CN111778211A - Dc-ctl中断培养后细胞冻存复苏再培养方法 - Google Patents

Dc-ctl中断培养后细胞冻存复苏再培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DC‑CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，包括以下步骤：S1.采集外周血，得到灭活血浆；S2.处理S1转移血浆层后余下的血细胞层，得到单个核细胞沉淀；S3.将S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到DC细胞，悬浮细胞作CIK培养；S4.收获7D时的DC‑CTL细胞；S5.将DC‑CTL细胞离心得到细胞沉淀，上清培养液保存待用；S6.将S5得到的细胞沉淀冻存；S7.将S5中的上清培养液解冻；取出S6中冻存的细胞并快速解冻，混匀后离心得到细胞沉淀；S8.将S7得到的细胞沉淀，并使用解冻后的上清培养液重悬，细胞悬液的终细胞浓度为1‑2百万活细胞/ml；S9.将S8的细胞悬液转移至培养箱中继续培养，收集DC‑CTL细胞，并取样做检测。

Description

DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法
技术领域
本发明涉及细胞生物制品技术领域，特别是涉及一种DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法。
背景技术
DC-CTL免疫细胞临床研究是一种新的肿瘤患者个体化临床应用的技术，而免疫细胞培养又是免疫细胞临床研究的实验室阶段，其重要性和必要性已经在临床研究领域得到越来越重要的认识。对于临床研究来讲，免疫细胞应用于临床实践目前主要是从外周血提取分离单个核细胞，然后经过一定周期细胞培养就需要完成应用实践。
DC-CTL细胞临床研究过程中，对肿瘤患者的筛选是严格准确的，随后随机分组做对照试验，评估处理试验组和对照组相应的试验数据，最后得出相应的试验结论。DC-CTL细胞培养过程都是一个连续的时间段，从患者外周血采集到制备完成的周期为14天，这就要求患者能够完全配合试验要求，要求在试验周期内患者能够确保试验按时进行。若肿瘤患者因个人等多种因素，很多时候无法确保能够完全按照临床试验步骤进行，就会导致整体试验减缓和影响，也直接影响到对照试验的准确性。这时候就需要废弃已经正在实验室培养的CTL细胞，再次进入临床试验阶段，又需再次采集再次培养，增加了试验的时间和试验经费，同时，也给患者带来实际的损伤。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法。
本发明的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，包括以下步骤：
S1.采集外周血并分入离心管中，将离心管放入离心机中离心得到血浆层，将血浆层转移到新的离心管中，得到灭活血浆；
S2.处理S1转移血浆层后余下的血细胞层，得到血细胞悬液；将血细胞悬液贴壁转移至淋巴细胞分离液离心管中，并进行梯度离心，梯度离心后，吸取中间的白膜层并转移至新的离心管中，将装有白膜层的离心管离心，得到单个核细胞沉淀；
S3.将S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到DC细胞，使DC细胞负载患者自体肿瘤组织抗原，悬浮细胞作CIK培养；
S4.将已负载肿瘤抗原的DC与杀伤性T细胞的CIK混合培养，收获7D时的DC-CTL细胞；
S5.将DC-CTL细胞离心得到细胞沉淀，上清培养液保存待用；
S6.将S5得到的细胞沉淀依次加入无血清培养液和无血清培养基冻存液，混匀后分装到冻存管中，待温度冷却至-80℃后转移至液氮罐中长期保存；
S7.将S5中的上清培养液解冻；上清液培养液解冻完毕后，取出S6中冻存的细胞并快速解冻，转移至新的离心管中，添加无血清培养液，混匀后离心得到细胞沉淀；
S8.将S7得到的细胞沉淀，并使用解冻后的上清培养液重悬，细胞悬液的终细胞浓度为1-2百万活细胞/ml；
S9.将S8的细胞悬液转移至培养箱中继续培养，收集DC-CTL细胞，并取样做检测。
进一步优选地，所述S1包括以下步骤：
S11.在无菌条件下，采集外周血，转移至含肝素钠的离心管内保存，冷链运输；
S12.消毒离心管外表面，转移至万级实验室的百级生物安全柜内；
S13.将外周血分入多个离心管并配平，将配平后的离心管放入离心机中离心得到血浆层，将血浆层转移到新的离心管中，得到灭活血浆。
进一步优选地，所述S2包括以下步骤：
S21.向S1中转移血浆层后余下的血细胞层加入生理盐水，混匀血细胞与生理盐水，得到血细胞悬液；
S22.将S21得到的血细胞悬液贴壁转移至淋巴细胞分离液离心管中，待结束后配平，配平后的离心管进行梯度离心；
S23.梯度离心后得到自上而下的血浆盐水层、白膜层、淋巴细胞分离液层和红细胞层，吸取中间的白膜层并转移至新的离心管中；
S24.将装有白膜层离心管离心，得到单个核细胞沉淀。
进一步优选地，所述S3包括以下步骤：
S31.向S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到的悬浮细胞加入含γ-干扰素的无血清培养基，重悬细胞均匀转移至CIK细胞瓶中，竖瓶放置培养箱中培养；
S32.向S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到的DC细胞加入含rh-GM-CSF、rhTL-4无血清培养基，培养瓶平躺放置培养箱中培养。
进一步优选地，所述S3还包括以下步骤：
S33.S31处理24h后，向S31的CIK细胞瓶中添加CD3McAb、rhIL-1ɑ、rhIL-2，继续竖瓶培养；
S34.S31处理3D后，向S33的CIK细胞瓶补加含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基，根据细胞状态判断是否继续竖瓶培养，若细胞集落大且瓶底无细胞贴壁则平放培养，若细胞集落小且细胞贴壁则继续竖瓶培养，DC细胞半量换液；
S35.S31处理5D后，向CIK细胞瓶内补加含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基，平放培养，DC细胞负载患者自体肿瘤组织抗原，并补加TNF-ɑ；
所述S4包括以下步骤：
S31处理6D时，将已负载肿瘤抗原的DC细胞与杀伤性T细胞的CIK混合培养，收获7D时的DC-CTL细胞。
进一步优选地，所述S5包括以下步骤：
将DC-CTL细胞转移至生物安全柜，用移液管转移至BD离心管中，配平后离心得到细胞沉淀，离心结束后，上清培养液-80℃保存待用。
进一步优选地，所述S6包括以下步骤：
S61.S31处理7D后，将S5中得到的细胞沉淀用生理盐水洗涤；
S62.将S61中经过洗涤后的细胞沉淀加入无血清培养液，使得细胞密度为冻存密度2倍，再缓慢加入已预冷20％DMSO：80％无血清培养基冻存液，混匀后转移分装到已准备好的冻存管内，封盖，贴便签，迅速转移至程序降温仪内，待温度冷却至-80℃后转移至液氮罐中长期保存。
进一步优选地，所述S7包括以下步骤：
S71.将S5中保存的上清培养液放入4℃解冻；
S72.待解冻完毕后，取出S6中冻存的细胞，即刻移入已预热的水浴锅中快速解冻，待解冻至95％时转移至生物安全柜中，无菌操作下打开盖子转移到新的离心管中，添加无血清培养基，充分混匀后离心得到细胞悬液；
S73.将S72得到的细胞悬液离心洗涤后，用含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基重悬，取样细胞悬液进行细胞计数和活力测定，余下细胞悬液混匀后离心得到细胞沉淀。
进一步优选地，所述S8包括以下步骤：
将S7得到的细胞沉淀用上清培养基重悬，根据细胞计数和细胞活力，终细胞浓度为1-2百万活细胞/ml；其中，上清培养基包括S7中已解冻的上清培养液和含1000IU/mlrhIL-2的无血清培养基。
进一步优选地，所述S9包括以下步骤：
S91.把S8的细胞悬液转移至培养袋中，并转移至培养箱中培养；
S92.S91处理4D后，观察细胞形态，补充含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基；
S93.S91处理7D后，收集DC-CTL细胞，并取样做检测，其中，所述检测的内容包括：细胞表型、细胞数量和活力、细菌真菌、支原体、内毒素和流式检测。
相对于现有技术，本发明的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法能够有效地减小因患者个人原因导致培养中断而带来的影响，有效降低临床试验成本，减少细胞浪费，同时能够减轻多次采集对试验者带来的损伤，优化临床研究实施。
具体实施方式
以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本公开。在本公开和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
本发明的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，包括以下步骤：
S1.采集外周血并分入离心管中，将离心管放入离心机中离心得到血浆层，将血浆层转移到新的离心管中，得到灭活血浆。
具体地，所述S1优选地包括以下步骤：
S11.在无菌条件下，采集外周血，转移至含肝素钠的离心管内保存，冷链运输。
在一种实施方式中，采集外周血100ml，转移至含肝素钠的50ml离心管内保存。
S12.消毒离心管外表面，转移至万级实验室的百级生物安全柜内。
优选地，使用75％酒精擦拭、消毒装有外周血的离心管外表面。
S13.分离血浆：
将外周血分入多个离心管并配平，将配平后的离心管放入离心机中离心得到血浆层，将血浆层转移到新的离心管中，得到灭活血浆。
在一种实施方式中，将外周血分成4管50ml离心管并配平，配平后的离心管在离心机转速1600rpm的条件下离心7min得到血浆层，得到血浆层后，血浆转移至另一个新的50ml离心管，在56℃下，灭活30min得到灭活血浆。
S2.梯度离心：
处理S1转移血浆层后余下的血细胞层，得到血细胞悬液；将血细胞悬液贴壁转移至淋巴细胞分离液离心管中，并进行梯度离心，梯度离心后，吸取中间的白膜层并转移至新的离心管中，将装有白膜层的离心管离心，得到单个核细胞沉淀。
具体地，所述S2优选地包括以下步骤：
S21.向S1中转移血浆层后余下的血细胞层加入生理盐水，混匀血细胞与生理盐水，得到血细胞悬液。
在一种实施方式中，向S1中转移血浆层后余下的血细胞层加入生理盐水至30ml，并轻轻混匀血细胞与盐水。
S22.梯度离心：
将S21得到的血细胞悬液贴壁转移至淋巴细胞分离液离心管中，待结束后配平，配平后的离心管进行梯度离心。
在一种实施方式中，将上述血细胞悬液轻轻贴壁转移至淋巴细胞分离液离心管中，注意界面清晰，待结束后配平，配平后的离心管在离心转速1800rpm的条件下离心20min，升速6、降速3的情况梯度离心。
S23.获取和分离白膜层：
梯度离心后得到自上而下的血浆盐水层、白膜层、淋巴细胞分离液层和红细胞层，吸取中间的白膜层并转移至新的离心管中。
在一种实施方式中，将吸取中间的白膜层并转移至新的50ml离心管中。
S24.细胞洗涤：
将装有白膜层离心管离心，得到单个核细胞沉淀。
在一种实施方式中，将离心管中的白膜层细胞离心两次，每次离心转速为1600rpm，离心时间为7min，从而得到单个核细胞沉淀。
S3.DC分离：
将S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到DC细胞，使DC细胞负载患者自体肿瘤组织抗原，悬浮细胞作CIK培养。
具体地，所述S3优选地包括以下步骤：
S31.CIK初始培养：
向S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到的悬浮细胞加入含γ-干扰素的无血清培养基，重悬细胞均匀转移至CIK细胞瓶中，竖瓶放置培养箱中培养。
在一种实施方式中，向S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到的悬浮细胞加入含γ-干扰素的无血清培养基100ml，重悬细胞均匀转移至4个75cm2斜颈透气培养瓶中，竖瓶放置在37℃、5％CO2的培养箱中培养。
S32.向S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到的DC细胞加入含rh-GM-CSF、rhTL-4无血清培养基，培养瓶平躺放置培养箱中培养。
在一种实施方式中，向S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到的DC细胞加入含rh-GM-CSF、rhTL-4无血清培养基20ml，培养瓶平躺放置在37℃、5％CO2培养箱中培养。
S33.S31处理24h后，向S31的CIK细胞瓶中添加CD3McAb、rhIL-1ɑ、rhIL-2，继续竖瓶培养。
注意此过程CIK细胞瓶轻拿轻放，不易过度摇晃。
S34.S31处理3D后，向S33的CIK细胞瓶补加含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基，根据细胞状态判断是否继续竖瓶培养，若细胞集落大且瓶底无细胞贴壁则平放培养，若细胞集落小且细胞贴壁则继续竖瓶培养，DC细胞半量换液。
在一种实施方式中，向S33的CIK细胞瓶补加100ml-140ml含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基。
另外，注意此过程CIK细胞瓶轻拿轻放，不易过度摇晃。
S35.S31处理5D后，向CIK细胞瓶内补加含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基，平放培养，DC细胞负载患者自体肿瘤组织抗原，并补加TNF-ɑ。
在一种实施方式中，向CIK细胞瓶内补加400ml-5600ml含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基。
另外，注意此过程CIK细胞瓶轻拿轻放，不易过度摇晃。
S4.将已负载肿瘤抗原的DC与杀伤性T细胞的CIK混合培养，收获7D时的DC-CTL细胞。
具体地，所述S4优选地包括以下步骤：
S31处理6D时，将已负载肿瘤抗原的DC细胞与杀伤性T细胞的CIK混合培养，收获7D时的DC-CTL细胞。
S5和S6为DC-CTL细胞冻存过程，具体为：
S5.将DC-CTL细胞离心得到细胞沉淀，上清培养液保存待用。
具体地，所述S5优选地包括以下步骤：
将DC-CTL细胞转移至生物安全柜，用移液管转移至BD离心管中，配平后离心得到细胞沉淀，离心结束后，上清培养液-80℃保存待用。
在一种实施方式中，将DC-CTL细胞转移至生物安全柜，在确认无误的情况下，用移液管转移至225mlBD离心管中，配平后，在1600rpm的转速下，离心7min得到细胞沉淀，离心结束后，上清培养液-80℃保存待用。
上清培养液低温保存，待后续复苏解冻使用，关键在于上清培养液中含有大量细胞诱导、扩增、代谢的多种活性成分和细胞因子，有利于为复苏继续培养的细胞提供熟悉和完善的环境，有利于细胞快速适应，减少细胞凋亡和损失，超低温更有利于上清培养液的营养成分得以长期有效。
S6.将S5得到的细胞沉淀依次加入无血清培养液和无血清培养基冻存液，混匀后分装到冻存管中，待温度冷却至-80℃后转移至液氮罐中长期保存。
具体地，所述S6优选地包括以下步骤：
S61.S31处理7D后，将S5中得到的细胞沉淀用生理盐水洗涤。
在一种实施方式中，将S5中得到的细胞沉淀用生理盐水洗涤两边，转速与时间与S5中一致。
S62.将S61中经过洗涤后的细胞沉淀加入无血清培养液，使得细胞密度为冻存密度2倍，再缓慢加入已预冷20％DMSO：80％无血清培养基冻存液，混匀后转移分装到已准备好的冻存管内，封盖，贴便签，迅速转移至程序降温仪内，待温度冷却至-80℃后转移至液氮罐中长期保存。
其中，无血清培养基冻存液的成分为10％DMSO：90％无血清培养基。
S7.复苏解冻细胞：
将S5中的上清培养液解冻；上清液培养液解冻完毕后，取出S6中冻存的细胞并快速解冻，转移至新的离心管中，添加无血清培养液，混匀后离心得到细胞沉淀。
具体地，所述S7优选地包括以下步骤：
S71.将S5中保存的上清培养液放入4℃解冻。
S72.待解冻完毕后，取出S6中冻存的细胞，即刻移入已预热的水浴锅中快速解冻，待解冻至95％时转移至生物安全柜中，无菌操作下打开盖子转移到新的离心管中，添加无血清培养基，充分混匀后离心得到细胞悬液。
在一种实施方式中，无菌操作下打开盖子转移到新的50ml离心管中，添加无血清培养基至45ml，充分混匀后离心得到细胞悬液。
细胞冻存管解冻95％即转入至生物安全柜，解冻95％是为了能够让细胞还处在低温状态，防止多解冻，减少细胞损伤。
S73.将S72得到的细胞悬液离心洗涤后，用含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基重悬，取样细胞悬液进行细胞计数和活力测定，余下细胞悬液混匀后离心得到细胞沉淀。
在一种实施方式中，用含1000IU/mlrhIL-2的无血清培养基重悬至45ml，取样0.5ml细胞悬液进行细胞计数和活力测定，余下细胞悬液混匀后离心得到细胞沉淀。
S8.将S7得到的细胞沉淀，并使用解冻后的上清培养液重悬，细胞悬液的终细胞浓度为1-2百万活细胞/ml。
具体地，所述S8优选地包括以下步骤：
将S7得到的细胞沉淀用上清培养基重悬，根据细胞计数和细胞活力，终细胞浓度为1-2百万活细胞/ml；其中，上清培养基包括S7中已解冻的上清培养液和一定量新配制的含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基。
检测细胞计数和细胞活力有利于使得细胞种瓶密度能在合理范围内，细胞能够在相对距离空间内进行相互链接和促进，让其后续培养能够尽快适应，更有利于细胞的生长扩增。
S9.细胞继续培养及检测：
将S8的细胞悬液转移至培养箱中继续培养，收集DC-CTL细胞，并取样做检测。
具体地，所述S9优选地包括以下步骤：
S91.把S8的细胞悬液转移至培养袋中，并转移至培养箱中培养。
注意无菌操作和轻拿轻放，转移至37℃、5％CO2的培养箱中培养。
S92.S91处理4D后，观察细胞形态，补充相适宜的新配制的含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基。
S93.S91处理7D后，收集DC-CTL细胞，并取样做检测，其中，所述检测的内容包括：细胞表型、细胞数量和活力、细菌真菌、支原体、内毒素和流式检测。
实验例：
本实验例取3份外周血的DC-CTL细胞，每份在7D时一半细胞继续培养，一半细胞采用本发明的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，对比3组细胞计数和细胞活力的结果，结果如下：
Figure BDA0002600730810000121
由该实验例的结果可知，本发明的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，可以保持细胞计数和细胞活力维持稳定，减小培养中断而带来的影响。
在DC-CTL免疫细胞临床研究过程，针对于身体虚弱患有疾病的患者，病情的变化很难预料，有时会影响应用实践的时间安排。本发明能够在时间有冲突的情况下，细胞培养中断后能够再复苏培养，就能够减小患者因临床研究而耽误疾病的治疗，也能够待身体允许后再继续进行临床应用，这样有助于减轻患者痛苦，更能优化临床研究实施。
相对于现有技术，本发明的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法能够有效地减小因患者个人原因导致培养中断而带来的影响，有效降低临床试验成本，减少细胞浪费，同时能够减轻多次采集对试验者带来的损伤，优化临床研究实施。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.采集外周血并分入离心管中，将离心管放入离心机中离心得到血浆层，将血浆层转移到新的离心管中，得到灭活血浆；
S2.处理S1转移血浆层后余下的血细胞层，得到血细胞悬液；将血细胞悬液贴壁转移至淋巴细胞分离液离心管中，并进行梯度离心，梯度离心后，吸取中间的白膜层并转移至新的离心管中，将装有白膜层的离心管离心，得到单个核细胞沉淀；
S3.将S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到DC细胞，使DC细胞负载患者自体肿瘤组织抗原，悬浮细胞作CIK培养；
S4.将已负载肿瘤抗原的DC与杀伤性T细胞的CIK混合培养，收获7D时的DC-CTL细胞；
S5.将DC-CTL细胞离心得到细胞沉淀，上清培养液保存待用；
S6.将S5得到的细胞沉淀依次加入无血清培养液和无血清培养基冻存液，混匀后分装到冻存管中，待温度冷却至-80℃后转移至液氮罐中长期保存；
S7.将S5中的上清培养液解冻；上清液培养液解冻完毕后，取出S6中冻存的细胞并快速解冻，转移至新的离心管中，添加无血清培养液，混匀后离心得到细胞沉淀；
S8.将S7得到的细胞沉淀，并使用解冻后的上清培养液重悬，细胞悬液的终细胞浓度为1-2百万活细胞/ml；
S9.将S8的细胞悬液转移至培养箱中继续培养，收集DC-CTL细胞，并取样做检测。
2.根据权利要求1所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：
S11.在无菌条件下，采集外周血，转移至含肝素钠的离心管内保存，冷链运输；
S12.消毒离心管外表面，转移至万级实验室的百级生物安全柜内；
S13.将外周血分入多个离心管并配平，将配平后的离心管放入离心机中离心得到血浆层，将血浆层转移到新的离心管中，得到灭活血浆。
3.根据权利要求1所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S2包括以下步骤：
S21.向S1中转移血浆层后余下的血细胞层加入生理盐水，混匀血细胞与生理盐水，得到血细胞悬液；
S22.将S21得到的血细胞悬液贴壁转移至淋巴细胞分离液离心管中，待结束后配平，配平后的离心管进行梯度离心；
S23.梯度离心后得到自上而下的血浆盐水层、白膜层、淋巴细胞分离液层和红细胞层，吸取中间的白膜层并转移至新的离心管中；
S24.将装有白膜层离心管离心，得到单个核细胞沉淀。
4.根据权利要求1-3任一项所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S3包括以下步骤：
S31.向S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到的悬浮细胞加入含γ-干扰素的无血清培养基，重悬细胞均匀转移至CIK细胞瓶中，竖瓶放置培养箱中培养；
S32.向S2得到的细胞沉淀用贴壁分离法得到的DC细胞加入含rh-GM-CSF、rhTL-4无血清培养基，培养瓶平躺放置培养箱中培养。
5.根据权利要求4所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S3还包括以下步骤：
S33.S31处理24h后，向S31的CIK细胞瓶中添加CD3McAb、rhIL-1ɑ、rhIL-2，继续竖瓶培养；
S34.S31处理3D后，向S33的CIK细胞瓶补加含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基，根据细胞状态判断是否继续竖瓶培养，若细胞集落大且瓶底无细胞贴壁则平放培养，若细胞集落小且细胞贴壁则继续竖瓶培养，DC细胞半量换液；
S35.S31处理5D后，向CIK细胞瓶内补加含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基，平放培养，DC细胞负载患者自体肿瘤组织抗原，并补加TNF-ɑ；
所述S4包括以下步骤：
S31处理6D时，将已负载肿瘤抗原的DC细胞与杀伤性T细胞的CIK混合培养，收获7D时的DC-CTL细胞。
6.根据权利要求5所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S5包括以下步骤：
将DC-CTL细胞转移至生物安全柜，用移液管转移至BD离心管中，配平后离心得到细胞沉淀，离心结束后，上清培养液-80℃保存待用。
7.根据权利要求6所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S6包括以下步骤：
S61.S31处理7D后，将S5中得到的细胞沉淀用生理盐水洗涤；
S62.将S61中经过洗涤后的细胞沉淀加入无血清培养液，使得细胞密度为冻存密度2倍，再缓慢加入已预冷20％DMSO：80％无血清培养基冻存液，混匀后转移分装到已准备好的冻存管内，封盖，贴便签，迅速转移至程序降温仪内，待温度冷却至-80℃后转移至液氮罐中长期保存。
8.根据权利要求7所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S7包括以下步骤：
S71.将S5中保存的上清培养液放入4℃解冻；
S72.待解冻完毕后，取出S6中冻存的细胞，即刻移入已预热的水浴锅中快速解冻，待解冻至95％时转移至生物安全柜中，无菌操作下打开盖子转移到新的离心管中，添加无血清培养基，充分混匀后离心得到细胞悬液；
S73.将S72得到的细胞悬液离心洗涤后，用含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基重悬，取样细胞悬液进行细胞计数和活力测定，余下细胞悬液混匀后离心得到细胞沉淀。
9.根据权利要求8所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S8包括以下步骤：
将S7得到的细胞沉淀用上清培养基重悬，根据细胞计数和细胞活力，终细胞浓度为1-2百万活细胞/ml；其中，上清培养基包括S7中已解冻的上清培养液和含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基。
10.根据权利要求9所述的DC-CTL中断培养后细胞冻存复苏再培养方法，其特征在于，所述S9包括以下步骤：
S91.把S8的细胞悬液转移至培养袋中，并转移至培养箱中培养；
S92.S91处理4D后，观察细胞形态，补充含1000IU/ml rhIL-2的无血清培养基；
S93.S91处理7D后，收集DC-CTL细胞，并取样做检测，其中，所述检测的内容包括：细胞表型、细胞数量和活力、细菌真菌、支原体、内毒素和流式检测。
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