CN108913660A - 冻存pbmc诱导cik细胞的培养试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒及方法，该培养试剂盒包括复苏液、第一培养液、第二培养液、第三培养液及第四培养液；复苏液由注射用生理盐水中加入人血清白蛋白制得；第一培养液由无血清免疫细胞培养液中加入rhIFN‑γ制得；第二培养液由无血清免疫细胞培养液中加入CD3单克隆抗体、CD28单克隆抗体、rhIL‑1和rhIL‑2制得；第三培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物制得；第四培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物和rhIL‑2制得。和现有技术相比，本发明能够培养冻存后的细胞，扩增效果良好，且无其它外源性蛋白，避免了临床应用时的免疫排斥反应，培养的CIK细胞杀伤效果良好，用于临床肿瘤防治时安全可靠。

Description

冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒及方法。

背景技术

肿瘤是机体在各种致癌因素的作用下，局部组织的某一个细胞失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物，这种新生物多呈占位性块状突起。一般认为，肿瘤细胞是单克隆性的，即一个肿瘤中的所有瘤细胞均是一个突变的细胞的后代。肉眼观察肿瘤的形态多种多样，并可在一定程度上反映肿瘤的良恶性。医学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。良性肿瘤生长缓慢，细胞的异型性不明显，一般与其来源组织相似。恶性肿瘤生长迅速，细胞常具有明显的异型性。近年来，恶性肿瘤治疗又出现了新方法，即细胞免疫治疗。细胞免疫治疗，是除放疗、化疗、手术治疗外地又一新方法。

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。CIK(cytokine-induced killer，中文名：多种细胞因子诱导的杀伤细胞)是单个核细胞在抗CD3单克隆抗体和多种细胞因子的作用下培养获得的一群异质细胞群，其中CD3+，CD56+淋巴细胞是主要效应细胞。CIK可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞；诱导肿瘤细胞凋亡；通过释放大量炎性细胞因子抑制或杀伤肿瘤细胞。CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想的效应细胞，但这种效应细胞在正常外周血中极其少见，仅为1％～5％。

效应细胞的数量是影响肿瘤防治效果的关键因素之一，体外研究显示随着这种效应细胞与肿瘤细胞比例的增加，免疫细胞对肿瘤的杀伤效果呈线性增加。每次增加回输免疫细胞的数量，可显著改善患者自体抗肿瘤细胞免疫功能。由此可见，如何获得足够数量的、免疫活性强的效应细胞是保证治疗效果的必备条件。

细胞免疫治疗主要是采集患者自身外周血，通过分离和收集得到外周血单个核细胞。但一般说来，接受细胞免疫治疗的群体主要为肿瘤或病毒感染患者，然而此类人群的免疫细胞机能已十分低下，分离出的免疫细胞活性较低；而异体的免疫细胞移植则可能引起患者体内的免疫排斥反应。因此，利用冻存技术将健康状况良好、免疫细胞活性较强时的细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，以备将来治病之需。目前常用的储存方法是利用低温冻存技术保存外周血单个核细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞，虽然现在已经研究出多种不同的冻存液配方，但是仍然会使冻存后细胞活性降低，导致细胞复苏后很难恢复活性，且复苏后培养困难，细胞扩增效率不高，从而使临床上很难得到足够数量的细胞。

发明内容

本发明针对现有冻存液配方的缺点，提出一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒及方法，用以解决现有技术存在的上述问题。

根据本发明的一个方面，提供了一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒，包括复苏液、第一培养液、第二培养液、第三培养液及第四培养液；

所述复苏液由注射用生理盐水中加入人血清白蛋白制得；

所述第一培养液由无血清免疫细胞培养液中加入rhIFN-γ制得；

所述第二培养液由无血清免疫细胞培养液中加入CD3单克隆抗体、CD28单克隆抗体、rhIL-1和rhIL-2制得；

所述第三培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物制得；

所述第四培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物和rhIL-2制得。

进一步的，所述的复苏液中人血清白蛋白的质量百分数浓度为5％。

进一步的，所述第一培养液中rhIFN-γ的质量百分数浓度为100-1000ng/mL。

进一步的，所述第二培养液中CD3单克隆抗体的质量百分数浓度为5-20μg/mL、CD28单克隆抗体的质量百分数浓度为5-20μg/mL、rhIL-1的质量百分数浓度为50-200ng/mL及rhIL-2的质量百分数浓度为50000-100000U/mL。

进一步的，所述第三培养液中血浆替代物的质量百分数浓度为5％。

进一步的，所述第四培养液中血浆替代物的质量百分数浓度为5％和rhIL-2的质量百分数浓度为200-1000U/mL。

进一步的，所述无血清免疫细胞培养液为AIM-V培养基、RPMI1640培养基或X-VIVO培养基。

根据本发明的另一个方面，提供了一种冻存PBMC诱导CIK细胞的方法，使用如上任一项所述的培养试剂盒进行扩增培养，包括以下步骤：

步骤一、PBMC的复苏：将装有PBMC的冻存管从气相液氮罐中取出，将冻存管置于水浴中以使冻存管中冻存的PBMC融解，然后将冻存管中的PBMC悬液转移至复苏液中，混匀后进行洗涤离心，将洗涤离心后的PBMC用所述第一培养液重悬以获取细胞悬液，接种于培养瓶中；

步骤二、复苏PBMC诱导CIK细胞培养：对步骤一中培养瓶中的细胞悬液进行诱导扩增培养；

步骤三、培养24h后将第三培养液添加到培养瓶中，并摇晃混匀；

步骤四、将上述步骤三中培养瓶中摇晃混匀的培养液继续培养13天或14天，每隔3天补充第四培养液以使免疫细胞的密度分别为0.2×10⁶/mL、0.6×10⁶/mL、1.2×10⁶/mL。

进一步的，所述步骤一具体是：

将装有PBMC的冻存管从气相液氮罐中取出，再将所述冻存管置于37℃恒温水浴中以使冻存管中冻存的PBMC溶解，然后将冻存管中的PBMC悬液转移至复苏液中混匀，混匀后进行洗涤再离心10min，将洗涤离心后的PBMC用所述第一培养液重悬以获取细胞悬液，接种于培养瓶中。

进一步的，所述步骤二具体是：

将第二培养液添加到步骤一中的细胞悬液中，放入温度为37℃、CO₂的体积百分比浓度为5％的培养箱中进行诱导扩增培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明所述的试剂盒，和现有技术相比，培养冻存后的细胞，扩增效果良好，且无其它外源性蛋白，避免了临床应用时的免疫排斥反应，培养的CIK细胞杀伤效果良好，用于临床肿瘤防治时安全可靠；

2、本发明所述的试剂盒，在复苏的过程中采用的复苏液，能够得到活性较高的细胞，从而显著增加了再培养后免疫细胞的得率。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明实施例中的PBMC冻存前和复苏后的细胞活率对比图；

图2为本发明实施例2、对照例1、对照例2及对照例3的冻存PBMC诱导CIK细胞培养培养扩增倍数对比图；

图3为本发明实施例2、对照例2和对照例3的冻存PBMC诱导CIK细胞培养培养14天后细胞表型检测对比图；

图4为本发明实施例2、对照例2和对照例3的冻存PBMC诱导CIK细胞培养培养14天后细胞体外杀伤作用对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

在本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的描述的一些流程中，包含了按照特定顺序出现的多个操作，但是应该清楚了解，这些操作可以不按照其在本文中出现的顺序来执行或并行执行，操作的序号如101、102等，仅仅是用于区分开各个不同的操作，序号本身不代表任何的执行顺序。另外，这些流程可以包括更多或更少的操作，并且这些操作可以按顺序执行或并行执行。需要说明的是，本文中的“第一”、“第二”等描述，是用于区分不同的消息、设备、模块等，不代表先后顺序，也不限定“第一”和“第二”是不同的类型。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分例，实施而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

实施例1

提供了本发明实施例的一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒，包括复苏液、第一培养液、第二培养液、第三培养液及第四培养液；

复苏液由注射用生理盐水中加入人血清白蛋白制得；

复苏液中人血清白蛋白的质量百分数浓度为5％，复苏液能够得到活性较高的细胞，从而显著增加了再培养后免疫细胞的得率。

第一培养液由无血清免疫细胞培养液中加入rhIFN-γ制得；

第一培养液中rhIFN-γ的质量百分数浓度为100-1000ng/mL，rhIFN-γ对细胞的增殖有抑制作用。

第二培养液由无血清免疫细胞培养液中加入CD3单克隆抗体、CD28单克隆抗体、rhIL-1和rhIL-2制得；

第二培养液中CD3单克隆抗体的质量百分数浓度为5-20μg/mL、CD28单克隆抗体的质量百分数浓度为5-20μg/mL、rhIL-1的质量百分数浓度为50-200ng/mL及rhIL-2的质量百分数浓度为50000-100000U/mL；

CD3单克隆抗体用于转导TCR识别抗原所产生的活化信号；

CD28单克隆抗体用于介导细胞对抗原的反应性；

rhIL-1是骨代谢调节的重要因子；

rhIL-2是基因重组产品，是一种非糖基化蛋白，含有133个氨基酸残基，相对分子质量为15.5k，其药理作用在于增强免疫应答；

第三培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物制得，血浆替代物为Compass Biomedical公司的PLUS^TM Cell Culture Supplement；

第三培养液中血浆替代物的质量百分数浓度为5％；

第四培养液中血浆替代物的质量百分数浓度为5％和rhIL-2的质量百分数浓度为200-1000U/mL；

第四培养液是指血浆替代物的质量百分数浓度为5％和rhIL-2的质量百分数浓度为200-1000U/mL的无血清免疫细胞培养液。

且上述各步骤中的无血清免疫细胞培养液为AIM-V培养基、RPMI1640培养基或X-VIVO培养基中的一种。

AIM-V培养基是一款无血清培养基，唯一一个通过美国FDA510(K)认证的治疗级T细胞培养基；

RPMI1640培养基含有10％胎牛血清，特别适用于杂交瘤细胞的培养；

X-VIVO培养基的应用包括：PBL的增殖；TIL的增殖；器官的冰冻保存和移植；人单核细胞和巨噬细胞的培养；干细胞的培养；树突状细胞的培养。

分别取上述实施例中不同浓度的冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒，进行冻存细胞的复苏，如图1所示，复苏后，培养试剂盒3中复苏细胞的细胞活率较高，具体如下表所示：

其中，培养试剂盒1、培养试剂盒2和培养试剂盒3中无血清免疫细胞培养液为AIM-V培养基。

实施例2

提供了本发明实施例的一种冻存PBMC诱导CIK细胞的方法，包括以下步骤：

步骤一、PBMC的复苏：将装有PBMC的冻存管从气相液氮罐中取出，将冻存管置于水浴中以使冻存管中冻存的PBMC融解，然后将冻存管中的PBMC悬液转移至复苏液中，混匀后进行洗涤离心，将洗涤离心后的PBMC用第一培养液重悬以获取细胞悬液，接种于培养瓶中；

具体的，将装有PBMC的冻存管从气相液氮罐中取出，再将冻存管置于37℃恒温水浴中以使冻存管中冻存的PBMC溶解，然后将冻存管中的PBMC悬液转移至复苏液中混匀，混匀后进行洗涤再离心10min，将洗涤离心后的PBMC用第一培养液重悬以获取细胞悬液，接种于培养瓶中；

复苏液的重量为500g减去PBMC悬液的重量。

步骤二、复苏PBMC诱导CIK细胞培养：对步骤一中培养瓶中的细胞悬液进行诱导扩增培养；

具体的，将第二培养液添加到步骤一中的细胞悬液中，放入温度为37℃、CO₂的体积百分比浓度为5％的培养箱中进行诱导扩增培养。

步骤三、培养24h后将第三培养液添加到培养瓶中，并摇晃混匀；

步骤四、将上述步骤三中培养瓶中摇晃混匀的培养液继续培养13天或14天，每隔3天补充第四培养液以使免疫细胞的密度分别为0.2×10⁶/mL、0.6×10⁶/mL、1.2×10⁶/mL。

为凸显实施例二的优点，加入其他三组对照例，三组对照例的步骤中除了步骤三中的添加物与实施例二中的步骤三不一致外，其余步骤、添加物和其他条件均一致，具体情况如下表：

使用培养试剂盒3的实施例二与三组对照例诱导CIK细胞14天后的细胞扩增倍数如下表和图2所示：

	扩增倍数
		实施例二	190％
对照例1	150％
		对照例2	0％
对照例3	120％

由此可见，实施例二、对照例2和对照例3在培养的细胞扩增倍数表现较优。

因对照例2和对照例3在培养的细胞扩增倍数表现较优，因此对比实施例二与对照例二和对照例3的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+及CD3-CD56+细胞亚群比例，如下表和图3所示：

	实施例二	对照例2	对照例3
				CD3+	97％	96％	98％
CD3+CD4+	38％	35％	36％
				CD3+CD8+	64％	62％	63％
CD3+CD56+	10％	9％	12％
				CD3-CD56+	2％	3％	2％

由此可见，在CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+及CD3-CD56+细胞亚群比例方面，实施例二相比于对照例2和对照例3也存在明显的优势，尤其是CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞亚群，表现相对较优。

因对照例2和对照例3在培养的细胞扩增倍数表现较优，因此对比实施例二与对照例2和对照例3培养出的CIK细胞的体外杀伤效果，如下表和图4所示：

	杀伤率
		实施例二	48％
对照例2	52％
		对照例3	59％

由此可见，在体外杀伤结果方面，实施例二相比于对照例2和对照例3比较也无较大差异。

综上所述，实施例二采用采用本试剂盒的方法可以很好地促进冻存PBMC诱导扩增CIK细胞，为细胞免疫治疗技术的临床应用提供支持。

以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种冻存PBMC诱导CIK细胞的培养试剂盒，其特征在于，包括复苏液、第一培养液、第二培养液、第三培养液及第四培养液；

所述复苏液由注射用生理盐水中加入人血清白蛋白制得；

所述第一培养液由无血清免疫细胞培养液中加入rhIFN-γ制得；

所述第二培养液由无血清免疫细胞培养液中加入CD3单克隆抗体、CD28单克隆抗体、rhIL-1和rhIL-2制得；

所述第三培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物制得；

所述第四培养液由无血清免疫细胞培养液中加入血浆替代物和rhIL-2制得。

2.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述的复苏液中人血清白蛋白的质量百分数浓度为5％。

3.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述第一培养液中rhIFN-γ的质量百分数浓度为100-1000ng/mL。

4.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述第二培养液中CD3单克隆抗体的质量百分数浓度为5-20μg/mL、CD28单克隆抗体的质量百分数浓度为5-20μg/mL、rhIL-1的质量百分数浓度为50-200ng/mL及rhIL-2的质量百分数浓度为50000-100000U/mL。

5.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述第三培养液中血浆替代物的质量百分数浓度为5％。

6.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述第四培养液中血浆替代物的质量百分数浓度为5％和rhIL-2的质量百分数浓度为200-1000U/mL。

7.根据权利要求1所述的培养试剂盒，其特征在于，所述无血清免疫细胞培养液为AIM-V培养基、RPMI1640培养基或X-VIVO培养基。

8.一种冻存PBMC诱导CIK细胞的方法，其特征在于，使用权利要求1-7任一项所述的培养试剂盒进行扩增培养，包括以下步骤：

步骤一、PBMC的复苏：将装有PBMC的冻存管从气相液氮罐中取出，将冻存管置于水浴中以使冻存管中冻存的PBMC融解，然后将冻存管中的PBMC悬液转移至复苏液中，混匀后进行洗涤离心，将洗涤离心后的PBMC用所述第一培养液重悬以获取细胞悬液，接种于培养瓶中；

步骤二、复苏PBMC诱导CIK细胞培养：对步骤一中培养瓶中的细胞悬液进行诱导扩增培养；

步骤三、培养24h后将第三培养液添加到培养瓶中，并摇晃混匀；

步骤四、将上述步骤三中培养瓶中摇晃混匀的培养液继续培养13天或14天，每隔3天补充第四培养液以使免疫细胞的密度分别为0.2×10⁶/mL、0.6×10⁶/mL、1.2×10⁶/mL。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤一具体是：

将装有PBMC的冻存管从气相液氮罐中取出，再将所述冻存管置于37℃恒温水浴中以使冻存管中冻存的PBMC溶解，然后将冻存管中的PBMC悬液转移至复苏液中混匀，混匀后进行洗涤再离心10min，将洗涤离心后的PBMC用所述第一培养液重悬以获取细胞悬液，接种于培养瓶中。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤二具体是：

将第二培养液添加到步骤一中的细胞悬液中，放入温度为37℃、CO₂的体积百分比浓度为5％的培养箱中进行诱导扩增培养。