液，1500r/min离心5min后用ALys505N-0培养基重悬肿瘤细胞至1-2×107个/mL，装入5mL至冻存管中；
（1-3）充分裂解肿瘤细胞；
（1-4）将肿瘤细胞裂解物加入离心管，3000r/min离心处理10min，收取上清，过滤，所得上清即为肿瘤抗原；将所得肿瘤抗原在-80℃下保存，备用；
CIK细胞培养包括以下步骤：
（2-1）取肿瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴细胞分离密度梯度离心法分离出PBMC；
（2-2）将步骤（2-1）所得PBMC细胞用ALys505N-0 培养基洗涤一次，所得PBMC细胞浓度需为3-5×107个/mL；
（2-3）用ALys505N-0 培养基将步骤（2-2）所得的PBMC的细胞浓度调整为1-2×106个/mL后置于T175培养瓶中，转移至培养箱中培养；
（2-4）2h后将T175培养瓶从培养箱中拿出，取另外一个T75培养瓶将悬浮细胞收集，加入1000IU/ml IFN-γ培养；
（2-5）24h后添加50ng/ml CD3单克隆抗体和1000IU/ml IL-1α进行增殖培养；
（2-6）每2-3d添加一倍的培养基培养，直至第7d时收获CIK细胞；
DC细胞培养包括以下步骤：
（3-1）取步骤（2-4）中的贴壁细胞，加入500-1000IU/ml GM-CSF和500IU/ml IL-4，并用ALys505N-0 培养基调整细胞浓度为1-2×106个/mL，放入培养箱中培养；
（3-2）每3d半量换液，并按照步骤（3-1）中浓度补充GM-CSF和IL-4；培养至第5d时，加入所制备的肿瘤抗原对DC进行抗原肽负载；
（3-3）培养至第6d时加入500IU/ml TNF-a 诱导DC细胞成熟，在培养的第7d时收获DC细胞；
DC-CIK细胞培养包括以下步骤：
（4-1）将步骤（2-6）收获的CIK细胞和步骤（3-3）收获的DC细胞按10：1混合置于含500IU/ml IL-2的ALys50N-0 培养基中进行培养，每3d补加含500IU/ml IL-2的ALys50N-0培养基；
（4-2）培养至第15天时收获DC-CIK细胞。
2.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞培养方法，其特征在于，步骤（1-3）的具体操作为：将冻存管浸入液氮中速冻，10min后取出放入37℃水中速溶5min，如此重复3-5次。
3.根据权利要求1所述的DC-CIK细胞培养方法，其特征在于，步骤（3-2）中肿瘤抗原的添加量为50mg/mL。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018424A (zh) * 2015-05-27 2015-11-04 贵州北科泛特尔生物科技有限公司 Dc-cik细胞及其制备方法
CN105087488A (zh) * 2015-09-15 2015-11-25 上海麦禾生物科技有限公司 一种肿瘤抗原诱导的dc-cik细胞的制备方法及应用
CN105154401B (zh) * 2015-09-30 2018-09-04 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种大规模培养nkt细胞的方法
CN108392627A (zh) * 2018-03-20 2018-08-14 北京哲大生物科技有限公司 Dc-taa肿瘤疫苗的制备方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Cytokine-Induced Killer Cells As Pharmacological Tools for Cancer Immunotherapy;Xingchun Gao等;《Frontiers in Immunology》;20170706;第8卷;Article 774 *

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