CN105713874A - 一种抗肿瘤相关抗原wt1特异性ctl及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明采用具有定向靶向的纳米脂质体负载肿瘤相关性抗原WT1制备抗原特异性T淋巴细胞。本发明制备肿瘤相关性抗原特异性T淋巴细胞技术不仅采用新型纳米脂质体负载肿瘤相关性抗原，以肿瘤相关性为治疗的靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤相关性的特异性细胞毒性T淋巴细胞，直接针对肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有“治本”性；采用72小时快速成熟树突状细胞，大大缩短肿瘤患者最佳治疗的时间窗口；同时采用工程细胞放大扩增抗原特异性T淋巴细胞，能产生高比例的杀伤能力更强的Tcm。本发明肿瘤相关性抗原WT1特异性T淋巴细胞制备方法简便易行，免疫靶点针对肿瘤相关性，抗原性强且稳定性良好。

Description

一种抗肿瘤相关抗原WT1特异性CTL及其制备方法
技术领域
本发明涉及生命科学技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤相关抗原WT1特异性CTL及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤是威胁人类生命健康的第二大致死因素。据统计，2008年全球新发恶性肿瘤患者1270万例，死亡760万例。恶性肿瘤的发生和侵袭转移过程受多层次、多因素调控，癌基因与抑癌基因作用的失衡是其中的关键环节之一。因此，寻找新的或进一步揭示已有癌基因或抑癌基因的功能，对阐明恶性肿瘤发生和演进机理、研发潜在治疗靶点具有重要意义。Wilms瘤基因1(Wilms’tumorgene1，WT1)首先在肾母细胞瘤(又称Wilms瘤)中作为抑癌基因被克隆鉴定，位于人11号染色体短臂1区3带，长约50kb，有10个外显子，富含“GC”同源序列。WT1基因编码产物为长约52-54kD的蛋白质。正常生理情况下，WT1主要在胚胎发生过程中表达，参与心脏、肾脏和脾脏等器官的形成。WT1在正常成体组织中表达部位局限且表达强度极低。WT1在成体组织中的异常表达与多种恶性肿瘤的发生密切相关，但根据细胞特征不同，其可发挥癌基因或抑癌基因作用。一方面，在Wilms瘤等儿童恶性肿瘤中，WT1通过干扰细胞增殖信号等途径抑制细胞生长，发挥抑癌基因作用；另一方面，WT1可增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，并通过调控原癌基因K-ras增强细胞的增殖能力，提示WT1亦可发挥癌基因作用。
WT1基因是一种肿瘤相关性抗原(tumorassociatedantigen,TAA)，在各型白血病有高水平表达，此外在多种实体瘤包括肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、食道癌、肝细胞癌和胃肠间质瘤等实体瘤中都有过表达，并且表达水平与预后呈负相关。WT1表达水平增高可促进细胞生长、凋亡受抑和诱导WT1转基因小鼠产生白血病；反义寡核苷酸抑制WT1表达或SiRNA沉默WT1后能使白血病细胞及实体瘤细胞生长停止，表明WT1在白血病和实体瘤的发展中担当着癌基因角色。根据以上发现，表明WT1是免疫治疗的理想靶抗原。而且最近美国国家癌症研究所根据疗效、免疫原性等标准评估了包括WT1在内的75个肿瘤抗原，WT1排名第一，被评为免疫治疗的首选靶抗原。此外，研究发现白血病细胞高表达WT1，表明基于WT1的免疫治疗，有望靶向杀死肿瘤细胞，进一步证明了WT1作为肿瘤免疫治疗优越性。为今后肿瘤患者的治疗和预后预测提供理论依据。
在人类抗癌历史上，与癌症抗争有过三大利器：外科手术，化疗，与放射治疗。至此，免疫科学家斯坦曼利用先前发现的树突状细胞(Dendriticcell,DC)，激发自身的免疫力清除肿瘤，利用自己的研究成果，将生命由预期的数月延长到四年。由于他对免疫领域的贡献在2011年获得诺贝尔生理医学奖，在肿瘤领域并开创了一个新的天地——肿瘤免疫细胞治疗。他的研究成果现在已经广泛应用于临床，已经成为继手术、放、化疗后的第四种癌症治疗方式。由于肿瘤免疫细胞治疗能够联合手术、化疗、放疗精准清除残余肿瘤细胞，防止复发和转移，加强免疫监视作用，提升患者生存质量和时间，并且没有放化疗的毒副作用和手术的巨大伤害。近年来，在临床应用中受到越来越广泛的关注，是国内外研究的热点，已被公认为是最具前景的肿瘤治疗方法。
过继性免疫细胞治疗是指通过输入自身或同种异体的肿瘤杀伤细胞来治疗肿瘤的方法。它不仅可以纠正细胞免疫功能的低下，促进宿主抗肿瘤免疫的功能，还可以直接发挥抗肿瘤的作用。其中细胞毒性T细胞的过继治疗有着特殊的优越性。细胞毒性T细胞的过继治疗是实体肿瘤，尤其是肿瘤相关抗原比较明确的恶性黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、前列腺癌、肺癌等的研究热点。特异性CTLs(细胞毒性T细胞)的产生是通过将肿瘤抗原负载成熟的DC(树突状细胞)刺激T细胞从而获得抗原的特异性CTLs克隆。这种CTL能识别并杀伤携带相应肿瘤抗原的恶性细胞，经过大量的扩增就能应用于临床治疗。这种治疗方法相比其他的治疗方法具有易获得、可操作性强，靶向性好，安全性高等特点。
但是，过继性T细胞转移还面临很多的问题：DC的成熟程度低，免疫耐受，特异性活化T细胞的数量不足等等。由于DC扩增具有很大的难度，所以这也间接限制了特异性活化T细胞的数量。以树突状细胞(Dendriticcell,DC)疫苗为代表的肿瘤免疫治疗成为继手术、化疗、和放疗后的第四种抗肿瘤疗法，主要利用肿瘤细胞的抗原物质刺激机体产生特异性肿瘤细胞免疫杀伤，从而达到消灭肿瘤的目的。与传统的抗肿瘤治疗相比，DC疫苗介导的免疫治疗具有安全性好、特异性高等诸多优点，目前已被广泛用于治疗肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等各类恶性肿瘤，然而其临床疗效仍有待进一步提高。树突状细胞(DC)作为体内功能最强的抗原递呈细胞，是激发机体产生抗肿瘤免疫应答的首要核心环节。它能摄取抗原，并将抗原信息通过MHC-I类分子提呈给CD8+T淋巴细胞，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)生成，继而杀死肿瘤细胞，适用于多种肿瘤的免疫疗法。因此，提高DC对抗原的摄取量和提呈能力是增强其临床疗效的重要策略。
纳米级脂质体是由磷脂双层壳包裹水相核心形成的球形的实体，其结构类似生物膜,是一种生物相容性好且无毒的纳米材料。它可包封水溶性和脂溶性药物,具有减少药物剂量、缓释、及靶向性释放药物等优点，因而被广泛用于纳米级抗肿瘤药物的开发。此外，纳米级脂质体也是一种优良的抗原载体，不仅能够包裹一系列理化性质不同的抗原及免疫佐剂，保护蛋白多肽抗原不被降解，还可以促进抗原呈递细胞对抗原的吞噬及呈递，提高机体的特异性免疫反应。基于以上这些优点，纳米级脂质体作为一种新型的疫苗载体，正逐渐用于细菌疫苗、病毒疫苗、抗寄生虫疫苗以及抗肿瘤疫苗等研制开发。中性脂质体和表面携带正电荷的阳离子纳米级脂质体是最常用的纳米疫苗载体。其中特别值得关注的是阳离子纳米级脂质体，它不但是优良的蛋白/多肽抗原载体，还是一种新型的免疫佐剂，可直接活化抗原呈递细胞，增强疫苗诱导的免疫反应。
目前肿瘤的细胞免疫治疗效果仍不理想，主要原因包括如下两方面：1)肿瘤患存在免疫抑制的微环境，一方面，肿瘤组织的T淋巴细胞产生免疫耐受，另一方面，肿瘤细胞能够分泌多种免疫抑制因子，诱导产生调节性T淋巴细胞或抑制DCs功能。2)肿瘤免疫治疗中应用的抗原大多表达在已分化的肿瘤细胞上，而肿瘤相关并不表达这些抗原，所诱发的免疫杀伤反应并不针对肿瘤相关。加上目前常规DC加入患者肿瘤细胞裂解得到的肿瘤抗原，使DC负载肿瘤抗原，虽然这种方法能使得DC摄取到患者的肿瘤抗原，但由于肿瘤抗原的抗原性较弱，DC对肿瘤抗原摄取量较少，其递呈抗原能力也就较低，使其产生的CTL细胞的杀伤活性不足,并且利用单纯的细胞因子放大扩增CTL细胞数量有限，产生的Tcm比例小，进而影响抗肿瘤治疗效果。
发明内容
本发明针对现有的肿瘤免疫细胞抗肿瘤疗效不佳等问题，提出采用靶向树突状细胞上C-型凝集素受体的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤细胞抗原WT1，通过大大提高DC细胞对肿瘤抗原的摄取效率和抗原呈递能力，增强其抗肿瘤作用，结合工程细胞和细胞因子大量扩增抗原特异性T细胞和Tcm,从而增强抗肿瘤免疫作用。此外，本发明以肿瘤细胞抗原WT1制备的抗原特异性CTL创新之处在于：以肿瘤细胞为治疗的靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞，直接针对肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有“治本”性。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术措施为：
一种抗肿瘤相关抗原WT1特异性CTL的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，制备包裹有肿瘤相关抗原WT1的靶向树突状细胞C-型凝集素受体的阳离子脂质体载体；
步骤二，利用所述步骤一得到的阳离子脂质体载体将肿瘤相关抗原WT1负载于成熟DC细胞；
步骤三，利用所述步骤二得到的成熟DC细胞诱导得到WT1特异性T淋巴细胞和中枢性记忆性T淋巴细胞。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
进一步地，所述步骤一中具体包括以下步骤：
步骤1，提供聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂，将C-型凝集素类型的糖连接在聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂，得到C-型凝集素类型的糖修饰的聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂；
步骤2，将阳离子脂和步骤1中得到的C-型凝集素类型的糖修饰的聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂分别溶解于氯仿和甲醇的混合溶剂中，得到混合液；
步骤3，用旋转蒸发仪将步骤2中得到的混合液旋转蒸干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥后加入含有肿瘤相关抗原WT1的PBS缓冲液或纯水放置4℃超声水化，挤压过膜后得到包裹有肿瘤相关抗原WT1的靶向树突状细胞C-型凝集素受体的阳离子脂质体载体。
优选地，步骤一中所述肿瘤相关抗原WT1选自HLA-A0201限制性肿瘤相关抗原WT1表位肽9肽，或人工合成的、改造的或突变的WT1抗原肽。具体地，WT1蛋白序列从N端到C端(449AA)为：MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL
其中，表位肽9肽序列为：RMFPNAPYL
优选地，所述C-型凝集素类型的糖为甘露糖或甘露糖苷。
进一步地，上述步骤二中具体包括以下步骤：
步骤1，将外周血单个核细胞悬于基础培养基并加入DC细胞诱导培养基，种于细胞培养板，在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导；
步骤2，向DC细胞中加入适量的所述步骤一得到负载有肿瘤相关抗原WT1的阳离子脂质体载体，共孵育培养6小时；然后加入DC促成熟培养基，继续培养24-48小时，即得到负载肿瘤相关抗原WT1的成熟DC细胞。
进一步地，上述步骤三中具体包括以下步骤：
步骤1，将所述步骤二中获得的成熟DC细胞诱导T细胞，诱导后的T细胞与工程细胞混合培养，添加细胞因子培养；
步骤2，根据细胞密度隔天补加含有细胞因子的培养基，使细胞维持一定范围的密度生长，直到2-3周，收获细胞，得到WT1特异性T淋巴细胞和中枢性记忆性T淋巴细胞。
优选地，上述阳离子脂质体包括磷脂酰乙醇胺双分子层、聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺以及甘露糖。更优选地，所述磷脂酰乙醇胺双分子层由磷脂酰乙醇胺阳离子脂和聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺分子组成。
优选地，上述聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺与所述甘露糖形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。更优选地，上述阳离子脂质体在磷脂分子的极性基团上连接所述甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。
优选地，所述细胞因子选自人重组细胞因子IL-2、IL-12和IL-18细胞因子。
优选地，所述工程细胞为人工细胞转染了人4-1BBL和IL-21的K562细胞株。
本发明另一方面还提供根据上述制备方法所制备得到的特异性CTL；以及制备得到的特异性CTL在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明采用具有定向靶向的纳米脂质体负载肿瘤相关抗原制备抗原特异性T淋巴细胞。与常规抗原特异性T淋巴细胞制备技术相比，本发明制备肿瘤相关抗原特异性T淋巴细胞技术不仅采用新型纳米脂质体负载肿瘤相关抗原，以肿瘤相关为治疗的靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤相关的特异性细胞毒性T淋巴细胞，直接针对肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有“治本”性；而且采用72小时快速成熟树突状细胞，比常规的7-8天收获成熟的DC能大大缩短肿瘤患者最佳治疗的时间窗口；同时采用工程细胞放大扩增抗原特异性T淋巴细胞，能产生高比例的杀伤能力更强的Tcm。本发明肿瘤相关抗原WT1特异性T淋巴细胞制备方法简便易行，免疫靶点针对肿瘤相关，抗原性强且稳定性良好，便于操作，适合在临床肿瘤过续性免疫治疗上进行应用推广。
附图说明
图1为实施例二中72小时快速成熟树突状细胞成熟表型鉴定结果。
图2为实施例三中肿瘤相关抗原WT1CTL细胞毒性因子IFN-r检测结果。
图3为实施例四中扩增的肿瘤相关抗原WT1特异性CTL的Tcm表型检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种抗肿瘤相关抗原WT1特异性CTL的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，制备包裹有肿瘤相关抗原WT1的靶向树突状细胞C-型凝集素受体的阳离子脂质体载体；
步骤二，利用所述步骤一得到的阳离子脂质体载体将肿瘤相关抗原WT1负载于成熟DC细胞；
步骤三，利用所述步骤二得到的成熟DC细胞诱导得到WT1特异性T淋巴细胞和中枢性记忆性T淋巴细胞。
本发明采用C-型凝集素类型的糖修饰的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤相关抗原，用于抗原特异性T淋巴细胞的制备。所述阳离子脂质体，包括磷脂酰乙醇胺双分子层、聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺以及甘露糖；所述的C-型凝集素类型的糖为甘露糖或甘露糖苷。所述磷脂双分子球由磷脂酰乙醇胺阳离子脂和所述聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺分子组成；所述甘露糖在所述聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺一端形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。这种阳离子脂质体通过在磷脂分子的极性基团上连接甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。所述肿瘤抗原是HLA-A0201限制性肿瘤相关抗原WT1表位肽9肽，包涵表位肽15肽及包涵表位肽30肽。所述的工程细胞跨膜表达人4-1BBL和IL-21的K562细胞株的人工细胞。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一抗肿瘤相关抗原WT1特异性CTL的制备方法
本发明的制备方法主要包括三大块步骤，本实施例为本发明通用的制备方法。
第一，C-型凝集素类型的糖修饰的阳离子脂质体抗原载体制作，具体操作如下：
首先制备甘露糖或甘露糖苷修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。将甘露糖或甘露糖苷通过醛基-氨基或羟基-氨基缩合的方式连接于聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂的氨基上，从而得到甘露糖或甘露糖苷的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。而后将阳离子脂DOTAP和甘露糖或甘露糖苷的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂分别溶于氯仿-甲醇(2:1)，并按照并按一定比例混合，将二者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的旋转蒸发仪将所述混合液旋转蒸干，使之形成一层均匀的薄膜，用真空干燥12小时去除残余的氯仿和甲醇后，添加含有肿瘤相关抗原WT1的PBS缓冲液或纯水放置4℃水浴超声水化3-5分钟，挤压薄膜后放置于4℃水化12小时。后经水浴超声1-3分钟，用注射器过滤聚碳酸酯膜一次，得到所述靶向树突状细胞(DC)上C-型凝集素受体的肿瘤相关抗原WT1阳离子脂质体载体，保存于4℃。
第二，72小时快速负载肿瘤相关抗原的树突状细胞的制备，具体操作如下：
将人外周血单个核细胞以3.0-5.0*106个/ml悬于基础培养基，加入DC细胞诱导培养基，种于细胞培养板，在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导。
第二天，向DC细胞中加入适量的肿瘤相关抗原WT1，共孵育培养6小时。然后加入DC促成熟培养基，继续培养24-48小时，即得到负载肿瘤相关抗原WT1的成熟DC细胞。
第三，快速扩增抗原特异性T淋巴细胞和Tcm的制备方法，具体操作如下：
将肿瘤相关抗原WT1呈递的成熟DC诱导后的T细胞与工程细胞按照1：2-1：4的比例混合培养，添加1ug/mlanti-humanCD3抗体，1ug/mlanti-humanCD28抗体，300IU/ml的人重组细胞因子IL-2和10ng/mlhumanIL-12细胞因子,共孵育在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养。
根据细胞密度隔天补加含有300IU/ml的人重组细胞因子IL-2和10ng/mlhumanIL-18细胞因子的培养基使细胞数目维持在1.3-2*106个/ml的密度范围，持续补充新鲜的培养基，直到两三周，收获细胞。
实施例二DC的成熟表型鉴定
本实施例中，从外周血中采集和分离单个核细胞，以3.0-5.0*106个/ml的密度悬于AIM-V无血清培养液，再向培养液中加入细胞因子IL-4和GM-CSF诱导DC形成，然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，第二天，向DC细胞培养液中加入包裹好的肿瘤相关WT1抗原的阳离子脂质体，浓度为1-2.5ug/ml共孵育6小时，此后向DC细胞中加入DC促成熟培养基，继续培养24-48小时，即得到负载肿瘤肿瘤相关抗原的DC细胞。DC的成熟表型鉴定结果如附图1。图中A,B为两个donor的mDC成熟程度检测数据，CD83是DC的成熟标志，CD80,CD86为共刺激分子。两个donor的mDCCD83CD80和CD83CD86同时双阳性表达阳性率达到98％以上。其中A中CD83CD80双阳性表达为98.6％和CD83CD86双阳性表达为98.8％；B中CD83CD80双阳性表达为98.3％和CD83CD86双阳性表达为98.1％。
实施例三72小时快速成熟的DC诱导WT1CTL的细胞毒性细胞因子的分泌检测
在实施例二中得到的负载肿瘤相关抗原的DC细胞中加入CTL诱导因子，诱导4-7天，中间每两天半量补加含有CTL诱导因子的培养基。待CTL诱导完成后，添加10ng/ml浓度的BFA，4小时后，离心收集CTL，用流式抗体IFN-r和CD8染色检测细胞毒性因子IFN-r分泌表达(如附图2)。图中A,B为两个donormDC诱导肿瘤细胞抗原WT1CTL的细胞毒性因子IFN-r检测数据。Loaded组为包裹WT1抗原的脂质体组，peptide组为单独的WT1抗原组。其中A图中loaded组IFN-r阳性分泌表达率为2.10％，peptide组IFN-r阳性分泌表达率为0.56％；。B图中loaded组IFN-r阳性分泌表达率为0.56％，peptide组IFN-r阳性分泌表达率为0.15％。
实施例四工程细胞扩增WT1CTL中的Tcm表型和比例测定
离心收集CTL后，CTL与工程细胞混合培养，混合比例为2-4：1。工程细胞提前伽马射线100Gy辐射后和CTL混合培养。添加1ug/mlanti-humanCD3,1ug/mlanti-humanCD28抗体,10ng/mlhumanIL-12和300IU/ml的人重组细胞因子IL-2细胞因子,共孵育在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养。根据细胞密度隔天补加含有300IU/ml的人重组细胞因子IL-2和10ng/mlhumanIL-18细胞因子的培养基使细胞数目维持在1.3-2*106个/ml的密度范围，持续补充新鲜的培养基，直到7-10天，收获细胞；根据细胞量可以重复刺激一次，每次刺激7-10天，具体操作同上。培养后的CTL流式细胞术检测(如附图3)。图中A,B为两个donor利用工程细胞扩增mDC诱导肿瘤细胞抗原WT1CTLTcm检测数据。peptide组为单独的WT1抗原扩增组，Background组为空载的脂质体扩增组，Loaded组为包裹WT1抗原的脂质体扩增组。其中A图中peptide扩增组，CD62LCCR7双阳性表达率为18.30％；Background扩增组，CD62LCCR7双阳性表达率为9.94％；loaded扩增组CD62LCCR7双阳性表达率为20.30％。图B中peptide扩增组，CD62LCCR7双阳性表达率为17.50％；Background扩增组，CD62LCCR7双阳性表达率为11.80％；loaded扩增组CD62LCCR7双阳性表达率为20.10％。
本发明采用具有定向靶向的纳米脂质体负载肿瘤相关抗原制备抗原特异性T淋巴细胞。与常规抗原特异性T淋巴细胞制备技术相比，本发明制备肿瘤相关抗原特异性T淋巴细胞技术不仅采用新型纳米脂质体负载肿瘤相关抗原，以肿瘤相关为治疗的靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤相关的特异性细胞毒性T淋巴细胞，直接针对肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有“治本”性；而且采用72小时快速成熟树突状细胞，比常规的7-8天收获成熟的DC能大大缩短肿瘤患者最佳治疗的时间窗口；同时采用工程细胞放大扩增抗原特异性T淋巴细胞，能产生高比例的杀伤能力更强的Tcm。本发明肿瘤相关抗原WT1特异性T淋巴细胞制备方法简便易行，免疫靶点针对肿瘤相关，抗原性强且稳定性良好，适合在临床肿瘤过续性免疫治疗上进行应用推广。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (12)

1.一种抗肿瘤相关抗原WT1特异性CTL的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，制备包裹有肿瘤相关抗原WT1的靶向树突状细胞C-型凝集素受体的阳离子脂质体载体；
步骤二，利用所述步骤一得到的阳离子脂质体载体将肿瘤相关抗原WT1负载于成熟DC细胞；
步骤三，利用所述步骤二得到的成熟DC细胞诱导得到WT1特异性T淋巴细胞和中枢性记忆性T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中具体包括以下步骤：
步骤1，提供聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂，将C-型凝集素类型的糖连接在聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂，得到C-型凝集素类型的糖修饰的聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂；
步骤2，将阳离子脂和步骤1中得到的C-型凝集素类型的糖修饰的聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂分别溶解于氯仿和甲醇的混合溶剂中，得到混合液；
步骤3，用旋转蒸发仪将步骤2中得到的混合液旋转蒸干，使之形成一层均匀的薄膜，真空干燥后加入含有肿瘤相关抗原WT1的PBS缓冲液或纯水放置4℃超声水化，挤压过膜后得到包裹有肿瘤相关抗原WT1的靶向树突状细胞C-型凝集素受体的阳离子脂质体载体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中具体包括以下步骤：
步骤1，将外周血单个核细胞悬于基础培养基并加入DC细胞诱导培养基，种于细胞培养板，在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导；
步骤2，向DC细胞中加入适量的所述步骤一得到负载有肿瘤相关抗原WT1的阳离子脂质体载体，共孵育培养6小时；然后加入DC促成熟培养基，继续培养24-48小时，即得到负载肿瘤相关抗原WT1的成熟DC细胞。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中具体包括以下步骤：
步骤1，将所述步骤二中获得的成熟DC细胞诱导T细胞，诱导后的T细胞与工程细胞混合培养，添加细胞因子培养；
步骤2，根据细胞密度隔天补加含有细胞因子的培养基，使细胞维持一定范围的密度生长，直到2-3周，收获细胞，得到WT1特异性T淋巴细胞和中枢性记忆性T淋巴细胞。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质体包括磷脂酰乙醇胺双分子层、聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺以及甘露糖。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂酰乙醇胺双分子层由磷脂酰乙醇胺阳离子脂和聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺分子组成。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺与所述甘露糖形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中所述肿瘤相关抗原WT1选自HLA-A0201限制性肿瘤相关抗原WT1表位肽9肽，如SEQNO.1所示；或人工合成的、改造的或突变的WT1抗原肽。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述工程细胞为人工细胞转染了人4-1BBL和IL-21的K562细胞株。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述细胞因子选自人重组细胞因子IL-2、IL-12和IL-18细胞因子。
11.根据权利要求1-10任意一项制备方法所制备得到的特异性CTL。
12.如权利要求11所述的特异性CTL在制备抗肿瘤药物中的应用。
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张强 等主编: "《药剂学》", 31 January 2005 *

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