CN105031631A - 一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于涉及一种基因工程领域，具体涉及一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法及其应用。采用靶向树突状细胞上C-型凝集素受体的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤干细胞抗原Sox2抗原，72小时快速成熟树突状细胞并且提高树突状细胞主动摄取抗原效率和MHC-I途径抗原呈递效率，比常规的7-8天收获成熟的DC能大大缩短肿瘤患者最佳治疗的时间窗口，有利于丰富成熟的树突状细胞刺激初始T细胞的信号诱导抗原特异性CTL产生；结合工程细胞和细胞因子大量扩增抗原特异性T细胞和Tcm，产生高比例的杀伤能力更强的Tcm，增强抗肿瘤免疫作用，是一种快速有效的肿瘤干细胞抗原特异性CTL的制备技术，有极大的经济价值和市场前景。

Description

一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于涉及一种基因工程领域，具体涉及一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法及其应用。

背景技术

恶性肿瘤已成为人类第一号“杀手”，在人类抗癌历史上，与癌症抗争有过三大利器：外科手术，化疗，与放射治疗。但这三种方法虽然能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。

至此，免疫科学家斯坦曼利用先前发现的树突状细胞(Dendriticcell，DC)，激发自身的免疫力清除肿瘤，利用自己的研究成果，将生命由预期的数月延长到四年。由于他对免疫领域的贡献在2011年获得诺贝尔生理医学奖，在肿瘤领域并开创了一个新的天地--肿瘤免疫细胞治疗。他的研究成果现在已经广泛应用于临床，已经成为继手术、放、化疗后的第四种癌症治疗方式。由于肿瘤免疫细胞治疗能够联合手术、化疗、放疗精准清除残余肿瘤细胞，防止复发和转移，加强免疫监视作用，提升患者生存质量和时间，并且没有放化疗的毒副作用和手术的巨大伤害。近年来，在临床应用中受到越来越广泛的关注，是国内外研究的热点，已被公认为是最具前景的肿瘤治疗方法。

1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。

目前肿瘤的细胞免疫治疗效果仍不理想，主要原因包括如下两方面：

1)肿瘤患存在免疫抑制的微环境，一方面，肿瘤组织的T淋巴细胞产生免疫耐受，另一方面，肿瘤细胞能够分泌多种免疫抑制因子，诱导产生调节性T淋巴细胞或抑制DCs功能。

2)肿瘤免疫治疗中应用的抗原大多表达在已分化的肿瘤细胞上，而肿瘤干细胞并不表达这些抗原，所诱发的免疫杀伤反应并不针对肿瘤干细胞。加上目前常规DC加入患者肿瘤细胞裂解得到的肿瘤抗原，使DC负载肿瘤抗原，虽然这种方法能使得DC摄取到患者的肿瘤抗原，但由于肿瘤抗原的抗原性较弱，DC对肿瘤抗原摄取量较少，其递呈抗原能力也就较低，使其产生的CTL细胞的杀伤活性不足，并且利用单纯的细胞因子放大扩增CTL细胞数量有限，产生的Tcm比例小，进而影响抗肿瘤治疗效果。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中肿瘤免疫治疗抗原摄取量少，产生的CTL细胞杀伤活性不足，抗肿瘤治疗效果不佳的局限性，从而提出一种杀伤能力强，抗原性特异性强，缩短患者治疗时间且稳定性良好，便于操作和临床肿瘤过继性免疫细胞治疗应用推广的HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明的公开了一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述方法为：

采用树突状细胞上的C-型凝集素类型的糖修饰的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤干细胞抗原，制备抗原特异性T淋巴细胞。

所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述阳离子脂质体包括磷脂酰乙醇胺双分子层、聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺以及甘露糖。

所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述的C-型凝集素类型的糖为甘露糖或甘露糖苷。

所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述树突状细胞为72小时快速成熟的负载肿瘤干细胞抗原Sox2的树突状细胞。

所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述抗原是HLA-A0201限制性肿瘤干细胞抗原Sox2表位肽9肽，包涵表位肽15肽及包涵表位肽30肽及人工合成和基因改造的或突变的Sox2抗原肽。

所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述的树突状细胞包括外周血单核细胞诱导的树突状细胞，造血干细胞和脐血干细胞诱导的树突状细胞DC。

所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述阳离子脂质体通过在磷脂分子的极性基团上连接甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。

所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述甘露糖在所述聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺一端形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。

所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，所述的工程细胞跨膜表达人4-1BBL、IL-21的K562细胞株的人工抗原提呈细胞。

任意所述一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法在生物工程领域中的应用。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明针对现有的肿瘤免疫细胞抗肿瘤疗效不佳等问题，提出采用72小时快速成熟DC技术和靶向树突状细胞上C-型凝集素受体的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤干细胞抗原Sox2，通过大大提高DC细胞对肿瘤抗原的摄取效率和抗原呈递能力，增强其抗肿瘤作用，结合工程细胞和细胞因子大量扩增抗原特异性T细胞和Tcm，从而增强抗肿瘤免疫作用。

此外，本发明以肿瘤干细胞抗原Sox2制备的抗原特异性CTL创新之处在于：以肿瘤干细胞为治疗的靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤干细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞，直接针对肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有“治本”性。

本发明采用具有定向靶向的纳米脂质体负载肿瘤干细胞抗原制备抗原特异性T淋巴细胞。与常规抗原特异性T淋巴细胞制备技术相比，本发明制备肿瘤干细胞抗原特异性T淋巴细胞技术不仅采用新型纳米脂质体负载肿瘤干细胞抗原，以肿瘤干细胞为治疗的靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤干细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞，直接针对肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有“治本”性；而且采用72小时快速成熟树突状细胞，比常规的7-8天收获成熟的DC能大大缩短肿瘤患者最佳治疗的时间窗口；同时采用工程细胞放大扩增抗原特异性T淋巴细胞，能产生高比例的杀伤能力更强的Tcm。

本发明肿瘤干细胞抗原特异性T淋巴细胞制备方法简便易行，免疫靶点针对肿瘤干细胞，抗原性强且稳定性良好，便于操作和临床肿瘤过继性免疫细胞治疗应用推广。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1A是本发明一个实施例2中72小时快速成熟树突状细胞表型；

图1B是本发明一个实施例2中72小时快速成熟树突状细胞表型；

图1C是本发明一个实施例2中72小时快速成熟树突状细胞表型；

图2A是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图2B是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图2C是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图2D是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图2E是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图2F是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图3A是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图3B是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图3C是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图3D是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图3E是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图3F是本发明一个实施例3中肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测；

图4A是本发明一个实施例4采用工程细胞两周扩增肿瘤干细胞抗原Sox2CTL的Tcm表型；

图4B是本发明一个实施例4采用工程细胞两周扩增肿瘤干细胞抗原Sox2CTL的Tcm表型；

图4C是本发明一个实施例4采用工程细胞两周扩增肿瘤干细胞抗原Sox2CTL的Tcm表型；

图5A是本发明一个实施例4采用工程细胞两周扩增肿瘤干细胞抗原Sox2CTL的Tcm表型；

图5B是本发明一个实施例4采用工程细胞两周扩增肿瘤干细胞抗原Sox2CTL的Tcm表型；

图5C是本发明一个实施例4采用工程细胞两周扩增肿瘤干细胞抗原Sox2CTL的Tcm表型。

具体实施方式

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例，对本发明作进一步详细的说明。

实施例1本实施例公开了C-型凝集素类型的糖修饰的阳离子脂质体抗原载体制作，具体操作如下：

(1)首先制备甘露糖或甘露糖苷修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。将甘露糖或甘露糖苷通过醛基-氨基或羟基-氨基缩合的方式连接于聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂的氨基上，从而得到甘露糖或甘露糖苷的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。而后将阳离子脂DOTAP和甘露糖或甘露糖苷的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂分别溶于氯仿-甲醇(2∶1)，并按照并按一定比例混合，将二者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的旋转蒸发仪将所述混合液旋转蒸干，使之形成一层均匀的薄膜，用真空干燥12小时去除残余的氯仿和甲醇后，添加含有肿瘤干细胞抗原Sox2的PBS缓冲液或纯水放置4℃水浴超声水化3-5分钟，挤压薄膜后放置于4℃水化12小时。后经水浴超声1-3分钟，用注射器过滤聚碳酸酯膜一次，得到所述靶向树突状细胞(DC)上C-型凝集素受体的肿瘤干细胞抗原Sox2阳离子脂质体载体，保存于4℃。

实施例2本实施例公开了72小时快速成熟负载肿瘤干细胞抗原的树突状细胞的制作过程，具体操作如下：

(1)从外周血中采集和分离单个核细胞，将单个核细胞以3.0-5.0*10⁶个/ml的密度悬于AIM-V无血清培养液，再向培养液中加入细胞因子IL-4和GM-CSF的DC细胞诱导培养基诱导DC形成，然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导。

(2)第二天，向DC细胞培养液中加入包裹好的肿瘤干细胞Sox2抗原(如具体的序列如序列表所示)的阳离子脂质体，浓度为1-2.5ug/ml共孵育6小时，此后向DC细胞中加入DC促成熟培养基，继续培养24-48小时，即得到负载肿瘤肿瘤干细胞抗原Sox2的DC细胞。

对DC的成熟表型进行鉴定，鉴定结果如图1A/图1B/图1C所示：该三个图中Q1/Q2，Q3/Q4为两个donor的mDC成熟程度检测数据，图1B-CD83是DC的成熟标志，CD80，CD86为共刺激分子。两个donor的mDCCD83CD80和CD83CD86同时双阳性表达阳性率达到98％以上。其中图1B中CD83CD80双阳性表达为98.6％和图1A中CD83CD86双阳性表达为98.8％；图1C中CD83CD80双阳性表达为98.3％和CD83CD86双阳性表达为98.1％。

实施例3本实施例公开了72小时快速成熟的DC诱导Sox2CTL的细胞毒性细胞因子的分泌的过程，具体操作如下：

(1)在得到负载肿瘤干细胞抗原的DC细胞的加入CTL诱导因子，诱导4-7天，中间每两天半量补加含有CTL诱导因子的培养基。

(2)待CTL诱导完成后，添加10ng/ml浓度的BFA，4小时后，离心收集CTL，用流式抗体IFN-r和CD8染色检测细胞毒性因子IFN-r分泌表达，肿瘤干细胞抗原Sox2CTL细胞毒性因子IFN-r检测结果如图2A/B/C/D/E/F和图3A/B/C/D/E/F所示：

图2A/B/C/D/E/F和图3A/B/C/D/E/F，这两组图为两个donormDC诱导肿瘤干细胞抗原SOX-2CTL的细胞毒性因子IFN-r检测数据系列图。Loaded组为包裹Sox2抗原的脂质体组，peptide组为单独的Sox2抗原组。其中图2A/B/C/D/E/F组中9-merSox2抗原中，loaded组IFN-r阳性分泌表达率为14.60％，peptide组IFN-r阳性分泌表达率为3.11％；15-merSox2抗原中，loaded组IFN-r阳性分泌表达率为17.30％，peptide组IFN-r阳性分泌表达率为5.67％；30-merSox2抗原中，loaded组IFN-r阳性分泌表达率为14.50％，peptide组IFN-r阳性分泌表达率为3.12％。图3A/B/C/D/E/F组中9-merSox2抗原中，loaded组IFN-r阳性分泌表达率为4.23％，peptide组IFN-r阳性分泌表达率为1.17％；15-merSox2抗原中，loaded组IFN-r阳性分泌表达率为1.76％，peptide组IFN-r阳性分泌表达率为0.77％；30-merSox2抗原中，loaded组IFN-r阳性分泌表达率为6.19％，peptide组IFN-r阳性分泌表达率为0.41％。

实施例4本实施例公开了工程细胞扩增Sox2CTL中的Tcm表型和比例的过程，具体操作如下：

(1)离心收集CTL后，将肿瘤干细胞抗原Sox2呈递的成熟DC诱导后的T细胞与工程细胞按照1∶2-1∶4的比例混合培养。工程细胞提前伽马射线100Gy辐射后和CTL混合培养。添加1ug/mlanti-humanCD3，1ug/mlanti-humanCD28抗体，10ng/ml的humanIL-12和300IU/ml的人重组细胞因子IL-2细胞因子，共孵育在37C，5％CO2，饱和湿度下培养。

(2)根据细胞密度隔天补加含有300IU/ml的人重组细胞因子IL-2和10ng/mlhumanIL-12细胞因子的培养基使细胞数目维持在1.3-2*10⁶个/ml的密度范围，持续补充新鲜的培养基，直到7-10天，收获细胞；根据细胞量可以重复刺激一次，每次刺激7-10天，具体操作同上。对培养后的CTL流式细胞术检测，检测结果如图4A/B/C和图5A/B/C所示：该两组系列图为为两个donor利用工程细胞扩增mDC诱导肿瘤干细胞抗原SOX-2CTLTcm检测数据。peptide组为单独的Sox2抗原扩增组，Background组为空载的脂质体扩增组，Loaded组为包裹Sox2抗原的脂质体扩增组。其中图4A/B/C组依次为peptide扩增组，Background扩增组，loaded扩增组；其中peptide扩增组，CD62LCCR7双阳性表达率为2.72％；Background扩增组，CD62LCCR7双阳性表达率为2.16％；loaded扩增组CD62LCCR7双阳性表达率为26.00％。图4A/B/C依次为peptide扩增组，Background扩增组，loaded扩增组；其中peptide扩增组，CD62LCCR7双阳性表达率为8.93％；Background扩增组，CD62LCCR7双阳性表达率为4.43％；loaded扩增组CD62LCCR7双阳性表达率为26.60％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述方法为：

采用树突状细胞上的C-型凝集素类型的糖修饰的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤干细胞抗原，制备抗原特异性T淋巴细胞。

2.如权利要求1所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质体包括磷脂酰乙醇胺双分子层、聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺以及甘露糖。

3.如权利要求1所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述的C-型凝集素类型的糖为甘露糖或甘露糖苷。

4.如权利要求1所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述树突状细胞为72小时快速成熟的负载肿瘤干细胞抗原Sox2的树突状细胞。

5.如权利要求1所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述抗原是HLA-A0201限制性肿瘤干细胞抗原Sox2表位肽9肽，包涵表位肽15肽及包涵表位肽30肽及人工合成和基因改造的或突变的Sox2抗原肽。

6.如权利要求1所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述的树突状细胞包括外周血单核细胞诱导的树突状细胞，造血干细胞和脐血干细胞诱导的树突状细胞DC。

7.如权利要求2所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质体通过在磷脂分子的极性基团上连接甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。

8.如权利要求3所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述甘露糖在所述聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺一端形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。

9.如权利要求1所述的一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法，其特征在于，所述的工程细胞跨膜表达人4-1BBL、IL-21的K562细胞株的人工抗原提呈细胞。

10.权利要求1-9任意所述一种HLA-A0201限制性抗Sox2特异性CTL的制备方法在生物工程领域中的应用。