CN112941023A - 一种免疫细胞培养基体系及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种免疫细胞培养基体系及其应用，属于生物试剂领域，所述免疫细胞培养基体系包括接种培养基和扩增培养基，所培养出的免疫细胞具有更高的活性，生长速度较快，杀伤能力更强，降低了大规模生产细胞的成本，并且可用于商品化大规模生产。

Description

一种免疫细胞培养基体系及其应用
技术领域
本发明属于生物试剂领域，具体涉及一种免疫细胞培养基体系及其应用。
背景技术
免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。体外扩增免疫细胞具有以下几个特点：增殖速度快，主要效用细胞CD3+CD56+T(抗肿瘤活性)可大量增殖，且细胞活性也大大增强；杀伤活性强，远优于传统的淋巴因子激活的杀伤细胞；杀瘤谱广，不受MHC限制，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用；免疫细胞的体外扩增需要外源性细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-12等的辅助，这些因子控制着人免疫系统内特异性细胞的扩增及其生物学活性。细胞因子是免疫活性细胞和其它细胞分泌的具有多种生物活性的多肽或蛋白质,这些细胞因子是重要的信息传递物质,特别在免疫、炎症和造血系统等生物学反应过程中具有重要的作用。近几年,细胞因子的研究已成为生物学研究中最活跃的领域之一。新的细胞因子不断被发现,大量的细胞因子正在或将要应用于医学临床。细胞因子的研究带动了整个免疫学的发展。其应用展现出广阔的前景。免疫细胞过继免疫治疗现已成为生物治疗的重要分支，它克服了以往效应细胞增殖数量少，需大量输注IL-2，提升白细胞效价较低及副作用大等的缺点，对于促进患者免疫系统的重建、骨髓净化、微小残留病灶的清除以及防止肿瘤的复发和转移等均具有重要的意义.目前研究发现，常用的几种免疫细胞细胞体外扩增方案扩增产物在扩增倍数、细胞表型上并没有明显差异；但在免疫细胞杀伤活性方面，经过体外大规模扩增之后，IL-2、IL-15、IL-7、OKT3扩增产物的杀伤活性明显优于普通培养的免疫细胞的扩曾情况，其中加入IL-2的效果最明显。在此基础之上，可以进一步地探讨和优化扩增方案，从而获得高效高纯度的免疫细胞。
作为免疫细胞体外增殖诱导的重要载体即培养基，直接关系着体外诱导结果，包括增殖数量、杀瘤效果等等。因为传统培养基添加了大量的动物源性血清存在安全隐患，所以现在已广泛应用无血清培养基，排除动物源性污染和血清导致的不确定性，在血源性细胞的培养中可从自身血样中提取的小量血清即可满足，甚至可以无需添加血清。目前，无血清培养基已用于血源性细胞的培养、真核系统中重组蛋白的表达、病毒及寄生。培养基作为免疫细胞体外扩增的主要载体，直接关系着其体外诱导的结果，包括增殖数量、杀瘤效果等各种生物活性指标。在基础研究中，为了促进细胞生长，传统培养基添加了动物源性血清等生物活性物质，故而存在血清批次造成的质量不稳定以及动源性污染等问题，因而越来越多的公司或者研究机构致力于研究成分明确的不含动物血清的培养基，即无血清培养基(SerumFreeMedium，SFM)。无血清培养基的出现是培养基发展历程上的一个里程碑，一般意义上的无血清培养基，是在各种基础培养基(如DMEM、RPMI1640、Ham’sF-12等)的基础上，添加各类可替代血清功能的组分配制而成细胞培养基，如人血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质，以及混合脂类、水解蛋白、微量元素、细胞因子等。
目前，市场上有很多免疫细胞培养：如X-VIVO，RPMI-1640，AIM-V，ALY505N，KBM551/561/581系列等，这些培养基各有各的优缺点。无血清培养基具有许多含血清培养基不具有的优点，尤其是在细胞免疫治疗领域。首先可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性；其次，血清对细胞有一定的毒性作用以及可能的血清源性污染都会对实验结果带来很大的影响。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种免疫细胞培养基体系，本发明目的之二在于提供一种免疫细胞培养基体系在体外扩增NK细胞和CIK细胞中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种免疫细胞培养基体系，所述培养基体系包括：
接种培养基，所述接种培养基由基础培养基、L-丙氨酸-L-丙烯酰胺、血清替代品和IFN-γ组成，其中，L-丙氨酸-L-丙烯酰胺的终浓度为500mg/L，血清替代品的体积分数为20％，IFN-γ的终浓度为1000u/ml；
扩增培养基，所述扩增培养基由基础培养基、L-丙氨酸-L-丙烯酰胺、血清替代品、IFN-γ、OKT-3和IL-2组成，其中，L-丙氨酸-L-丙烯酰胺的终浓度为500mg/L，血清替代品的体积分数为20％，IFN-γ的终浓度为1000u/ml、OKT-3的终浓度为100ng/ml、IL-2的终浓度为500u/ml。
作为优选的的技术方案之一，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
2、一种免疫细胞培养基体系在体外扩增NK细胞和CIK细胞中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的免疫细胞培养基培养出的免疫细胞具有更高的活性，生长速度较快，杀伤能力更强，降低了大规模生产细胞的成本，可用于商品化大规模生产。L-Alanyl-L-Glutamine添加为免疫细胞扩增时大量合成核酸和蛋白质提供了支持，KnockOutSR消除使用胎牛血清进行细胞培养时面临的许多缺点与风险，而IFN-γ，OKT-3，IL-2细胞因子的添加，能够有效激活免疫细胞的增殖和活化，具有显著突出的技术效果。
附图说明
图1为三种培养基对免疫细胞增值的影响结果图，A为细胞个数，B为细胞状态。
图2为三种培养基对免疫细胞表型影响结果图，A为新配方免疫培养基组；B为AIM-V培养基组(G)，C为ALY505N培养基组(505)。
图3为肿瘤对三种培养基培养的免疫细胞的杀伤活性结果图，A为杀伤24h后，死细胞数，B为杀伤48h后，死细胞数。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。通过实施例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。
实施例1
新配方免疫细胞培养基的制备
1)接种培养基：在DMEM/F12基础培养基中加入L-丙氨酸-L-丙烯酰胺(L-Alanyl-L-Glutamine)、KnockOutSR和IFN-γ，其中，L-丙氨酸-L-丙烯酰胺的终浓度为500mg/L，血清替代品的体积分数为20％，IFN-γ的终浓度为1000u/ml。
2)扩增培养基：在DMEM/F12基础培养基中加入L-Alanyl-L-Glutamine、KnockOutSR、IFN-γ、OKT-3和IL-2，其中，L-丙氨酸-L-丙烯酰胺的终浓度为500mg/L，血清替代品的体积分数为20％，IFN-γ的终浓度为1000u/ml、OKT-3的终浓度为100ng/ml、IL-2的终浓度为500u/ml。
实施例2
新配方免疫细胞培养基与AIM-V(G)/ALY505N(505)培养基的性能比较
1)PBMC的分离
将5mL血液缓慢加入3mL淋巴细胞分离液(Ficoll)中，400g离心30min，移除上层血浆，分离出白膜层、上层的残留血浆和下层Ficoll至50mL离心管中，每支管中补加生理盐水至45mL，摇晃、振荡混匀，1800rpm离心10min，弃上清，重复一次。用5mL血浆重悬，吹打混匀后取100μL计数。
2)免疫细胞培养
分离出PMBC后，将血浆重悬的细胞液均分为两份，各加10mL的接种培养基，37℃，5％CO2培养；每2天镜检观察一次，拍照，吹打混匀，计数；一周后分别补加5mL扩增培养基；2周后镜检细胞，拍照，吹打混匀后计数，两份各取10mL转移至新T75细胞瓶中，补加5ml扩增培养基；剩下的细胞用流式细胞仪以及台盼蓝染色实验确定细胞活率。AIM-V(G)和ALY505N(505)培养基分别按照同样方法培养PMBC，初始细胞浓度均为1×106/mL。
3)免疫细胞增殖影响
每次补液操作均对细胞进行计数，由计数结果和对应体积计算得到各操作点的细胞总量，将计数结果汇总后以操作时间为横轴、细胞总数为纵轴作细胞增殖曲线。取适量培养至第13天的免疫细胞液，将团块吹打分散后取100μL，与100μL的台盼蓝染剂充分混匀后置于载玻片上，显微镜(×100)观察、拍照、估算细胞活率。
结果如图1中A、B所示，新配方培养基组(LP组)所培养的细胞增殖最快，ALY505N组(505组)培养基次之，两者的最终增殖倍率都高于130倍；AIM-V组(G组)培养基培养的细胞增殖最缓，且最终增殖倍率也不如其他两种培养基(图1中A)。培养至13天时以台盼蓝测定三组细胞的活性，其中新配方组细胞测定吹打前和吹打后两种状态(图1中B)，可以看出用新配方培养的细胞呈团块化生长，需吹打才能分散成单个细胞，三组细胞的活率都≥99％，细胞密度都比较高。
4)免疫细胞免疫表型影响
取适量培养至第13天的免疫细胞液吹打混匀，以无菌的D-hanks液清洗细胞2-3次，用1％BSA-D-hanks重悬细胞，调整浓度为1×107-3×107/mL，将细胞重悬液分装至1.5mL离心管中，分别加入PE-CD3、FITC-CD56、APC-CD8a抗体(1μL/test)，冰上孵育1h，用400μL1％BSA-D-hanks重悬细胞，检测细胞的CD3+和CD56+细胞比例，结果如表1和图2中A、B、C所示，新配方组(LP组)的细胞双阳性和三阳性均值都高于22％，而另两组细胞的双阳性和三阳性均值都低于20％，反应出新配方培养基比另两种培养基更宜于促进CD3+和CD56+细胞群的增殖。
表1三种培养基对免疫细胞免疫表型影响结果
Figure BDA0002992451620000041
5)免疫细胞杀伤活性影响
免疫细胞培养两周后，以无菌的D-hanks液清洗T75内的肿瘤细胞(HEPG-2)2-3次，用1mL胰酶将其消化脱壁，并用2mL含10％FBS的DMEM/HIGH GLUCOSE终止消化，吹打使其分散为单个细胞后转移至15mL离心管，原T75以6mL无菌的D-hanks液清洗，清洗液并入同一15mL离心管，1000rpm离心10min；弃上清，以2mL 10％FBS-DMEM/HIGHGLUCOSE重悬后计数，用10％FBS-DMEM/HIGH GLUCOSE调整浓度为1×106/mL，每个T25中加入200μL上述细胞液(含2×105/T25)、5mL10％FBS-DMEM/HIGHGLUCOSE；14天时，在预铺肿瘤细胞的T25中加入对应免疫细胞2×106/T25，每个时间点设置空白对照(NC，不加免疫细胞的肿瘤细胞)。通过MTT实验验证细胞杀伤能力，将杀伤24h/48h的细胞镜检拍照，以无菌的D-hanks液清洗2-3次后再次镜检拍照，用胰酶将残余的肿瘤细胞消化脱壁，以10％FBS-DMEM/HIGH GLUCOSE终止消化后加少量无菌的D-hanks液转移至15mL离心管，1000rpm离心10min；弃上清，以适量10％FBS-DMEM/HIGH GLUCOSE重悬(NC约为2×104/200μL)后铺96孔板，每种细胞铺一列6孔，每孔200μL细胞悬液；培箱中放置24h后加入20μL/孔MTT，培箱中静置4h后，将孔中溶液吸出，加入150μL的DMSO，再在培箱中静置30min，酶标仪在492nm下测定吸光度(OD值)。
结果如图3中A、B所示，杀伤24h时新配方组(LP组)的细胞能达到大于60％的杀伤活性，AIM-V组(G组)的细胞杀伤活性略低，但也能达到50％，而ALY505N组的细胞杀伤活性仅能达到15％；杀伤48h时，新配方组(LP组)和AIM-V组(G组)细胞的杀伤活性都在50％左右，新配方组(LP组)杀伤效果相对较好，ALY505N组(505组)杀伤活性则低于40％。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种免疫细胞培养基体系，其特征在于，所述培养基体系包括：
接种培养基，所述接种培养基由基础培养基、L-丙氨酸-L-丙烯酰胺、血清替代品和IFN-γ组成，其中，L-丙氨酸-L-丙烯酰胺的终浓度为500mg/L，血清替代品的体积分数为20％，IFN-γ的终浓度为1000u/ml；
扩增培养基，所述扩增培养基由基础培养基、L-丙氨酸-L-丙烯酰胺、血清替代品、IFN-γ、OKT-3和IL-2组成，其中，L-丙氨酸-L-丙烯酰胺的终浓度为500mg/L，血清替代品的体积分数为20％，IFN-γ的终浓度为1000u/ml、OKT-3的终浓度为100ng/ml、IL-2的终浓度为500u/ml。
2.如权利要求1所述的免疫细胞培养基体系，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
3.权利要求1所述的免疫细胞培养基体系在体外扩增NK细胞和CIK细胞中的应用。
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