CN106818710A - 一种细胞冻存液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种细胞冻存液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫细胞冻存及复苏技术领域，特别涉及人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后再培养的方法，本发明的提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，包括冻存人外周血单个核细胞时冻存液、冻存密度的选择以及复苏时保护液的选择，通过筛选合适的冻存液和冻存密度保存了外周血单个核细胞的细胞活性，复苏时选择合适的保护液，有利于更好的保护细胞的活性，从而大大提高了冻存的外周血单个核细胞的活性和利用率。

Description

一种细胞冻存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫细胞冻存及复苏技术领域，特别涉及一种细胞冻存液以及制备方法，已经应用于人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏后再培养。
背景技术
免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞等，其中淋巴细胞具有免疫调节和自我复制等特点，针对病毒、细菌、真菌感染的治疗均可起到关键的作用，免疫细胞在癌症治疗中具有很大的临床应用价值。免疫细胞治疗主要是采集患者自身外周血，通过分离和收集得到外周血单个核细胞。但一般说来，接受免疫细胞治疗的群体主要为肿瘤或病毒感染患者，然而此类人群的免疫细胞机能已十分低下，分离出的免疫细胞活性较低；而异体的免疫细胞移植则可能引起患者体内的免疫排斥反应。因此人们可在自身健康状况良好、免疫细胞活性较强时，提前将健康细胞储存起来，以备将来治病之需。
细胞冻存是细胞长期保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。目前常用的储存方法是利用低温冻存技术保存外周血单个核细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞，但现有冻存技术会使细胞活性降低，细胞存活率不高，且由于冻存过程会改变细胞的物理化学环境，同时伴有生物性损伤，导致冻存细胞复苏过程会进一步增加脆弱细胞死亡的几率。因此，如何有效的提高冻存以及复苏时细胞的活性将直接影响免疫细胞疗法的临床应用。
发明内容
本发明要解决的主要技术问题是提供一种增加单个核细胞得率，提高单个核细胞活性的方法，通过保存健康人的外周血单个核细胞，并保持冻存过程中细胞的活性，提高扩增培养的细胞扩增倍数，从而提高回输到患者的细胞总量。
本发明的目的之一在于提供一种细胞冻存液，包括组分及体积百分数：
无血清培养基的体积百分比为0%～50%，
自体血浆的体积百分比为40%～90%，
DMSO的体积百分比为5%～10%，
海藻糖的体积百分比为5%～10%；
各组分之和为100%。
本发明的另一目的在于提供细胞冻存液的配制方法，包括步骤：
1）海藻糖和DMSO按1：1的比例混匀，将自体血浆加入到无血清培养基中，使自体血浆的体积百分比为50%～100%，
2）将10%～20%的海藻糖和DMSO混合液缓慢加入，得到细胞冻存液。
本发明还提供一种提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法。
人体外周血单个核细胞低温冻存与复苏保护，本发明涉及冻存技术一种新的应用，利用低温冻存技术保存人体外周血单个核细胞，需要时复苏并诱导为肿瘤杀伤性细胞，不但可以实践疾病预防的概念，更能提升预防医学的价值题。预先储存健康的免疫细胞，当日后患者需要治疗时，复苏诱导为杀伤性细胞，不仅能为患者节约费用，还可减轻患者的痛苦。
本发明通过以下技术方案实现目的：
提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，包括以下步骤：包括以下步骤：
1）采集外周血，分离上层淡黄色血浆层，并于56℃灭活15-30min，900-1200g离心5-10min，剩余的液体即为浓缩的血细胞，用生理盐水稀释浓缩的血细胞至原体积；
2）将细胞分离液加入离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的加到细胞分离液上层，血液稀释液与细胞分离液的体积比为2:1，600-700g离心15-20min，吸取离心管内的单个核细胞层，移到离心管内并补加生理盐水，洗涤并离心收集外周血单个核细胞；
3) 外周血单个核细胞的冻存：将步骤2)收集的外周血单个核细胞利用自体血浆重悬，向制得的细胞悬液中加入细胞冻存液，摇匀分装至冻存管中，放入程序降温盒中，转至-80℃后，后转移至液氮罐；
4) 外周血单个核细胞的复苏：将步骤3)冻存的冻存管从气相液氮罐中取出，水浴溶解后将冻存管中的细胞悬液转移至复苏保护液中，细胞悬液与复苏保护液的体积比为1：5-10，混匀后洗涤离心，将洗涤离心后的外周血单个核细胞用培养基重悬，接种于培养瓶中；
5) 外周血单个核细胞诱导扩增培养：对步骤4)中培养瓶里的细胞悬液进行诱导扩增培养。
其中，步骤3)的细胞冻存液的配制方法：海藻糖和DMSO按1：1的比例混匀，将自体血浆加入到无血清培养基中，使自体血浆的体积百分比为50%～100%，并将10%～20%的海藻糖和DMSO混合液缓慢加入，得到细胞冻存液。
其中，步骤3)的冻存过程具体为：将步骤2)收集的PBMC用自体血浆重悬，再将上述细胞冻存液缓慢加入到细胞悬液中，细胞冻存液中无血清培养基、自体血浆与DMSO和海藻糖混合液的体积比为0～9：0～9：1。
进一步优化，步骤3)中所述的无血清培养基为GIBCO的AIM-V培养基。
进一步优化，步骤3)中冻存的细胞密度为0.5～2.5×107 /mL。
其中，步骤4)的冻存管从气相液氮罐中取出后，置于37℃恒温水浴中，并迅速溶解，转移至复苏保护液中，混匀后500g离心10min。
进一步优化，步骤4)的培养瓶中接种的细胞密度为0.5×106/mL。
诱导CIK细胞培养：
6）向步骤4)的细胞悬液中添加IFN-γ细胞因子，使终浓度为200～1000U/mL，进行诱导培养CIK细胞，并按总体积10％的量添加自体血浆；
7）第二天添加CD3、CD28、IL-2等细胞因子，使终浓度分别为300～1500U/mL、300～1000U/mL、200～2000U/mL；
8）每隔2天补充新鲜的免疫细胞培养基和200～2000U/mL IL-2，保持免疫细胞的密度为0.2～1.2×106 /mL；
9）连续培养14天。
和现有技术相比，本发明的提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，包括人外周血单个核细胞冻存和复苏步骤，通过提取、冻存健康的细胞，并在后期复苏后诱导扩增培养，在冻存的过程中采用特有的细胞冻存液和合适的细胞密度可有效的保持免疫细胞的活性，在复苏的过程中采用了特有的复苏保护液，能够得到活性较高的细胞，从而显著增加了再培养后免疫细胞的得率。
附图说明
图1 为实施例8～11扩增培养后的CIK细胞扩增倍数对比图。
图2 为实施例14～16扩增培养后的CIK细胞扩增倍数对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施例子对本发明做进一步详细介绍，以便清楚理解本发明所要保护的技术方案。
实施例1 外周血单个核细胞提取
1）采集健康志愿者外周血，加入到含有肝素钠抗凝剂的离心管中，将外周血用移液器上下吹打混匀后，取样进行全血计数，500×g，7min 离心，离心结束后，用移液器吸取上层淡黄色血浆层，并转移到新的离心管内，于56℃水浴箱内进行灭活30 min；血浆灭活完成以后，900×g，10min离心，取上清于新的离心管中，即为自体血浆，置于2℃-8℃保存备用。
2）用移液器吸取上层淡黄色血浆层后，剩余的液体即为浓缩的血细胞，用生理盐水稀释浓缩的血细胞至原体积；
3）将Ficoll分离液加入离心管的底部，将步骤2)中的血液稀释液缓慢的加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为2:1，700g离心20min，吸取离心管内的白膜层（单个核细胞），移到50mL离心管内并补加生理盐水至50mL，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞；
实施例2 PBMC的冻存
1）将DMSO和海藻糖按体积比为1：1混合配制混合液；
2）按无血清培养基、自体血浆与DMSO和海藻糖混合液的体积比为4：5：1的比例配制细胞冻存液1，置于2-8℃冰箱预冷；
3）用细胞冻存液1重悬单个核细胞，制成9 mL细胞冻存悬液，分9管冻存，每管1mL，冻存密度为：1×107cell/mL～2×107cell/mL；
4）装入程序降温盒放入-80℃冰箱后，转入-196℃气相液氮罐冻存。
实施例3 PBMC的冻存
1）将DMSO和海藻糖按体积比为1：1混合配制混合液；
2）按无血清培养基、自体血浆与DMSO和海藻糖混合液的体积比为0：9：1的比例配制细胞冻存液2，置于2-8℃冰箱预冷；
3）用细胞冻存液2重悬单个核细胞，制成9 mL细胞冻存悬液，分9管冻存，每管1 mL，冻存密度为：1×107cell/mL～2×107cell/mL；
4）装入程序降温盒放入-80℃冰箱后，转入-196℃气相液氮罐冻存。
实施例4 PBMC的冻存
1）将DMSO和海藻糖按体积比为1：1混合配制混合液；
2）按无血清培养基、自体血浆与DMSO和海藻糖混合液的体积比为9：0：1的比例配制细胞冻存液3，置于2-8℃冰箱预冷；
3）用细胞冻存液1重悬单个核细胞，制成9 mL细胞冻存悬液，分9管冻存，每管1 mL，冻存密度为：1×107cell/mL～2×107cell/mL；
4）装入程序降温盒放入-80℃冰箱后，转入-196℃气相液氮罐冻存。
实施例5 PBMC的冻存
1）将DMSO和海藻糖按体积比为1：1混合配制混合液；
2）按无血清培养基、自体血浆与DMSO和海藻糖混合液的体积比为1：3：1的比例配制细胞冻存液4，置于2-8℃冰箱预冷；
3）用细胞冻存液1重悬单个核细胞，制成9 mL细胞冻存悬液，分9管冻存，每管1mL，冻存密度为：1×107cell/mL～2×107cell/mL；
4）装入程序降温盒放入-80℃冰箱后，转入-196℃气相液氮罐冻存。
实施例6 PBMC的冻存
1）将DMSO和海藻糖按体积比为1：1混合配制混合液；
2）按无血清培养基、自体血浆与DMSO和海藻糖混合液的体积比为0：4：1的比例配制细胞冻存液5，置于2-8℃冰箱预冷；
3）用细胞冻存液2重悬单个核细胞，制成9 mL细胞冻存悬液，分9管冻存，每管1 mL，冻存密度为：1×107cell/mL～2×107cell/mL；
4）装入程序降温盒放入-80℃冰箱后，转入-196℃气相液氮罐冻存。
实施例7 PBMC的冻存
1）将DMSO和海藻糖按体积比为1：1混合配制混合液；
2）按无血清培养基、自体血浆与DMSO和海藻糖混合液的体积比为4：0：1的比例配制细胞冻存液6，置于2-8℃冰箱预冷；
3）用细胞冻存液1重悬单个核细胞，制成9 mL细胞冻存悬液，分9管冻存，每管1 mL，冻存密度为：1×107cell/mL～2×107cell/mL；
4）装入程序降温盒放入-80℃冰箱后，转入-196℃气相液氮罐冻存。
进一步地，分别于冻存1、3、6个月后，将实施例2～7冻存的细胞取出后，放入37℃恒温水浴中，并不断轻轻摇动，迅速融溶，取样进行细胞计数和活率检测。
表1 不同细胞冷冻液对PBMC的保护效果比较（Mean±SD，n=3）
由表1 可以看出，实施例2、3、5、6的PBMC冻存1个月、3个月和6个月后复苏细胞的活性均在90%以上，且冻存3个月和6个月分别与实施例4和实施例7相比，具有统计学意义（P<0.05），而实施例3和实施例6的细胞复苏后活性高于其它实施例，且实施例6的PBMC复苏后活性最高；同时，实施例6的PBMC在-196℃液氮中储存1个月、3个月和6个月后复苏，镜下观察见细胞形态完整，没有可见异物、细菌、真菌、内毒素、支原体等污染，表明，采用实施例6的方法冻存，大大提高了PBMC的复苏效率。
实施例8 冻存密度的选择
1）在实施例2～7的基础上，我们选择实施例6的方法配制细胞冻存液；
2）用细胞冻存液重悬PBMC，调整细胞密度为2.5×106cell/mL，并按1 mL/管分装到冻存管中，使细胞冻存密度为2.5×106cell/mL；
3）装入程序降温盒放入-80℃冰箱后，转入-196℃气相液氮罐冻存。
实施例9 冻存密度的选择
1）在实施例2～7的基础上，我们选择实施例6的方法配制细胞冻存液；
2）用细胞冻存液重悬PBMC，调整细胞密度为5×106cell/mL，并按1 mL/管分装到冻存管中，使细胞冻存密度为5×106cell/mL；
3）装入程序降温盒放入-80℃冰箱后，转入-196℃气相液氮罐冻存。
实施例10 冻存密度的选择
1）在实施例2～7的基础上，我们选择实施例6的方法配制细胞冻存液；
2）用细胞冻存液重悬PBMC，调整细胞密度为1×107cell/mL，并按1 mL/管分装到冻存管中，使细胞冻存密度为1×107cell/mL；
3）装入程序降温盒放入-80℃冰箱后，转入-196℃气相液氮罐冻存。
实施例11 冻存密度的选择
1）在实施例2～7的基础上，我们选择实施例6的方法配制细胞冻存液；
2）用细胞冻存液重悬PBMC，调整细胞密度为2.5×107cell/mL，并按1 mL/管分装到冻存管中，使细胞冻存密度为2.5×107cell/mL；
3）装入程序降温盒放入-80℃冰箱后，转入-196℃气相液氮罐冻存。
实施例12 未冻存细胞培养
1）按实施例1的方法提取PBMC，取适量细胞悬液进行细胞计数，流式表型检测；
2）将PBMC用免疫细胞初始培养基重悬并计数，调整细胞密度为0.5×106cell/mL进行诱导CIK细胞培养；
3）细胞悬液中添加IFN-γ细胞因子，使终浓度为200～1000U/mL，并按总体积10％的量添加自体血浆；
4）培养24h后观察细胞状态，并添加CD3、CD28、IL-2等细胞因子，使终浓度分别为300～1500U/mL、300～1000U/mL、200～2000U/mL；轻轻晃动培养瓶，混匀，放置于 CO2培养箱继续培养；
5）之后每隔2天补加一次免疫细胞培养基和200～2000U/mL IL-2，并计数，补充培养基后使细胞密度保持在0.2～1.2×106cell/mL；
6）培养14天后，进行细胞计数、流式表型及体外杀伤活性检测。
实施例13 细胞复苏及再培养
1）细胞冻存6个月后，对冻存细胞进行复苏；
2）将冻存细胞取出后迅速放入37℃水浴中，水浴至冻存管中留有微小冰块，再用4℃预冷的0.9%氯化钠注射液重悬洗涤细胞，体积比为1：10，取适量细胞悬液进行细胞计数，活率检测，流式检测；
3）将重悬的细胞500g，10min离心；
4）将PBMC用免疫细胞初始培养基重悬并计数，调整细胞密度为0.5×106cell/mL进行诱导CIK细胞培养；
5）细胞悬液中添加IFN-γ细胞因子，使终浓度为200～1000U/mL，并按总体积10％的量添加自体血浆；
6）培养24h后观察细胞状态，并添加CD3、CD28、IL-2等细胞因子，使终浓度分别为300～1500U/mL、300～1000U/mL、200～2000U/mL；轻轻晃动培养瓶，混匀，放置于 CO2培养箱继续培养；
7）之后每隔2天补加一次免疫细胞培养基和200～2000U/mL IL-2，并计数，补充培养基后使细胞密度保持在0.2～1.2×106cell/mL；
8）培养14天后，进行细胞计数、流式表型及体外杀伤活性检测。
进一步地，按实施例13所述的方法将实施例8～11的细胞进行复苏和培养，同时与实施例12的结果进行对比，如表2、表3、表4和图1所示。
表2 不同密度冻存细胞复苏后细胞活率比较（Mean±SD，n=3）
实施例8 实施例9 实施例10 实施例11
细胞活率（%） 97.3±0.97 96.9±0.81 97.4±1.03 96.7±0.78
表3不同密度冻存细胞培养CIK细胞流式表型比较（Mean±SD，n=3）
实施例8 实施例9 实施例10 实施例11 实施例12
CD3+CD56+（%） 57.7±8.15 57.3±8.01 51.4±7.03 46.7±5.78 57.4±8.28
表4不同密度冻存细胞培养CIK细胞杀伤效果比较（Mean±SD，n=3）
实施例8 实施例9 实施例10 实施例11 实施例12
杀伤率（%） 42.1±1.38 43.3±1.05 38.7±1.81 36.2±1.63 42.1±1.25
从图1可以看出，随着细胞冻存密度的增大，细胞复苏后扩增倍数会呈逐渐降低的趋势，实施例8和实施例9细胞的扩增倍数相当，且与实施例12相比无明显差异，而实施例10和实施例11的扩增倍数均比实施例12小，因此，选实施例9效果最佳；且从表2、表3和表4可看出实施例8～11复苏后再培养，均可以得到较好的目的细胞和较好的杀伤活性， 表明本发明所述的PBMC冻存液和冻存密度经复苏再培养后可以获得较高纯度的NKT效应细胞。
实施例14 复苏保护液的选择
1）在实施例8～12的基础上，我们选择实施例9的方法冻存细胞；
2）将冻存细胞取出后迅速放入37℃水浴中，水浴至冻存管中留有微小冰块，再用1640培养基+5%人血清白蛋白重悬洗涤细胞，体积比为1：10，取适量细胞悬液进行细胞计数和活率检测；
3）将重悬的细胞500g，10min离心；
4）将PBMC用免疫细胞初始培养基重悬并计数，调整细胞密度为0.5×106cell/mL进行诱导CIK细胞培养；
5）细胞悬液中添加IFN-γ细胞因子，使终浓度为200～1000U/mL，并按总体积10％的量添加自体血浆；
6）培养24h后观察细胞状态，并添加CD3、CD28、IL-2等细胞因子，使终浓度分别为300～1500U/mL、300～1000U/mL、200～2000U/mL；轻轻晃动培养瓶，混匀，放置于 CO2培养箱继续培养；
7）之后每隔2天补加一次免疫细胞培养基和200～2000U/mL IL-2，并计数，补充培养基后使细胞密度保持在0.2～1.2×106cell/mL；
8）培养14天后，进行细胞计数。
实施例15 复苏保护液的选择
1）在实施例8～12的基础上，我们选择实施例9的方法冻存细胞；
2）将冻存细胞取出后迅速放入37℃水浴中，水浴至冻存管中留有微小冰块，再用PBS缓冲液+5%人血清白蛋白重悬洗涤细胞，体积比为1：10，取适量细胞悬液进行细胞计数和活率检测；
3）将重悬的细胞500g，10min离心；
4）将PBMC用免疫细胞初始培养基重悬并计数，调整细胞密度为0.5×106cell/mL进行诱导CIK细胞培养；
5）细胞悬液中添加IFN-γ细胞因子，使终浓度为200～1000U/mL，并按总体积10％的量添加自体血浆；
6）培养24h后观察细胞状态，并添加CD3、CD28、IL-2等细胞因子，使终浓度分别为300～1500U/mL、300～1000U/mL、200～2000U/mL；轻轻晃动培养瓶，混匀，放置于 CO2培养箱继续培养；
7）之后每隔2天补加一次免疫细胞培养基和200～2000U/mL IL-2，并计数，补充培养基后使细胞密度保持在0.2～1.2×106cell/mL；
8）培养14天后，进行细胞计数。
实施例16 复苏保护液的选择
1）在实施例8～12的基础上，我们选择实施例9的方法冻存细胞；
2）将冻存细胞取出后迅速放入37℃水浴中，水浴至冻存管中留有微小冰块，再用注射用生理盐水+5%人血清白蛋白重悬洗涤细胞，体积比为1：10，取适量细胞悬液进行细胞计数和活率检测；
3）将重悬的细胞500g，10min离心；
4）将PBMC用免疫细胞初始培养基重悬并计数，调整细胞密度为0.5×106cell/mL进行诱导CIK细胞培养；
5）细胞悬液中添加IFN-γ细胞因子，使终浓度为200～1000U/mL，并按总体积10％的量添加自体血浆；
6）培养24h后观察细胞状态，并添加CD3、CD28、IL-2等细胞因子，使终浓度分别为300～1500U/mL、300～1000U/mL、200～2000U/mL；轻轻晃动培养瓶，混匀，放置于 CO2培养箱继续培养；
7）之后每隔2天补加一次免疫细胞培养基和200～2000U/mL IL-2，并计数，补充培养基后使细胞密度保持在0.2～1.2×106cell/mL；
8）培养14天后，进行细胞计数。
分别将实施例14～16培养后的细胞进行计数，结果如图2所示。
从图2可以看出，采用实施例14处理的细胞培养CIK细胞后扩增倍数最大，而实施例15和实施例16则相对较差，表明实施例14的方法可以更好的保护冻存后复苏的细胞，使细胞保持较大的活性。
以上所述是本发明的优选实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种细胞冻存液，包括组分及体积百分数：
无血清培养基的体积百分比为0%～50%，
自体血浆的体积百分比为40%～90%，
DMSO的体积百分比为5%～10%，
海藻糖的体积百分比为5%～10%；
各组分之和为100%。
2.权利要求1所述的细胞冻存液的配制方法，包括步骤：
1）海藻糖和DMSO按1：1的比例混匀，将自体血浆加入到无血清培养基中，使自体血浆的体积百分比为50%～100%，
2）将10%～20%的海藻糖和DMSO混合液缓慢加入，得到细胞冻存液。
3.一种提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，包括以下步骤：
1）采集外周血，分离上层淡黄色血浆层，并于56℃灭活15-30min，900-1200g离心5-10min，剩余的液体即为浓缩的血细胞，用生理盐水稀释浓缩的血细胞至原体积；
2）将细胞分离液加入离心管的底部，将步骤1)中的血液稀释液缓慢的加到细胞分离液上层，血液稀释液与细胞分离液的体积比为2:1，600-700g离心15-20min，吸取离心管内的单个核细胞层，移到离心管内并补加生理盐水，洗涤并离心收集外周血单个核细胞；
3) 外周血单个核细胞的冻存：将步骤2)收集的外周血单个核细胞利用自体血浆重悬，向制得的细胞悬液中加入权利要求1所述的细胞冻存液，摇匀分装至冻存管中，放入程序降温盒中，转至-80℃后，后转移至液氮罐；
4) 外周血单个核细胞的复苏：将步骤3)冻存的冻存管从气相液氮罐中取出，水浴溶解后将冻存管中的细胞悬液转移至复苏保护液中，细胞悬液与复苏保护液的体积比为1：5-10，混匀后洗涤离心，将洗涤离心后的外周血单个核细胞用培养基重悬，接种于培养瓶中；
5) 外周血单个核细胞诱导扩增培养：对步骤4)中培养瓶里的细胞悬液进行诱导扩增培养。
4.如权利要求书3所述的提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，其特征是：所述步骤3)的冻存过程具体为：将步骤2)收集的外周血单个核细胞用自体血浆重悬，再将上述细胞冻存液缓慢加入到细胞悬液中，细胞冻存液中无血清培养基、自体血浆与DMSO和海藻糖混合液的体积比为0：4：1；冻存的细胞密度为5×106 /mL。
5.如权利要求3所述提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，其特征是：步骤4）所述复苏保护液为1640培养基+5%人血清白蛋白，或者为PBS缓冲液+5%人血清白蛋白，或者为注射用生理盐水+5%人血清白蛋白。
6.如权利要求3所述的提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，其特征是：所述步骤4)的冻存管从气相液氮罐中取出后，置于37℃恒温水浴中，并迅速溶解，转移至复苏保护液中，混匀后500g离心10min；培养瓶中接种的细胞密度为0.5×106/mL。
7.如权利要求书3所述的提高外周血单个核细胞冻存后再培养活性的方法，其特征是：还包括步骤：
6）向步骤4)的细胞悬液中添加IFN-γ细胞因子，使终浓度为200～1000U/mL，进行诱导培养CIK细胞，并按总体积10-15％的量添加自体血浆；
7）培养18-24h后观察细胞状态，并添加细胞因子CD3、CD28、IL-2，使终浓度分别为300～1500U/mL、300～1000U/mL、200～2000U/mL；轻轻晃动培养瓶，混匀，放置于 CO2培养箱继续培养；
8）之后每隔2天补加一次免疫细胞培养基和200～2000U/mL IL-2，并计数，补充培养基后使细胞密度保持在0.2～1.2×106cell/mL；
9）连续培养10-14天。
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