CN1816349A - 用于wt1特异性免疫治疗的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于恶性疾病，诸如白血病和癌症治疗的组合物和方法。该组合物包含WT1多核苷酸，WT1多肽、呈递WT1多肽的抗原呈递细胞，特异性结合WT1多肽的抗体；或者特异性地与WT1多肽反应的T细胞中的一种或多种。例如，这种组合物可以用于转移性疾病的预防和治疗。

Description

用于WT1特异性免疫治疗的组合物和方法
关于联邦政府资助的研究或开发的陈述
本发明部分是在NIH SBIR I期拨款号IR43 CA81752-01A1的政府支持下进行的。政府可以对本发明具有一些权利。
技术领域
总体而言，本发明涉及恶性疾病诸如白血病和癌症的免疫治疗。更具体地，本发明涉及用于产生或增强对WT1免疫应答的组合物，并且涉及这种组合物用于预防和/或治疗恶性疾病的用途。
背景技术
在美国和全世界，癌症和白血病是严重的健康问题。尽管在这种疾病的检测和治疗方面已经取得了进展，但是目前尚没有用于预防或治疗癌症和白血病的疫苗或其它普遍成功的方法。目前该疾病的治疗依赖于早期诊断和攻击性治疗相联合，所述攻击性治疗可以包括各种治疗诸如手术、放射治疗、化学治疗和激素治疗中的一种或多种治疗。常常根据各种预后参数，包括特异性肿瘤标志的分析选定特定癌症治疗的疗程。然而，确定的标志的使用常常引起难以解释的结果，并且在许多癌症患者中持续观察到了高死亡率。
免疫治疗具有实质上改进癌症和白血病治疗及存活的潜能。最近的资料表明在骨髓移植(例如，供体淋巴细胞输注)的情况下可以通过免疫治疗治愈白血病。这种治疗可能涉及产生和增强对肿瘤相关抗原(TAA)的免疫应答。然而，迄今已知的TAA相当少，并且除了罕有的例外，还没有表明产生针对这种抗原的免疫应答具有治疗益处。
因此，该领域需要用于预防和治疗白血病和癌症的改进的方法。本发明满足了这些需要，并且进一步提供了其它相关的优点。
发明内容
简而言之，本发明提供了用于诊断和治疗疾病诸如白血病和癌症的组合物和方法。在一方面，本发明提供了包含天然WT1免疫原性部分的多肽，或者区别在于一个或多个置换、缺失、添加和/或插入的其变异体，这样的变异体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力基本上没有被降低。在本发明的一些实施方式中，多肽至少包含WT1的免疫原性部分，其中免疫原性部分包含在WT1的氨基酸2-281中。在一些实施方式中，多肽包含天然WT1多肽的不超过16个连续的氨基酸残基。在其它实施方式中，多肽包含天然WT1多肽或其变异体氨基酸残基1-174的免疫原性部分，其中多肽包含存在于天然WT1多肽氨基酸175到449中不超过16个连续的氨基酸残基。免疫原性部分优选结合MHCI类和/或II类分子。在一些实施方式中，多肽包含选自下面的序列：(a)表II-XLVI的任何一个或多个中所述的序列，(b)区别在于一个或多个置换、缺失、添加和/或插入的前述序列的变异体，这样的变异体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力基本上没有被降低和(c)上述多肽的模拟物，这样的模拟物与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力基本上没有被降低。
在其它实施方式中，多肽包含选自下面的序列：(a)ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)、GATLKGVAA(SEQ ID NO：88)、CMTWNQMNL(SEQ IDNO：49和258)、SCLESQPTI(SEQ ID NO：199和296)、SCLESQPAI(SEQID NO：198)、NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147和284)、ALLPAVSSL(SEQID NO：35和255)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185和293)、VLDFAPPGA(SEQ ID NO：241)、VLDFAPPGAS(SEQ ID NO：411)、SEQ ID NO：414-450、ALLPAVPSL(SEQ ID NO：451)，(b)区别在于一个或多个置换、缺失、添加和/或插入的前述序列的变异体，这样的变异体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力基本上没有被降低和(c)上述多肽的模拟物，这样的模拟物与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力基本上没有被降低。模拟物可以包含氨基酸与一个或多个氨基酸模拟物相组合，或者可以是完全非肽模拟物。
在进一步的方面，本发明提供了包含WT1蛋白质免疫原性部分变异体的多肽，其中该变异体由于免疫原性部分中1-3个氨基酸位置的置换而与免疫原性部分有所不同，相对于天然WT1蛋白质，该变异体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力基本上没有被降低或者被增强了。
本发明进一步提供了编码上述WT1多肽的WT1多核苷酸。
在另一方面，本发明提供了药物组合物和疫苗。药物组合物可以包含上述多肽或模拟物和/或以下的一种或多种：(i)WT1多核苷酸；(ii)特异性结合WT1多肽的抗体或其抗原结合片段；(iii)特异性地与WT1多肽反应的T细胞或(iv)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，及药物学可接受的载体或赋形剂。疫苗包含上述多肽和/或以下的一种或多种：(i)WT1多核苷酸；(ii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞或(iii)抗独特型抗体，和非特异性免疫应答增强剂。在一些实施方式中，天然WT1多肽的少于23个连续的氨基酸残基，优选少于17个氨基酸残基存在于这种药物组合物和疫苗中所使用的WT1多肽中。免疫应答增强剂可以是佐剂。优选免疫应答增强剂增强T细胞应答。
本发明进一步提供了用于增强或诱导患者免疫应答的方法，该方法包括向患者给予上述药物组合物或疫苗。在一些实施方式中，该患者是人类。
本发明进一步提供了用于抑制患者恶性疾病发生发展的方法，该方法包括向患者给予上述药物组合物或疫苗。恶性疾病包括但不限于白血病(例如，急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病和慢性髓细胞白血病)和癌症(例如，乳腺癌、肺癌、甲状腺或胃肠癌或黑色素瘤)。患者可能但不一定患有恶性疾病，并且药物组合物或疫苗的给药可以抑制这种疾病的发作，或者可以抑制现存疾病的进展和/或转移。
另一方面，本发明进一步提供了从骨髓和/或外周血或其级分中清除表达WT1的细胞的方法，该方法包括用与WT1多肽特异性反应的T细胞接触骨髓、外周血或者骨髓或外周血的级分，其中该接触步骤是在一定条件下和时间内进行的，该条件和时间足以允许使WT1阳性细胞清除至小于在骨髓、外周血或其级分中的髓细胞或淋巴细胞数量的10％，优选小于5％，更优选小于1％。骨髓、外周血和其级分可以获自患有与WT1表达有关的疾病的患者，或者可以获自未患有这种疾病的人类或非人类的哺乳动物。
在相关的方面中，本发明提供了用于抑制患者中恶性疾病发生发展的方法，该方法包括向患者给予上述制备的骨髓、外周血或者骨髓或外周血的级分。这种骨髓、外周血或级分可以是自身的，或者可以来源于相关或无关的人类或非人类的动物(例如，同源或异源的)。
在其它方面，本发明提供了用于刺激(或致敏(priming))和/或扩增T细胞的方法，该方法包括在一定条件下和时间内用WT1多肽接触T细胞，该条件和时间足以允许刺激和/或扩增T细胞。这种T细胞可以是自身的、异源、同源或无关的WT1特异性T细胞，并且可以在体外或体内进行刺激。在一些实施方式中，扩增的T细胞可以存在于骨髓、外周血或者骨髓或外周血的级分中，并且可以是(但不需要是)克隆的。在一些实施方式中，在刺激和/或扩增期间，T细胞可以存在于哺乳动物中。例如，可以在供体淋巴细胞输注中使用WT1特异性T细胞。
在相关的方面中，提供了用于抑制患者中恶性疾病发生发展的方法，该方法包括向患者给予上述制备的T细胞。在一些实施方式中，这种T细胞可以是自身的、同源或异源的。
在其它方面，本发明进一步提供了用于在患者中监测对与WT1表达相关的恶性疾病的免疫或者治疗的有效性的方法。这种方法是基于监测患者中的抗体、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞应答。在这方面中，该方法可以包括步骤：(a)温育第一生物样品与以下的一种或多种：(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，其中第一生物样品获自治疗或免疫前的患者，其中在足以允许形成免疫复合物的条件下和时间内进行该温育；(b)检测在WT1多肽与生物样品中特异性地结合WT1多肽的抗体之间形成的免疫复合物；(c)利用获自治疗或免疫后相同患者的第二生物样品重复步骤(a)和(b)；和(d)比较第一和第二生物样品中检测到的免疫复合物数量，并且据此监测对患者治疗或免疫的有效性。
在上述方法的一些实施方式中，检测步骤包括(a)温育免疫复合物和能结合免疫复合物的检测试剂，其中该检测试剂包含报道基团，(b)清除未结合的检测试剂，和(c)检测报道基团的有无。检测试剂可以包括例如能结合特异性结合WT1多肽的抗体的二抗或其抗原结合片段，或分子诸如蛋白质A。在其它实施方式中，报道基团结合WT1多肽，并且检测步骤包括清除未结合的WT1多肽，并且随后检测报道基团的有无。
在进一步的方面，用于监测患者中对与WT1表达相关的恶性疾病的免疫或治疗有效性的方法可以包括步骤：(a)温育第一生物样品与以下的一种或多种：(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，其中该生物样品包含CD4+和/或CD8+T细胞，并且获自治疗或免疫前的患者，其中在足以允许T细胞特异性激活、增殖和/或裂解的条件下和时间内进行该温育；(b)检测T细胞激活、增殖和/或裂解的数量；(c)利用包含CD4+和/或CD8+T细胞的第二生物样品重复步骤(a)和(b)，其中第二生物样品获自经治疗或免疫后的相同患者；和(d)比较第一和第二生物样品中T细胞激活、增殖和/或裂解的数量，和据此监测对患者治疗或免疫的有效性。
本发明进一步提供了用于抑制患者中与WT1表达相关的恶性疾病发生发展的方法，该方法包括步骤：(a)温育从患者分离得到的CD4+和/或CD8+T细胞与以下的一种或多种：(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，以使T细胞增殖；和(b)向患者给予有效量的增殖的T细胞，并且据此抑制患者中恶性疾病的发生发展。在一些实施方式中，温育T细胞的步骤可以重复一次或多次。
在其它方面中，本发明提供了用于抑制患者中与WT1表达相关的恶性疾病发生发展的方法，该方法包括步骤：(a)温育从患者分离得到的CD4+和/或CD8+T细胞与以下的一种或多种：(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，以使T细胞增殖；(b)克隆增殖的一种或多种细胞；和(c)向患者给予有效量的克隆的T细胞。
在其它方面中，提供了用于确定患者是否患有与WT1表达相关的恶性疾病的方法，该方法包括步骤：(a)温育从患者分离得到的CD4+和/或CD8+T细胞与以下的一种或多种：(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；和(b)检测是否特异性激活T细胞，据此确定是否患有与WT1表达相关的恶性疾病。在一些实施方式中，检测步骤包括检测T细胞是否增殖。
在进一步的方面中，本发明提供了用于确定患者是否患有与WT1表达相关的恶性疾病的方法，该方法包括步骤：(a)温育获自患者的生物样品与以下的一种或多种：(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，其中在允许形成免疫复合物的条件下和时间内进行该温育；和(b)检测在WT1多肽与生物样品中特异性结合WT1多肽的抗体之间形成的免疫复合物；和据此确定是否患有与WT1表达相关的恶性疾病。
参考下面详细的说明和附图的情况，本发明的这些和其它方面将显而易见。将这里公开的所有文献整体引入作为参考文献，如同每篇文献单独引入作为参考文献。
附图说明
图1描述了小鼠(MO)和人类(HU)WT1蛋白质序列(分别是SEQID NO：320和319)的比较。
图2是Western印迹，示例在患有血液恶性肿瘤(AML)的患者中对WT1特异性抗体的检测。泳道1显示分子量标记；泳道2显示阳性对照(用WT1特异性抗体免疫沉淀的WT1阳性人类白血病细胞系)；泳道3显示阴性对照(用小鼠血清免疫沉淀的WT1阳性细胞系)；和泳道4显示用患有AML的患者血清免疫沉淀的WT1阳性细胞系。对于泳道2-4，通过凝胶电泳分离免疫沉淀物，并且用WT1特异性抗体探测。
图3是Western印迹，示例对用TRAMP-C免疫的B6小鼠中WT1特异性抗体应答的检测，其中，TRAMP-C是一种WT1阳性肿瘤细胞系。泳道1，3和5显示分子量标记，泳道2，4和6显示WT1特异性阳性对照(N180，Santa Cruz Biotechnology，跨越WT1蛋白质N-末端区域180个氨基酸的多肽，在Western印迹中迁移至52kD处)。使用的一抗在泳道2中为WT180、在泳道4中为未免疫的B6小鼠血清和在泳道6中为经免疫的B6小鼠血清。
图4是Western印迹，示例对用代表性的WT1肽免疫的小鼠中的WT1特异性抗体的检测。泳道1，3和5显示分子量标记，泳道2，4和6显示WT1特异性阳性对照(N180，Santa Cruz Biotechnology，跨越WT1蛋白质N-末端区域180个氨基酸的多肽，在Western印迹中迁移至52kD处)。使用的一抗在泳道2中为WT180，在泳道4中为未免疫的B6小鼠血清和在泳道6中为经免疫的B6小鼠血清。
图5A到5C是示例在用代表性的WT1肽免疫的小鼠中，刺激增殖性T细胞应答的图表。如所述，用一种T细胞系和两种不同克隆进行胸苷掺入测定，结果表示为cpm。X轴上标明的对照是无抗原(No Ag)和B6/培养基；所用的抗原是人类p6-22(p1)，p117-139(p2)或人类p244-262(p3)。
图6A和6B是直方图，示例在用代表性的WT1肽免疫的小鼠中，刺激增殖性T细胞应答。第三次免疫后3周，将经疫苗A或疫苗B接种过的小鼠的脾脏细胞与单独培养基(培养基)、或者脾脏细胞与培养基(B6/无抗原)，用肽p6-22(p6)、p117-139(p117)、p244-262(p244)(疫苗A；图6A)或p287-301(p287)、p299-313(p299)、p421-435(p421)(疫苗B；图6B)脉冲的B6脾脏细胞，以及用无关的对照肽(无关肽)以25μg/ml脉冲的脾脏细胞培养，并且在96小时后通过(3H)胸苷掺入测定增殖。柱条代表刺激指数(SI)，其被计算为试验孔的平均值除以对照(B6脾脏细胞无抗原)的平均值。
图7A-7D是直方图，示例对p117-139和p6-22特异的增殖性T细胞系和克隆的产生。体内免疫后，分别利用疫苗A或B的所有3种肽进行最初3次的体外刺激(IVS)。随后只用两种相关肽p117-139和p6-22进行作为单肽刺激的IVS。如所述，克隆来源于对p6-22和p117-139特异性的T细胞系。将T细胞与单独培养基(培养基)或者脾脏细胞和培养基(B6/无抗原)、用肽p6-22(p6)、p117-139(p117)或无关对照肽(无关肽)以25μg/ml脉冲的B6脾脏细胞培养，并且在96小时后通过(3H)胸苷掺入测定增殖。柱条代表刺激指数(SI)，其被计算为试验孔的平均值除以对照(B6脾脏细胞无抗原)的平均值。
图8A和8B表示对人类WT1(SEQ ID NO：319)中有潜能激发Th应答的肽的TSITES分析的结果。用“A”标明的区域是模块的AMPHI中点，“R”表示匹配Rothbard/′Taylor基序的残基，“D”表示匹配IAd基序的残基，和‘d’表示匹配IEd基序的残基。
图9A和9B是图表，示例在用WT1肽免疫的小鼠中，激发WT1肽特异性CTL。图9A表示异源细胞系对靶细胞的裂解，图9B表示肽包被细胞系的裂解。在每种情况下，示出以3种所标明的效应子：靶比率的％裂解(如用标准铬释放测定法所测定的)。提供了淋巴瘤细胞(LSTRA和E10)及E10+p235-243(E10+P235)的结果。E10细胞这里也称为EL-4细胞。
图10A-10D是图表，示例用WT1肽P117接种B6小鼠后，激发杀死WT1阳性肿瘤细胞系，但不杀死WT1阴性细胞系的WT1特异性CTL。图10A示例未免疫的B6小鼠的T细胞不杀死WT1阳性肿瘤细胞系。图10B示例异源细胞系裂解靶细胞。图10C和10D证明在两个不同试验中，与WT1阴性细胞系比较，WT1阳性肿瘤细胞系的裂解。此外，图10C和10D显示肽包被细胞系的裂解(用相关WT1肽P117包被的WT1阴性细胞系E10)。在每种情况下，示出以3种标明的效应子：靶比率的％裂解(如用标准铬释放测定法所测定的)。提供了淋巴瘤细胞(E10)、前列腺癌细胞(TRAMP-C)、转化的成纤维细胞系(BLK-SV40)及E10+p117的结果。
图11A和11B是柱状图，示例代表性肽P117-139特异性CTL裂解WT1阳性肿瘤细胞的能力。第3次免疫后3周，用相关肽体外刺激已经用肽p235-243或p117-139接种的小鼠的脾脏细胞，并且检测其裂解与WT1肽温育的靶以及WT1阳性和阴性肿瘤细胞的能力。柱条表示用25∶1的E∶T比率一式三份进行的铬释放测定中的特异性裂解％平均值。如所示，图11A显示了p235-243特异性T细胞系针对：WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)、用相关(用于免疫及用于再刺激)肽p235-243脉冲的EL-4(EL-4+p235)；用无关肽p117-139(EL-4+p117)、p126-134(EL-4+p126)或p130-138(EL-4+p130)脉冲的EL-4和WT1阳性肿瘤细胞BLK-SV40(BLK-SV40，WT1阳性)和TRAMP-C(TRAMP-C，WT1阳性)的细胞毒活性。如所示，图11B显示了p117-139特异性T细胞系针对EL-4、用相关肽P117-139脉冲的EL-4(EL-4+p117)和用无关肽p123-131(EL-4+p123)或p128-136(EL-4+p128)脉冲的EL-4、BLK-SV40和TRAMP-C的细胞毒活性。
图12A和12B是柱状图，示例如冷靶抑制所证明的对WT1阳性肿瘤细胞裂解的特异性。柱条表示用25∶1的E∶T比率一式三份进行的铬释放测定中的特异性裂解％平均值。如所示，图12A显示了p117-139特异性T细胞系针对：WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)、WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C(TRAMP-C，WT1阳性)、与10倍过量(与热靶比较)的用无51Cr标记的相关肽p117-139脉冲的EL-4细胞温育的TRAMP-C细胞(TRAMP-C+p117冷靶)、及与用无51Cr标记的无关肽脉冲的EL-4温育的TRAMP-C细胞(TRAMP-C+无关冷靶)的细胞毒活性。如所示，图12B显示了p117-139特异性T细胞系针对：WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)、WT1阳性肿瘤细胞系BLK-SV40(BLK-SV40，WT1阳性)、与相关冷靶温育的BLK-SV40细胞(BLK-SV40+p117冷靶)和与无关冷靶温育的BLK-SV40细胞(BLK-SV40+无关冷靶)的细胞毒活性。
图13A-13C是柱状图，描述了对在p117-139中的9聚体(mer)CTL表位的评价。对p117-139肿瘤特异性CTL系进行了针对含有或缺乏适合的H-2bI类结合基序的氨基酸117-139中的肽的检测，并且在用p126-134或p130-138进行再刺激之后。柱条表示用25∶1的E∶T比率一式三份进行的铬释放测定中的特异性裂解％平均值。图13A显示p117-139特异性T细胞系针对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)和用肽p117-139(EL-4+p117)、p119-127(EL-4+p119)、p120-128(EL-4+p120)、p123-131(EL-4+p123)、p126-134(EL-4+p126)、p128-136(EL-4+p128)和p130-138(EL-4+p130)脉冲的EL-4细胞的细胞毒活性。图13B显示用p126-134再刺激后CTL系针对WT1阴性细胞系EL-4，用p117-139(EL-4+p117)、p126-134(EL-4+p126)脉冲的EL-4细胞和WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C的细胞毒活性。图13C显示用p130-138再刺激后CTL系针对EL-4、用p117-139(EL-4+p117)、p130-138(EL-4+p130)脉冲的EL-4细胞和WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C的细胞毒活性。
图14描述在患有AML的63名患者中，对WT1的血清抗体反应性。用ELISA评价患有AML的患者中血清抗体对WT1/N-末端蛋白质的反应性。第一和第二条泳道分别表示阳性和阴性对照。将商业购买获得的WT1特异性抗体WT180用于阳性对照。随后的63条泳道表示使用来自于每个患者个体的血清的结果。所示的OD值来自于利用1∶500血清稀释度的ELISA。该图包含来自于3个独立试验的累积数据。
图15描述了在患有AML的2名患者中，对WT1蛋白质和对照蛋白质的血清抗体反应性。用ELISA评价患有AML的2名患者中血清抗体对WT1/全长、WT1N-末端、TRX和Ra12蛋白质的反应性。所示的OD值来自于利用1∶500血清稀释度的ELISA。AML-1和AML-2表示来自图1个体患者中证实具有对WT1/全长的抗体反应性的2名患者的血清。WT1全长蛋白质表达为与Ra12的融合蛋白。WT1/N-末端蛋白质表达为与TRX的融合蛋白。以相似的方式纯化对照Ra12和TRX蛋白质。结果证实针对WT1融合蛋白的血清抗体反应性针对的是蛋白质的WT1部分。
图16描述了在患有CML的81名患者中，对WT1的血清抗体反应性。用ELISA评价患有AML的患者中血清抗体对WT1/全长蛋白质的反应性。第一和第二条泳道分别表示阳性和阴性对照。商购获得的WT1特异性抗体WT180用于阳性对照。随后的81条泳道表示利用来自于每个患者个体的血清的结果。所示的OD值来自于利用1∶500血清稀释度的ELISA。该图包含来自于3个独立试验的累积数据。
图17描述了在患有CML的2名患者中，对WT1蛋白质和对照蛋白质的血清抗体反应性。用ELISA评价患有CML的2名患者中血清抗体对WT1/全长、WT1/N-末端、TRX和Ra12蛋白质的反应性。所示的OD值来自于利用1∶500血清稀释度的ELISA。CML-1和CML-2代表图3个体患者中证明具有对WT1/全长的抗体反应性的2名患者的血清。WT1/全长蛋白质表达为与Ra12的融合蛋白。WT1/N-末端蛋白质表达为与TRX的融合蛋白。以相似的方式纯化对照Ra12和TRX蛋白质。结果证实针对WT1融合蛋白的血清抗体反应性针对的是蛋白质的WT1部分。
图18提供了用于血清学分析的重组WT1蛋白质的特征。
图19A1-19E3是柱状图，描述了通过用不同剂量的WT1蛋白质接种所激发的小鼠中的抗体应答。
图20A和B是用WT1蛋白质免疫的小鼠中增殖性T细胞应答的柱状图。
图21是通过荧光显微镜检查得到的人DC的照片，该人DC在腺病毒WT1和痘苗病毒WT1感染后表达WT1。
图22是证明腺病毒WT1感染后，WT1在人DC中的表达可再现，并且该表达不受对照腺病毒感染所诱导的照片。
图23是IFN-γELISPOT测定的图表，显示WT1完整基因体外致敏激发WT1特异性T细胞应答。
图24显示WT1蛋白质的氨基酸2-281(SEQ ID NO：461)和编码这些氨基酸残基的cDNA(SEQ ID NO：460)。将该截短的WT1蛋白质称为WT1-F。
本发明的详细描述
这里将本说明书中提到和/或申请资料页中列出的美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物整体引入作为参考文献。
如上述，本发明总体涉及用于恶性疾病免疫治疗和诊断的组合物和方法。这里所述的组合物可以包含WT1多肽、WT1多核苷酸、表达WT1多肽的抗原呈递细胞(APC，例如树突细胞)、结合WT1多肽的试剂诸如抗体和/或对WT1特异性的免疫系统细胞(例如T细胞)。本发明的WT1多肽通常包含维尔姆斯(Wilms)瘤基因产物(WT1)或其变异体的至少一部分。本发明的核酸序列通常包含编码这种多肽的全部或一部分的DNA或RNA序列，或与这种序列互补的DNA或RNA序列。抗体通常是免疫系统蛋白质，或其抗原结合片段，其能结合WT1多肽的一部分。这种组合物中可以使用的T细胞通常是对WT1多肽特异性的T细胞(例如，CD4+和/或CD8+)。这里描述的一些方法进一步利用了表达这里所提供的WT1多肽的抗原呈递细胞。
本发明是基于下面的发现：针对维尔姆斯瘤(WT)基因产物(例如，WT1)产生的免疫应答可以给患恶性疾病的患者提供预防和/或治疗的益处，该恶性疾病的特征在于增加的WT1基因表达。这种疾病包括但不限于白血病(例如，急性髓细胞白血病(AML)，慢性髓细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和儿童ALL))及许多癌症诸如肺癌、乳腺癌、甲状腺和胃肠癌和黑色素瘤。WT1基因最初是基于维尔姆斯瘤患者中染色体11p13处的细胞遗传缺失而被鉴定和分离的(参见Ca11等，美国专利号：5,350,840)。该基因由10个外显子组成，并且编码锌指转录因子，在图1和SEQ ID NO：319和320中提供了小鼠和人类WT1蛋白质的序列。
WT1多肽
在本发明的上下文中，WT1多肽是包含如这里所述的天然WT1(即，由未经遗传修饰的生物体表达的WT1蛋白质)或其变异体的至少免疫原性部分的多肽。只要WT1多肽包含天然蛋白质或其变异体的至少免疫原性部分，那么WT1多肽就可以具有任何长度。换而言之，WT1多肽可以是寡肽(即，由相对小数量的通过肽键连接的氨基酸残基，诸如8-10个残基组成)，全长WT1蛋白质(例如，存在于人类或非人类动物诸如小鼠中)或中等大小的多肽。在一些实施方式中，优选使用包含天然WT1多肽的小数目连续氨基酸残基的WT1多肽。在期望产生T细胞应答的一些应用中优选这种多肽。例如，这种WT1多肽可以包含少于23个，优选不超过18个，更优选不超过15个天然WT1多肽的连续氨基酸残基。包含天然WT1多肽的9个连续氨基酸残基的多肽通常适于这种目的。来源于天然蛋白质的其它序列和/或异源序列可以存在于任何WT1多肽中，并且这种序列可以(但不必需)具有进一步的免疫原性或抗原性特性。这里提供的多肽可以进一步连接(共价或非共价地)其它多肽或非多肽化合物。
这里所述的“免疫原性部分”是被B细胞和/或T细胞表面抗原受体所识别(即，特异性结合)的多肽的一部分。一些优选的免疫原性部分结合于MHCI类或II类分子。如这里所述的，如果利用本领域已知的任何测定法可检测到这种结合，免疫原性部分就被称为“结合”MHCI类或II类分子。例如，通过监测促进125I标记的β2-微球蛋白(β2m)掺入到MHCI类/β2m/肽异源三聚体复合物中的能力可以间接地评价多肽结合MHCI类的能力(参见，例如Parker等，J.Immunol.152：163，1994)。作为可替代的方案，可以使用本领域已知的功能性肽竞争测定法。一些免疫原性部分具有一条或多条在表II-XIV中一个或多个表中所述的序列。代表性的免疫原性部分包括但不限于RDLNALLPAVPSLGGGG(人类WT1残基6-22；SEQ ID NO：1)、PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(人类和小鼠WT1残基117-139；分别是SEQ ID NO：2和3)、GATLKGVAAGSSSSVKWTE(人类WT1残基244-262；SEQ ID NO：4)、GATLKGVAA(人类WT1残基244-252；SEQ ID NO：88)、CMTWNQMNL(人类和小鼠WT1残基235-243；分别是SEQ ID NO：49和258)、SCLESQPTI(小鼠WT1残基136-144；SEQ ID NO：296)、SCLESQPAI(人类WT1残基136-144；SEQ ID NO：198)、NLYQMTSQL(人类和小鼠WT1残基225-233；分别是SEQ ID NO：147和284)、ALLPAVSSL(小鼠WT1残基10-18；SEQ ID NO：255)、RMFPNAPYL(人类和小鼠WT1残基126-134；分别是SEQ ID NO：185和293)、VLDFAPPGA(人类WT1残基37-45；SEQ ID NO：241)、或VLDFAPPGAS(人类WT1残基37-46；SEQ ID NO：411)。在SEQ ID NO：414-451中提供了其它的免疫原性部分。这里提供了其它的免疫原性部分，并且可以用公知技术，诸如Paul，Fundamental Immunology，第三版，243-247(Raven Press，1993)和其中引用的参考文献中概述的技术常规性地鉴定其它免疫原性部分。鉴定免疫原性部分的代表性技术包括筛选多肽与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。天然WT1多肽的免疫原性部分是以基本不低于于全长WT1反应性的水平与这种抗血清和/或T细胞反应(例如，在ELISA和/或T细胞反应性测定中)的部分。换而言之，免疫原性部分可以在这种测定中以与全长多肽反应性相似或比其高的水平反应。通常，可以利用本领域普通技术人员公知的方法，诸如Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988中所述的方法进行这种筛选。
作为可替代的方案，可以利用计算机分析，诸如Tsites程序(参见Rothbard和Taylor，EMBO J.7：93-100，1988；Deavin等，Mol.Immunol.33：145-155，1996)鉴定免疫原性部分，该程序检索有潜能激发Th应答的肽基序。可以根据BIMAS(Parker等，J.Immunol.152：163，1994)和其它HLA肽结合预测分析法鉴定带有适于结合鼠和人类的I类或II类MHC的基序的CTL肽。作为可替代的方案，通过利用确定的肽结合基序诸如Rammensee等，Immunogenetics41：178-228，1995中描述的那些，可以鉴定与特定MHC分子结合的免疫原性部分。为了证实肽与鼠和人类的I类或II类MHC分子结合，可以使用本领域已知的肽结合测定法。为了证实免疫原性，可以利用HLA A2或其它转基因小鼠模型和/或利用树突细胞、成纤维细胞或外周血细胞的体外刺激分析来检测肽。
如上述，组合物可以包含天然WT1蛋白质的变异体。这里所述的多肽“变异体”是由于一个或多个置换、缺失、添加和/或插入而与天然多肽不同的多肽，使得保留了多肽的免疫原性(即，相对于天然多肽，变异体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力基本上没有被降低)。换而言之，相对于天然多肽，变异体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力可以被增强或不变，或者相对于天然多肽，可以被减少小于50％，优选小于20％。在一个实施方式中，相对于天然多肽，变异体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力可以被减少小于10％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％。通常，通过修饰一条上述多肽序列和评价修饰的多肽与这里所述的抗血清和/或T细胞的反应性可以鉴定这种变异体。在本发明的一个实施方式中，可以通过评价变异体结合人类或鼠HLA分子的能力鉴定变异体。在一个优选的实施方式中，变异体多肽具有修饰，使得相对于野生型(未修饰的)WT1多肽，变异体多肽结合I类或II类MHC分子的能力提高，所述MHC分子例如HLA-A2、HLA-A24、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A68、HLA-A11、HLA-A31、HLA-A33、HLA-B14、HLA-B40、HLA-B60、HLA-B62、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B3501、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B44、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B58、HLA-CW03、HLA-CW04、HLA-CW06或HLA-CW07的能力。在其它的实施方式中，修饰了氨基酸1-281的WT1的N-末端部分，使得相对于野生型(未修饰的)WT1多肽序列，其中任意数目的多肽可以结合HLA-A2、HLA-A24、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A68、HLA-A11、HLA-A31、HLA-A33、HLA-B14、HLA-B40、HLA-B60、HLA-B62、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B3501、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B44、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B58、HLA-CW03、HLA-CW04、HLA-CW06或HLA-CW07的能力提高。在其它的实施方式中，包含至少一个免疫原性部分(表位)的多肽经修饰，以增加它结合MHC分子诸如HLA-A2、HLA-A24、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A68、HLA-A11、HLA-A31、HLA-A33、HLA-B14、HLA-B40、HLA-B60、HLA-B62、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B3501、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B44、HLA-B51、HLA-B52、HLA-B58、HLA-CW03、HLA-CW04、HLA-CW06或HLA-CW07的能力。实施例30描述了可以产生的示例性变异体。本领域技术人员容易认识到这些是示例性变异体，对于结合除了HLA-A2外的其它HLA分子的肽而言，可以用相似的方式产生其它变异体。在进一步的实施方式中，相对于天然WT1多肽，变异体多肽结合HLA分子的能力增加了至少2倍，优选至少3倍、4倍或5倍。在本发明范围中已经发现在WT1多肽的免疫原性部分中相对小数量的置换(例如，1到3个)可以用于增强多肽激发免疫应答的能力。如上述，通常可以利用如前所述的计算机程序鉴定适合的置换，并如这里所述根据修饰的多肽与抗血清和/或T细胞的反应性证实效果。因此，在一些优选的实施方式中，WT1多肽包含在免疫原性部分中有1到3个氨基酸残基被置换的变异体，使其与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力在统计学上大于未修饰多肽。优选，这种置换位于可以如上所述被鉴定的多肽的MHC结合位点中。优选的置换能增加与MHCI类或II类分子的结合。
一些变异体含有保守性置换。“保守性置换”是氨基酸被置换成具有相似特性的另一种氨基酸的置换，这样肽化学领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲水(hydropathic)性质基本上保持不变。通常可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质进行氨基酸的置换。例如，带负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；和丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守性改变的其它组氨基酸包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变异体也可以或者可替代地含有非保守性改变。例如，也可以(或可替代地)通过氨基酸的缺失或添加修饰变异体，该氨基酸对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最小的影响。
在优选的实施方式中，构建WT1 N-末端(氨基酸1-249)的变异体多肽，其中该变异体多肽能与识别全长WT1和/或WT1 N-末端多肽的抗体结合。抗体的非限制性例子是抗WT1抗体WT180(Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)。
如上述，WT1多肽在蛋白质N-末端可以缀合共翻译或翻译后地引导蛋白质转移的信号(或前导)序列。多肽也可以或可替代地缀合接头或其它序列以易于多肽的合成、纯化或鉴定(例如，聚-His)或增强多肽与固体支持体结合。例如，多肽可以缀合于免疫球蛋白的Fc区。
可以利用各种公知技术中的任何一项技术制备WT1多肽。可以容易地从多核苷酸制备这里所述WT1多核苷酸所编码的重组多肽。通常，本领域普通技术人员已知的各种表达载体中的任何一种表达载体都可以用于表达重组WT1多肽。在任何已经被表达载体转化或转染的适合宿主细胞中可以获得表达，所述表达载体含有编码重组多肽的DNA分子。适合的宿主细胞包括原核生物、酵母和高级真核生物细胞。优选，使用的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)、酵母或哺乳动物细胞系诸如COS或CHO。可以使用商购过滤器，首先浓缩来源于适合宿主/载体系统的上清液，该宿主/载体系统向培养基中分泌重组蛋白质或多肽。然后，将浓缩物应用于适合的纯化基质诸如亲和性基质或离子交换树脂。最后，可以使用一步或多步反相HPLC步骤进一步纯化重组多肽。可以使用这种技术以制备天然多肽或其变异体。例如，利用标准诱变技术，诸如寡核苷酸定点特异性诱变通常可以制备编码天然多肽变异体的多核苷酸，并且可以清除DNA部分以允许制备截短多肽。
利用本领域普通技术人员公知的技术，通过合成方法也可以产生某些部分和其它变异体。例如，可以合成具有少于约500个氨基酸，优选少于约100个氨基酸，更优选少于约50个氨基酸的多肽。利用任何一种商购的固相支持体技术，诸如Merrifield固相支持体合成方法可以合成多肽，在该合成方法中，顺序地向生长的氨基酸链中添加氨基酸。参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963。可以从供应商诸如Applied BioSystems，Inc.(Foster City，CA)商购得到用于多肽自动合成的设备，并且可以根据制造商的说明书操作该设备。
一般地，这里所述的多肽和多核苷酸是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是从其原始环境中被移除出来的多肽或多核苷酸。例如，如果天然存在的蛋白质与天然系统中一些或所有的共存物质分离开，那么该天然存在的蛋白质就是分离的。优选，这种多肽具有至少约90％纯度，更优选至少约95％纯度，最优选至少约99％纯度。例如，如果多核苷酸被克隆到不是其天然环境一部分的载体中，那么就认为该多核苷酸是分离的。
在进一步的方面中，本发明提供了WT1多肽的模拟物。这种模拟物可以包含连接一个或多个氨基酸模拟物的氨基酸(即，可以用氨基酸模拟物置换WT1蛋白质中一个或多个氨基酸)或者可以是完整的非肽模拟物。氨基酸模拟物是与氨基酸构象相似的化合物，因此它可以置换WT1多肽中氨基酸，而基本上不降低与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。非肽模拟物是不含氨基酸的化合物，并且具有与WT1多肽相似的全部构象，这样相对于WT1多肽，模拟物与WT1特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力基本上没有被降低。基于评价肽序列三维结构的标准技术(例如，核磁共振技术和计算机技术)可以设计这种模拟物。可以设计这样的模拟物：其中用不必具有相同大小或体积，但是具有产生相似生物学应答的相似化学和/或物理特性的基团取代WT1多肽一个或多个侧链官能团。应该理解在这里所述实施方式中，模拟物可以代替WT1多肽。
在其它示例性实施方式中，多肽可以是包含这里所述多个多肽的融合多肽，或者是包含至少一种这里所述多肽和无关序列诸如已知的肿瘤蛋白质的多肽。例如，融合伴侣可以有助于提供T辅助表位(免疫融合伴侣)，优选人类识别的T辅助表位，或者可以有助于以比天然重组蛋白质更高的产量表达蛋白质(表达增强剂)。一些优选的融合伴侣是兼具免疫和表达增强性的融合伴侣。可以选用其它融合伴侣以增加多肽的溶解性或使多肽能够被靶向期望的细胞内区室。其它进一步的融合伴侣包括亲和标记物，其方便多肽的纯化。
通常可以使用标准技术包括化学缀合制备融合多肽。优选融合多肽表达为重组多肽，以在表达系统中相对于非融合多肽具有增加水平的产量。简而言之，可以单独装配编码多肽组分的DNA序列，并且将其连接到适合的表达载体中。用或不用肽接头，将编码一种多肽组分的DNA序列的3’末端连接到编码第二种多肽组分的DNA序列的5’末端，使序列的阅读框同相。这允许翻译为保留两种组分多肽的生物学活性的单一融合多肽。
可以使用肽接头序列以将第一种多肽组分和第二种多肽组分隔开一段距离，该段距离足以确保每种多肽都折叠为其二级和三级结构。利用本领域已知的标准技术将这种肽接头序列掺入到融合多肽中。可以根据下面的因素选择适合的肽接头序列：(1)它们接纳柔性延伸构象的能力；(2)它们不能接纳可以与第一种和第二种多肽上功能性表位相互作用的二级结构的能力；和(3)缺少可能与多肽功能性表位反应的疏水性或带电荷残基。优选的肽接头序列包含Gly、Asn和Ser残基。其它接近中性的氨基酸，诸如Thr和Ala也可以用在接头序列中。可以被有用地用作接头的氨基酸序列包括Maratea等，Gene 40：39-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：8258-8262，1986；美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180中公开的氨基酸序列。接头序列一般可以是1到约50个氨基酸的长度。当第一种和第二种多肽具有可以用于隔开功能性结构域和防止空间位阻的非必需N-末端氨基酸区域时，就不需要接头序列。
连接的DNA序列可操作地连接适合的转录或翻译调节元件。负责DNA表达的调节元件只位于编码第一种多肽的DNA序列5’端。相似地，终止翻译需要的终止密码子和转录终止信号只存在于编码第二种多肽的DNA序列3’端。
融合多肽可以包含这里所述的多肽及无关的免疫原性蛋白质，诸如能激发记忆应答的免疫原性蛋白质。这种蛋白质的例子包括破伤风、肺结核和肝炎蛋白质(参见，例如Stoute等，New Engl.J.Med.，336：86-91，1997)。
在一个优选的实施方式中，免疫融合伴侣来源于分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)，诸如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)来源的Ra12片段。美国专利申请60/158,585中描述了Ra12组合物和它们用于增加异源多核苷酸/多肽序列表达和/或免疫原性的方法，这里将这篇文献整体引入作为参考文献。简而言之，Ra12指是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)MTB32A核酸亚序列的多核苷酸区域。MTB32A是由强毒和无毒株系结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的基因编码的32KD分子量的丝氨酸蛋白酶。已经描述了MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列(例如，美国专利申请60/158,585；也参见Skeiky等，Infection and Immun.(1999)67：3998-4007，这里将这篇文献引入作为参考文献)。MTB32A编码序列的C-末端片段以高水平表达，并且在整个纯化过程中保持为可溶性多肽。而且，Ra12可以增强与其融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。一种优选的Ra12融合多肽包含对应于MTB32A氨基酸残基192-323的14KD C-末端片段。其它优选的Ra12多核苷酸通常包含编码一部分Ra12多肽的至少约15个连续核苷酸，至少约30个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约200个核苷酸，或至少约300个核苷酸。Ra12多核苷酸可以包含天然序列(即，编码Ra12多肽或其部分的内源序列)，或者可以包含这种序列的变异体。Ra12多核苷酸变异体可以包含一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，这样相对于包含天然Ra12多肽的融合多肽，编码的融合多肽生物学活性基本上没有被降低。优选变异体显示与编码天然Ra12多肽或其部分的多核苷酸序列具有至少约70％一致性，更优选至少约80％一致性和最优选至少约90％一致性。
在其它优选的实施方式中，免疫融合伴侣来源于蛋白质D，该蛋白为革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenza B)的表面蛋白质(WO 91/18926)。优选，蛋白质D衍生物包含约三分之一蛋白质(例如，N-末端的头100-110个氨基酸)，并且蛋白质D衍生物可以被脂质化。在一些优选的实施方式中，脂蛋白D融合伴侣的头109个残基包含在N-末端上以提供具有另外外源T细胞表位的多肽和增加在大肠杆菌(E.coli)中的表达水平(功能相当于表达增强子)。脂质尾部确保抗原最佳呈递给抗原呈递细胞。其它融合伴侣包括来源于流感病毒的非结构蛋白质—NS1(血凝素)。尽管可以使用包含T辅助表位的不同片段，但是通常使用N-末端的81个氨基酸。
在另一个实施方式中，免疫融合伴侣是称为LYTA的蛋白质或其一部分(优选C-末端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，其合成称为酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码：Gene 43：265-292，1986)。LYTA是特异性降解肽聚糖骨架中一些键的自溶酶。LYTA蛋白质C-末端结构域负责对胆碱或一些胆碱类似物诸如DEAE的亲和性。已经利用这种性质开发了用于表达融合蛋白的大肠杆菌(E.coli)C-LYTA表达质粒。已经描述了在氨基末端含有C-LYTA片段的杂合蛋白质的纯化(参见Biotechnology10：795-798，1992)。在优选的实施方式中，LYTA的重复部分可以被掺入到融合多肽中。在开始于残基178的C-末端区域中发现了重复部分。特别优选的重复部分包含残基188-305。
在另一个示例性实施方式中，融合伴侣N-末端上包含来源于大肠杆菌(E.coli)中TorA信号肽的双精氨酸转运(TAT)信号肽；参见J.Mol.Microbiol.(2000)2(2)：179-189；Journal ofBacteriology，2001年1月，604-610页，183卷，2期；Journal ofBiochemistry 276卷，2001年3月16日，8159-8164页，这里将这篇文献的整体引入作为参考文献。
然而，另一个示例性实施方式涉及融合多肽和编码它们的多核苷酸，如美国专利号5,633,234中所述，其中融合伴侣包含能将多肽引导到内体/溶酶体区室的靶向信号。本发明的免疫原性多肽与该靶向信号融合时，它将更有效地结合MHC II类分子，据此提供了对该多肽特异性的增强的体内CD4+T细胞刺激。
本发明提供截短形式的WT1多肽，其能在大肠杆菌(E.coli)中被重组表达，而不添加融合伴侣。这些截短形式的例子如SEQ ID NO：342-346中所示，并且被SEQ ID NO：337-341中所示的多核苷酸编码。在多种截短形式中，WT1的头76个氨基酸可以与蛋白质的C-末端融合，产生更容易在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组蛋白。除了大肠杆菌(E.coli)外，也可以使用其它宿主，诸如，例如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。可以进一步制备没有组氨酸标记的蛋白质。
在其它实施方式中，可以制备不同亚基，并且按照不同于天然WT1顺序的顺序将该不同亚基融合在一起。此外，可以制备具有例如Ra12的融合。在SEQ ID NO：332-336中示出了示例性融合蛋白，并且SEQID NO：327-331中所示的多核苷酸可以编码该融合蛋白。
WT1多核苷酸
这里所述的编码WT1多肽的任何多核苷酸是本发明所包括的WT1多核苷酸。这种多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是(基因组、cDNA或合成的)DNA或RNA分子。其它编码或非编码序列可以但不是必需存在于本发明多核苷酸中，并且多核苷酸可以但不是必需连接其它分子和/或支持材料。
WT1多核苷酸可以编码天然WT1蛋白质，或者可以编码这里所述的WT1变异体。多核苷酸变异体可以含有一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，相对于天然WT1蛋白质，其编码多肽的免疫原性没有被降低。通常可以如这里所述评价对所编码多肽的免疫原性的作用。优选的变异体在不超过20％，优选在不超过10％核苷酸位置中含有核苷酸置换、缺失、插入和/或添加，所述核苷酸位置编码天然WT1序列的免疫原性部分。一些变异体基本上与天然基因或其部分同源。这种多核苷酸变异体能在中等严格条件下与天然存在的编码WT1多肽的DNA序列(或其互补序列)杂交。适合的中等严格条件包括在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)溶液中预冲洗；在50℃-65℃，5XSSC中过夜杂交；接着用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC中的每一种在65℃冲洗2次20分钟。这种杂交DNA序列也在本发明范围内。
本领域普通技术人员可以理解，作为密码子简并的结果，存在许多编码WT1多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些多核苷酸与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。虽然如此，本发明也具体考虑了由于密码子使用差异而有所不同的多核苷酸。
因此，根据本发明的另一方面，提供了多核苷酸组合物，其包含这里所述的一些或所有多核苷酸序列，这里所述的多核苷酸序列的互补序列和这里所述的多核苷酸序列的简并变异体。在一些优选的实施方式中，这里所述的多核苷酸序列编码上述免疫原性多肽。
一旦鉴定了上述WT1免疫原性部分，可以利用各种技术中任何一种技术制备WT1多核苷酸。例如，可以从由表达WT1的细胞制备的cDNA扩增WT1多核苷酸。可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增这种多核苷酸。对于这种方法，可以根据免疫原性部分序列设计序列特异性引物，并且可以购买或合成该序列特异性引物。例如，用于人类WT1基因PCT扩增的适合引物包括：第一步-P118：1434-1414：5′GAG AGT CAGACT TGA AAG CAGT 3′(SEQ ID NO：5)和P135：5′CTG AGC CTC AGC AAATGG GC 3′(SEQ ID NO：6)；第二步-P136：5′GAG CAT GCA TGG GCT CCGACG TGC GGG 3′(SEQ ID NO：7)和P137：5′GGG GTA CCC ACT GAACGG TCC CCG A 3′(SEQ ID NO：8)。用于小鼠WT1基因PCR扩增的引物包括：第一步-P138：5′TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3′(SEQ IDNO：9)和P139：5′GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3′(SEQ ID NO：10)，第二步-P140：5′GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3′(SEQ IDNO：11)和P141：5′GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3′(SEQID NO：12)。
然后，利用公知的技术，扩增的部分可以随后用于从人类基因组DNA文库或从适合的cDNA文库中分离全长基因。作为可替代的方案，可以从多个PCR片段构建全长基因。也可以通过合成寡核苷酸组分，并且将这些组分连接在一起以产生完整的多核苷酸来制备WT1多核苷酸。
也可以通过本领域已知的任何方法，包括化学合成(例如，固相亚磷酰胺化学合成)合成WT1多核苷酸。也可以利用标准诱变技术诸如寡核苷酸定点特异性诱变向多核苷酸序列中引入修饰(参见Adelman等，DNA 2：183，1983)。作为可替代的方案，只要DNA被掺入到具有适合RNA聚合酶启动子(诸如T7或SP6)的载体中，就可以通过体外或体内转录编码WT1多肽的DNA序列产生RNA分子。某些部分可以用于制备这里所述编码的多肽。此外，或者作为可替代方案，可以向患者给药一个部分，以使体内产生其编码的多肽(例如，用编码WT1多肽的cDNA构建体转染抗原呈递细胞诸如树突细胞，并且向患者给药转染的细胞)。
编码WT1多肽的多核苷酸通常可以用于在体外或体内产生多肽。与编码序列互补的WT1多核苷酸(即，反义多核苷酸)也可以用作探针或用于抑制WT1表达。可以被转录为反义RNA的cDNA构建体也可以被导入到组织细胞中以便于产生反义RNA。
可以进一步修饰任何多核苷酸以增加体内稳定性。可能的修饰包括但不限于在5’和/或3’末端添加侧翼序列；在骨架中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶键；和/或包含非传统的碱基诸如肌苷、2-硫代胞苷(queosine)和3-(3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷(wybutosine)及乙酰基-甲基-、硫代-和其它修饰形式的腺嘌呤、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶核苷。
利用已确定的重组DNA技术，这里所述的核苷酸序列可以连接各种其它的核苷酸序列。例如，多核苷酸可以克隆到包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和粘粒在内的各种克隆载体中的任一种克隆载体中。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。一般地，载体将含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择性标记。其它的元件将依赖于期望的用途，并且对于本领域普通技术人员显而易见。特别地，本发明的一个实施方式包括以可操作连接(即，“可操作地连接”)表达控制序列(启动子)的方式掺入本发明核酸分子的表达载体。示例性载体包括但不限于这里的实施例20和40中所描述的载体。就细胞转化或转染以产生编码目的分子的真核生物细胞系或原核生物细胞系而言，痘苗病毒或减毒病毒载体的构建是本领域公知的。这种方法中可以使用的宿主细胞例子是COS细胞、CHO细胞、酵母细胞、昆虫细胞(例如，草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)或Sf-9细胞)、NIH3T3细胞等。也可以使用原核生物细胞诸如大肠杆菌(E.coli)和其它细菌。
在一些实施方式中，可以配制多核苷酸以允许其进入到哺乳动物细胞中，并且在其中表达。如下所述，这种制剂在用于治疗目的时特别有用。本领域普通技术人员已知有许多实现在靶细胞中表达多核苷酸的方法，并且可以使用任何适合的方法。例如，多核苷酸可以被掺入到病毒载体诸如，但不限于腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒或痘苗或其它痘病毒(例如，禽痘病毒)中。将DNA掺入到这种载体中的技术是本领域普通技术人员公知的。逆转录病毒载体还可以转移或掺入选择性标记基因(以有助于转导细胞的鉴定和筛选)和/或靶向部分，诸如编码特异性靶细胞上配体或受体的基因以使载体靶向具有特异性。使用抗体，用本领域普通技术人员已知的方法也可以完成靶向。例如，这种载体中cDNA构建体可以用于转染人类或动物细胞系，以用于建立WT1阳性肿瘤模型，该模型可以用于进行肿瘤保护和过继免疫治疗试验以证明对肿瘤或白血病生长的抑制或这种细胞的裂解。
其它的多核苷酸治疗制剂包括胶体分散系统诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、小珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、微胶粒、混合微胶粒和脂质体。用作体外和体内递送载体的优选胶体系统是脂质体(即，人工膜泡囊)。这种系统的制备和用途是本领域公知的。
抗体组合物、其片段和其它结合剂
根据另一方面，本发明进一步提供了结合剂，诸如抗体和其抗原结合片段，其显示了对这里所公开的WT1多肽或其部分、其变异体或衍生物的免疫性结合。如果抗体或其抗原结合片段以可检测的水平与多肽反应(例如，在ELISA测定中)，并且在相似条件下不与无关多肽可检测地反应，那么就称之为“特异性结合”、“免疫性结合”本发明的WT1多肽和/或与本发明的WT1多肽发生“免疫反应”。
如该范围中使用的免疫性结合一般指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白特异的抗原之间发生的非共价相互作用类型。可以用相互作用的解离常数(Kd)表示免疫结合相互作用的强度或亲和性，其中Kd值越小，亲和性越大。可以用本领域公知的方法定量所选用的多肽的免疫性结合的特性。一种这样的方法需要测定抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物伴侣的浓度、相互作用的亲和性和同样地影响两个方向速率的几何参数。因此，通过计算结合和解离的浓度和实际速率可以确定“打开速率常数(on rate constant(Kon))”和“关闭速率常数(off rate constant(Koff))”。Koff/Kon比率能取消与亲和性无关的所有参数，因此对于解离常数Kd也是一样的。通常参见Davies等(1990)Annual Rev.Biochem.59：439-473。
抗体的“抗原结合位点”或“结合部分”指参与抗原结合的免疫球蛋白分子部分。通过重(“H”)和轻(“L”)链N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成抗原结合位点。重和轻链V区中3个高度不同的序列段称为“高变区”，其置于称为“框架区”或“FR”的多个保守性侧翼序列之间。术语“FR”指邻近免疫球蛋白中高变区之间天然发现的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的3个高变区和重链的3个高变区相互相对设置在三维空间中以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且每条重和轻链的3个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。
利用这里提供的代表性测定法，结合剂可以进一步能够区分有和无WT1相关癌症的患者。例如，结合肿瘤蛋白质的抗体或其它结合剂将优选产生信号，该信号表明至少约20％患有疾病的患者，更优选至少约30％的患者中存在癌症。作为可替代的方案或者此外，抗体将产生阴性信号，该阴性信号表明至少约90％无癌症的个体中不存在疾病。为了检测是否结合剂满足这种要求，可以如这里所述，测定来源于有和无癌症的患者(如利用标准临床检测所确定的)的生物样品(例如，血液、血清、唾液、尿和/或肿瘤活检)中是否存在与结合剂结合的多肽。优选，将测定统计学显著性数目的有和无疾病的样品。每种结合剂应该满足上述标准；然而，本领域普通技术人员将认识到可以组合使用结合剂以改进敏感性。
满足上述要求的任何试剂可以是结合剂。例如，结合剂可以是有或无肽组分的核糖体、RNA分子或多肽。在优选的实施方式中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。可以用本领域中普通技术人员已知的各种技术中任何一种技术制备抗体。参见，例如Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。通常，可以通过细胞培养技术产生抗体，包括产生这里所述的单克隆抗体，或者通过抗体基因转染到适合的细菌或哺乳动物细胞宿主中以允许重组抗体产生来产生抗体。在一项技术中，包含多肽的免疫原最初被注射到各种哺乳动物中任何一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔子、绵羊或山羊)中。在该步骤中，本发明的多肽可以用作无修饰的免疫原。作为可替代的方案，特别是对于相对短的多肽，如果多肽连接载体蛋白诸如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白，那么就可以激发超免疫应答。优选根据预定的包含一次或多次加强免疫的进度表，将免疫原注射到动物宿主中，并且周期性地从动物取血。然后，例如，通过利用偶联适合固相支持体的多肽的亲和层析从这种抗血清中纯化对该多肽特异的多克隆抗体。
例如，利用Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519，1976的技术和对其加以改进的技术可以制备对目的抗原多肽特异的单克隆抗体。简而言之，这些方法包括能产生具有期望特异性(即，与目的多肽的反应性)抗体的无限增殖细胞系的制备。例如，可以从获自上述免疫动物的脾脏细胞产生这种细胞系。然后，例如通过与骨髓瘤细胞融合伴侣融合，优选该融合伴侣与免疫动物是同源的，所述脾脏细胞被无限增殖化。可以使用各种融合技术。例如，脾脏细胞和骨髓瘤细胞可以与非离子型洗涤剂混合几分钟，然后以低密度将它们放置在支持杂交细胞生长而不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。优选的筛选技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)筛选。足够的时间，通常约1到2周后，观察杂交细胞集落。选定单个集落，并且检测它们的培养上清针对多肽的结合活性。具有高度反应性和特异性的杂交瘤是优选的。
可以从生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，可以使用各种技术，诸如将杂交瘤细胞系注射到适当的脊椎动物如小鼠的腹腔中增加产量。然后，可以从腹水液或血液中收集单克隆抗体。可以用常规技术诸如层析、凝胶过滤、沉淀和提取从抗体中清除杂质。本发明的多肽可以用在纯化过程中，例如亲和层析步骤中。
本领域已知大量对治疗有用的分子，其包含能显示抗体分子免疫结合特性的抗原结合位点。蛋白酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，其中的两个片段(“F(ab)”片段)分别含有共价异源二聚体，该共价异源二聚体包含完整的抗原结合位点。酶-胃蛋白酶能切割IgG分子以提供几个片段，包括含有两个抗原结合位点的“F(ab)2”片段。通过优先蛋白酶解切割IgM，很少地蛋白酶解切割IgG或IgA免疫球蛋白分子可以产生“Fv”片段。然而，更常利用本领域已知的重组技术获得Fv片段。Fv片段包含非共价VH∷VL异源二聚体，该异源二聚体包含抗原结合位点，该抗原结合位点保留了天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力。Inbar等，(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69：2659-2662；Hochman等，(1976)Biochem 15：2706-2710；和Ehrlich等，(1980)Biochem 19：4091-4096。
单链Fv(“sFv”)多肽是由基因融合表达的共价连接的VH∷VL异源二聚体，该基因融合包含肽编码接头连接的VH-和VL-编码基因。Huston等，(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85(16)：5879-5883。已经描述了识别化学结构的大量方法，该化学结构用以将天然聚集的，但是化学分离的来源于抗体V区的轻和重多肽链转换成sFv分子，其将折叠成三维结构，该三维结构与抗原结合位点结构基本相似。参见，例如Huston等，美国专利号5,091,513和5,132,405；和Ladner等，美国专利号4,946,778。
上述每种分子都含有分别置于重链和轻链FR组之间的重链和轻链CDR组，该重链和轻链FR组提供对CDR的支持和限定CDR相互之间的空间关系。这里所述的术语“CDR组”指重或轻链V区的3个高变区。由重或轻链N-末端产生的这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包含6个CDR，该6个CDR包含来源于每个重和轻链V区的CDR组。包含单个CDR(例如CDR1、CDR2或CDR3)的多肽这里称为“分子识别单位”。大量抗原-抗体复合物的晶体学分析证明CDR的氨基酸残基形成了与结合抗原的广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3的抗原接触。因此，分子识别单位主要负责抗原结合位点的特异性。
这里所述的术语“FR组”指4个侧翼氨基酸序列，其构成重或轻链V区CDR组的CDR的框架。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR，特别是直接邻近CDR的FR残基主要负责将V区折叠成抗原结合位点。在FR中，一些氨基酸残基和一些结构特征是非常高度保守的。在这方面，所有V区序列都含有约90个氨基酸残基的内部二硫化物环。当V区折叠成结合位点时，CDR显示为形成抗原结合表面的突出环基序。通常知道存在FR保守性结构区，其影响CDR环折叠成某些“规范”结构的折叠形状，而精确的CDR氨基酸序列与之无关。而且，已知一些FR残基参与稳定抗体重和轻链相互作用的非共价结构域间的接触。
描述了包含来源于非人类免疫球蛋白的抗原结合位点的大量“人源化”的抗体分子，包括嵌合抗体，其具有与人类恒定结构域融合的啮齿动物V区和与之相关的CDR(Winter等.(1991)Nature 349：293-299；Lobuglio等.(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224；Shaw等，(1987)J Immunol.138：4534-4538；和Brown等.(1987)Cancer Res.47：3577-3583)，在与适合的人类抗体恒定结构域融合前移植到人类支架FR中的啮齿动物CDR(Riechmann等.(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等.(1988)Science 239：1534-1536；和Jones等.(1986)Nature 321：522-525)，和由重组镶饰的啮齿动物FR支持的CDR(欧洲专利公开号519,596，1992年12月23日公开)。设计这些“人源化”分子以最小化对啮齿动物抗人类抗体分子的不希望的免疫应答，该不希望的免疫应答限制了在人类接受者中应用这些部分进行治疗的耐久性和有效性。
这里所述的术语“镶饰的FR”和“重组镶饰的FR”指用人类FR残基选择性置换例如啮齿动物重或轻链V区FR残基以提供包含抗原结合位点的异种(Xenogeneic)分子，该异种分子基本保留了所有天然FR多肽的折叠结构。镶饰技术是基于这样的理解：抗原结合位点的配体结合特征主要由抗原结合表面中重和轻链CDR组的结构和相对位置决定。Davies等.(1990)Ann.Rev.Biochem.59：439-473。因此，只有在小心地维持CDR结构、它们之间相互作用和它们与V区结构域其余部分相互作用的人源化抗体中才可以保持抗原结合特异性。通过使用镶饰技术，用人类残基选择性置换免疫系统容易遇到的外部(例如，溶剂易接近的)FR残基以提供包含弱免疫原性或基本上无免疫原性镶饰表面的杂合分子。
镶饰方法利用了Kabat等编辑的可得到的人类抗体可变结构域序列数据，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，(U.S.Dept.of Health and Human Services，U.S.GovernmentPrinting Office，1987)中对Kabat数据库和其它可得到的美国和外国数据库(核酸和蛋白质)进行了更新。从已知的人类和鼠抗体片段三维结构可以推论出V区氨基酸的溶剂易接近性。在镶饰鼠抗原结合位点中存在两步通用的步骤。最初，比较目的抗体分子可变结构域的FR和获自上述鉴定来源的人类可变结构域相应的FR序列。然后残基对残基地比较最同源的人类V区和相应的鼠氨基酸残基。利用本领域公知的重组技术，用人类部分中存在的残基置换不同于人类配对物的鼠FR中的残基。只对至少部分地被暴露(溶剂易接近的)的部分进行残基转换，并且要小心进行对V区结构域三级结构具有重要影响的氨基酸残基置换，诸如所述氨基酸是脯氨酸、甘氨酸和带电荷氨基酸。
在这个方法中，所得到的“镶饰的”鼠抗原结合位点由此被设计成保留有鼠CDR残基、基本邻近CDR的残基、鉴定为埋入或多半埋入的残基(溶剂易接近的)、认为参与重和轻链结构域之间非共价(例如，静电和疏水性)接触的残基、认为影响CDR环“规范的”三级结构的来源于FR保守性结构域的残基。然后，将这些设计标准用于制备重组核苷酸序列，该重组核苷酸序列将鼠抗原结合位点的重和轻链的CDR组合到人类出现的FR中，该重组核苷酸序列可以用于转染哺乳动物细胞以表达显示鼠抗体分子抗原特异性的重组人类抗体。
在本发明的另一个实施方式中，本发明的单克隆抗体可以偶联一种或多种治疗剂。在这方面适合的治疗剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素和其衍生物。优选的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。优选的药物包括氨甲蝶呤和嘧啶和嘌呤类似物。优选的分化诱导剂包括佛波酯和丁酸。优选的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素和白树素(gelonin)。假单胞杆菌属(Pseudomonas)外毒素、志贺氏菌属(Shigella)毒素和商陆抗病毒蛋白质。
治疗剂可以直接或间接地(例如，通过接头基团)偶联(例如，共价结合)到适合的单克隆抗体上。当治疗剂和抗体分别具有能相互反应的取代基时，它们之间的直接反应是可能的。例如，一个上的亲核基团诸如氨基或巯基能与另一个上含有羰基的基团诸如酐或卤化酰基，或者与含有好的离去基团(例如卤化物)的烷基反应。
作为可替代的方案，期望通过接头基团偶联治疗剂和抗体。接头基团可以起间隔区的作用以间隔开抗体和治疗剂，以避免对结合能力的干扰。接头基团也可以用来增加治疗剂或抗体上取代基的化学反应性，据此增加偶联效率。化学反应性的增加也可以有利于治疗剂或治疗剂上的官能团的使用，反之将是不可能的。
本领域技术人员显而易见可以使用各种双功能或多功能试剂作为接头基团，其可以是同官能的或杂官能的(诸如Pierce Chemical Co.，Rockford，IL的目录中所述的试剂)。例如，通过氨基、羧基、巯基或氧化的碳水化合物残基可以实现偶联。有描述这种方法学的大量参考文献，例如Rodwell等，美国专利号4,671,958。
当治疗剂无本发明免疫缀合物抗体部分时更有效的情况下，可以期望使用在内化到细胞中时或期间可被切割的接头基团。已经描述了大量不同的可切割的接头基团。在细胞内从这些接头基团上释放治疗剂的机理包括通过还原二硫键(例如，Spitler，美国专利号4,489,710)、照射对光不稳定的键(例如，Senter等，美国专利号4,625,014)，水解衍生的氨基酸侧链(例如，Kohn等，美国专利号4,638,045)，通过血清补体介导的水解(例如，Rodwell等，美国专利号4,671,958)和酸催化的水解(例如，Blattler等，美国专利号4,569,789)进行切割。
可以期望偶联一个以上的治疗剂到抗体上。在一个实施方式中，治疗剂的多个分子偶联到一个抗体分子上。在另一个实施方式中，一种以上类型治疗剂可以偶联一个抗体。与特定的实施方式无关，可以用各种方法制备具有一个以上治疗剂的免疫缀合物。例如，一个以上治疗剂可以直接偶联抗体分子，或者可以使用提供多个附着位点的接头。作为可替代的方案，可以使用载体。
载体可以通过各种方法，包括直接共价结合或通过接头基团带有治疗剂。适合的载体包括蛋白质，诸如白蛋白(例如，Kato等，美国专利号4,507,234)，肽和多糖，诸如氨基葡聚糖(例如Shih等，美国专利号4,699,784)。载体也可以通过非共价结合或通过诸如脂质体囊泡中胶囊化而带有治疗剂(例如，美国专利号4,429,008和4,873,088)。对放射性核素试剂特异的载体包括放射性卤代小分子和螯合物。例如，美国专利号4,735,792公开了代表性的放射性卤代小分子和它们的合成。可以从螯合物形成放射性核素螯合物，该螯合物包括含有氮和硫原子作为供体原子以结合金属或金属氧化物、放射性核素的螯合物。例如，Davison等，美国专利号4,673,562公开了代表性的螯合物和它们的合成。
T细胞
免疫治疗组合物也可以或者作为可替代的方案包含对WT1特异的T细胞。通常利用标准方法体外或离体制备这种细胞。例如，T细胞可以存在于哺乳动物，诸如患者的骨髓、外周血或骨髓级分或外周血中，或者利用商购的细胞分离系统，诸如从CellPro Inc.，Bothell WA获得的CEPRATETM系统可以从哺乳动物，诸如患者的骨髓、外周血或骨髓级分或外周血中分离T细胞(也参见美国专利号5,240,856；美国专利号5,215,926；WO89/06280；WO 91/16116和WO 92/07243)。作为可替代的方案，T细胞可以来源于相关或无关的人类、非人类的动物、细胞系或培养物。
可以用WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。在足以允许对WT1多肽特异的T细胞产生的条件下和时间内进行这种刺激。优选，WT1多肽或多核苷酸存在于递送载体内，诸如微球体中以有利于抗原特异性T细胞的产生。简而言之，可以将通过常规技术(诸如，通过外周血淋巴细胞的Ficoll/Hypaque密度梯度离心)从患者或相关或无关供体中分离出的T细胞与WT1多肽温育。例如，在37℃，T细胞可以在体外与WT1多肽(例如，5到25μg/ml)或合成相似数量WT1多肽的细胞温育2-9天(通常为4天)。可以期望在缺少WT1多肽的情况下温育单独等份的T细胞样品作为对照。
如果T细胞杀死WT1多肽包被的或表达编码这种多肽基因的靶细胞，那么就认为T细胞对WT1多肽是特异性的。可以利用各种标准技术中的任何一种技术评价T细胞的特异性。例如，在铬释放测定法或增殖测定法中，与阴性对照比较，在裂解和/或增殖中，刺激指数增加2倍以上表示T细胞特异性。例如，可以如Chen等，Cancer Res.54：1065-1070，1994中所述进行这种测定。作为可替代的方案，可以用各种已知技术完成T细胞增殖的检测。例如，通过测定DNA合成的增加速率(例如，通过用氚化胸苷脉冲标记T细胞培养物，和测定掺入到DNA中的氚化胸苷数量)可检测T细胞增殖。其它检测T细胞增殖的方法包括测定白细胞介素-2(IL-2)产生、Ca2+流量或染料摄取，诸如3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-四唑的增加。作为可替代的方案，可以测定淋巴因子(诸如干扰素-γ)的合成或者可以定量能应答WT1多肽的T细胞的相对数量。如利用标准细胞因子测定法所测定的，与WT1多肽(200ng/ml-100μg/ml，优选100ng/ml-25μg/ml)接触3-7天应该产生至少2倍增加的T细胞增殖和/或如上述接触2-3小时应该产生T细胞的激活，在该测定法中细胞因子释放水平(例如，TNF或IFN-γ)的2倍增加表示T细胞激活(参见Coligan等，CurrentProtocols in Immunology，卷1，Wiley Interscience(Greene1998)。可以利用标准技术扩增WT1特异性T细胞。在优选的实施方式中，T细胞来源于患者或相关或无关供体，并且刺激和扩增后向患者给药该T细胞。
应答WT1多肽、多核苷酸或表达WT1的APC而被激活的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。可以用各种方法检测CD4+或CD8+T细胞的特异性激活。检测特异性T细胞激活的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子(例如淋巴因子)的产生或溶细胞活性的产生(即，对WT1特异的细胞毒性T细胞的产生)。对于CD4+T细胞，检测特异性T细胞激活的优选方法是T细胞增殖的检测。对于CD8+T细胞，检测特异性T细胞激活的优选方法是溶细胞活性的产生。
对于治疗目的，可以在体外或体内大量地扩增应答WT1多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T细胞。可以用各种方法完成这种T细胞的体外增殖。例如，在有或无T细胞生长因子，诸如白细胞介素-2和/或合成WT1多肽的刺激细胞添加的情况下，可以再次将T细胞暴露于WT1多肽。在产生CD8+T细胞应答的情况下优选添加刺激细胞。T细胞可以在体外被大量培养，同时保留特异性以应答WT1多肽间歇再刺激。简而言之，对于初次体外刺激(IVS)，大量的淋巴细胞(例如，大于4×107)可以被放置在装有含人血清培养基的培养瓶中。WT1多肽(例如，10μg/ml的肽)可以与破伤风类毒素(例如，5μg/ml)一起被直接添加。然后，可以温育培养瓶(例如，37℃，7天)。对于第二次IVS，收集T细胞，并且放置在装有2-3×107个经过辐照的外周血单核细胞的培养瓶中。直接添加WT1多肽(例如10μg/ml)。在37℃温育培养瓶7天。第二次IVS后的第2天和第4天，可以添加2-5单位的白细胞介素-2(IL-2)。对于第三次IVS，T细胞可以放置在小孔中，并且用肽包被的个体自身EBV转化的B细胞刺激T细胞。可以在每轮周期的第2天和第4天添加IL-2。一旦证明细胞是特异性细胞毒性T细胞，就可以利用10天刺激周期，在第2，4和6天用较高IL-2(20单位)扩增它们。
作为可替代的方案，通过克隆可以大量扩增在WT1多肽存在情况下增殖的一种或多种T细胞。克隆细胞的方法是本领域已知的，并且包括极限稀释。可以通过密度梯度离心和绵羊红细胞花结从致敏患者的外周血中纯化应答的T细胞，并且在经过辐照的自身填充细胞存在的情况下，通过用标称抗原刺激建立培养。为了产生CD4+T细胞系，将WT1多肽用作抗原刺激物，并且将通过EB病毒感染而无限增殖化的自身外周血淋巴细胞(PBL)或淋巴母细胞系(CLC)用作抗体呈递细胞。为了产生CD8+T细胞系，用产生WT1多肽的表达载体转染的自身抗原呈递细胞作为刺激细胞。在装有1×106个经过辐照的PBL或LCL细胞和重组白细胞介素-2(rIL2)(50U/ml)的96孔平底板中，以每孔0.5个细胞的频率将经过刺激的T细胞平板接种，据此可以在抗原刺激后2-4天克隆建立的T细胞系。初次平板接种后约2-3周可以鉴定已建立克隆生长的孔，并且在自身抗原呈递细胞存在的情况下用适合的抗原进行再刺激，接着在抗原刺激后2-3天通过添加低剂量的rIL2(10U/ml)进行扩增。大约每隔2周用抗原和rIL2进行周期性再刺激，据此T细胞克隆可以被维持在24孔板中。
在一些实施方式中，可以在体内和/或体外致敏异源T细胞(即，使其对WT1致敏)。通过在足以允许T细胞致敏的条件下和时间内用WT1多肽、编码这种多肽的多核苷酸或产生这种多肽的细胞接触T细胞可以获得这种致敏。通常，例如，如果与WT1多肽接触后造成T细胞增殖和/或激活就认为T细胞被致敏，其中通过标准增殖、如这里所述的铬释放和/或细胞因子释放测定法测定所述的T细胞增殖和/或激活。与阴性对照比较，增加2倍以上的增殖或裂解的刺激指数和增加3倍以上的细胞因子水平表示T细胞特异性。例如，体外致敏的细胞可以用在骨髓移植中或作为供体淋巴细胞输注。
对WT1特异性的T细胞能杀死表达WT1蛋白质的细胞。可将导入编码对WT1的T细胞受体(TCP)链的基因作为定量和定性地改进对荷有WT1的白血病和癌细胞的应答的方法。增加可以与WT1阳性细胞反应的T细胞数量的疫苗是靶向荷有WT1细胞的一种方法。使用对WT1特异性T细胞的T细胞治疗是另一种方法。可替代的方法是向T细胞中或具有裂解潜能的其它细胞中导入对WT1特异的TCR链。在适合的实施方式中，从WT1特异性T细胞系中克隆出TCRα和β链，并且该TCRα和β链被用于过继T细胞治疗，诸如引入此处的参考文献WO96/30516中所述。
T细胞受体组合物
T细胞受体(TCR)包含2条不同的高度可变的多肽链，称为T细胞受体α和β链，这两条链通过二硫键连接(Janeway，Travers，Walport.Immunobiology.第四版，148-159.ElsevierScience Ltd/Garland Publishing.1999)。具有不变CD3链的α/β异源二聚体复合物在细胞膜上。该复合物特异性地识别结合于MHC分子上的抗原性肽。通过体细胞基因重排，TCR特异性的巨大多变性的产生与免疫球蛋白多变性的产生极其相似。β链基因包含50个以上可变(V)、2个多变(D)、10个以上连接(J)片段和2个恒定区片段(C)。α链基因含有70个以上V片段和60个以上J片段及一个C片段，但是没有D片段。在胸腺中T细胞发育期间，β链的D到J基因出现重排，接着V基因片段与DJ重排。这种功能性VDJβ外显子被转录和剪接以连接Cβ。对于α链，Vα基因片段与Jα基因片段重排以产生功能性外显子，然后该外显子被转录和与Cα剪接。通过在β链的V、D和J片段之间和α链中V和J片段之间随机添加P和N～核苷酸，在重组过程期间进一步增加多变性(Janeway，Travers，Walport.Immunobiology.第四版，98和150.ElsevierScience Ltd/Garland Publishing.1999)。
在另一方面中，本发明提供了对这里公开的多肽或对其变异体或衍生物特异的TCR。根据本发明，提供了识别这里所述肿瘤多肽的T细胞受体α和β链V-J或V-D-J连接区或其部分的多核苷酸和氨基酸序列。通常，本发明的这方面涉及识别或结合MHC范围中存在的肿瘤多肽的T细胞受体。在优选的实施方式中，T细胞受体识别的肿瘤抗原包含本发明的多肽。例如，利用标准分子生物学和重组DNA技术可以从对肿瘤多肽特异的T细胞中分离cDNA，该cDNA编码对WT1肽特异的TCR。
本发明进一步包括具有与本发明T细胞受体基本相同功能或活性的T细胞受体或其类似物，其识别或结合肿瘤多肽。这种受体包括但不限于受体片段，或这里提供的T细胞受体的置换、添加或缺失变异体。本发明也包括与这里提供的T细胞受体基本同源或基本保留相同活性的多肽或肽。术语“类似物”包括与这里提供的T细胞受体具有基本相同的氨基酸残基序列的任何蛋白质或多肽，其中已经用功能相似的残基保守性地置换了一个或多个残基、优选不超过5个残基、更优选不超过25个残基，并且其显示了这里所述T细胞受体的功能方面。
本发明进一步提供了适合的哺乳动物宿主细胞，例如非特异性T细胞，其中用编码对这里所述多肽特异的TCR的多核苷酸转染所述细胞，因此使该宿主细胞对多肽特异。TCR的α和β链可以包含在单独的表达载体上或者作为可替代的方案，包含在单个表达载体上，该单个表达载体也含有内部核糖体进入位点(IRES)用以不依赖帽子结构而对IRES下游的基因进行翻译。例如，在下面进一步讨论的WT1相关癌症的过继免疫治疗中，可以使用能表达对多肽特异的TCR的所述宿主细胞。
在本发明的进一步方面，可以在WT1相关癌症诊断的试剂盒中使用对这里所述多肽特异性的克隆的TCR。例如，可以用肿瘤特异性TCRs的核酸序列或其部分作为探针或引物，用以检测生物样品中编码特异性TCR重排基因的表达。因此，本发明进一步提供了用于检测信使RNA或DNA的方法，该DNA编码对多肽特异的TCR。
肽-MHC四聚体复合物
在另一方面，本发明提供了对T细胞特异的肽-MHC四聚体复合物(四聚体)，所述的T细胞能识别这里所公开的多肽或者其变异体或衍生物。在一个实施方式中，可以在WT1特异性T细胞检测中使用四聚体。四聚体可用于对WT1特异性免疫应答的监测、WT1相关恶性肿瘤的早期检测和微小残留病的监测。通常用流式细胞分析术进行四聚体染色，并且该四聚体染色可以用于鉴定患有WT1相关疾病的患者群中处于高复发或疾病进展风险的患者组。
药物组合物
在另外的实施方式中，本发明涉及以单独或联合一种或多种其它治疗的方式向细胞或动物给予的制剂，该制剂在药物学可接受的载体中含有这里所公开的多核苷酸、多肽、T细胞、TCR和/或抗体组合物中的一种或多种。
可以理解，如果需要，这里所公开的组合物也可以联合其它试剂给药，例如其它蛋白质或多肽或各种药物学活性剂。实际上，只要另外的试剂与靶细胞或宿主组织接触时不引起严重的副作用，实质上对还可包含的其它成分没有限制。因此，在特定情况下，组合物可以与所需的各种其它试剂一起被递送。可以从宿主细胞或其它生物来源中纯化这种组合物，或者作为可替代的方案，可以如这里所述化学合成这种组合物。同样，这种组合物可以进一步包含置换或衍生的RNA或DNA组合物。
因此，在本发明的另一方面中，提供了药物组合物，其包含这里所述的多核苷酸、多肽、抗体、TCR和/或T细胞组合物中的一种或多种，以及生理学可接受的载体。在一些优选的实施方式中，本发明的药物学组合物包含有用于预防性和治疗性疫苗应用的本发明免疫原性多核苷酸和/或多肽组合物。例如，通常在M.F.Powell和M.J.Newman编辑，″Vaccine Design(the subunit and adjuvantapproach)，″Plenum Press(NY，1995)中描述了疫苗制备。通常，这种组合物将包含本发明的一种或多种多核苷酸和/或多肽组合物，同时含有一种或多种免疫刺激剂。
显而易见，这里所述的任何药物组合物都可以含有药物学可接受的本发明多核苷酸和多肽的盐。例如，可以从药物学可接受的非毒性碱，包括有机碱(例如伯、仲、叔胺和碱性氨基酸)和无机碱(例如钠、钾、锂、铵、钙和镁盐)制备这种盐。
在另一实施方式中，示例性的免疫原性组合物，例如本发明的疫苗组合物包含编码如上所述一种或多种多肽的DNA，以原位产生该多肽。如上所述，可以在本领域普通技术人员已知的各种递送系统中的任何递送系统中给药多肽。实际上，本领域公知大量的基因递送技术，诸如Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems15：143-198，1998和其中引用的参考文献所描述的基因递送系统。当然，适合的多核苷酸表达系统将包含用于在患者中进行表达所必需的DNA调节序列(诸如适合的启动子和终止信号)。作为可替代的方案，细菌递送系统可以包括细菌(诸如卡介苗)的给药，该细菌在其细胞表面上表达免疫原性部分或者分泌这种表位。
因此，在一些实施方式中，利用多种已知基于病毒的系统中的任何系统将编码这里所述免疫原性多肽的多核苷酸导入到适合的哺乳动物宿主细胞中进行表达。在一个示例性实施方式中，逆转录病毒提供了基因递送系统的方便和有效的平台。利用本领域已知的技术，选定的编码本发明多肽的核苷酸序列可以被插入到载体中和包装在逆转录病毒颗粒中。然后，重组病毒可以被分离和递送给个体。已经描述了大量示例性逆转录病毒系统(例如美国专利号5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7：980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy 1：5-14；Scarpa等.(1991)Virology 180：849-852；Burns等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：8033-8037；和Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109)。
此外，也描述了大量示例性基于腺病毒的系统。与掺入到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒保持在染色体外，因此能使与插入性诱变相关的风险最小化(Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57：267-274；Bett等.(1993)J.Virol.67：5911-5921；Mittereder等.(1994)Human Gene Therapy 5：717-729；Seth等.(1994)J.Virol.68：933-940；Barr等.(1994)Gene Therapy 1：51-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques 6：616-629；和Rich等.(1993)Human Gene Therapy 4：461-476)。
已经开发了各种腺伴随病毒(AAV)载体系统用于多核苷酸递送。利用本领域公知的技术可以容易地构建AVV载体。参见，例如美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公布号WO 92/01070和WO93/03769；Lebkowski等.(1988)Molec.Cell.Biol.8：3988-3996；Vincent等。(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology3：533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.andImmunol.158：97-129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy5：793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy 1：165-169；和Zhou等.(1994)J.Exp.Med.179：1867-1875。
用于通过基因转移递送编码本发明多肽的多核苷酸的其它病毒载体包括来源于痘科病毒，诸如痘苗病毒和禽痘病毒的病毒载体。例如，可以如下构建表达新分子的痘苗病毒重组体。编码多肽的DNA首先被插入到适合的载体中以使它邻近痘苗启动子和侧翼痘苗DNA序列，诸如编码胸苷激酶(TK)的序列。然后，该载体用于转染同时被痘苗感染的细胞。同源重组用于向病毒基因组中插入痘苗启动子和编码目的多肽的基因。通过在5-溴脱氧尿苷存在的情况下培养细胞，并且挑取对其有抗性的病毒噬菌斑可以筛选所得到的TK.sup.(-)重组体。
基于痘苗感染/转染的系统可以常规地用于提供在生物体宿主细胞中诱导性地瞬时表达或共表达这里所述的一种或多种多肽。在这个特别系统中，首先用编码噬菌体T7 RNA聚合酶的痘苗病毒重组体体外感染细胞。该聚合酶表现出灵敏的特异性，因为它只转录具有T7启动子的模板。感染后，以用T7启动子启动的多核苷酸或目的多核苷酸转染细胞。在来源于痘苗病毒重组体的胞质中表达的聚合酶将转染的DNA转录为RNA，然后通过宿主翻译机制将RNA翻译为多肽。该方法实现了以高水平、瞬时性在胞质产生大量RNA和其翻译产物。参见，例如Elroy-Stein和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：6743-6747；Fuerst等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：8122-8126。
作为可替代的方案，禽痘病毒，诸如鸟痘病毒和金丝雀痘病毒也可以用于递送目的编码序列。已知当表达来源于哺乳动物病原体的免疫原的重组禽痘病毒被施用给非禽物种时，其提供了保护性的免疫性。特别期望在人类和其它哺乳动物物种中使用禽痘病毒载体，因为禽痘病毒属成员只能在易感禽物种中大量地复制，因此在哺乳动物细胞中不具有感染性。如上文关于痘苗病毒产生所述，产生重组禽痘病毒的方法是本领域已知的，并且利用了基因重组。参见，例如WO91/12882；WO 89/03429；和WO 92/03545。已经开发了大量痘病毒作为表达异源蛋白质的活病毒载体(Cepko等，Cell 37：1053-1062(1984)；Morin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4626-4630(1987)；Lowe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：3896-3900(1987)；Panicali &Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：4927-4931(1982)；Machett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：7415-7419(1982))。代表性鸟痘病毒和猪痘病毒可以分别通过ATCC保藏号VR-229和VR-363获得。重组痘苗-CEA可以从ATCC保藏号VR2323获得。其它示例性病毒载体也包括但不限于Therion Biologics(Cambridge，MA，USA)在美国专利号6,051,410、5,858,726、5,656,465、5,804,196、5,747,324、6,319,496、6,165,460中所述的病毒载体。
大量甲病毒载体中的任何一种病毒载体，诸如美国专利号5,843,723；6,015,686；6,008,035和6,015,694中所述的甲病毒载体也可以用于本发明多核苷酸组合物的递送。也可以使用基于委内瑞拉马脑炎(VEE)的一些载体，在美国专利号5,505,947和5,643,576中可以发现该载体的示例性例子。
而且，分子缀合物载体，诸如Michael等.J.Biol.Chem.(1993)268：6866-6869和Wagner等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：6099-6103中所述腺病毒嵌合载体也可以用于本发明的基因递送。
例如，可以在Fisher-Hoch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：317-321，1989；Flexner等，Ann.N.Y.Acad.Sci.569：86-103，1989；Flexner等，Vaccine 8：17-21，1990；美国专利号4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利号4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO91/02805；Berkner，Biotechniques 6：616-627，1988；Rosenfeld等，Science 252：431-434，1991；Kolls等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219，1994；Kass-Eisler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11498-11502，1993；Guzman等，Circulation 88：2838-2848，1993；和Guzman等，Cir.Res.73：1202-1207，1993中发现关于这些和其它已知的基于病毒的递送系统的另外示例性信息。
如本领域技术人员将容易理解的，如这里所述，任何数量的另外成分可以存在于表达WT1多肽或其任何部分的DNA或逆转录病毒载体中。例如，用于递送本发明多核苷酸或多肽的表达载体可以包含任何数量的各种共刺激分子，包括但不限于CD28、B7-1、ICAM-1和LFA-3。递送载体也可以包含任何数量的细胞因子，例如IFN-γ、GM-CSF或IL-2。在一个示例性实施方式中，重组病毒载体，例如痘苗或鸟痘病毒载体包含B7-1、ICAM-1和IFA-3。
本发明也包括这里所述DNA和/或病毒载体的任何组合在用于WT1表达相关的恶性肿瘤治疗中的用途。在一个示例性实施方式中，向患有WT1相关恶性肿瘤的动物或人类患者给予重组痘苗病毒载体，随后给予重组鸟痘病毒载体。在本发明的另一个实施方式中，给药痘苗病毒载体后，给药重组鸟痘病毒载体2次(例如：致敏/强化/强化疫苗接种的方案)。
在一些实施方式中，多核苷酸可以整合到靶细胞基因组中。这种整合可以通过同源重组位于特定位置和方向(基因置换)或者它可以整合到随机、非特定位置中(基因增大)。然后在进一步的实施方式中，多核苷酸可以被稳定地维持在细胞中作为单独的游离型DNA片段。这种多核苷酸片段或“游离体”编码这样的序列，即该序列足以允许独立于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步的维持和复制。递送表达构建体到细胞中的方法和细胞中保留多核苷酸的位置取决于所用表达构建体的类型。
在本发明的另一个实施方式中，多核苷酸作为“裸DNA”被给药/递送，例如，如Ulmer等，Science 259：1745-1749，1993和Cohen，Science 259：1691-1692，1993综述中所述。通过将DNA包被到能被有效地转运到细胞中的可生物降解的小珠上可以增加裸DNA的摄取。
在另一个实施方式中，通过粒子轰击方法可以递送本发明的组合物，已经有许多粒子轰击方法的介绍。在一个示例性的例子中，使用装置诸如Powderject Pharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject Vaccines Inc.(Madison，WI)制造的装置可以获得气体驱动的粒子加速，美国专利号5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；和欧洲专利号0500 799中描述了其中的一些例子。这种方法提供了无针的递送方法，其中微观颗粒的干粉制剂诸如多核苷酸或多肽颗粒在由手提式装置产生的氦气喷射流中被加速到高速，推进该颗粒进入到目的靶组织中。
在相关实施方式中，可以用于气体驱动无针注射本发明组合物的其它装置和方法包括Bioject，Inc.(Portland，OR)提供的装置和方法，美国专利号4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412中描述了其中的一些例子。
根据另一个实施方式，这里所述的药物组合物将包含除了本发明免疫原性多核苷酸、多肽、抗体、T细胞、TCR和/或APC组合物以外的一种或多种免疫刺激剂。免疫刺激剂实质上指增强或促进对外源抗原(抗体和/或细胞介导的)免疫应答的任何物质。优选的一类免疫刺激剂包含佐剂。许多佐剂包含有被设计成用于保护抗原免受快速分解代谢的物质，诸如氢氧化铝或矿物油，和免疫应答刺激物诸如脂质A、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)来源的蛋白质。有些佐剂可以商购得到，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKlineBeecham，Philadelphia，PA)；铝盐诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化的多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；单磷酰基脂质A和quilA。细胞因子诸如GM-CSF、白细胞介素-2、-7、-12和其它的细胞因子诸如生长因子也可以用作佐剂。
在本发明的一些实施方式中，优选，佐剂组合物是能诱导Th1型占优势免疫应答的佐剂组合物。高水平的Th1型细胞因子(例如，IFNγ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于促进诱导针对施用抗原的细胞介导免疫应答。相反，高水平的Th2-型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于促进诱导体液免疫应答。施用这里提供的疫苗后，患者将支持包含Th1和Th2型应答的免疫应答。在优选的实施方式中，其中Th1型应答占优势时，Th1型细胞因子的水平将比Th2型细胞因子的水平增加更大的程度。利用标准测定法可以容易地评价这些细胞因子的水平。对于细胞因子家族的综述，参见Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7：145-173，1989。
激发Th1型应答占优势的一些优选的佐剂包括，例如单磷酰基脂质A，优选3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A及铝盐的组合。可以从Corixa公司(Seattle，WA；参见，例如美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)得到MPL_佐剂。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未被甲基化)也诱导Th1占优势的应答。这种寡核苷酸是公知的，并且例如在WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利号6,008,200和5,856,462中描述了这种寡核苷酸。例如Sato等，Science 273：352，1996也描述了免疫刺激DNA序列。另一种优选的佐剂包含皂苷，诸如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticals Inc.，Framingham，MA)；七叶皂苷；毛地黄皂苷或丝石竹属(Gypsophila)或藜属(Chenopodium quinoa)皂苷。其它优选的制剂包含一种以上的皂苷在本发明佐剂组合中，例如下面QS21、QS7、Quil A、β-七叶皂苷或毛地黄皂苷中的至少两种皂苷的组合。
作为可替代的方案，皂苷制剂可以联合包含脱乙酰壳多糖或其它聚阳离子聚合物、聚交酯和聚交酯-共聚-乙交酯颗粒、基于聚-N-乙酰基葡糖胺的聚合物基质的疫苗载体，包含多糖或化学修饰多糖、脂质体和基于脂质的颗粒，包含单甘油酯的颗粒等。可以在胆固醇存在的情况下制备皂苷制剂以形成颗粒结构诸如脂质体或ISCOMs。而且，皂苷可以与聚氧乙烯醚或酯一起制备成非颗粒溶液或悬浮液，或者颗粒结构诸如微室脂质体(paucilamelar liposome)或ISCOM。皂苷也可以与赋形剂诸如CarbopolR一起制备以增加粘度，或者可以与粉末赋形剂诸如乳糖制成干粉形式。
在一个优选的实施方式中，如WO 94/00153中所述，佐剂系统包含单磷酰基脂质A和皂苷衍生物的组合，诸如QS21和3D-MPL_佐剂的组合，或者如WO96/33739中所述，包含其中QS21经胆固醇淬灭的较小反应原性的组合物。其它优选的制剂包含水包油乳液和生育酚。另一种特别优选的佐剂制剂如WO 95/17210中所述，在水包油乳液中使用QS21、3D-MPL_佐剂和生育酚。
另一种增强的佐剂系统包含含有CpG的寡核苷酸和皂苷衍生物的组合，特别是WO 00/09159中公开的CpG和QS21的组合。优选，该制剂还包含水包油乳液和生育酚。
本发明的药物组合物中使用的另外示例性佐剂包括MontanideISA 720(Seppic，France)、SAF(Chiron，California，UnitedStates)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐剂(例如，SBAS-2或SBAS-4，可获自SmithKline Beecham，Rixensart，Belgium)、Detox(Enhanzyn_)(Corixa，Hamilton，MT)、RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其它氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸盐(AGP)，诸如未决的美国专利申请序号08/853,826和09/074,720中和美国专利号6,303,347中所述的氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸盐(AGPs)，这里将这些文献公开的内容整体引入作为参考文献，和聚氧乙烯醚佐剂，诸如WO99/52549A1中所述的聚氧乙烯醚佐剂。本发明的药物组合物中使用的另外示例性佐剂包括isotucerosol。
其它优选的佐剂包含具有下面通式的佐剂分子：
(I)：HO(CH2CH2O)n-A-R，
其中n是1-50，A是键或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
本发明的一个实施方式包括疫苗制剂，其包含通式(I)的聚氧乙烯醚，其中n在1和50之间，优选4-24之间，最优选是9；R成分是C1-50，优选C4-C20烷基，最优选C12烷基，A是键。聚氧乙烯醚的浓度应该在0.1-20％，优选0.1-10％的范围内，最优选在0.1-1％的范围内。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂酰醚、聚氧乙烯-9-硬脂酰醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-月桂酰醚、聚氧乙烯-35-月桂酰醚和聚氧乙烯-23-月桂酰醚。Merck索引(第12版：登录号7717)中描述了聚氧乙烯醚诸如聚氧乙烯月桂酰醚。WO 99/52549中描述了这些佐剂分子。
如果需要，根据上述通式(I)的聚氧乙烯醚可以与另一种佐剂组合。例如，如未决的UK专利申请GB 9820956.2中所述，优选的佐剂组合优选与CpG组合。
根据本发明的另一个实施方式，通过抗原呈递细胞(APC)，诸如可以被人工改造成有效的APC的树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和其它细胞向宿主递送这里所述的免疫原性组合物。可以但不是必须基因修饰这种细胞以增加呈递抗原的能力，以改进T细胞应答的激活和/或维持，以本身具有抗肿瘤作用和/或与接受者免疫相容(即，匹配的HLA单倍型)。通常可以从各种生物液体和器官，包括肿瘤和肿瘤周边组织中任何之一中分离出APC，并且APC可以是自身、异源、同系或异种的细胞。
本发明的一些优选的实施方式使用树突细胞或其祖细胞作为抗原呈递细胞。树突细胞是高度有效的APC(Sanchereau and Steinman，Nature 392：245-251，1998)，并且已经证明其作为用于激发预防或治疗的抗肿瘤免疫性的生理学佐剂是有效的(参见，Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50：507-529，1999)。通常，可以基于树突细胞典型的形状(原位是星状，体外可以观察到明显的胞质突(树突))、它们高效地吸收、加工和呈递抗原的能力和它们激活原初T细胞应答的能力鉴定它。当然，可以人工改造树突细胞以体内或离体表达树突细胞上不常发现的特异性细胞表面受体或配体，并且本发明考虑了这种修饰的树突细胞。作为树突细胞的替代物，可以在疫苗中使用分泌型囊泡加载抗原的树突细胞(称为外来体)(参见，Zitvogel等，NatureMed.4：594-600，1998)。
树突细胞和祖细胞可以获自外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、肿瘤周边组织浸润细胞、淋巴结、脾脏、皮肤、脐带血或任何其它适合的组织和液体。例如，通过向自外周血收集的单核细胞培养物中添加细胞因子诸如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα的组合可以离体分化树突细胞。作为可替代的方案，通过向培养基添加GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或其它诱导树突细胞分化、成熟和增殖的化合物的组合，自外周血、脐带血或骨髓收集的CD34阳性细胞可以分化成树突细胞。
树突细胞被方便地分类为“未成熟”和“成熟”细胞，可以用简单的方法区分这两种充分表征的表型。然而，这种命名法不应该解释为排除所有可能的分化中间时期。未成熟的树突细胞的特征是其为具有高度抗原摄取和加工能力的APC，其与Fcγ受体和甘露糖受体的高度表达相关。成熟表型的特征通常为这些标志物的表达较低，而负责T细胞激活的细胞表面分子诸如I类和II类MHC、粘附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)高表达。
通常可以用本发明的多核苷酸(或者其部分或其它变异体)转染APC，以在细胞表面上表达其所编码的多肽或其免疫原性部分。如这里所述，这种转染可以离体发生，然后，包含这种转染细胞的药物学组合物可以用于治疗目的。作为可替代的方案，可以向患者给予靶向树突细胞或其它抗原呈递细胞的基因递送载体，引起发生在体内的转染。例如，通常可以使用本领域已知的任何方法，诸如WO 97/24447中所述的方法或Mahvi等，Immunology and cell Biology 75：456-460，1997中所述的基因枪方法进行树突细胞的体内和离体转染。通过温育树突细胞或祖细胞与肿瘤多肽、(裸或质粒载体中的)DNA或RNA；或者与表达抗原的重组细菌或病毒(例如、痘苗病毒、鸟痘病毒、腺病毒或慢病毒载体)可以突现树突细胞的抗原加载。加载前，多肽可以共价缀合提供T细胞辅助的免疫伴侣(例如，载体分子)。作为可替代的方案，可以用非缀合的免疫伴侣单独地或在多肽存在的情况下脉冲树突细胞。
尽管在本发明药物组合物中可以使用本领域普通技术人员已知的任何适合的载体，但是载体的类型通常将随着给药方式而变化。本发明的组合物可以制备成任何适合的给药方式，包括例如局部、口服、鼻子、粘膜、静脉内、颅内、腹腔内、皮下和肌内给药方式。
这种药物组合物中使用的载体是生物可相容的，并且也可以是生物可降解的。在一些实施方式中，优选制剂提供了相对恒定水平的活性组分释放。然而，在其它实施方式中，可能希望给药后立即更快速率的释放。这种组合物制剂属于利用已知技术的本领域普通技术人员的公知水平范围内。这方面使用的示例性载体包括聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素、葡聚糖等微颗粒。其它示例性延迟释放的载体包括超分子生物载体，其包含非液体的亲水核心(例如，交联的多糖或寡糖)和任选的外层，该外层包含两亲性化合物，诸如磷脂(参见，例如美国专利号5,151,254和PCT申请WO94/20078，WO/94/23701和WO 96/06638)。持续释放制剂中含有的活性化合物的量取决于植入的位点、释放的速率和期望期间及待要被治疗或预防的疾病性质。
在另一个示例性实施方式中，使用生物可降解的微球体(例如，聚乳酸酯聚甘醇酸酯)作为本发明组合物的载体。例如，美国专利号4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344；5,407,609和5,942,252中公开了适合的生物可降解的微球体。也可以将诸如WO/9940934和其中引用的参考文献中所述的修饰的乙型肝炎核心蛋白质载体系统用于许多应用中。另一种示例性载体/递送系统使用了包含颗粒蛋白质复合物的载体，诸如美国专利号5,928,647中所述的载体，其能诱导宿主中I类限制性细胞毒性T淋巴细胞的应答。
在另一个示例性实施方式中，使用磷酸钙核心颗粒作为本发明组合物的载体、疫苗佐剂或者作为可控释放基质。例如，公开的专利申请号WO/0046147中公开了示例性磷酸钙颗粒。
本发明的药物组合物常常进一步包含一种或多种缓冲液(例如，中性缓冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白质、多肽或氨基酸诸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(例如，氢氧化铝)、使带有受者血液的制剂等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。作为可替代的方案，本发明的组合物可以被制成冻干物制剂。
这里所述的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，诸如密封的安瓿或小瓶中。通常密封这种容器以保持使用时制剂的无菌性和稳定性。一般地，制剂可以作为油或水载体中的悬浮液、溶液或乳液贮藏。作为可替代的方案，药物组合物可以贮藏在冷冻干燥的条件下，该条件只需要使用前添加无菌的液体载体。
为了在各种治疗方案中使用这里所述特定组合物而开发适合的给药剂量和治疗方案，包括例如口服、肠道外、静脉内、鼻内和肌内给药和制剂，是本领域公知的，为了一般示例性目的，下面简要讨论了其中的一些。
在一些实施方式中，可以通过口服给药向动物递送这里所述的药物组合物。同样地，可以与惰性稀释剂或与可同化食用的载体一起制备这些组合物，或者它们可以被包裹在硬或软壳明胶胶囊中，或者它们可以被压缩成片剂，或者它们可以直接被掺入到膳食食物中。
甚至，活性成分可以与赋形剂混合，并且用在可摄取的片剂、口腔片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂等形式中(参见，例如Mathiowitz等，Nature 1997 Mar 27；386(6623)：410-4；Hwang等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998；15(3)：243-84；美国专利5,641,515；美国专利5,580,579和美国专利5,792,451)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可以含有各种另外的成分中的任一成分，例如可以添加粘合剂，诸如黄蓍树胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；和甜味剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精或者调味剂，诸如薄荷、冬青油或樱桃香料。当剂量单位形式是胶囊时，它可以含有除了上述物质外的液体载体。各种其它物质可以作为包衣料存在或者用以修饰剂量单位的物理形式。例如，可以用紫胶、糖或两者包衣片剂、丸剂或胶囊。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何物质在所用量中都应该是药物学纯度的和基本无毒的。此外，活性化合物可以被掺入到持续释放的制剂和剂型中。
尽管活性组分的百分比当然地可以改变，并且方便地在总制剂重量或体积的约1或2％和约60％或70％或更高之间，但是，通常这些制剂将包含至少约0.1％或更多的活性化合物。自然地，可以对每种治疗有用的组合物中活性化合物的量进行配制，从而在任何给定的化合物单位剂量中获得适当的剂量。制备这种药物制剂领域的技术人员将考虑因素诸如溶解度、生物利用率、生物学半衰期、给药途径、产品贮存期限及其它药理学的考虑因素，同样地，可以期望各种剂量和治疗方案。
对于口服给药，作为可替代的方案，本发明的组合物可以与一种或多种赋形剂混合成漱口药、洁牙剂、口含片剂、口服喷雾剂或舌下口服给药制剂。作为可替代的方案，活性组分可以掺入到口服溶液，诸如含有四硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的口服溶液中，或者分散在洁牙剂中，或者以治疗有效量添加到可以组合物中，该组合物包含水、粘合剂、研磨剂、调味剂、起沫剂和湿润剂。作为可替代的方案，组合物可以制成可放置在舌下或溶解在口中的片剂或溶液形式。
在一些情况下，将期望非肠道、静脉内、肌内或腹腔内地递送这里所公开的药物组合物。这种方法是本领域技术人员公知的，例如在美国专利5,543,158；美国专利5,641,515和美国专利5,399,363中进一步描述了其中的一些方法。在一些实施方式中，可以在水中与表面活性剂诸如羟丙基纤维素适当混合，制备作为游离碱或药物学可接受盐的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及油中制备分散体。在通常的贮藏和使用条件下，这些制剂一般含有防腐剂以防止微生物生长。
适于可注射使用的示例性药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(例如，参见美国专利5,466,468)。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须在一定程度上是流动的，该流动程度使注射器能够容易注射。它在制造和贮藏条件下必须是稳定的，并且其保存必须对抗抗微生物，诸如细菌和真菌的污染。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的适当的混合物和/或植物油的溶剂或分散体介质。例如，通过使用包衣诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒大小和/或通过使用表面活性剂可以维持适宜的流动性。通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类(parabens)、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠等可以方便地防止微生物的作用。在许多情况下，优选其包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶可以引起可注射组合物的延长吸收。
在一个实施方式中，以水溶液形式进行非肠道给药，如有必要应该适当缓冲该溶液，并且首先用足够的盐或葡萄糖使稀释剂变成等渗的。这些特定的水溶液特别适合静脉内、肌内、皮下和腹腔内给药。在这方面，根据本公开的内容，可以使用本领域技术人员已知的无菌水介质。例如，1剂量可以溶解在1ml等渗的NaCl溶液中，然后或者添加到1000ml皮下输液液体中或在目的输注位点注射(参见，例如″Remington′s Pharmaceutical Sciences″第15版，1035-1038和1570-1580页)。根据受治疗个体的状态，剂量上的一些变动将必然发生。而且，为了向人体给药，制剂当然优选满足FDA生物学标准办公室所要求的无菌性、致热性和一般的安全性和纯度标准。
在本发明的另一个实施方式中，这里公开的组合物可以被制成中性或盐形式。示例性的在药物学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基与无机酸诸如，例如盐酸、磷酸或与有机酸诸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成)。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱诸如，例如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁和有机碱诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。一旦制成制剂，将以与剂量制剂相容的方式和治疗有效的量给药溶液。
载体可以进一步包含任何和所有的溶剂、分散介质、载体、包衣剂、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。将这种介质和试剂用于药物活性物质是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与活性组分不相容，均可考虑将其用于治疗组合物中。补加的活性组分也可以被掺入到组合物中。短语“药物学上可接受”指当向人体给药时分子实体和组合物不会产生过敏性或相似的不适反应。
在一些实施方式中，可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气溶胶递送载体递送药物组合物。例如美国专利5,756,353和美国专利5,804,212中描述了通过鼻气溶胶喷雾直接向肺递送基因、核酸和肽组合物的方法。同样，利用鼻内微颗粒树脂(Takenaga等，J ControlledRelease 1998 Mar 2；52(1-2)：81-7)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利5,725,87)的药物递送也是药物学领域公知的。同样，美国专利5,780,045中描述了以聚四氟乙烯支持体基质的形式，跨粘膜药物递送的示例性递送。
在一些优选的实施方式中，用脂质体、纳米胶囊、微颗粒、脂质颗粒、囊泡等向适合的宿主细胞/生物体中导入本发明的组合物。特别地，可以将本发明的组合物制成包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球和纳米粒等任一种中的制剂进行递送。作为可替代的方案，本发明的组合物可以共价或非共价地连接这种载体工具的表面。
脂质体和类脂质体制剂作为有效的药物载体，其制备和应用通常是本领域技术人员已知的(参见，例如Lasic，Trends Biotechnol 1998年7月；16(7)：307-21；Takakura，Nippon Rinsho 1998年3月；56(3)：691-5；Chandran等，Indian J Exp Biol.1997年8月；35(8)：801-9；Margalit，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1995；12(2-3)：233-61；美国专利5,567,434；美国专利5,552,157；美国专利5,565,213；美国专利5,738,868和美国专利5,795,587，这里具体地将每篇文献整体引入作为参考文献)。
脂质体已经成功地用于通过其它方法通常难以转染的多种细胞类型，其中包括T细胞悬浮液、原代肝细胞培养物和PC12细胞(Renneisen等，J Biol Chem.1990年9月25日；265(27)：16337-42；Muller等，DNA Cell Biol.1990年4月9日(3)：221-9)。此外，脂质体不存在基于病毒的递送系统通常具有的DNA长度限制问题。脂质体已经被有效地用于向各种培养细胞系和动物中导入基因、各种药物、放射性治疗剂、酶、病毒、转录因子、变构效应剂等。而且，应用脂质体未表现出与系统递送后的自身免疫应答或不可接受的毒性有关。
在一些实施方式中，脂质体由分散在水介质中的磷脂形成，并且自发地形成多层同心的双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。
作为可替代的方案，在其它的实施方式中，本发明提供了本发明组合物的药物学可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常能够以稳定和可再生的方式包载化合物(参见，例如，Quintanar-Guerrero等，DrugDev Ind Pharm.1998年12月；24(12)：1113-28)。为了避免由于细胞内聚合物超载的副作用，可以设计利用体内能被降解的聚合物制造这种超细颗粒(大小约0.1μm)。例如，可以如Couvreur等，CritRev Ther Drug Carrier Syst.1988；5(1)：1-20；zur Muhlen等，EurJ Pharm Biopharm.1998年3月；45(2)：149-55；Zambaux等.JControlled Release.1998年1月2日；50(1-3)：31-40；和美国专利5,145,684中所述制备这种颗粒。
恶性疾病的治疗
癌症治疗的免疫方法是基于这样的认识：癌细胞常常可以逃避针对异常或外源细胞和分子的身体防御，通过治疗性地刺激可能重建这些防御，例如Klein，Immunology(Wiley-Interscience，New York，1982)中623-648页。各种免疫效应子可以直接或间接地抑制肿瘤生长的大量最近观察资料已经再次引起了对这种癌症治疗方法的兴趣，例如Jager等，Oncology 2001；60(1)：1-7；Renner等，Ann Hematol2000年12月；79(12)：651-9。
其功能与抗肿瘤细胞免疫性和从身体排除肿瘤细胞相关的4种基本的细胞类型是：i)向血浆中分泌免疫球蛋白用以鉴定和标记非自身侵入细胞的B淋巴细胞；ii)分泌补体蛋白质的单核细胞，该补体蛋白质负责裂解和加工免疫球蛋白包被的靶侵入细胞；iii)具有两种破坏肿瘤细胞机理、依赖于抗体的细胞的细胞毒性和自然杀伤性的自然杀伤淋巴细胞；和iv)加工抗原特异性受体和具有识别带互补标分值子的肿瘤细胞能力的T淋巴细胞(Schreiber，H.，1989，inFundamental Immunology(编辑).W.E.Paul，923-955页)。
癌症免疫治疗通常关注诱导体液免疫应答、细胞免疫应答或这两种免疫应答。而且，已知为了再次诱导抗体或细胞毒性CD8+T细胞，必需诱导CD4+T辅助细胞。对癌细胞，特别是与WT1表达相关的癌细胞具有选择性或理想地具有特异性的多肽抗原提供了用于诱导抗与WT1表达相关癌症的免疫应答的有效方法，并且是本发明的重要方面。
在本发明的另一方面，这里所述的组合物和疫苗可以用于抑制恶性疾病(例如，进行性或转移性疾病或以小肿瘤负载诸如微小残留病为特征的疾病)的发生发展。通常，这种方法可以用于预防、延迟或治疗与WT1表达相关的疾病。换而言之，这里提供的治疗方法可以用于治疗现有的WT1相关疾病，或者可以用于预防或延迟没有患病或患有与WT1表达无关的疾病的患者中这种疾病的发作。
如果患病的细胞(例如，肿瘤细胞)在疾病过程期间的某个时间比相同组织的正常细胞产生更高可检测水平的WT1多肽，那么该疾病“与WT1表达相关”。WT1表达与恶性疾病相关不要求WT1存在于肿瘤上。例如，WT1的过表达可以涉及肿瘤的启动，但是可以随后不再表达蛋白质。作为可替代的方案，不以WT1表达增加为特征的恶性疾病以后可以进展为以WT1表达增加为特征的疾病也是与WT1表达相关的疾病。因此，其中具有以前表达、目前表达或预期随后表达增加水平的WT1的患病细胞的任何恶性疾病被认为“与WT1表达相关”。
可以利用各种技术中的任何技术进行免疫治疗，其中这里所提供的化合物或细胞起到从患者清除表达WT1细胞的作用。发生这种清除是由于增强或诱导了患者中对WT1或表达WT1的细胞特异性的免疫应答。作为可替代的方案，可以离体(例如，通过处理自身骨髓、外周血或骨髓级分或外周血)清除表达WT1的细胞。利用本领域任何标准的技术可以获得骨髓和外周血的级分。
在这种方法中，可以向患者给予药物组合物和疫苗。这里所述的“患者”指任何温血动物，优选人类。患者可以患有或者不患有恶性疾病。因此，上述的药物组合物和疫苗可以用于防止疾病的发作(即，预防性地)或者用于治疗患有疾病的患者(例如，用于防止和延迟现有疾病的进展和/或转移)。患病的患者可以具有微小残留病(例如，处于完全或部分缓解状态的白血病患者中的低肿瘤负载或手术放射治疗和/或化学治疗后肿瘤负载减少的癌症患者)。可以免疫这种患者以抑制复发(即，防止或延迟复发，或者减轻复发的严重性)。在一些优选的实施方式中，患者患有白血病(例如，AML、CML、ALL或儿童ALL)、脊髓发育不良综合症(MDS)或癌症(例如，胃肠癌、肺癌、甲状腺癌或乳腺癌或黑色素瘤)，其中癌症或白血病是WT1阳性的(即，与这里所述的抗WT1抗体可检测地反应或者如这里所述，以RT-PCR可检测的水平表达WT1mRNA)，或者患有针对WT1表达细胞的自身免疫疾病。
与WT1过表达相关的其它疾病包括如Satoh F.等，Pathol.Int.50(6)：458-71(2000)，和Campbell C.E.等，Int.J.Cancer 78(2)：182-8(1998)中所述的肾癌(诸如肾细胞癌或维尔姆斯瘤)；和Amin，K.M.等，Am.J.Pathol.146(2)：344-56(1995)中所述的间皮瘤。Harada等.(Mol.Urol.3(4)：357-364(1999)描述了人类睾丸生殖细胞肿瘤中WT1基因表达。Nonomura等.Hinyokika Kiyo 45(8)：593-7(1999)描述了利用睾丸癌特异性基因进行的聚合酶链式反应的睾丸癌的分子疾病分期。Shimizu等，In1.J.Gynecol.Pathol.19(2)：158-63(2000)描述了上皮卵巢肿瘤中维尔姆斯瘤基因(WT1)的免疫组织化学检测。
Barnoud，R.等，Am.J.Surg.Pathol.24(6)：830-6(2000)；和Pathol.Res.Pract.194(10)：693-700(1998)也描述了促纤维增生性小圆细胞肿瘤中的WT1过表达。Menssen，H.D.等，J.CancerRes.Clin.Oncol.126(4)：226-32(2000)，“与新分离的肿瘤标本比较，在肺癌、结肠癌和成胶质细胞瘤中的维尔姆斯瘤基因(WT1)表达”描述了成胶质细胞瘤和其它癌症中WT1过表达。表现出WT1过表达的其它疾病包括EBV相关疾病，诸如伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤和鼻咽癌(Spinsanti P.等，Leuk.Lymphoma 38(5-6)：611-9(2000)，“正常和恶性人类B淋巴细胞的维尔姆斯瘤基因表达”)。
在Pan等，Leukemia 14(9)：1634-4(2000)中描述了来源于患白血病或脊髓发育不良综合症患者的外周血单核细胞的体外IL-12治疗，并且报道了细胞毒性增加和WT1基因表达的减少。Leukemia 13(6)：891-900(1999)，Patmasiriwat等报道了脊髓发育不良综合症和急性白血病中的WT1和GATA1表达。Leukemia 13(3)：393-9(1999)，Tamaki等报道了维尔姆斯瘤基因WT1是诊断脊髓发育不良综合症疾病进展的良好标志物。Oji等，Jpn.J.Cancer Res.90(2)：194-204(1999)中讨论了维尔姆斯瘤基因WT1在实体瘤中的表达和其对肿瘤细胞生长的参与，涉及胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌细胞系、生殖细胞肿瘤细胞系、卵巢癌、子宫癌、甲状腺癌细胞系、肝细胞癌。
这里所提供的组合物可以单独地或与常规治疗方案，诸如外科手术、放射、化学治疗和/或(自身、同源、异源或无关的)骨髓移植联合使用。如下面更详细讨论的，这里所提供的结合剂和T细胞可以用于自身干细胞的净化。例如，在骨髓移植或者血液或其成分的输血前，这种净化是有益的。这里所提供的结合剂、T细胞、抗原呈递细胞(APC)和组合物可以进一步用于体外和/或体内扩增和刺激(或致敏)自身、异源、同源或无关的WT1特异性T细胞。例如，这种WT1特异性T细胞可以用在供体淋巴细胞输注中。
给药的途径和频率及剂量将随着不同的个体而变化，可以容易地用标准技术对其进行确定。通常，可以通过注射(例如，皮内、肌内、静脉内或皮下)，鼻内(例如，通过吸入)或口服给予药物组合物和疫苗。在一些肿瘤中，可以局部地(例如，直肠结肠镜检查、胃镜检查、视频内镜检查、血管造影术或本领域已知的其它方法)给予药物组合物或疫苗。优选，在52周的期间内可以给药1～10次剂量。优选，以1个月的间隔给药6次剂量，此后可以周期地给予加强接种。交替的方法可以适于单独的患者。适合的剂量是当如上所述给药时能促进比基线(即，未治疗的)水平高出至少10-50％的抗肿瘤免疫应答的化合物的量。通过测定患者中的抗肿瘤抗体或者通过依赖于疫苗的溶细胞效应细胞的产生可以监测这种应答，其中的溶细胞效应细胞能在体外杀死患者肿瘤细胞。与非接种的患者比较，这种疫苗也应该能在接种的患者中引起具有产生改进的临床结果的免疫应答(例如，更频繁地完全或部分缓解，或更长时间的无疾病和/或总的存活)。通常，对于包含一种或多种多肽的药物组合物和疫苗，其中存在的每种多肽的剂量范围是约100μg到5mg。适合的剂量大小将随着患者的身高体重等而变化，但是通常范围将是从约0.1mL到约5mL。
通常，适合的剂量和治疗方案以足以提供免疫和/或预防效果的量提供活性化合物。通过与非治疗患者相比在治疗患者中建立改进的临床结果(例如，更频繁地完全或部分缓解，或更长时间的无疾病和/或总的存活)可以监测这种应答。预存的对WT1免疫应答的增加通常与改进的临床结果相关。通常利用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定法可以评价这种免疫应答，利用获自治疗前后患者的样品可以进行所述的测定。
在一些实施方式中，免疫治疗可以是主动免疫治疗，其中该治疗依赖于通过给予免疫应答修饰试剂(诸如这里所提供的多肽和多核苷酸)，在体内刺激内源性宿主免疫系统起反应对抗肿瘤。
在其它实施方式中，免疫治疗可以是被动免疫治疗，其中该治疗涉及具有确定的肿瘤免疫反应性试剂(诸如效应细胞或抗体)的递送，该试剂可以直接或间接地介导抗肿瘤作用，并且不必一定依赖于完整的宿主免疫系统。效应细胞的例子包括上述T细胞、T淋巴细胞(诸如CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+T辅助肿瘤浸润淋巴细胞)、杀伤细胞(诸如自然杀伤细胞和淋巴因子激活杀伤细胞)、表达所述多肽的B细胞和抗原呈递细胞(诸如树突细胞和巨噬细胞)。对这里所述多肽特异的T细胞受体和抗体受体可以被克隆、表达和转移到其它载体或效应细胞中用于过继免疫治疗。也可以将这里所提供的多肽用来产生用于被动免疫治疗的抗体或抗独特型抗体(如上述和美国专利号4,918,164中所述)。
为了在检测、诊断分析或治疗应用中期望的选择性使用，可以利用各种标记中的任何标记对单克隆抗体进行标记(如美国专利号6,090,365；6,015,542；5,843,398；5,595,721和4,708,930中所述，因此这里将它们整体引入作为参考文献，就如同每篇文献单独被引入作为参考文献一样)。在每种情况下，标记的单克隆抗体与抗原决定簇位点的结合将发出检测信号或者发出向非正常细胞上的抗原决定簇递送特定治疗剂的信号。本发明的进一步目的是提供经过适当标记的特异性单克隆抗体，以此获得所期望的该抗体的选择性使用。
如这里所述，通过体外培养，可以获得足够量的用于过继免疫治疗的效应细胞。用于在体内将单个抗原特异性效应细胞扩增为总数几十亿个，同时保留其抗原识别的培养条件是本领域公知的。这种体外培养条件通常为在细胞因子(诸如IL-2)和不分裂的饲养细胞存在的情况下，使用抗原进行间歇刺激。如上所述，这里提供的免疫反应性多肽可以用于快速扩增抗原特异性T细胞培养物以产生足够数量的用于免疫治疗的细胞。特别地，利用本领域公知的标准技术，可以用免疫反应性多肽脉冲或用一种或多种多核苷酸转染的抗原呈递细胞，诸如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和/或B细胞。例如，可以用多核苷酸转染抗原呈递细胞，该多核苷酸具有适于增加其在重组病毒或其它表达系统中表达的启动子。培养的用于治疗中使用的效应细胞必须能广泛地生长和分布，并且能体内长期存活。研究表明通过用补加有IL-2的抗原进行重复刺激可以诱导培养的效应细胞以相当大的数量在体内生长和长期存活(参见，例如Cheever等，Immunological Reviews 157：177，1997)。
作为可替代的方案，表达这里所述多肽的载体可以被导入到取自患者的抗原呈递细胞中，并且离体克隆增殖以移植回相同的患者中。利用本领域已知的任何方法，可以优选以无菌形式通过静脉内、腔内、腹腔内或肿瘤内给药，将转染的细胞再次导入到患者中。
在另一方面，用于抑制与WT1表达相关的恶性疾病发生发展的方法包括给予已经被激活以应答如上所述WT1多肽或表达WT1的APC的自身T细胞。这种T细胞可以是CD4+和/或CD8+，并且可以如上所述被增殖。可以向个体给予能有效抑制恶性疾病发生发展的量的T细胞。通常，按照约1×109到1×1010个T细胞/M2向静脉内、腔内或切除肿瘤的病灶床中给药。对本领域技术人员而言显而易见，细胞的数量和给药的频率取决于患者的应答。
在一些实施方式中，可以在自身骨髓移植前刺激T细胞。可以在体内和体外进行这种刺激。对于体外刺激，获自患者的骨髓和/或外周血(或骨髓或外周血的级分)可以在足以允许上述T细胞刺激的条件下和时间内与WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的APC接触。然后利用标准技术，向患者给予骨髓、外周血干细胞和/或WT1特异性T细胞。
在相关的实施方式中，可以在同源性或异源性(相关或无关)骨髓移植前刺激相关或无关供体的T细胞。可以在体内和体外发生这种刺激。对于体外刺激，获自相关或无关供体的骨髓和/或外周血(或骨髓或外周血的级分)可以在足以允许上述T细胞刺激的条件下和时间内与WT1多肽、表达WT1多肽的WT1多核苷酸和/或APC接触。然后利用标准技术，可以向患者给予骨髓、外周血干细胞和/或WT1特异性T细胞。
在其它的实施方式中，这里所述的WT1特异性T细胞可以用于从自身骨髓、外周血或者骨髓或外周血的级分(例如，在向患者给药前富集CD34+的外周血(PB))中清除表达WT1的细胞。这种方法通过在一定条件下和时间内使骨髓或PB与这种T细胞接触，所述条件和时间足以允许表达WT1的细胞减少到骨髓或外周血中骨髓或淋巴细胞总数的10％以下，优选5％以下，更优选1％以下。用标准方法诸如，例如定性和定量PCR分析、形态学、免疫组织化学和FACS分析可以容易地检测这种细胞已经被清除的程度。然后，可以利用标准技术向患者给予骨髓或PB(或其级分)。
癌症检测和诊断组合物、方法和试剂盒
通常，可以根据获自患者的生物样品(例如，血液、血清、唾液、尿和/或肿瘤活检)中是否存在一种或多种WT1蛋白质和/或编码这种蛋白质的多核苷酸检查患者中与WT1表达相关的癌症。换而言之，这种WT1蛋白质可以用作表示癌症存在与否的标志。这里提供的结合剂通常允许检测生物样品中与结合剂结合的抗原水平。
可以用多核苷酸引物和探针检测编码WT1蛋白质的mRNA水平，该mRNA水平也指示性地表明癌症的存在与否。通常，WT1序列在肿瘤组织中应该以比肿瘤所来源的相同类型的正常组织中高至少2倍、优选3倍、更优选5倍或更高的水平存在。在一些诊断实施方式中，在与肿瘤来源组织类型不同的组织类型中WT1的表达水平无关，因为通过观察肿瘤组织中与相同类型正常组织中表达水平的预定差异表达水平，例如2倍、5倍等可以证实肿瘤细胞的存在。
可以方便地将其它差异表达模式用于诊断目的。例如，在本发明的一个方面，相同类型的肿瘤组织和正常组织中，但不是其它正常组织类型中，例如PBMC中WT1序列的过表达可以被开发用于诊断。在这种情况下，例如在取自不同于肿瘤来源组织位点的循环或一些其它组织位点的样品中，例如，通过利用RT-PCR分析检测样品中肿瘤序列的表达可以鉴定和/或证实转移性肿瘤细胞的存在。在许多情况下，将期望利用细胞捕获或其它类似的技术富集目的样品中肿瘤细胞，例如PBMC。
本领域普通技术人员已知有多种可以利用结合剂检测样品中的WT1多肽标志的测定法。参见，例如Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。通常，可以用下面的方法确定患者中是否存在与WT1相关的癌症：(a)用结合剂接触获自患者的生物样品；(b)检测样品中与结合剂结合的WT1多肽水平；和(c)比较WT1多肽的水平与预先确定的截断值。
在优选的实施方式中，该测定法包括使用固定在固相支持体上的结合剂结合并清除样品残余物中的WT1多肽。然后，可以利用含有报道基团的并与结合剂/WT1多肽复合物特异性结合的检测试剂对结合的WT1多肽进行检测。例如，这种检测试剂可以含有特异性结合WT1多肽的结合剂或特异性与结合剂结合的抗体或其它试剂，诸如抗免疫球蛋白、蛋白质G、蛋白质A或凝集素。作为可替代的方案，可以使用竞争性测定法，其中用报道基团标记WT1多肽，并且结合剂和样品温育后允许WT1多肽结合在固定的结合剂上。样品成分抑制标记的WT1多肽与结合剂结合的程度体现了样品与固定的结合剂的反应性。如上所述，适用于这种测定法的多肽包括结合剂结合的全长WT1蛋白质和其多肽部分。
固相支持体可以是本领域普通技术人员已知的WT1蛋白质可连接的任何材料。例如，固相支持体可以是微量滴定板或硝酸纤维素或其它适合的膜中的检测孔。作为可替代的方案，支持体可以是小珠或圆盘，诸如玻璃、玻璃纤维、乳胶或塑料材料诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支持体也可以是磁性颗粒或光导纤维传感器，诸如，例如美国专利号5,359,681中公开的支持体。利用本领域技术人员已知的各种技术，可以将结合剂固定在固相支持体上，在专利和科学文献中详尽地描述这些技术。在本发明的范围中，术语“固定”指非共价结合(诸如吸附)和共价连接(可以是支持体上试剂和官能团之间的直接连接或可以是通过交联剂的连接)。优选通过吸附固定到微量滴定板的孔或膜中。在这种情况下，通过在适当的缓冲液中使结合剂与固相支持体接触适当长的时间，可以获得吸附。接触时间随着温度而变化，但是通常在约1小时和约1天之间。通常，用数量范围是约10ng到约10μg，优选约100ng到约1μg的结合剂与塑料微量滴定板(例如聚苯乙烯或聚氯乙稀)的孔接触足以固定足够量的结合剂。
通常，可以通过首先使支持体与双功能试剂反应获得结合剂与固相支持体的共价连接，该双功能试剂将与支持体和连接到剂上的官能团，诸如羟基或氨基反应。例如，利用苯醌或通过支持体上的醛基与结合伴侣上胺和活性氢的缩合作用，结合剂可以共价连接到具有适当的聚合物包被的支持体(参见，例如Pierce ImmunotechnologyCatalog and Handbook，1991，在A12-A13)。
在一些实施方式中，测定法是双抗体夹心测定法。通过首先使已经被固定在固相支持体上的抗体与样品接触，所说的固相支持体通常是微量滴定板孔，以使样品中的WT1多肽与固定的抗体结合。然后，从固定的多肽-抗体复合物中去除未结合的样品，并且添加含有报道基团的检测试剂(优选能结合于多肽上的不同位点的二抗)。然后，利用适合于特异性报道基团的方法检测与固相支持体保持结合的检测试剂的量。
更具体地，一旦如上所述抗体被固定在支持体上，通常要对支持体上剩余的蛋白质结合位点进行封闭。可以使用本领域普通技术人员已知的任何适合的封闭剂，诸如牛血清白蛋白或Tween20TM(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)。然后，固定的抗体与样品温育，并且使多肽结合于抗体。温育前，可以用适合的稀释剂，诸如磷酸缓冲盐液(PBS)稀释样品。通常，适合的接触时间(即，温育时间)是足以检测获自患有与WT1相关癌症个体的样品中WT1多肽存在的时间长短，所获得的WT1中至少约95％处于结合和未结合多肽之间的平衡。本领域普通技术人员将知道通过测定出现在时间期间的结合水平，可以容易测定获得平衡所需的时间。在室温下，一般约30分钟的温育时间就足够了。
然后，通过用适合的缓冲液，诸如含有0.1％Tween 20TM的PBS冲洗固相支持体可以去除未结合的样品。然后，可以向固相支持体添加含有报道基团的二抗。优选的报道基团包括上述列举的报道基团。
然后，检测试剂与固定的抗体-多肽复合物温育时间，该段时间足以检测结合的多肽。一般通过测定出现在时间期间的结合水平来测定适合的时间段长短。然后，去除未结合的检测试剂，并且利用报道基团检测结合的检测试剂。用于检测报道基团的方法取决于报道基因的性质。对于放射性基团，闪烁计数或放射自显影方法一般是适合的。可以用光谱方法检测染料、发光基团和荧光基团。可以用偶联有不同报道基团(通常是放射性或荧光基团或酶)的抗生物素蛋白检测生物素。一般可以通过添加底物(通常作用特定的时间)，接着通过反应产物的光谱或其它分析检测酶报道基团。
为了确定与WT1表达相关的癌症存在与否，通常，比较从与固相支持体保持结合的报道基团检测得到的信号与对应于预先确定截断值的信号值。在一个优选的实施方式中，用于检测与WT1相关癌症的截断值是当固定的抗体与来自未患癌症的患者的样品温育时获得的平均信号。通常，产生预先确定截断值以上3个标准偏差信号的样品被认为是癌症阳性。在交替的优选实施方式中，利用接受者操作者曲线(Receiver Operator Curve)，根据Sackett等，ClinicalEpidemiology：A Basic Science for Clinical Medicine，LittleBrown and Co.，1985，106-7页的方法确定截断值。简而言之，在这个实施方式中，可以从对应于诊断检测结果的每个可能截断值的成对真阳性率(即，敏感性)和假阳性率(100％特异性)曲线确定截断值。曲线上最接近上部左侧角截断值(即，围绕最大面积的值)是最准确的截断值，并且产生高于通过这种方法所确定截断值的信号的样品可以认为是阳性的。作为可替代的方案，截断值可以沿着曲线移位到左侧以最小化假阳性率，或者移位到右侧以最小化假阴性率。通常，产生高于通过这种方法所确定截断值的信号的样品被认为是癌症阳性的。
在相关的实施方式中，以流通(flow-through)或试纸检测方法进行测定，其中结合剂固定在膜，诸如硝酸纤维素上。在流通检测中，当样品通过膜时，样品中的多肽结合固定的结合剂。然后，当含有第二种结合剂的溶液流过膜时，第二种标记的结合剂与结合剂-多肽复合物结合。然后，可以如上所述进行结合的第二种结合剂的检测。在试纸检测方法中，结合有结合剂的膜一端浸入在含有样品的溶液中。样品沿着膜迁移通过含有第二种结合剂的区域，并且到达固定的结合剂区。在固定抗体区的第二种结合剂浓度表示癌症的存在。通常，在该位点的第二种结合剂的浓度产生可视读取的图形，诸如线条。不存在这种图形表示阴性结果。通常，选定固定在膜上的结合剂的量，这样当生物样品含有的多肽水平能足以在上述方法的双抗体夹心测定法中产生阳性信号时，可产生目视可辨别的图形。这种测定法中使用的优选结合剂是抗体和其抗原结合片段。优选，固定在膜上抗体量的范围是约25ng到约1μg，更优选是约50ng到约500ng。通常可以用非常小量的生物样品进行这种检测。
当然，还有多种适合于与本发明WT1蛋白质或结合剂一起使用的其它测定方法。上面的描述仅仅是示例性的。例如，本领域普通技术人员显而易见可以容易地修改上述方法，使用肿瘤多肽对生物样品中与这种多肽结合的抗体进行检测。这种WT1特异性抗体的检测可以与WT1表达相关的癌症存在关联。
作为替代方案或者也可以基于是否存在特异性地与生物样品中的肿瘤蛋白质反应的T细胞而对与WT1表达相关的癌症进行检测。在一些方法中，自患者分离的包含CD4+和/或CD8+T细胞的生物样品与WT1多肽、编码这种多肽的多核苷酸和/或表达这种多肽至少免疫原性部分的APC温育，检测是否能特异性激活T细胞。适合的生物样品包括但不限于分离的T细胞。例如，可以是通过常规技术(诸如，通过外周血淋巴细胞的Ficoll/Hypaque(3，5-双(乙酰氨基)-2，4，6-三碘苯甲酸钠)密度梯度离心)从患者中分离的T细胞。可使T细胞在体外与多肽(例如，5-25μg/ml)在37℃温育2-9天(通常4天)。可能需要在无WT1多肽的情况下，温育另一等份的T细胞样品作为对照。对于CD4+T细胞，优选通过评价T细胞增殖检测激活。对于CD8+T细胞，优选通过评价溶细胞活性检测激活。比无病患者中高至少2倍的增殖水平和/或高至少20％的溶细胞活性表示患者中存在与WT1表达相关的癌症。
如上述，作为可替代的方案或者也可以基于生物样品中编码WT1蛋白质的mRNA水平检测癌症。例如，在基于聚合酶链式反应(PCR)的测定法中可以使用至少两种寡核苷酸引物以扩增来源于生物样品的WT1 cDNA部分，其中至少一种寡核苷酸引物对编码WT1蛋白质的多核苷酸特异(即，与其杂交)。然后，利用本领域公知的技术，诸如凝胶电泳分离和检测扩增的cDNA。
相似地，在杂交测定中可以使用特异性杂交编码WT1蛋白质多核苷酸的寡核苷酸探针以检测生物样品中编码WT1蛋白质的多核苷酸的存在。
为了允许测定条件下的杂交，寡核苷酸引物和探针应该包含与编码本发明WT1蛋白质的多核苷酸部分具有至少约60％，优选至少约75％，更优选至少约90％一致性的寡核苷酸序列，所述多核苷酸部分的长度是至少10个核苷酸，更优选至少20个核苷酸。如上所述，优选，寡核苷酸引物和/或探针在中等严格条件下杂交这里所述编码多肽的多核苷酸。在这里所述的诊断方法中可以有用地使用的寡核苷酸引物和/或探针优选长度是至少10-40个核苷酸。在优选的实施方式中，寡核苷酸引物包含具有这里所述序列的DNA分子的至少10个邻接的核苷酸，更优选至少15个邻接的核苷酸。基于PCT测定法和杂交测定法的技术是本领域公知的(参见，例如Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51：263，1987；Erlich编辑，PCR Technology，Stockton Press，NY，1989)。
一种优选的测定法使用了RT-PCR，其中PCR与逆转录联合应用。通常，从生物样品诸如活检组织提取RNA，并且将其逆转录以产生cDNA分子。利用至少一种特异性引物的PCR扩增产生cDNA分子，例如，利用凝胶电泳可以分离和观察该cDNA分子。可以对提取自检测患者和未患癌症的个体的生物样品进行扩增。可以对跨越2个数量级的若干稀释度的cDNA进行扩增反应。与相同稀释的非癌样品比较，若干稀释度的检测患者样品中增加2倍或更高的表达通常被认为是阳性的。
在本发明的另一方面，细胞捕获技术可以与例如实时PCR联合使用以提供表达WT1抗原的转移性细胞检测的更敏感工具。将生物样品，例如骨髓样品、外周血和穿刺样品中WT1相关癌细胞的检测用于患有与WT1表达相关癌患者的诊断和预后是值得期待的。
可以用表面细胞标记的特异性单克隆抗体或四聚体抗体复合物包被的免疫磁珠首先富集或阳性筛选样品中的癌细胞。可以使用各种商购的试剂盒，包括Dynabeads_ Epithelial Enrich(Dynal Biotech，Oslo，Norway)、StemSepTM(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，BC)和RosetteSep(StemCell Technologies)。本领域技术人员将认识到还可以使用其它的方法学和试剂盒富集或阳性筛选期望的细胞群。Dynabeads_Epithelial Enrich含有mAb包被的磁珠，该mAbs对正常和肿瘤上皮组织上表达的两种糖蛋白膜抗原特异。可以向样品添加包被的小珠，然后将样品应用于磁体，因此捕获结合于小珠的细胞。冲洗掉不需要的细胞，并且从小珠洗脱磁分离的细胞，并且在进一步分析中使用。
可以用RosetteSep直接从血液样品中富集细胞，RosetteSep中包含四聚体抗体混合物，该混合物靶向各种不需要的细胞，并且它们与样品中红细胞(RBC)上的血型糖蛋白A交联，形成花结。当通过Ficoll离心时，所靶向的细胞与游离的RBC一起沉淀。在耗竭混合物中的抗体组合决定将去除哪种细胞和随后将回收哪种细胞。可以使用的抗体包括但不限于：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD24、CD25、CD29、CD33、CD34、CD36、CD38、CD41、CD45、CD45RA、CD45RO、CD56、CD66B、CD66e、HLA-DR、IgE和TCRαβ。
在另一个实施方式中，这里所述的组合物可用作癌症进展的标志。在该实施方式中，可以随着时间进行上述与WT1表达相关的癌症诊断测定，并且评价反应性多肽或多核苷酸水平的改变。例如，可以每隔24-72小时进行测定，测定时间为6个月到1年期间，此后根据需要进行测定。通常，随着时间检测到的WT1多肽或多核苷酸增加的患者中，其癌症正在进展。相反，当反应性多肽或多核苷酸的水平随着时间保持恒定或减少时，癌症没有进展。
可以直接对肿瘤进行一些体内诊断测定。一种这样的测定法包括用结合剂接触肿瘤细胞。然后，通过报道基团可以直接或间接地检测已结合的结合剂。这种结合剂也可以用在组织学应用中。作为可替代的方案，多核苷酸探针可以用在这种应用中。
本发明进一步提供了在任何上述诊断方法中使用的试剂盒。这种试剂盒通常包含用于诊断测定的两种或多种成分。该成分可以是化合物、试剂、容器和/或设备。例如，试剂盒中的一个容器可以含有特异性结合WT1蛋白质的单克隆抗体或其片段。如上所述，可以提供与支持体材料附着的这种抗体或片段。一个或多个另外的容器可以包含测定法中将要使用的组分，诸如试剂或缓冲液。这种试剂盒也可以或者作为可替代的方案包含上述检测试剂，该检测试剂含有适于抗体结合直接或间接检测的报道基团。
作为可替代的方案，可以设计试剂盒以检测生物样品中编码WT1蛋白质的mRNA水平。这种试剂盒通常包含与编码WT1蛋白质的多核苷酸杂交的上述至少一种寡核苷酸探针或引物。例如，这种寡核苷酸可以用于PCR或杂交测定法中。这种试剂盒中可以存在的另外成分包括第二种寡核苷酸和/或诊断试剂或容器以有利于编码WT1蛋白质的多核苷酸检测。
下面的实施例用于示例，其不限制本发明。
具体实施方式
实施例
实施例1
对患有血液恶性肿瘤的患者中的WT1免疫应答的鉴定
这个实施例示例了对患有血液恶性肿瘤的患者中现存的免疫应答的鉴定。
为了评价患者中预先存在有WT1特异性抗体应答，利用Western印迹分析法分析患有急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性髓细胞白血病(CML)和严重再生障碍性贫血患者的血清。检测血清免疫沉淀来源于人类白血病细胞系K562的WT1的能力(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA)。在每种情况下，通过凝胶电泳分离免疫沉淀物，将其转移到膜上，并且用抗WT1抗体WT180(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)探测它。这种Western印迹分析鉴定了患有血液恶性肿瘤的患者中潜在的WT1特异性抗体。表示患AML的患者的结果的代表性Western印迹如图2中所示。利用患者血清所生成的免疫沉淀物中的52kDa蛋白质被WT1特异性抗体识别。该52kD蛋白的迁移距离与阳性对照相同。
另外的研究分析了患有AML和CML的患者血清中是否存在有针对全长和截短WT1蛋白质的抗体。将表示人类WT1/全长(aa1-449)，N-末端(aa-1-249)(WT1/N-末端)和C-末端(aa267-449)(WT1/C-末端)区域的cDNA构建体亚克隆到经过修饰的pET28载体中。WT1/全长和WT1/N-末端蛋白质被表达为Ra12融合蛋白。Ra12是被称为MTB32B的分泌型结核分枝杆菌蛋白质的C末端片段(Skeiky等，Infect Immun.67；3998，1999)。Ra12-WT1/全长融合区域3’端被克隆到经组氨酸标记修饰的pET28载体中的组氨酸标记处。WT1/N-末端区域被亚克隆到经修饰的pET28载体中，该载体具有5’组氨酸标记，接着是硫氧还蛋白(TRX)-WT1/N-末端融合区域，接着是3’组氨酸标记。WT1/C-末端编码区被亚克隆到经修饰的pET28载体中，该载体无融合伴侣，只含有5’和3’组氨酸标记，接着是凝血酶和EK位点。
用3种WT1表达构建体转化BL21 pLysS大肠杆菌(E.coli)(Stratagene，La Jolla，CA)，过夜生长，并且用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。如下纯化WT1蛋白质：收集细胞，并且在37℃，通过在具有完全蛋白酶抑制剂片剂的10mM Tris，pH8.0(Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)中温育裂解细胞，接着重复超声处理循环。用10mM Tris，pH8冲洗包涵体2次。然后，通过对镍-次氮基三乙酸树脂进行金属螯合物亲和层析(QIAGEN Inc.，Valencia，CA；Hochuli等，Biologically ActiveMolecules：217，1989)，接着通过在Source Q阴离子交换树脂(Amersham Pharmacia Biotech，Upsala，Sweden)上层析纯化蛋白质。通过N-末端测序证实WT1蛋白质一致性。
研究来源于患有非继发性AML或CML成人患者的血清中是否存在特异性Ab。将重组蛋白质吸附到TC微孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)。用PBS/0.5％Tween 20冲洗该板，并且用1％BSA/PBS/0.1％Tween 20封闭该板。冲洗后，添加血清稀释液，并且在4℃过夜温育。冲洗该板，添加驴抗人类IgG-HRP二抗(Jackson-1mmunochem，West Grove，PA)，并且在室温下温育2h。冲洗该板，与TMB过氧化物酶底物溶液(Kirkegaard and Perry Laboratories，MA)温育，用1N H2SO4猝灭，并且立刻读数(Cyto-Fluor 2350；Millipore，Bedford，MA)。
为了进行血清学监测，用ELISA检测1∶50到1∶20,000系列稀释范围的人类血清。阳性反应定义为超过来源于正常供体(n＝96)(WT1/全长、WT1C-末端)血清平均OD值3个标准偏差的1∶500稀释血清的OD值。由于正常供体血清对WT1/N-末端蛋白质具有较高的背景，所以对WT1/N-末端的阳性反应定位为超过来源于正常供体血清平均OD值4个标准偏差的1∶500稀释血清的OD值。为了证实患者Ab应答是直接针对WT1，而不是针对蛋白质的Ra12或TRX融合部分或可能的大肠杆菌杂质蛋白质，对照包含用相同的方法单独纯化的Ra12和TRX蛋白质。从分析中排除掉显示抗Ra12和/或TRX蛋白质反应性的样品。
为了评价是否具有对WT1的免疫性，检测正常个体和患有白血病患者血清中针对重组全长和截短WT1蛋白质的Ab。通过检测与WT1/全长蛋白质、WT1/N-末端蛋白质和WT1/C-末端蛋白质的ELISA反应性分析抗体的反应性。
96个正常供体中只有2个供体具有与WT1/全长蛋白质反应的血清抗体(图18)。其中一个个体具有WT1/N-末端蛋白质的抗体，另一个个体具有WT1/C-末端蛋白质的抗体。相反，在患有AML的63名患者中有16名患者(25％)具有与WT1/全长蛋白质反应的血清抗体。63名患者中只有2名患者(3％)具有对WT1/C-末端蛋白质的反应性，可以说对比鲜明。在患有CML的81名患者中有15名患者(19％)具有与WT1/全长蛋白质反应的血清抗体，81名患者中的12名患者(15％)具有与WT1/N-末端蛋白质反应的血清抗体。81名患者中只有3名患者(3％)具有对WT1/C-末端蛋白质的反应性(图16和17)。
这些数据表明在一些患有AML和CML的患者可检测到Ab应答WT1。白血病患者中更多的抗体发生率给由于患者具有表达或在一些时间表达WT1的恶性肿瘤而导致出现对WT1蛋白质的免疫提供了强有力的证据。不限于特定的理论，认为观察到的对WT1的抗体应答最可能是由于患者自身白血病细胞上的WT1免疫而引起的，并且提供了尽管WT1是“自身”蛋白质，但是它可以是免疫原性的直接证据。
WT1抗体的存在强有力地解释了在相同患者中同时存在的辅助T细胞应答。WT1是内部蛋白质。因此，CTL应答可能在白血病治疗方面最有效，并且可能是最毒的免疫性武器。因此，这些数据提供了针对WT1的治疗疫苗将能激发对WT1免疫应答的证据。
检测到的大多数抗体与N-末端内的表位反应，而只有一小分组患者显示了对C-末端的弱抗体应答。这与动物模型中的观察结果一致，而用来源于N-末端的肽免疫激发了抗体、辅助T细胞和CTL应答，但是经检测没有一种来源于C-末端的肽激发了抗体或T细胞应答(Gaiger等，Blood 96：1334，2000)。
实施例2
用表达WT1的细胞系免疫小鼠诱导WT1抗体
该实施例示例了用表达WT1的细胞诱导体内WT1特异性抗体应答。
在患有白血病的患者中存在有WT1抗体的检测强有利地表明可以对WT1蛋白质免疫以激发对WT1的免疫性。为了检测通过接种可以产生对WT1的免疫性，用TRAMP-C注射B6来源的WT1阳性肿瘤细胞系小鼠。简而言之，用5×106个TRAMP-C细胞皮下免疫雄性B6小鼠，以3周为间隔用5×106个细胞加强免疫2次。在最后免疫后经过3周，获得血清，并且在含有25μM β-2-巯基乙醇、200单位青霉素/ml、10mML-谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO)中制备脾脏的单细胞悬浮液。
TRAMP-C免疫后，检测到了免疫动物中WT1特异性抗体应答。代表性的Western印迹如图3中所示。这些结果表明对WT1蛋白质免疫可以激发对WT1蛋白质的应答。
实施例3
用WT1肽免疫小鼠诱导TH和抗体应答
该实施例示例了用WT1肽免疫以激发对WT1特异性免疫应答的能力。
根据Tsites程序(Rothbard and Taylor，SAMBO J.7：93-100，1988；Deavin等，Mol.Immunol.33：145-155，1996)鉴定适于激发Ab和增殖性T细胞应答的肽，该程序检索了有潜能激发Th应答的肽基序。合成和测定了表I中所示的肽的序列。
                             表I
                            WT1肽
  肽   序列  注释
  小鼠：p6-22   RDLNALLPAVSSLGGGG(SEQ ID NO：13)  相对于人类WT1序列有1个错配
  人类：p6-22   RDLNALLPAVPSLGGGG(SEQ ID：1)
  人类/小鼠：p117-139   PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(SEQ ID NO：2和3)
  小鼠：p244-262   GATLKGMAAGSSSSVKWTE(SEQ ID NO：14)  相对于人类WT1序列有1个错配
  人类：p244-262   GATLKGVAAGSSSSVKWTE(SEQ ID NO：4)
  人类/小鼠：p287-301   RIHTHGVFRGIQDVR(SEQ ID NO：15和16)
  小鼠：p299-313   VRRVSGVAPTLVRS(SEQ ID NO：17)  相对于人类WT1序列有1个错配
  人类/小鼠：p421-435   CQKKFARSDELVRHH(SEQ ID NO：19和20)
为了免疫，将肽分组如下：
A组p6-22人类：1ml中10.9mg(10μl＝100μg)
   p117-139人类/小鼠：1ml中7.6mg(14μl＝100μg)
   p244-262人类：1ml中4.6mg(22μl＝100μg)
B组p287-301人类/小鼠：1ml中7.2mg(14μl＝100μg)
   小鼠p299-313：1ml中6.6mg(15μl＝100μg)
   p421-435人类/小鼠：1ml中3.3mg(30μl＝100μg)
对照(FBL肽100μg)+CFA/IFA
对照(CD45肽100μg)+CFA/IFA
A组含有存在于WT1氨基末端部分中的肽(外显子1)，B组含有存在于羧基末端中的肽，该羧基末端含有4个锌指区域，该锌指区域具有与其它DNA结合蛋白质同源的序列。B组中，p287-301和p299-313来源于外显子7和锌指1，p421-435来源于外显子10和锌指IV。
用一组WT1肽或用对照肽免疫B6小鼠。在1ml无菌水中溶解肽用于注射，以3周的时间间隔免疫B6小鼠3次。使用的佐剂是CFA/IFA、GM-CSF和Montinide。然后，如实施例1和2中所述检测对WT1特异的抗体存在，并且利用标准胸苷掺入测定法评价增殖性T细胞应答，其中在抗原存在的情况下培养细胞，并且通过测定掺入的放射性评价增殖(Chen等，Cancer Res.54：1065-1070，1994)。特别地，淋巴细胞在96孔板中以每孔2×105个细胞与4×105个经过照射的(3000拉德)同系脾脏细胞和指定的肽一起培养。
用指定为A组的一组肽免疫小鼠激发了对WT1的免疫应答(图4)。疫苗B免疫后没有检测到抗体，这与用B细胞免疫而未出现辅助T细胞应答一致。P117-139激发了增殖性T细胞应答(图5A-5C)。刺激指数(SI)在8和72之间变化。其它的肽(P6-22和P299-313)也表现出能激发增殖性T细胞应答。用P6-22免疫引起的刺激指数(SI)为2.3，用P299-313免疫引起的刺激指数(SI)为3.3。阳性对照包含ConA刺激的T细胞及经过用已知抗原，诸如CD45和FBL刺激的T细胞及异源T细胞系(DeBruijn等，Eur.J.Immunol.21：2963-2970，1991)。
图6A和6B表示观察到的针对疫苗A(图6A)和疫苗B(图6B)中3种肽中每种肽的增殖性应答。疫苗A激发对免疫肽p6-22和p117-139的增殖性T细胞应答，刺激指数(SI)在3和8之间变化(大量线条)。没有检测到对p244-262的增殖性应答(图6A)。
随后作为只利用p6-22和p117-139的单肽刺激进行体外刺激。用p117-139刺激疫苗A特异性T细胞系，结果引起其针对p117-139的增殖，但是其没有对p6-22的应答(图7A)。来源于该细胞系的克隆对p117-139具有特异性(图7B)。相反，用p6-22刺激疫苗A特异性T细胞系，结果引起了针对p6-22的增殖，但是其没有产生针对p117-139的应答(图7C)。来源于该细胞系的克隆对p6-22是特异的(图7D)。
这些结果表明用WT1肽接种可以激发对WT1蛋白质的抗体应答和对免疫肽的增殖性T细胞应答。
实施例4
用WT1肽免疫小鼠诱导CTL应答
该实施例示例了WT1肽激发CTL免疫性的能力。
利用BIMAS HLA肽结合预测分析法(Parker等，J.Immunol.152：163，1994)鉴定具有适于结合于I类MHC的基序的肽(9-mers)。用这种分析法鉴定的肽如表II-XLIV中所示。在这些表的每个表中，分值反映了肽与所示MHC分子的理论结合亲和性(解离的半衰期)。表中还示出了如Rammensee等，Immunogenetics 41：178-228，1995所述确定的肽结合基序，这里将这篇文献整体引入作为参考文献。DiBrino等，J.Biol.Chem.269：23426-23434，1994中描述的HLA-B14的肽结合基序，这里也将这篇文献引入作为参考文献。肽的位置简写为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8和P9。
使用Tsites程序(Rothbard和Taylor，EMBO J.7：93-100，1988；Deavin等，Mol.Immunol.33：145-155，1996)鉴定肽，该程序检索具有激发Th应答潜能的肽基序，在图8A和8B和表XLV中进一步示出了该肽基序。
                          表II
              对人类WT1肽与人类HLA A1结合
              的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-A1肽结合基序锚定残基是在位置3(P3)的D或E；在P9的Y；
              辅助锚定是在P4的P和在P7的L)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   137   CLESQPAIR(SEQ ID NO：47)   18.000
  2   80   GAEPHEEQC(SEQ ID NO：87)   9.000
  3   40   FAPPGASAY(SEQ ID NO：74)   5.000
  4   354   QCDFKDCER(SEQ ID NO：162)   5.000
  5   2   GSDVRDLNA(SEQ ID NO：101)   3.750
  6   152   VTFDGTPSY(SEQ ID NO：244)   2.500
  7   260   WTEGQSNHS(SEQ ID NO：247)   2.250
  8   409   TSEKPFSCR(SEQ ID NO：232)   1.350
  9   73   KQEPSWGGA(SEQ ID NO：125)   1.350
  10   386   KTCQRKFSR(SEQ ID NO：128)   1.250
  11   37   VLDFAPPGA(SEQ ID NO：241)   1.000
  12   325   CAYPGCNKR(SEQ ID NO：44)   1.000
  13   232   QLECMTWNQ(SEQ ID NO：167)   0.900
  14   272   ESDNHTTPI(SEQ ID NO：71)   0.750
  15   366   RSDQLKRHQ(SEQ ID NO：193)   0.750
  16   222   SSDNLYQMT(SEQ ID NO：217)   0.750
  17   427   RSDELVRHH(SEQ ID NO：191)   0.750
  18   394   RSDHLKTHT(SEQ ID NO：192)   0.750
  19   317   TSEKRPFMC(SEQ ID NO：233)   0.675
  20   213   QALLLRTPY(SEQ ID NO：160)   0.500
                       表III
             对人类WT1肽与人类HLA A 0201结合
               的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-A0201肽结合基序锚定残基是在P2的L或M；在P9的V或L；
                  辅助锚定是在P6的V)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   313.968
  2   187   SLGEQQYSV(SEQ ID NO：214)   285.163
  3   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   181.794
  4   242   NLGATLKGV(SEQ ID NO：146)   159.970
  5   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   68.360
  6   292   GVFRGIQDV(SEQ ID NO：103)   51.790
  7   191   QQYSVPPPV(SEQ ID NO：171)   22.566
  8   280   ILCGAQYRI(SEQ ID NO：116)   17.736
  9   235   CMTWNQMNL(SEQ ID NO：49)   15.428
  10   441   NMTKLQLAL(SEQ ID NO：149)   15.428
  11   7   DLNALLPAV(SEQ ID NO：58)   11.998
  12   227   YQMTSQLEC(SEQ ID NO：251)   8.573
  13   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   8.014
  14   309   TLVRSASET(SEQ ID NO：226)   7.452
  15   408   KTSEKPFSC(SEQ ID NO：129)   5.743
  16   340   LQMHSRKHT(SEQ ID NO：139)   4.752
  17   228   QMTSQLECM(SEQ ID NO：169)   4.044
  18   93   TVHFSGQFT(SEQ ID NO：235)   3.586
  19   37   VLDFAPPGA(SEQ ID NO：241)   3.378
  20   86   EQCLSAFTV(SEQ ID NO：69)   3.068
                  表IV
       对人类WT1肽与人类HLA A 0205结合
       的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-A0205肽结合基序锚定残基是在P9的L；辅助锚定是在P2
         的V、L、I、M和在P6的I、V、L、A)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   42.000
  2   292   GVFRGIQDV(SEQ ID NO：103)   24.000
  3   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   21.000
  4   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   21.000
  5   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   16.800
  6   302   RVPGVAPTL(SEQ ID NO：195)   14.000
  7   441   NMTKLQLAL(SEQ ID NO：149)   7.000
  8   235   CMTWNQMNL(SEQ ID NO：49)   7.000
  9   187   SLGEQQYSV(SEQ ID NO：214)   6.000
  10   191   QQYSVPPPV(SEQ ID NO：171)   4.800
  11   340   LQMHSRKHT(SEQ ID NO：139)   4.080
  12   242   NLGATLKGV(SEQ ID NO：146)   4.000
  13   227   YQMTSQLEC(SEQ ID NO：251)   3.600
  14   194   SVPPPVYGC(SEQ ID NO：218)   2.000
  15   93   TVHFSGQFT(SEQ ID NO：235)   2.000
  16   280   ILCGAQYRI(SEQ ID NO：116)   1.700
  17   98   GQFTGTAGA(SEQ ID NO：99)   1.200
  18   309   TLVRSASET(SEQ ID NO：226)   1.000
  19   81   AEPHEEQCL(SEQ ID NO：30)   0.980
  20   73   KQEPSWGGA(SEQ ID NO：125)   0.960
                   表V
       对人类WT1肽与人类HLA A 24结合
       的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA A 24肽结合基序锚定残基是在P2的Y；在P9的I、L或F；
       辅助锚定是在P5的I或V和在P6的F)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   302   RVPGVAPTL(SEQ ID NO：195)   16.800
  2   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：194)   12.000
  3   356   DFKDCERRF(SEQ ID NO：55)   12.000
  4   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   9.600
  5   326   AYPGCNKRY(SEQ ID NO：42)   7.500
  6   270   GYESDNHT(SEQ ID NO：106)T   7.500
  7   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   7.200
  8   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   7.200
  9   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   7.200
  10   329   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：90)   6.600
  11   417   RWPSCQKKF(SEQ ID NO：196)   6.600
  12   47   AYGSLGGPA(SEQ ID NO：41)   6.000
  13   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   6.000
  14   4   DVRDLNALL(SEQ ID NO：62)   5.760
  15   285   QYRIHTHGV(S EQ ID NO：175)   5.000
  16   192   QYSVPPPVY(SEQ ID NO：176)   5.000
  17   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   4.800
  18   441   NMTKLQLAL(SEQ ID NO：149)   4.800
  19   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   4.000
  20   235   CMTWNQMNL(SEQ ID NO：49)   4.000
                     表VI
          对人类WT1肽与人类HLA A 3结合
          的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-A3肽结合基序锚定残基是在P2的L、V或M；在P9的K、
Y或F；辅助锚定是在P3的F或Y；在P6的I、M、F、V或L；在P7
                  的I、L、M、F)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   436   NMHQRNMTK(SEQ ID NO：148)   40.000
  2   240   QMNLGATLK(SEQ ID NO：168)   20.000
  3   88   CLSAFTVHF(SEQ ID NO：48)   6.000
  4   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   4.500
  5   169   AQFPNHSFK(SEQ ID NO：36)   4.500
  6   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   4.050
  7   137   CLESQPAIR(SEQ ID NO：47)   4.000
  8   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   3.000
  9   32   AQWAPVLDF(SEQ ID NO：37)   2.700
  10   280   ILCGAQYRI(SEQ ID NO：116)   2.700
  11   386   KTCQRKFSR(SEQ ID NO：128)   1.800
  12   235   CMTWNQMNL(SEQ ID NO：49)   1.200
  13   441   NMTKLQLAL(SEQ ID NO：149)   1.200
  14   152   VTFDGTPSY(SEQ ID NO：244)   1.000
  15   187   SLGEQQYSV(SEQ ID NO：214)   0.900
  16   383   FQCKTCQRK(SEQ ID NO：80)   0.600
  17   292   GVFRGIQDV(SEQ ID NO：103)   0.450
  18   194   SVPPPVYGC(SEQ ID NO：218)   0.405
  19   287   RIHTHGVFR(SEQ ID NO：182)   0.400
  20   263   GQSNHSTGY(SEQ ID NO：100)   0.360
                      表VII
          对人类WT1肽与人类HLA A 68.1结合
          的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-A68.1肽结合基序锚定残基是在P2的V或T；在P9的R
                      或K)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   100   FTGTAGACR(SEQ ID NO：84)   100.000
  2   386   KTCQRKFSR(SEQ ID NO：128)   50.000
  3   368   DQLKRHQRR(SEQ ID NO：60)   30.000
  4   312   RSASETSEK(SEQ ID NO：190)   18.000
  5   337   LSHLQMHSR(SEQ ID NO：141)   15.000
  6   364   FSRSDQLKR(SEQ ID NO：83)   15.000
  7   409   TSEKPFSCR(SEQ ID NO：232)   15.000
  8   299   DVRRVPGVA(SEQ ID NO：63)   12.000
  9   4   DVRDLNALL(SEQ ID NO：62)   12.000
  10   118   SQASSGQAR(SEQ ID NO：216)   10.000
  11   343   HSRKHTGEK(SEQ ID NO：111)   9.000
  12   169   AQFPNHSFK(SEQ ID NO：36)   9.000
  13   292   GVFRGIQDV(SEQ ID NO：103)   8.000
  14   325   CAYPGCNKR(SEQ ID NO：44)   7.500
  15   425   FARSDELVR(SEQ ID NO：75)   7.500
  16   354   QCDFKDCER(SEQ ID NO：162)   7.500
  17   324   MCAYPGCNK(SEQ ID NO：142)   6.000
  18   251   AAGSSSSVK(SEQ ID NO：28)   6.000
  19   379   GVKPFQCKT(SEQ ID NO：104)   6.000
  20   137   CLESQPAIR (SEQ ID NO：47)   5.000
                    表VIII
         对人类WT1肽与人类HLA A1101结合
        的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-A1101肽结合基序锚定残基是在P9的K；辅助锚定残基是在P2的V、I、F、Y，在P 3的M、L、F、Y、I、A，在P7的L、I、Y、V或F)
顺序 起始位置 亚序列残基列表 分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   386   KTCQRKFSR(SEQ ID NO：128)   1.800
  2   169   AQFPNHSFK(SEQ ID NO：36)   1.200
  3   436   NMHQRNMTK(SEQ ID NO：148)   0.800
  4   391   KFSRSDHLK(SEQ ID NO：120)   0.600
  5   373   HQRRHTGVK(SEQ ID NO：109)   0.600
  6   383   FQCKTCQRK(SEQ ID NO：80)   0.600
  7   363   RFSRSDQLK(SEQ ID NO：178)   0.600
  8   240   QMNLGATLK(SEQ ID NO：168)   0.400
  9   287   RIHTHGVFR(SEQ ID NO：182)   0.240
  10   100   FTGTAGACR(SEQ ID NO：84)   0.200
  11   324   MCAYPGCNK(SEQ ID NO：142)   0.200
  12   251   AAGSSSSVK(SEQ ID NO：28)   0.200
  13   415   SCRWPSCQK(SEQ ID NO：201)   0.200
  14   118   SQASSGQAR(SEQ ID NO：216)   0.120
  15   292   GVFRGIQDV(SEQ ID NO：103)   0.120
  16   137   CLESQPAIR(SEQ ID NO：47)   0.080
  17   425   FARSDELVR(SEQ ID NO：75)   0.080
  18   325   CAYPGCNKR(SEQ ID NO：44)   0.080
  19   312   RSASETSEK(SEQ ID NO：190)   0.060
  20   65   PPPPHSFIK(SEQ ID NO：156)   0.060
                         表IX
            对人类WT1肽与人类HLA A 3101结合
             的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-A3101肽结合基序锚定残基是在P9的R；辅助锚定是在P2的L、V、Y或F；在P3的F、L、Y、W，在P6的L、F、V、I)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   386   KTCQRKFSR(SEQ ID NO：128)   9.000
  2   287   RIHTHGVFR(SEQ ID NO：182)   6.000
  3   137   CLESQPAIR(SEQ ID NO：47)   2.000
  4   118   SQASSGQAR(SEQ ID NO：216)   2.000
  5   368   DQLKRHQRR(SEQ ID NO：60)   1.200
  6   100   FTGTAGACR(SEQ ID NO：84)   1.000
  7   293   VFRGIQDVR(SEQ ID NO：238)   0.600
  8   325   CAYPGCNKR(SEQ ID NO：44)   0.600
  9   169   AQFPNHSFK(SEQ ID NO：36)   0.600
  10   279   PILCGAQYR(SEQ ID NO：155)   0.400
  11   436   NMHQRNMTK(SEQ ID NO：148)   0.400
  12   425   FARSDELVR(SEQ ID NO：75)   0.400
  13   32   AQWAPVLDF(SEQ ID NO：37)   0.240
  14   240   QMNLGATLK(SEQ ID NO：168)   0.200
  15   354   QCDFKDCER(SEQ ID NO：162)   0.200
  16   373   HQRRHTGVK(SEQ ID NO：109)   0.200
  17   383   FQCKTCQRK(SEQ I D NO：80)   0.200
  18   313   SASETSEKR(SEQ ID NO：197)   0.200
  19   358   KDCERRFSR(SEQ ID NO：118)   0.180
  20   391   KFSRSDHLK(SEQ ID NO：120)   0.180
                       表X
            对人类WT1肽与人类HLA A 3302结合
             的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-A3302肽结合基序锚定残基是在P9的R；辅助锚定是在P2
                    的A、I、L、F、Y或V)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   337   LSHLQMHSR(SEQ ID NO：141)   15.000
  2   409   TSEKPFSCR(SEQ ID NO：232)   15.000
  3   364   FSRSDQLKR(SEQ ID NO：83)   15.000
  4   137   CLESQPAIR(SEQ ID NO：47)   9.000
  5   368   DQLKRHQRR(SEQ ID NO：60)   9.000
  6   287   RIHTHGVFR(SEQ ID NO：182)   4.500
  7   210   TGSQALLLR(SEQ ID NO：223)   3.000
  8   425   FARSDELVR(SEQ ID NO：75)   3.000
  9   313   SASETSEKR(SEQ ID NO：197)   3.000
  10   293   VFRGIQDVR(SEQ ID NO：238)   3.000
  11   354   QCDFKDCER(SEQ ID NO：162)   3.000
  12   100   FTGTAGACR(SEQ ID NO：84)   3.000
  13   118   SQASSGQAR(SEQ ID NO：216)   3.000
  14   325   CAYPGCNKR(SEQ ID NO：44)   3.000
  15   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   1.500
  16   139   ESQPAIRNQ(SEQ ID NO：72)   1.500
  17   299   DVRRVPGVA(SEQ ID NO：63)   1.500
  18   419   PSCQKKFAR(SEQ ID NO：159)   1.500
  19   272   ESDNHTTPI(SEQ ID NO：71)   1.500
  20   4   DVRDLNALL(SEQ ID NO：62)   1.500
                   表XI
         对人类WT1肽与人类HLA B14结合
        的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B14肽结合基序锚定残基是在P2的R，在P3的Y，在P5
的R，在P9的L；4个锚定残基中的3个残基就足够了)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   362   RRFSRSDQL(SEQ ID NO：187)   1000.000
  2   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：127)   300.000
  3   423   KKFARSDEL(SEQ ID NO：122)   150.000
  4   390   RKFSRSDHL(SEQ ID NO：183)   150.000
  5   439   QRNMTKLQL(SEQ ID NO：173)   20.000
  6   329   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：90)   10.000
  7   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   10.000
  8   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   9.000
  9   301   RRVPGVAPT(SEQ ID NO：189)   6.000
  10   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   5.000
  11   371   KRHQRRHTG(SEQ ID NO：126)   5.000
  12   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   5.000
  13   144   IRNQGYSTV(SEQ ID NO：117)   4.000
  14   429   DELVRHHNM(SEQ ID NO：53)   3.000
  15   437   MHQRNMTKL(SEQ ID NO：143)   3.000
  16   125   ARMFPNAPY(SEQ ID NO：38)   3.000
  17   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   3.000
  18   286   YRIHTHGVF(SEQ ID NO：252)   3.000
  19   174   HSFKHEDPM(SEQ ID NO：110)   3.000
  20   372   RHQRRHTGV(SEQ ID NO：181)   3.000
                     表XII
           对人类WT1肽与人类HLA B40结合
          的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B40肽结合基序锚定残基是在P2的E，在P9的L、W、M或A；
           辅助锚定是在P3的F、I或V)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   81   AEPHEEQCL(SEQ ID NO：30)   40.000
  2   429   DELVRHHNM(SEQ ID NO：53)   24.000
  3   410   SEKPFSCRW(SEQ ID NO：207)   20.000
  4   318   SEKRPFMCA(SEQ ID NO：208)   15.000
  5   233   LECMTWNQM(SEQ ID NO：131)   12.000
  6   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：206)   10.000
  7   349   GEKPYQCDF(SEQ ID NO：91)   8.000
  8   6   RDLNALLPA(SEQ ID NO：177)   5.000
  9   85   EEQCLSAFT(SEQ ID NO：65)   4.000
  10   315   SETSEKRPF(SEQ ID NO：209)   4.000
  11   261   TEGQSNHST(SEQ ID NO：221)   4.000
  12   23   GCALPVSGA(SEQ ID NO：89)   3.000
  13   38   LDFAPPGAS(SEQ ID NO：130)   3.000
  14   273   SDNHTTPIL(SEQ ID NO：204)   2.500
  15   206   TDSCTGSQA(SEQ ID NO：220)   2.500
  16   24   CALPVSGAA(SEQ ID NO：43)   2.000
  17   98   GQFTGTAGA(SEQ ID NO：99)   2.000
  18   30   GAAQWAPVL(SEQ ID NO：86)   2.000
  19   84   HEEQCLSAF(SEQ ID NO：107)   2.000
  20   26   LPVSGAAQW(SEQ ID NO：138)   2.000
                    表XIII
           对人类WT1肽与人类HLA B60结合
           的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B60肽结合基序锚定残基是在P2的E，在P9的L；辅助锚定是
                      在P7的I或V)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   81   AEPHEEQCL(SEQ ID NO：30)   160.000
  2   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：206)   40.000
  3   429   DELVRHHNM(SEQ ID NO：53)   40.000
  4   233   LECMTWNQM(SEQ ID NO：131)   22.000
  5   273   SDNHTTPIL(SEQ ID NO：204)   20.000
  6   209   CTGSQALLL(SEQ ID NO：52)   8.000
  7   30   GAAQWAPVL(SEQ ID NO：86)   8.000
  8   318   SEKRPFMCA(SEQ ID NO：208)   8.000
  9   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   8.000
  10   138   LESQPAIRN(SEQ ID NO：132)   5.280
  11   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   4.400
  12   329   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：90)   4.400
  13   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   4.400
  14   85   EEQCLSAFT(SEQ ID NO：65)   4.400
  15   208   SCTGSQALL(SEQ ID NO：202)   4.000
  16   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   4.000
  17   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：194)   4.000
  18   261   TEGQSNHST(SEQ ID NO：221)   4.000
  19   18   LGGGGGCAL(SEQ ID NO：134)   4.000
  20   221   YSSDNLYQM(SEQ ID NO：253)   2.200
                  表XIV
        对人类WT1肽与人类HLA B61结合
        的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B61肽结合基序锚定残基是在P2的E，在P9的V；辅助锚定是
          在P3的F、I、L、V、Y、W，在P6的I)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   318   SEKRPFMCA(SEQ ID NO：208)   20.000
  2   429   DELVRHHNM(SEQ ID NO：53)   16.000
  3   298   QDVRRVPGV(SEQ ID NO：164)   10.000
  4   81   AEPHEEQCL(SEQ ID NO：30)   8.000
  5   233   LECMTWNQM(SEQ ID NO：131)   8.000
  6   6   RDLNALLPA(SEQ ID NO：177)   5.500
  7   85   EEQCLSAFT(SEQ ID NO：65)   4.000
  8   261   TEGQSNHST(SEQ ID NO：221)   4.000
  9   206   TDSCTGSQA(SEQ ID NO：220)   2.500
  10   295   RGIQDVRRV(SEQ ID NO：179)   2.200
  11   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：206)   2.000
  12   250   VAAGSSSSV(SEQ ID NO：236)   2.000
  13   29   SGAAQWAPV(SEQ ID NO：211)   2.000
  14   315   SETSEKRPF(SEQ ID NO：209)   1.600
  15   138   LESQPAIRN(SEQ ID NO：132)   1.200
  16   244   GATLKGVAA(SEQ ID NO：88)   1.100
  17   20   GGGGCALPV(SEQ ID NO：92)   1.100
  18   440   RNMTKLQLA(SEQ ID NO：186)   1.100
  19   23   GCALPVSGA(SEQ ID NO：89)   1.100
  20   191   QQYSVPPPV(SEQ ID NO：171)   1.000
                    表XV
            对人类WT1肽与人类HLA B62结合
            的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B62肽结合基序锚定残基是在P2的Q或L，在P9的F或Y；辅
               助锚定是在P5的I或V)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   146   NQGYSTVTF(SEQ ID NO：150)   211.200
  2   32   AQWAPVLDF(SEQ ID NO：37)   96.000
  3   263   GQSNHSTGY(SEQ ID NO：100)   96.000
  4   88   CLSAFTVHF(SEQ ID NO：48)   96.000
  5   17   SLGGGGGCA(SEQ ID NO：215)   9.600
  6   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   8.800
  7   191   QQYSVPPPV(SEQ ID NO：171)   8.000
  8   98   GQFTGTAGA(SEQ ID NO：99)   8.000
  9   384   QCKTCQRKF(SEQ ID NO：163)   6.000
  10   40   FAPPGASAY(SEQ ID NO：74)   4.800
  11   227   YQMTSQLEC(SEQ ID NO：251)   4.800
  12   187   SLGEQQYSV(SEQ ID NO：214)   4.400
  13   86   EQCLSAFTV(SEQ ID NO：69)   4.400
  14   152   VTFDGTPSY(SEQ ID NO：244)   4.400
  15   101   TGTAGACRY(SEQ ID NO：224)   4.000
  16   242   NLGATLKGV(SEQ ID NO：146)   4.000
  17   92   FTVHFSGQF(SEQ ID NO：85)   4.000
  18   7   DLNALLPAV(SEQ ID NO：58)   4.000
  19   123   GQARMFPNA(SEQ ID NO：98)   4.000
  20   280   ILCGAQYRI(SEQ ID NO：116)   3.120
                         表XVI
              对人类WT1肽与人类HLA B7结合
             的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B7肽结合基序锚定残基是在P2的P，在P9的L或F；辅助锚
                      定是在P2的R)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   240.000
  2   4   DVRDLNALL(SEQ ID NO：62)   200.000
  3   302   RVPGVAPTL(SEQ ID NO：195)   20.000
  4   30   GAAQWAPVL(SEQ ID NO：86)   12.000
  5   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   12.000
  6   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   12.000
  7   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   12.000
  8   299   DVRRVPGVA(SEQ ID NO：63)   5.000
  9   208   SCTGSQALL(SEQ ID NO：202)   4.000
  10   303   VPGVAPTLV(SEQ ID NO：242)   4.000
  11   18   LGGGGGCAL(SEQ ID NO：134)   4.000
  12   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：194)   4.000
  13   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   4.000
  14   209   CTGSQALLL(SEQ ID NO：52)   4.000
  15   329   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：90)   4.000
  16   235   CMTWNQMNL(SEQ ID NO：49)   4.000
  17   441   NMTKLQLAL(SEQ ID NO：149)   4.000
  18   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   4.000
  19   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   4.000
  20   143   AIRNQGYST(SEQ ID NO：33)   3.000
                        表XVII
              对人类WT1肽与人类HLA B8结合
             的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B8肽结合基序锚定残基是在P3的K，在P5的K或R，在P9的L)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   329   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：90)   16.000
  2   4   DVRDLNALL(SEQ ID NO：62)   12.000
  3   316   ETSEKRPFM(SEQ ID NO：73)   3.000
  4   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   1.600
  5   208   SCTGSQALL(SEQ ID NO：202)   0.800
  6   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   0.800
  7   244   GATLKGVAA(SEQ ID NO：88)   0.800
  8   30   GAAQWAPVL(SEQ ID NO：86)   0.800
  9   299   DVRRVPGVA(SEQ ID NO：63)   0.400
  10   420   SCQKKFARS(SEQ ID NO：200)   0.400
  11   387   TCQRKFSRS(SEQ ID NO：219)   0.400
  12   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   0.400
  13   141   QPAIRNQGY(SEQ ID NO：170)   0.400
  14   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   0.400
  15   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   0.400
  16   384   QCKTCQRKF(SEQ ID NO：163)   0.400
  17   136   SCLESQPAI(SEQ ID NO：198)   0.300
  18   347   HTGEKPYQC(SEQ ID NO：112)   0.300
  19   401   HTRTHTGKT(SEQ ID NO：114)   0.200
  20   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：127)   0.200
                    表XVIII
          对人类WT1肽与人类HLA B2702结合
          的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B2702肽结合基序锚定残基是在P2的R；在P9的F、Y、I、L或W)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：127)   900.000
  2   362   RRFSRSDQL(SEQ ID NO：187)   900.000
  3   286   YRIHTHGVF(SEQ ID NO：252)   200.000
  4   125   ARMFPNAPY(SEQ ID NO：38)   200.000
  5   375   RRHTGVKPF(SEQ ID NO：188)   180.000
  6   32   AQWAPVLDF(SEQ ID NO：37)   100.000
  7   301   RRVPGVAPT(SEQ ID NO：189)   60.000
  8   439   QRNMTKLQL(SEQ ID NO：173)   60.000
  9   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   22.500
  10   426   ARSDELVRH(SEQ ID NO：39)   20.000
  11   146   NQGYSTVTF(SEQ ID NO：150)   20.000
  12   144   IRNQGYSTV(SEQ ID NO：117)   20.000
  13   389   QRKFSRSDH(SEQ ID NO：172)   20.000
  14   263   GQSNHSTGY(SEQ ID NO：100)   20.000
  15   416   CRWPSCQKK(SEQ ID NO：50)   20.000
  16   191   QQYSVPPPV(SEQ ID NO：171)   10.000
  17   217   LRTPYSSDN(SEQ ID NO：140)   10.000
  18   107   CRYGPFGPP(SEQ ID NO：51)   10.000
  19   98   GQFTGTAGA(SEQ ID NO：99)   10.000
  20   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   6.000
                         表XIX
            对人类WT1肽与人类HLA B2705结合
             的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B2705肽结合基序锚定残基是在P2的R；在P9的L或F；在
     P9也已经发现了用于天然加工表位的Y、R、H和K)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：127)   30000.000
  2   362   RRFSRSDQL(SEQ ID NO：187)   30000.000
  3   416   CRWPSCQKK(SEQ ID NO：50)   10000.000
  4   439   QRNMTKLQL(SEQ ID NO：173)   2000.000
  5   286   YRIHTHGVF(SEQ ID NO：252)   1000.000
  6   125   ARMFPNAPY(SEQ ID NO：38)   1000.000
  7   294   FRGIQDVRR(SEQ ID NO：81)   1000.000
  8   432   VRHHNMHQR(SEQ ID NO：243)   1000.000
  9   169   AQFPNHSFK(SEQ ID NO：36)   1000.000
  10   375   RRHTGVKPF(SEQ ID NO：188)   900.000
  11   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   750.000
  12   144   IRNQGYSTV(SEQ ID NO：117)   600.000
  13   301   RRVPGVAPT(SEQ ID NO：189)   600.000
  14   32   AQWAPVLDF(SEQ ID NO：37)   500.000
  15   191   QQYSVPPPV(SEQ ID NO：171)   300.000
  16   373   HQRRHTGVK(SEQ ID NO：109)   200.000
  17   426   ARSDELVRH(SEQ ID NO：39)   200.000
  18   383   FQCKTCQRK(SEQ ID NO：80)   200.000
  19   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   200.000
  20   389   QRKFSRSDH(SEQ ID NO：172)   200.000
                        表XX
          对人类WT1肽与人类HLA B3501结合
          的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B 3501肽结合基序锚定残基是在P2的P；在P9的Y、F、M、L或I)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   278   TPILCGAQY(SEQ ID NO：227)   40.000
  2   141   QPAIRNQGY(SEQ ID NO：170)   40.000
  3   219   TPYSSDNLY(SEQ ID NO：231)   40.000
  4   327   YPGCNKRYF(SEQ ID NO：250)   20.000
  5   163   TPSHHAAQF(SEQ ID NO：228)   20.000
  6   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   20.000
  7   221   YSSDNLYQM(SEQ ID NO：253)   20.000
  8   26   LPVSGAAQW(SEQ ID NO：138)   10.000
  9   174   HSFKHEDPM(SEQ ID NO：110)   10.000
  10   82   EPHEEQCLS(SEQ ID NO：68)   6.000
  11   213   QALLLRTPY(SEQ ID NO：160)   6.000
  12   119   QASSGQARM(SEQ ID NO：161)   6.000
  13   4   DVRDLNALL(SEQ ID NO：62)   6.000
  14   40   FAPPGASAY(SEQ ID NO：74)   6.000
  15   120   ASSGQARMF(SEQ ID NO：40)   5.000
  16   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   5.000
  17   303   VPGVAPTLV(SEQ ID NO：242)   4.000
  18   316   ETSEKRPFM(SEQ ID NO：73)   4.000
  19   152   VTFDGTPSY(SEQ ID NO：244)   4.000
  20   412   KPFSCRWPS(SEQ ID NO：123)   4.000
                      表XXI
         对人类WT1肽与人类HLA B3701结合
         的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B 3701肽结合基序锚定残基是在P8的F、M或L；在P9的I或
        L；辅助锚定是在P2的D、E和在P5的V、I)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：206)   40.000
  2   273   SDNHTTPIL(SEQ ID NO：204)   40.000
  3   81   AEPHEEQCL(SEQ ID NO：30)   10.000
  4   298   QDVRRVPGV(SEQ ID NO：164)   8.000
  5   428   SDELVRHHN(SEQ ID NO：203)   6.000
  6   85   EEQCLSAFT(SEQ ID NO：65)   5.000
  7   208   SCTGSQALL(SEQ ID NO：202)   5.000
  8   4   DVRDLNALL(SEQ ID NO：62)   5.000
  9   209   CTGSQALLL(SEQ ID NO：52)   5.000
  10   38   LDFAPPGAS(SEQ ID NO：130)   4.000
  11   223   SDNLYQMTS(SEQ ID NO：205)   4.000
  12   179   EDPMGQQGS(SEQ ID NO：64)   4.000
  13   206   TDSCTGSQA(SEQ ID NO：220)   4.000
  14   6   RDLNALLPA(SEQ ID NO：177)   4.000
  15   84   HEEQCLSAF(SEQ ID NO：107)   2.000
  16   233   LECMTWNQM(SEQ ID NO：131)   2.000
  17   429   DELVRHHNM(SEQ ID NO：53)   2.000
  18   315   SETSEKRPF(SEQ ID NO：209)   2.000
  19   349   GEKPYQCDF(SEQ ID NO：91)   2.000
  20   302   RVPGVAPTL(SEQ ID NO：195)   1.500
                    表XXII
      对人类WT1肽与人类HLA B3801结合
      的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B3801肽结合基序锚定残基是在P9的F或L；辅助锚定是在P2
                的H和在P3的D或E)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   437   MHQRNMTKL(SEQ ID NO：143)   36.000
  2   434   HHNMHQRNM(SEQ ID NO：108)   6.000
  3   372   RHQRRHTGV(SEQ ID NO：181)   6.000
  4   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   4.000
  5   433   RHHNMHQRN(SEQ ID NO：180)   3.900
  6   165   SHHAAQFPN(SEQ ID NO：213)   3.900
  7   202   CHTPTDSCT(SEQ ID NO：45)   3.000
  8   396   DHLKTHTRT(SEQ ID NO：57)   3.000
  9   161   GHTPSHHAA(SEQ ID NO：94)   3.000
  10   302   RVPGVAPTL(SEQ ID NO：195)   2.600
  11   417   RWPSCQKKF(SEQ ID NO：196)   2.400
  12   327   YPGCNKRYF(SEQ ID NO：250)   2.400
  13   208   SCTGSQALL(SEQ ID NO：202)   2.000
  14   163   TPSHHAAQF(SEQ ID NO：228)   2.000
  15   120   ASSGQARMF(SEQ ID NO：40)   2.000
  16   18   LGGGGGCAL(SEQ ID NO：134)   2.000
  17   177   KHEDPMGQQ(SEQ ID NO：121)   1.800
  18   83   PHEEQCLSA(SEQ ID NO：154)   1.800
  19   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   1.300
  20   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   1.300
                   表XXIII
       对人类WT1肽与人类HLA B 3901结合
        的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B3901肽结合基序锚定残基是在P2的R或H；在P9的L；辅助
                锚定是在P6的I、V或L)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   437   MHQRNMTKL(SEQ ID NO：143)   135.000
  2   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：127)   45.000
  3   434   HHNMHQRNM(SEQ ID NO：108)   30.000
  4   362   RRFSRSDQL(SEQ ID NO：187)   30.000
  5   372   RHQRRHTGV(SEQ ID NO：181)   30.000
  6   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   9.000
  7   439   QRNMTKLQL(SEQ ID NO：173)   7.500
  8   390   RKFSRSDHL(SEQ ID NO：183)   6.000
  9   396   DHLKTHTRT(SEQ ID NO：57)   6.000
  10   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   6.000
  11   423   KKFARSDEL(SEQ ID NO：122)   6.000
  12   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   6.000
  13   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   6.000
  14   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   6.000
  15   144   IRNQGYSTV(SEQ ID NO：117)   5.000
  16   136   SCLESQPAI(SEQ ID NO：198)   4.000
  17   292   GVFRGIQDV(SEQ ID NO：103)   3.000
  18   302   RVPGVAPTL(SEQ ID NO：195)   3.000
  19   208   SCTGSQALL(SEQ ID NO：202)   3.000
  20   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   3.000
                       表XXIV
            对人类WT1肽与人类HLA B 3902结合
           的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B3902肽结合基序锚定残基是在P2的K或Q；在P9的L；辅助
              锚定是在P5的I、L、F或V)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   24.000
  2   390   RKFSRSDHL(SEQ ID NO：183)   20.000
  3   423   KKFARSDEL(SEQ ID NO：122)   20.000
  4   32   AQWAPVLDF(SEQ ID NO：37)   5.000
  5   146   NQGYSTVTF(SEQ ID NO：150)   5.000
  6   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   2.400
  7   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   2.400
  8   30   GAAQWAPVL(SEQ ID NO：86)   2.400
  9   441   NMTKLQLAL(SEQ ID NO：149)   2.400
  10   302   RVPGVAPTL(SEQ ID NO：195)   2.400
  11   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   2.000
  12   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：194)   2.000
  13   209   CTGSQALLL(SEQ ID NO：52)   2.000
  14   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：127)   2.000
  15   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   2.000
  16   437   MHQRNMTKL(SEQ ID NO：143)   2.000
  17   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   2.000
  18   208   SCTGSQALL(SEQ ID NO：202)   2.000
  19   329   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：90)   2.000
  20   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   2.000
                        表XXV
             对人类WT1肽与人类HLA B4403结合
              的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B4403肽结合基序锚定残基是在P2的E；在P9的Y或F)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   315   SETSEKRPF(SEQ ID NO：209)   80.000
  2   349   GEKPYQCDF(SEQ ID NO：91)   80.000
  3   84   HEEQCLSAF(SEQ ID NO：107)   60.000
  4   410   SEKPFSCRW(SEQ ID NO：207)   48.000
  5   429   DELVRHHNM(SEQ ID NO：53)   24.000
  6   278   TPILCGAQY(SEQ ID NO：227)   15.000
7 141   QPAIRNQGY(SEQ ID NO：170)   9.000
  8   40   FAPPGASAY(SEQ ID NO：74)   9.000
  9   213   QALLLRTPY(SEQ ID NO：160)   9.000
  10   318   SEKRPFMCA(SEQ ID NO：208)   8.000
  11   81   AEPHEEQCL(SEQ ID NO：30)   8.000
  12   152   VTFDGTPSY(SEQ ID NO：244)   4.500
  13   101   TGTAGACRY(SEQ ID NO：224)   4.500
  14   120   ASSGQARMF(SEQ ID NO：40)   4.500
  15   261   TEGQSNHST(SEQ ID NO：221)   4.000
  16   85   EEQCLSAFT(SEQ ID NO：65)   4.000
  17   233   LECMTWNQM(SEQ ID NO：131)   4.000
  18   104   AGACRYGPF(SEQ ID NO：31)   4.000
  19   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：206)   3.000
  20   185   QGSLGEQQY(SEQ ID NO：166)   3.000
                     表XXVI
        对人类WT1肽与人类HLA B5101结合
        的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B5101肽结合基序锚定残基是在P2的A、P或G；在P9的F或I)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   303   VPGVAPTLV(SEQ ID NO：242)   314.600
  2   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   242.000
  3   250   VAAGSSSSV(SEQ ID NO：236)   157.300
  4   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   50.000
  5   30   GAAQWAPVL(SEQ ID NO：86)   50.000
  6   20   GGGGCALPV(SEQ ID NO：92)   44.000
  7   64   PPPPPHSFI(SEQ ID NO：157)   40.000
  8   29   SGAAQWAPV(SEQ ID NO：211)   40.000
  9   18   LGGGGGCAL(SEQ ID NO：134)   31.460
  10   295   RGIQDVRRV(SEQ ID NO：179)   22.000
  11   119   QASSGQARM(SEQ ID NO：161)   18.150
  12   418   WPSCQKKFA(SEQ ID NO：246)   12.100
  13   82   EPHEEQCLS(SEQ ID NO：68)   12.100
  14   110   GPFGPPPPS(SEQ ID NO：96)   11.000
  15   272   ESDNHTTPI(SEQ ID NO：71)   8.000
  16   306   VAPTLVRSA(SEQ ID NO：237)   7.150
  17   280   ILCGAQYRI(SEQ ID NO：116)   6.921
  18   219   TPYSSDNLY(SEQ ID NO：231)   6.600
  19   128   FPNAPYLPS(SEQ ID NO：79)   6.500
  20   204   TPTDSCTGS(SEQ ID NO：230)   6.050
                       表XXVII
            对人类WT1肽与人类HLA B5102结合
            的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B5102肽结合基序锚定残基是在P2的P、A或G；在P9的I或
               V；辅助锚定是在P3的Y)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   295   RGIQDVRRV(SEQ ID NO：179)   290.400
  2   303   VPGVAPTLV(SEQ ID NO：242)   200.000
  3   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   133.100
  4   250   VAAGSSSSV(SEQ ID NO：236)   110.000
  5   30   GAAQWAPVL(SEQ ID NO：86)   55.000
  6   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   50.000
  7   20   GGGGCALPV(SEQ ID NO：92)   44.000
  8   29   SGAAQWAPV(SEQ ID NO：211)   44.000
  9   64   PPPPPHSFI(SEQ ID NO：157)   40.000
  10   119   QASSGQARM(SEQ ID NO：161)   36.300
  11   110   GPFGPPPPS(SEQ ID NO：96)   27.500
  12   412   KPFSCRWPS(SEQ ID NO：123)   25.000
  13   18   LGGGGGCAL(SEQ ID NO：134)   24.200
  14   24   CALPVSGAA(SEQ ID NO：43)   16.500
  15   219   TPYSSDNLY(SEQ ID NO：231)   15.000
  16   292   GVFRGIQDV(SEQ ID NO：103)   14.641
  17   136   SCLESQPAI(SEQ ID NO：198)   14.520
  18   418   WPSCQKKFA(SEQ ID NO：246)   12.100
  19   269   TGYESDNHT(SEQ ID NO：225)   11.000
  20   351   KPYQCDFKD(SEQ ID NO：124)   11.000
                     表XXVIII
          对人类WT1肽与人类HLA B5201结合
         的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B5201肽结合基序锚定残基是在P8的I或V；在P9的I或V；
辅助锚定是在P2的Q，在P3的F、Y或W，在P5的L、I或V)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   191   QQYSVPPPV(SEQ ID NO：171)   100.000
  2   32   AQWAPVLDF(SEQ ID NO：37)   30.000
  3   243   LGATLKGVA(SEQ ID NO：133)   16.500
  4   303   VPGVAPTLV(SEQ ID NO：242)   13.500
  5   86   EQCLSAFTV(SEQ ID NO：69)   12.000
  6   295   RGIQDVRRV(SEQ ID NO：179)   10.000
  7   98   GQFTGTAGA(SEQ ID NO：99)   8.250
  8   292   GVFRGIQDV(SEQ ID NO：103)   8.250
  9   29   SGAAQWAPV(SEQ ID NO：211)   6.000
  10   146   NQGYSTVTF(SEQ ID NO：150)   5.500
  11   20   GGGGCALPV(SEQ ID NO：92)   5.000
  12   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   4.000
  13   64   PPPPPHSFI(SEQ ID NO：157)   3.600
  14   273   SDNHTTPIL(SEQ ID NO：204)   3.300
  15   286   YRIHTHGVF(SEQ ID NO：252)   3.000
  16   269   TGYESDNHT(SEQ ID NO：225)   3.000
  17   406   TGKTSEKPF(SEQ ID NO：222)   2.750
  18   327   YPGCNKRYF(SEQ ID NO：250)   2.750
  19   7   DLNALLPAV(SEQ ID NO：58)   2.640
  20   104   AGACRYGPF(SEQ ID NO：31)   2.500
                    表XXIX
         对人类WT1肽与人类HLA B5801结合
         的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-B5801肽结合基序锚定残基是在P2的A、S或T；在P9的F或
W；辅助锚定是在P4的P、E、或K，在P5的V、I、L、M、F)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   230   TSQLECMTW(SEQ ID NO：234)   96.800
  2   92   FTVHFSGQF(SEQ ID NO：85)   60.000
  3   120   ASSGQARMF(SEQ ID NO：40)   40.000
  4   168   AAQFPNHSF(SEQ ID NO：29)   20.000
  5   408   KTSEKPFSC(SEQ ID NO：129)   12.000
  6   394   RSDHLKTHT(SEQ ID NO：192)   9.900
  7   276   HTTPILCGA(SEQ ID NO：115)   7.200
  8   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：194)   6.600
  9   152   VTFDGTPSY(SEQ ID NO：244)   6.000
  10   40   FAPPGASAY(SEQ ID NO：74)   6.000
  11   213   QALLLRTPY(SEQ ID NO：160)   4.500
  12   347   HTGEKPYQC(SEQ ID NO：112)   4.400
  13   252   AGSSSSVKW(SEQ ID NO：32)   4.400
  14   211   GSQALLLRT(SEQ ID NO：102)   4.356
  15   174   HSFKHEDPM(SEQ ID NO：110)   4.000
  16   317   TSEKRPFMC(SEQ ID NO：233)   4.000
  17   26   LPVSGAAQW(SEQ ID NO：138)   4.000
  18   289   HTHGVFRGI(SEQ ID NO：113)   3.600
  19   222   SSDNLYQMT(SEQ ID NO：217)   3.300
  20   96   FSGQFTGTA(SEQ ID NO：82)   3.300
                          表XXX
               对人类WT1肽与人类HLA CW0301结合
                 的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
   (HLA-CW0301肽结合基序锚定残基是在P9的L、F、M或I；辅助锚定
         是在P3的V、I、Y、L或M，在P4的P，在P6的F或Y)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   10   ALLLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   100.000
  2   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：127)   48.000
  3   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   36.000
  4   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：206)   30.000
  5   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   24.000
  6   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   24.000
  7   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   20.000
  8   362   RRFSRSDQL(SEQ ID NO：187)   12.000
  9   329   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：90)   10.000
  10   286   YRIHTHGVF(SEQ ID NO：252)   10.000
  11   301   RRVPGVAPT(SEQ ID NO：189)   10.000
  12   24   CALPVSGAA(SEQ ID NO：43)   10.000
  13   136   SCLESQPAI(SEQ ID NO：198)   7.500
  14   437   MHQRNMTKL(SEQ ID NO：143)   7.200
  15   390   RKFSRSDHL(SEQ ID NO：183)   6.000
  16   423   KKFARSDEL(SEQ ID NO：122)   6.000
  17   92   FTVHFSGQF(SEQ ID NO：85)   5.000
  18   429   DELVRHHNM(SEQ ID NO：53)   5.000
  19   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   4.800
  20   30   GAAQWAPVL(SEQ ID NO：86)   4.000
                        表XXXI
              对人类WT1肽与人类HLA CW0401结合
               的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-CW0401肽结合基序锚定残基是在P2的Y、P或F；在P9的L、
                F或M；辅助锚定是在P6的V、I或L)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   356   DFKDCERRF(SEQ ID NO：55)   120.000
  2   334   YFKLSHLQM(SEQ ID NO：248)   100.000
  3   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   88.000
  4   163   TPSHHAAQF(SEQ ID NO：228)   52.800
  5   327   YPGCNKRYF(SEQ ID NO：250)   40.000
  6   285   QYRIHTHGV(SEQ ID NO：175)   27.500
  7   424   KFARSDELV(SEQ ID NO：119)   25.000
  8   326   AYPGCNKRY(SEQ ID NO：42)   25.000
  9   192   QYSVPPPVY(SEQ ID NO：176)   25.000
  10   417   RWPSCQKKF(SEQ ID NO：196)   22.000
  11   278   TPILCGAQY(SEQ ID NO：227)   12.000
  12   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   11.616
  13   141   QPAIRNQGY(SEQ ID NO：170)   11.000
  14   303   VPGVAPTLV(SEQ ID NO：242)   11.000
  15   219   TPYSSDNLY(SEQ ID NO：231)   10.000
  16   39   DFAPPGASA(SEQ ID NO：54)   7.920
  17   99   QFTGTAGAC(SEQ ID NO：165)   6.000
  18   4   DVRDLNALL(SEQ ID NO：62)   5.760
  19   70   SFIKQEPSW(SEQ ID NO：210)   5.500
  20   63   PPPPPPHSF(SEQ ID NO：158)   5.280
                       表XXXII
           对人类WT1肽与人类HLA CW0602结合
            的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-CW0602肽结合基序锚定残基是在P9的L、I、V或Y；辅助锚定
             是在P5的I、L、F或M，在P6的V、I或L)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：127)   9.680
  2   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   6.600
  3   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   6.600
  4   7   DLNALLPAV(SEQ ID NO：58)   6.000
  5   441   NMTKLQLAL(SEQ ID NO：149)   6.000
  6   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   6.000
  7   4   DVRDLNALL(SEQ ID NO：62)   6.000
  8   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：206)   4.400
  9   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   4.000
  10   213   QALLLRTPY(SEQ ID NO：160)   3.300
  11   319   EKRPFMCAY(SEQ ID NO：67)   3.000
  12   30   GAAQWAPVL(SEQ ID NO：86)   2.200
  13   242   NLGATLKGV(SEQ ID NO：146)   2.200
  14   292   GVFRGIQDV(SEQ ID NO：103)   2.200
  15   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   2.200
  16   362   RRFSRSDQL(SEQ ID NO：187)   2.200
  17   439   QRNMTKLQL(SEQ ID NO：173)   2.200
  18   295   RGIQDVRRV(SEQ ID NO：179)   2.200
  19   423   KKFARSDEL(SEQ ID NO：122)   2.200
  20   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   2.200
                              表XXXIII
                  对人类WT1肽与人类HLA CW0702结合
                  的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
(HLA-CW0702肽结合基序锚定残基是在P9的Y、F或L；辅助锚定是
在P2的Y或P，在P5的V、Y、I、L、F或M，在P6的V、I、L或M)
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   319   EKRPFMCAY(SEQ ID NO：67)   26.880
  2   326   AYPGCNKRY(SEQ ID NO：42)   24.000
  3   40   FAPPGASAY(SEQ ID NO：74)   14.784
  4   192   QYSVPPPVY(SEQ ID NO：176)   12.000
  5   278   TPILCGAQY(SEQ ID NO：227)   12.000
  6   219   TPYSSDNLY(SEQ ID NO：231)   12.000
  7   213   QALLLRTPY(SEQ ID NO：160)   8.800
  8   125   ARMFPNAPY(SEQ ID NO：38)   8.000
  9   327   YPGCNKRYF(SEQ ID NO：250)   6.600
  10   152   VTFDGTPSY(SEQ ID NO：244)   5.600
  11   141   QPAIRNQGY(SEQ ID NO：170)   4.800
  12   345   RKHTGEKPY(SEQ ID NO：184)   4.000
  13   185   QGSLGEQQY(SEQ ID NO：166)   4.000
  14   101   TGTAGACRY(SEQ ID NO：224)   4.000
  15   375   RRHTGVKPF(SEQ ID NO：188)   4.000
  16   263   GQSNHSTGY(SEQ ID NO：100)   4.000
  17   163   TPSHHAAQF(SEQ ID NO：228)   3.000
  18   33   QWAPVLDFA(SEQ ID NO：174)   2.688
  19   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   2.640
  20   84   HEEQCLSAF(SEQ ID NO：107)   2.400
                          表XXXIV
                对人类WT1肽与小鼠MHC I类Db结合
                 的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   235   CMTWNQMNL(SEQ ID NO：49)   5255.712
  2   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   1990.800
  3   221   YSSDNLYQM(SEQ ID NO：253)   930.000
  4   228   QMTSQLECM(SEQ ID NO：169)   33.701
  5   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   21.470
  6   441   NMTKLQLAL(SEQ ID NO：149)   19.908
  7   437   MHQRNMTKL(SEQ ID NO：143)   19.837
  8   136   SCLESQPAI(SEQ ID NO：198)   11.177
  9   174   HSFKHEDPM(SEQ ID NO：110)   10.800
  10   302   RVPGVAPTL(SEQ ID NO：195)   10.088
  11   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   8.400
  12   10   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   5.988
  13   208   SCTGSQALL(SEQ ID NO：202)   4.435
  14   209   CTGSQALLL(SEQ ID NO：52)   3.548
  15   238   WNQMNLGAT(SEQ ID NO：245)   3.300
  16   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：194)   3.185
  17   24   CALPVSGAA(SEQ ID NO：43)   2.851
  18   18   LGGGGGCAL(SEQ ID NO：134)   2.177
  19   142   PAIRNQGYS(SEQ ID NO：152)   2.160
  20   30   GAAQWAPVL(SEQ ID NO：86)   1.680
                            表XXXV
                对人类WT1肽与小鼠MHC I类Dd结合
                的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   112   FGPPPPSQA(SEQ ID NO：76)   48.000
  2   122   SGQARMFPN(SEQ ID NO：212)   36.000
  3   104   AGACRYGPF(SEQ ID NO：31)   30.000
  4   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：194)   28.800
  5   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   20.000
  6   302   RVPGVAPTL(SEQ ID NO：195)   20.000
  7   18   LGGGGGCAL(SEQ ID NO：134)   20.000
  8   81   AEPHEEQCL(SEQ ID NO：30)   10.000
  9   29   SGAAQWAPV(SEQ ID NO：211)   7.200
  10   423   KKFARSDEL(SEQ ID NO：122)   7.200
  11   295   RGIQDVRRV(SEQ ID NO：179)   7.200
  12   390   RKFSRSDHL(SEQ ID NO：183)   6.000
  13   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：127)   6.000
  14   362   RRFSRSDQL(SEQ ID NO：187)   6.000
  15   417   RWPSCQKKF(SEQ ID NO：196)   6.000
  16   160   YGHTPSHHA(SEQ ID NO：249)   6.000
  17   20   GGGGCALPV(SEQ ID NO：92)   6.000
  18   329   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：90)   5.000
  19   372   RHQRRHTGV(SEQ ID NO：181)   4.500
  20   52   GGPAPPPAP(SEQ ID NO：93)   4.000
                          表XXXVI
                对人类WT1肽与小鼠MHC I类Kb结合
                的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   329   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：90)   24.000
  2   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147)   10.000
  3   420   SCQKKFARS(SEQ ID NO：200)   3.960
  4   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：194)   3.630
  5   437   MHQRNMTKL(SEQ ID NO：143)   3.600
  6   387   TCQRKFSRS(SEQ ID NO：219)   3.600
  7   302   RVPGVAPTL(SEQ ID NO：195)   3.300
  8   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   3.000
  9   289   HTHGVFRGI(SEQ ID NO：113)   3.000
  10   43   PGASAYGSL(SEQ ID NO：153)   2.400
  11   155   DGTPSYGHT(SEQ ID NO：56)   2.400
  12   273   SDNHTTPIL(SEQ ID NO：204)   2.200
  13   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185)   2.200
  14   128   FPNAPYLPS(SEQ ID NO：79)   2.000
  15   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：206)   1.584
  16   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   1.584
  17   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：127)   1.500
  18   18   LGGGGGCAL(SEQ ID NO：134)   1.320
  19   233   LECMTWNQM(SEQ ID NO：131)   1.320
  20   441   NMTKLQLAL(SEQ ID NO：149)   1.200
                          表XXXVII
               对人类WT1肽与小鼠MHC I类Kd结合
                的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   285   QYRIHTHGV(SEQ ID NO：175)   600.000
  2   424   KFARSDELV(SEQ ID NO：119)   288.000
  3   334   YFKLSHLQM(SEQ ID NO：248)   120.000
  4   136   SCLESQPTI(SEQ ID NO：199)   115.200
  5   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151)   115.200
  6   10   ALLPAVSSL(SEQ ID NO：35)   115.200
  7   47   AYGSLGGPA(SEQ ID NO：41)   86.400
  8   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   80.000
  9   270   GYESDNHTA(SEQ ID NO：105)   72.000
  10   326   AYPGCNKRY(SEQ ID NO：42)   60.000
  11   192   QYSVPPPVY(SEQ ID NO：176)   60.000
  12   272   ESDNHTAPI(SEQ ID NO：70)   57.600
  13   289   HTHGVFRGI(SEQ ID NO：113)   57.600
  14   126   DVRDLNALL(SEQ ID NO：62)   57.600
  15   4   CTGSQALLL(SEQ ID NO：52)   57.600
  16   208   SCTGSQALL(SEQ ID NO：202)   48.000
  17   441   NMTKLQLAL(SEQ ID NO：149)   48.000
  18   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   48.000
  19   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144)   48.000
  20   235   CMTWNQMNL(SEQ ID NO：49)   48.000
                        表XXXVIII
              对人类WT1肽与小鼠MHC I类Kk结合
              的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   81   AEPHEEQCL(SEQ ID NO：30)   40.000
  2   85   EEQCLSAFT(SEQ ID NO：65)   40.000
  3   429   DELVRHHNM(SEQ ID NO：53)   20.000
  4   315   SETSEKRPF(SEQ ID NO：209)   20.000
  5   261   TEGQSNHST(SEQ ID NO：221)   20.000
  6   410   SEKPFSCRW(SEQ ID NO：207)   10.000
  7   272   ESDNHTTPI(SEQ ID NO：71)   10.000
  8   318   SEKRPFMCA(SEQ ID NO：208)   10.000
  9   138   LESQPAIRN(SEQ ID NO：132)   10.000
  10   233   LECMTWNQM(SEQ ID NO：131)   10.000
  11   298   QDVRRVPGV(SEQ ID NO：164)   10.000
  12   84   HEEQCLSAF(SEQ ID NO：107)   10.000
  13   349   GEKPYQCDF(SEQ ID NO：91)   10.000
  14   289   HTHGVFRGI(SEQ ID NO：113)   10.000
  15   179   EDPMGQQGS(SEQ ID NO：64)   8.000
  16   136   SCLESQPAI(SEQ ID NO：198)   5.000
  17   280   ILCGAQYRI(SEQ ID NO：116)   5.000
  18   273   SDNHTTPIL(SEQ ID NO：204)   4.000
  19   428   SDELVRHHN(SEQ ID NO：203)   4.000
  20   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：206)   4.000
                             表XXXIX
                   对人类WT1肽与小鼠MHC I类Ld结合
                    的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   163   TPSHHAAQF(SEQ ID NO：228)   360.000
  2   327   YPGCNKRYF(SEQ ID NO：250)   300.000
  3   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：59)   150.000
  4   26   LPVSGAAQW(SEQ ID NO：138)   93.600
  5   278   TPILCGAQY(SEQ ID NO：227)   72.000
  6   141   QPAIRNQGY(SEQ ID NO：170)   60.000
  7   219   TPYSSDNLY(SEQ ID NO：231)   60.000
  8   303   VPGVAPTLV(SEQ ID NO：242)   60.000
  9   120   ASSGQARMF(SEQ ID NO：40)   50.000
  10   63   PPPPPPHSF(SEQ ID NO：158)   45.000
  11   113   GPPPPSQAS(SEQ ID NO：97)   45.000
  12   157   TPSYGHTPS(SEQ ID NO：229)   39.000
  13   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：61)   32.500
  14   110   GPFGPPPPS(SEQ ID NO：96)   30.000
  15   82   EPHEEQCLS(SEQ ID NO：68)   30.000
  16   412   KPFSCRWPS(SEQ ID NO：123)   30.000
  17   418   WPSCQKKFA(SEQ ID NO：246)   30.000
  18   221   YSSDNLYQM(SEQ ID NO：253)   30.000
  19   204   TPTDSCTGS(SEQ ID NO：230)   30.000
  20   128   FPNAPYLPS(SEQ ID NO：79)   30.000
                        表XL
             对人类WT1肽与牛HLA A20结合
            的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   350   EKPYQCDFK(SEQ ID NO：66)   1000.00
  2   319   EKRPFMCAY(SEQ ID NO：67)   500.000
  3   423   KKFARSDEL(SEQ ID NO：122)   500.000
  4   345   RKHTGEKPY(SEQ ID NO：184)   500.000
  5   390   RKFSRSDHL(SEQ ID NO：183)   500.00D
  6   137   CLESQPAIR(SEQ ID NO：47)   120.000
  7   380   VKPFQCKTC(SEQ ID NO：239)   100.000
  8   407   GKTSEKPFS(SEQ ID NO：95)   100.000
  9   335   FKLSHLQMH(SEQ ID NO：78)   100.000
  10   247   LKGVAAGSS(SEQ ID NO：135)   100.000
  11   370   LKRHQRRHT(SEQ ID NO：136)   100.000
  12   258   VKWTEGQSN(SEQ ID NO：240)   100.000
  13   398   LKTHTRTHT(SEQ ID NO：137)   100.000
  14   331   NKRYFKLSH(SEQ ID NO：145)   100.000
  15   357   FKDCERRFS(SEQ ID NO：77)   100.000
  16   385   CKTCQRKFS(SEQ ID NO：46)   100.000
  17   294   FRGIQDVRR(SEQ ID NO：81)   80.000
  18   368   DQLKRHQRR(SEQ ID NO：60)   80.000
  19   432   VRHHNMHQR(SEQ ID NO：243)   80.000
  20   118   SQASSGQAR(SEQ ID NO：216)   80.000
                             表XLI
                 对小鼠WT1肽与人类HLA A 0201结合
                  的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：293)   313.968
  2   187   SLGEQQYSV(SEQ ID NO：299)   285.163
  3   10   ALLPAVSSL(SEQ ID NO：255)   181.794
  4   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：284)   68.360
  5   292   GVFRGIQDV(SEQ ID NO：270)   51.790
  6   93   TLHFSGQFT(SEQ ID NO：302)   40.986
  7   191   QQYSVPPPV(SEQ ID NO：290)   22.566
  8   280   ILCGAQYRI(SEQ ID NO：274)   17.736
  9   441   NMTKLHVAL(SEQ ID NO：285)   15.428
  10   235   CMTWNQMNL(SEQ ID N0：258)   15.428
  11   7   DLNALLPAV(SEQ ID NO：261)   11.998
  12   242   NLGATLKGM(SEQ ID NO：283)   11.426
  13   227   YQMTSQLEC(SEQ ID NO：307)   8.573
  14   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：286)   8.014
  15   309   TLVRSASET(SEQ ID NO：303)   7.452
  16   408   KTSEKPFSC(SEQ ID NO：277)   5.743
  17   340   LQMHSRKHT(SEQ ID NO：280)   4.752
  18   228   QMTSQLECM(SEQ ID NO：289)   4.044
  19   37   VLDFAPPGA(SEQ ID NO：304)   3.378
  20   302   RVSGVAPTL(SEQ ID NO：295)   1.869
                          表XLII
              对小鼠WT1肽与小鼠MHC I类Db结合
               的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价).
  1   221   YSSDNLYQM(SEQ ID NO：308)   312.000
  2   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：293)   260.000
  3   235   CMTWNQMNL(SEQ ID NO：258)   260.000
  4   437   MHQRNMTKL(SEQ ID NO：281)   200.000
  5   238   WNQMNLGAT(SEQ ID NO：305)   12.000
  6   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：282)   8.580
  7   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：298)   7.920
  8   136   SCLESQPTI(SEQ ID NO：296)   7.920
  9   81   AEPHEEQCL(SEQ ID NO：254)   6.600
  10   10   ALLPAVSSL(SEQ ID NO：255)   6.600
  11   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：294)   6.000
  12   441   NMTKLHVAL(SEQ ID NO：285)   3.432
  13   228   QMTSQLECM(SEQ ID NO：289)   3.120
  14   174   HSFKHEDPM(SEQ ID NO：272)   3.120
  15   242   NLGATLKGM(SEQ ID NO：283)   2.640
  16   261   TEGQSNHGI(SEQ ID NO：301)   2.640
  17   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：284)   2.640
  18   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：263)   2.600
  19   119   QASSGQARM(SEQ ID NO：288)   2.600
  20   18   LGGGGGCGL(SEQ ID NO：279)   2.600
                         表XLIII
            对小鼠WT1肽与小鼠MHC I类Kb结合
            的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   329   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：268)   24.000
  2   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：284)   10.000
  3   420   SCQKKFARS(SEQ ID NO：297)   3.960
  4   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：294)   3.630
  5   437   MHQRNMTKL(SEQ ID NO：281)   3.600
  6   387   TCQRKFSRS(SEQ ID NO：300)   3.600
  7   289   HTHGVFRGI(SEQ ID NO：273)   3.000
  8   130   NAPYLPSCL(SEQ ID NO：282)   3.000
  9   43   PGASAYGSL(SEQ ID NO：287)   2.400
  10   155   DGAPSYGHT(SEQ ID NO：260)   2.400
  11   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：293)   2.200
  12   128   FPNAPYLPS(SEQ ID NO：267)   2.000
  13   207   DSCTGSQAL(SEQ ID NO：263)   1.584
  14   3   SDVRDLNAL(SEQ ID NO：298)   1.584
  15   332   KRYFKLSHL(SEQ ID NO：276)   1.500
  16   233   LECMTWNQM(SEQ ID NO：278)   1.320
  17   18   LGGGGGCGL(SEQ ID NO：279)   1.320
  18   242   NLGATLKGM(SEQ ID NO：283)   1.200
  19   123   GQARMFPN(SEQ ID NO：269)A   1.200
  20   441   NMTKLHVAL(SEQ ID NO：285)   1.200
                          表XLIV
              对小鼠WT1肽与小鼠MHC I类Kd结合
              的BIMAS HLA肽结合预测分析结果
顺序 起始位置 亚序列残基列表   分值(对含有该亚序列的分子解离半衰期评价)
  1   285   QYRIHTHGV(SEQ ID NO：291)   600.000
  2   424   KFARSDELV(SEQ ID NO：275)   288.000
  3   334   YFKLSHLQM(SEQ ID NO：306)   120.000
  4   136   SCLESQPTI(SEQ ID NO：296)   115.200
  5   239   NQMNLGATL(SEQ ID NO：286)   115.200
  6   10   ALLPAVSSL(SEQ ID NO：255)   115.200
  7   47   AYGSLGGPA(SEQ ID NO：256)   86.400
  8   180   DPMGQQGSL(SEQ ID NO：262)   80.000
  9   270   GYESDNHTA(SEQ ID NO：271)   72.000
  10   192   QYSVPPPVY(SEQ ID NO：292)   60.000
  11   326   AYPGCNKRY(SEQ ID NO：257)   60.000
  12   289   HTHGVFRGI(SEQ ID NO：273)   57.600
  13   4   DVRDLNALL(SEQ ID NO：264)   57.600
  14   126   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：293)   57.600
  15   209   CTGSQALLL(SEQ ID NO：259)   48.000
  16   86   EQCLSAFTL(SEQ ID NO：265)   48.000
  17   302   RVSGVAPTL(SEQ ID NO：295)   48.000
  18   218   RTPYSSDNL(SEQ ID NO：294)   48.000
  19   272   ESDNHTAPI(SEQ ID NO：266)   48.000
  20   225   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：284)   48.000
                           表XLV
              对能激发辅助T细胞应答的人类WT1肽
                的Tsites肽结合预测分析结果
  肽   序列
  p6-23   RDLNALLPAVPSLGGGG(SEQ ID NO：1)
  p30-35   GAAQWA(SEQ ID NO：309)
  p45-56   ASAYGSLGGPAP(SEQ ID NO：310)
  p91-105   AFTVHFSGQFTGTAG(SEQ ID NO：311)
  p117-139   PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(SEQ ID NO：2)
  p167-171   HAAQF(SEQ ID NO：312)
  p202-233   CHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQL(SEQ IDNO：313)
  p244-262   GATLKGVAAGSSSSVKWTE(SEQ ID NO：4)
  p287-318   RIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETS(SEQ ID NO：314)
  p333-336   RYFK(SEQ ID NO：315)
  p361-374   ERRFSRSDQLKRHQ(SEQ ID NO：316)
  p389-410   QRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTS(SEQ ID NO：317)
  p421-441   CQKKFARSDELVRHHNMHQRN(SEQ ID NO：318)
选定一些CTL肽(如表XLVI中所示)用于进一步研究。对于表XLVI中的每种肽，提供了利用BIMAS HLA肽结合预测分析获得的分值。
                                     表XLVI
                              WT1肽序列和HLA肽结合预测
  肽   序列   注释
  p329-337   GCNKRYFKL(SEQ ID NO：90和268)   分值24,000
  p225-233   NLYQMTSQL(SEQ ID NO：147和284)   也结合于II类和HLA A2、Kd，分值10,000
  p235-243   CMTWNQMNL(SEQ ID NO：49和258)   也结合于HLA A2，分值5,255,712
  p126-134   RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185和293)   也结合于Kd、II类和HLA A2，分值1,990,800
  p221-229   YSSDNLYQM(SEQ ID NO：253和308)   也结合于Ld，分值312,000
  p228-236   QMTSQLECM(SEQ ID NO：169和289)   分值3,120
  p239-247   NQMNLGATL(SEQ ID NO：151和286)   也结合于HLA A0201、Kd，分值8,015
  小鼠p136-144   SCLESQPTI(SEQ ID NO：296)   也结合于Kd，与人类有1个错配
  人类p136-144   SCLESQPAI(SEQ ID NO：198)   分值7,920
  小鼠p10-18   ALLPAVSSL(SEQ ID NO：255)   也结合于Kd、HLA A2，与人类有1个错配
  人类p10-18   ALLPAVPSL(SEQ ID NO：34)   分值6,600
如Ljunggren等，Nature 346：476-480，1990所述，利用白血病细胞系RMA-S证实结合C57BI/6鼠MHC的肽。简而言之，在26℃，在补加有1％FCS的完全培养基中培养RMA-S细胞7小时。向24孔板的每个孔中添加总数106个RMA-S细胞，在26℃下或者单独温育或者与指定的肽(25μg/ml)一起温育16小时，并且在37℃，在完全培养基中另外温育3小时。然后，冲洗细胞3次，并且用偶联有荧光素异硫氰酸盐的抗Db或抗Kb抗体(PharMingen，San Diego，CA)染色细胞。冲洗标记的细胞2次，在500μl含有1％多聚甲醛的PBS中重悬和固定标记的细胞，并且在流式细胞仪(Becton-DickinsonFACSCalibur_)中分析荧光强度。通过比较与肽温育的细胞和单独在培养基中温育的细胞所增加的平均荧光强度来测定RMA-S细胞表面上Db或Kb分子增加的百分数。
用能够结合鼠I类MHC的肽免疫小鼠。免疫后，在体外刺激脾脏细胞，并且检测其对与WT1肽温育的靶的裂解能力。用标准铬释放测定法评价CTL(Chen等，Cancer Res.54：1065-1070，1994)。在37℃，在特异性肽存在或不存在的情况下，温育106个靶细胞与150μCi钠51Cr 90分钟。冲洗细胞3次，并且在含有5％胎牛血清的RPMI中重悬细胞。对于测定，在U形底的96孔板中，104个51Cr标记的靶细胞与不同浓度的效应细胞在终体积200μl中温育。在37℃，4到7小时后去除上清液，用下面的公式确定特异性裂解百分数：
％特异性裂解＝100×(试验性释放-自发性释放)/(最大的释放-自发性释放)。
表XLVII中给出的结果表明一些WT1肽可以结合于MHC I类分子上，该分子是产生CTL所必需的。而且，如利用铬释放测定法所测定的，其中的几种肽能激发肽特异性CTL(图9A和9B)。用CTL肽人的p10-18、人的p136-144、小鼠p136-144和p235-243免疫后，产生了肽特异性的CTL系，并且建立了克隆。这些结果表明肽特异性CTL可以杀死表达WT1的恶性细胞。
               表XLVII
    WT1 CTL肽与小鼠B6 I类抗原的结合
  肽  对小鼠MHC I类的结合亲和性
  阳性对照  91％
  阴性对照  0.5-1.3％
  p235-243  33.6％
  p136-144小鼠  27.9％
  p136-144人类  52％
  p10-18：人类  2.2％
  p225-233  5.8％
  p329-337  1.2％
  p126-134  0.9％
  p221-229  0.8％
  p228-236  1.2％
  p239-247  1％
实施例5
使用WT1多肽在小鼠中激发WT1特异性CTL
该实施例示例了代表性WT1多肽激发能杀死WT1阳性肿瘤细胞系的CTL免疫性的能力。
P117-139，如上述，利用TSITES和BIMAS HLA肽结合预测分析法鉴定具有适于结合I类和II类MHC的基序的肽。如实施例3中所述免疫小鼠。免疫后，在体外刺激脾脏细胞，并且检测其裂解与WT1肽温育的靶及WT1阳性和阴性肿瘤细胞系的能力。用标准铬释放测定法评价CTL。图10A-10D中所示的结果表明P117可以激发能够杀死WT1阳性肿瘤细胞的WT1特异性CTL，而没有观察到可杀死WT1阴性细胞。这些结果证明肽特异性CTL实际上杀死表达WT1的恶性细胞，并且疫苗和T细胞治疗有效地抗表达WT1的恶性肿瘤。
利用9-mer I类MHC结合肽p136-144、p225-233、p235-243及23-mer肽p117-139进行相似的免疫。免疫后，用4种肽中的每种肽体外刺激脾脏细胞，并且检测其裂解与WT1肽温育的靶的能力。产生了对p136-144、p235-243和p117-139特异，但是对p225-233不特异的CTL。图11A和11B中示出了p235-243和p117-139的CTL数据。没有示出肽p136-144和p225-233的数据。
CTL裂解要求靶WT1肽被内源性加工并且结合肿瘤细胞MHC I类分子被呈递。相对于WT1阴性肿瘤细胞系，检测上述WT1肽特异性CTL裂解WT1阳性肿瘤细胞系的能力。对p235-243裂解靶特异的CTL与p235-243肽温育，但是不能裂解表达WT1蛋白质的细胞系(图11A)。与之对比鲜明的是对p117-139裂解靶特异的CTL与p117-139温育，还能裂解表达WT1的恶性细胞(图11B)。作为阴性对照，对p117-139特异的CTL不裂解WT1阴性的EL-4(这里也称为E10)。
通过冷靶抑制证实了WT1特异性裂解的特异性(图12A-12B)。在96孔U形底的板中按多种效应子：靶的比率接种效应细胞。添加10倍过量(与热靶比较)的无51Cr所示的所示肽包被的靶。最后，每孔添加104个51Cr标记的靶细胞，并且在37℃温育板4小时。每孔的总体积是200μl。
通过与相关肽p117-139温育的EL-4，而不是与无关肽温育的EL-4将由p117-139特异性CTL导致的TRAMP-C裂解由58％阻断到36％(图12A)。相似地，与相关肽p117-139温育的EL-4将BLKSV40裂解由18％阻断到0％。结果证实WT1肽特异性CTL通过识别经过加工的WT1特异性地杀死恶性细胞。
具有推定的CTL基序的几个片段包含在p117-139中。为了检测CTL表位的精确序列，合成p117-139中所有可能的9-mer肽(表XLVIII)。这些肽中的两种肽(p126-134和p130-138)表现出能结合H-2b I类分子(表XLVIII)。由p117-139免疫产生的CTL能裂解与p126-134及p130-138温育的靶，但是不裂解与p117-139中其它9-mer肽温育的靶(图13A)。
用p126-134或p130-138再刺激p117-139特异性CTL系。用p126-134或p130-138再刺激后，两种T细胞系均表现出肽特异性裂解，不过只有p130-138特异性CTL表现出能裂解WT1阳性肿瘤细胞系(图13B和13C)。因此，p130-138看似天然加工的表位。
                                  表XLVIII
在p117-139中的WT1 CTL 9mer肽与小鼠B6 I类抗原的结合
  肽  对小鼠MHC I类的结合亲和性
  P117-125 PSQASSGQA(SEQ ID NO：221)  2％
  P118-126 SQASSGQAR(SEQ ID NO：216)  2％
  P119-127 QASSGQARM(SEQ ID NO：161和288)  2％
  P120-128 ASSGQARMF(SEQ ID NO：40)  1％
  P121-129 SSGQARMFP(SEQ ID：222)  1％
  P122-130 SGQARMFPN(SEQ ID NO 212)  1％
  P123-131 GQARMFPNA(SEQ ID NO：98和269)  1％
  P124-132 QARMFPNAP(SEQ ID NO：223)  1％
  P125-133 ARMFPNAPY(SEQ ID NO：38)  1％
  P126-134 RMFPNAPYL(SEQ ID NO：185和293)  79％
  P127-135 MFPNAPYLP(SEQ ID NO：224)  2％
  P128-136 FPNAPYLPS(SEQ ID NO：79和267)  1％
  P129-137 PNAPYLPSC(SEQ ID NO：225)  1％
  P130-138 NAPYLPSCL(SEQ ID NO：144和282)  79％
  P131-139 APYLPSCLE(SEQ ID NO：226)  1％
实施例6
小鼠肿瘤细胞系中WT1特异性mRNA的鉴定
该实施例示例了使用RT-PCR检测细胞和细胞系中WT1特异性mRNA。
通过密度梯度离心分离单核细胞，立即冷冻，并且在-80℃贮藏直至利用RT-PCR分析且是否存在WT1特异性mRNA。通常如Fraizer等，Blood 86：4704-4706，1995所述进行RT-PCR。根据标准方法从107个细胞中提取总RNA。RNA沉淀被重悬于25μl焦碳酸二乙酯处理的水中，并且直接用于逆转录。锌指区域(外显子7到10)被PCR扩增为330bp的小鼠cDNA。扩增是在热循环仪中进行一轮或必要时进行两轮连续PCR以实现扩增。在50μl的总反应体积中使用AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)，2.5mM MgCl2和每种引物各20pmol。在用溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上电泳20μL等份的PCR产物。用Polaroid胶片(Polaroid 667，Polaroid Ltd.，Hertfordshire，England)给凝胶拍照。根据Kwok和Higuchi，Nature339：237-238，1989预防交叉污染。在每个试验中，阴性对照包含cDNA和PCR-试剂与水代替cDNA的混合物。为了避免假阴性，通过使用β-肌动蛋白引物的对照PCR来评价每种样品中是否存在完整的RNA和是否产生了足够的cDNA。从分析中去除掉未被这些引物扩增的样品。
用于小鼠细胞系中WT1扩增的引物是：P115：1458-1478：5′CCCAGG CTG CAA TAA GAG ATA 3′(正向引物；SEQ ID NO：21)；和P116：1767-1787：5′ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3′(反向引物；SEQ ID NO：22)(参见Inoue等，Blood 88：2267-2278，1996；Fraizer等，Blood 86：4704-4706，1995)。
对照反应中使用的β-肌动蛋白引物是：5′GTG GGG CGC CCC AGG CACCA 3′(有义引物；SEQ ID NO：23)；和5′GTC CTT AAT GTC ACG CACGAT TTC 3′(反义引物；SEQ ID NO：24)。
用于扩增人类WT1的引物包括：P117：954-974：5′GGC ATC TGAGAC CAG TGA GAA 3′(SEQ ID NO：25)；和P118：1434-1414：5′GAGAGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3′(SEQ ID NO：5)。对于嵌套RT-PCR，引物可以是P119：1023-1043：5′GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3′(SEQ ID NO：26)；和P120：1345-1365：5′TCA AAG CGC CAG CTG GAGTTT 3′(SEQ ID NO：27)。
表XL VIII表示小鼠肿瘤细胞系的WT1 PCR分析结果。在表IV中，(+++)表示第一步RT-PCR中强的WT1 PCR扩增产物，(++)表示用第一步WT1 RT PCR可检测到WT1扩增产物，(+)表示只在第二步WT1 RT PCR中可检测到产物，(-)表示WT1 PCR阴性。
                                      表XLIX
                          小鼠肿瘤细胞系中WT1 mRNA的检测
  细胞系   WT1 mRNA
  K562(人类白血病；ATCC)：阳性对照；(Lozzio和Lozzio，Blood45：321-334，1975)   +++
  TRAMPC(SV40转化的前列腺，B6)；Foster等，Cancer Res.57：3325-3330，1997   +++
  BLK-SV40 HD2(SV40转化的成纤维细胞，B6；ATCC)；Nature276：510-511，1978   ++
  CTLL(T细胞，B6；ATCC)；Gillis，Nature 268：154-156，1977   +
  FM(FBL-3亚系，白血病，B6)；Glynn和Fefer，Cancer Res.28：434-439，1968   +
  BALB 3T3(ATCC)；Aaroston和Todaro，J.Cell.Physiol.72：141-148，1968   +
  S49.1(淋巴瘤，类T细胞，B/C；ATCC)；Horibata和Harris，Exp.Cell.Res.60：61，1970   +
BNL CL.2(胚胎肝脏，B/C；ATCC)；Nature 276：510-511，1978 +
  MethA(肉瘤，B/C)；Old等，Ann，NY Acad.Sci.101：80-106，1962   -
  P3.6.2.8.1(骨髓瘤，B/C；ATCC)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 66：344，1970   -
  P2N(白血病，DBA/2；ATCC)；Melling等，J.Immunol.117：1267-1274，1976   -
  BCL1(淋巴瘤，B/C；ATCC)；Slavin和Strober，Nature 272：624-626，1977   -
  LSTRA(淋巴瘤，B/C)Glynn等，Cancer Res.28：434-439，1968   -
  E10/EL-4(淋巴瘤，B6)；Glynn等，Cancer Res.28：434-439，1968   -
实施例7
WT1 TRX融合构建体在大肠杆菌(E.coli)中的表达
用下面的引物PCR扩增WT1截短的开放阅读框(WT1B)：
在氨基酸2起始的正向引物：
P-37(SEQ ID NO.342)5′ggctccgacgtgcgggacctg 3′Tm 64℃
在终止密码子之后增设EcoRI位点的反向引物：
P-23(SEQ ID NO.343)5′gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3′Tm 63℃
在下面的条件下进行PCR：
10μl 10×Pfu缓冲液
1μl 10mM dNTPs
2μl 10μM每种寡聚物
83μL无菌水
1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃，2分钟
96℃，20秒，63℃，15秒，72℃，3分钟×40个循环
72℃ 4分钟。
PCR产物用EcoRI限制酶消化、凝胶纯化，然后克隆到pTrx 2H载体中(经修饰的pET28载体，该载体带有在N-末端的Trx融合和围绕Trx融合的两个His标记。Trx融合后，存在凝血酶和肠激酶的蛋白酶切割位点)中。用StuI和EcoRI限制酶消化pTrx2H构建体。正确的构建体被DNA测序分析证实，然后被转化到BL21(DE3)pLys S和BL21(DE3)CondonPlus表达宿主细胞中。
实施例8
WT1 A His标签融合构建体在大肠杆菌(E.coli)中的表达
用下面的引物PCR扩增WT1 N-末端开放阅读框(WT1A)：
在氨基酸2起始的正向引物：
P-37(SEQ ID NO.344)5′ggctccgacgtgcgggacctg 3′Tm 64℃
在位于氨基酸249后的人工终止密码子后增设EcoRI位点的反向引物：
PDM-335(SEQ ID NO.345)5′gaattctcaaagcgccagctggagtttggt3′Tm 64℃
在下面的条件下进行PCR：
10μl 10×Pfu缓冲液
1μl 10mM dNTPs
2μl 10μM每种寡聚物
83μL无菌水
1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃，2分钟
96℃，20秒，63℃，15秒，72℃，1分钟20秒×40个循环
72℃ 4分钟。
PCR产物用EcoRI限制酶消化、凝胶纯化，然后克隆到pPDM中，该pPDM是带有符合阅读框的His标签的经修饰的pET28载体，其已经被Eco721和EcoRI限制酶消化。PCR产物也被转化到pTrx 2H载体中。用StuI和EcoRI限制酶消化pTrx 2H构建体。用DNA测序分析证实该构建体是正确的，然后将其转化到BL21(DE3)pLys S和BL21(DE3)CondonPlus表达宿主细胞中。
实施例9
WT1 B His标签融合构建体在大肠杆菌(E.coli)中的表达
用下面的引物PCR扩增WT1截短的开放阅读框(WT1 A)：
在氨基酸250起始的正向引物：
PDM-346(SEQ ID NO.346)5′cacagcacagggtacgagagc 3′Tm 58℃
在终止密码子后增设EcoRI位点的反向引物：
P-23(SEQ ID NO.347)5′gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3′Tm 63℃
在下面的条件下进行PCR：
10μl 10×Pfu缓冲液
1μl 10mM dNTPs
2μl 10μM每种寡聚物
83μL无菌水
1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃，2分钟
96℃，20秒，63℃，15秒，72℃，1分钟30秒×40个循环
72℃ 4分钟。
PCR产物用EcoRI限制酶消化、凝胶纯化，然后克隆到pPDM中，该pPDM是带有符合阅读框的His标签的经修饰的pET28载体，其已经被Eco721和EcoRI限制酶消化。PCR产物也被转化到pTrx 2H载体中。用StuI和EcoRI限制酶消化pTrx 2H构建体。用DNA测序分析证实该构建体是正确的，然后被转化到BL21(DE3)pLys S和BL21(DE3)CondonPlus表达宿主细胞中。
对于实施例7-9，公开了下面的SEQ ID NO：
SEQ ID NO.327是测定的Trx_WT1_B的cDNA序列；
SEQ ID NO.328是测定的Trx_WT1_A的cDNA序列；
SEQ ID NO.329是测定的Trx_WT1的cDNA序列；
SEQ ID NO.330是测定的WT1_A的cDNA序列；
SEQ ID NO.331是测定的WT1_B的cDNA序列；
SEQ ID NO.332是预测的由SEQ ID No.327编码的氨基酸序列；
SEQ ID NO.333是预测的由SEQ ID No.328编码的氨基酸序列；
SEQ ID NO.334是预测的由SEQ ID No.329编码的氨基酸序列；
SEQ ID NO.335是预测的由SEQ ID No.330编码的氨基酸序列；
SEQ ID NO.336是预测的由SEQ ID No.331编码的氨基酸序列。
实施例10
大肠杆菌(E.coli)中表达的WT1截短形式
利用下面的引物，通过PCR扩增WT1的3个阅读框：
对于WT1 Tr2：
PDM-441(SEQ ID NO.348)
5′cacgaagaacagtgcctgagcgcattcac 3′Tm 63℃
PDM-442(SEQ ID NO.349)
5′ccggcgaattcatcagtataaattgtcactgc 3′TM 62℃
对于WT1 Tr3：
PDM-443(SEQ ID NO.350)
5′caggctttgctgctgaggacgccc 3′Tm 64℃
PDM-444(SEQ ID NO.351)
5′cacggagaattcatcactggtatggtttctcacc Tm 64℃
对于WT1 Tr4：
PDM-445(SEQ ID NO.352)
5′cacagcaggaagcacactggtgagaaac 3′Tm 63℃
PDM-446(SEQ ID NO.353)
5′ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3′TM 63℃
在下面的条件下进行PCR：
10μl 10×Pfu缓冲液
1μl 10mM dNTPs
2μl 10μM每种寡聚物
83μL无菌水
1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃，2分钟
96℃，20秒，63℃，15秒，72℃，30秒×40个循环
72℃ 4分钟。
PCR产物用EcoRI消化，并且克隆到已经被Eco721和EcoRI消化的pPDM His(经修饰的pET28载体，其在5’末端上具有符合阅读框的His标签)中。通过序列分析证实构建体是正确的，然后将该构建体被转化到BL21 pLys S和BL21 CondonPlus细胞或BLR pLys S和BLR CondonPlus细胞中。
实施例11
WT1 C(氨基酸76-437)和WT1 D(氨基酸91-437)在大肠杆菌(E.coli)中表达
利用下面引物，通过PCR扩增WT1 C阅读框：
PDM-504(SEQ ID NO.354)
5′cactccttcatcaaacaggaac 3′Tm 61℃
PDM-446(SEQ ID NO.355)
5′ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3′Tm 63℃。
在下面的条件下进行PCR：
10μl 10×Pfu缓冲液
1μl 10mM dNTPs
2μl 10μM每种寡聚物
83μL无菌水
1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃，2分钟
96℃，20秒，63℃，15秒，72℃，2分钟×40个循环
72℃ 4分钟。
PCR产物用EcoRI消化，并且克隆到已经被Eco721和EcoRI消化的pPDM His中。通过序列分析证实该序列，然后该序列被转化到与CondonPlus RP共转化的BLR pLys S和BLR中。
实施例12
通过退火重叠寡聚物合成产生WT1 TR-1
进行该实施例以检测改变脯氨酸密码子使用在表达上的作用。
下面成对的寡聚物被退火：
1.PDM-505(SEQ ID NO.356)5′
ggttccgacgtgcgggacctgaacgcactgctg 3′
PDM-506(SEQ ID NO.357)5′
ctgccggcagcagtgcgttcaggtcccgcacgtcggaacc 3′
2.PDM-507(SEQ ID NO.358)5′
ccggcagttccatccctgggtggcggtggaggctg 3′
PDM-508(SEQ ID NO.359)5′
cggcagtgcgcagcctccaccgccacccagggatggaa 3′
3.PDM-509(SEQ ID NO.360)5′
cgcactgccggttagcggtgcagcacagtgggctc 3′
PDM-510(SEQ ID NO.361)5′
cagaactggagcccactgtgctgcaccgctaac 3′
4.PDM-511(SEQ ID NO.362)5′
cagttctggacttcgcaccgcctggtgcatccgcatac 3′
PDM-512(SEQ ID NO.363)5′
cagggaaccgtatgcggatgcaccaggcggtgcgaagtc 3′
5.PDM-513(SEQ ID NO.364)5′
ggttccctgggtggtccagcacctccgcccgcaacgcc 3′
PDM-514(SEQ ID NO.365)5′
ggcggtgggggcgttgcgggcggaggtgctggaccacc 3′
6.PDM-515(SEQ ID NO.366)5′
cccaccgcctccaccgcccccgcactccttatcaaacag 3′
PDM-516(SEQ ID NO.367)5′
ctaggttcctgtttgatgaaggagtgcgggggcggtgga 3′
7.PDM-517(SEQ ID NO.368)5′
gaacctagctggggtggtgcagaaccgcacgaagaaca 3′
PDM-518(SEQ ID NO.369)5′
ctcaggcactgttcttcgtgcggttctgcaccaccccag 3′
8.PDM-519(SEQ ID NO.370)5′
gtgcctgagcgcattctgagaattctgcagat 3′
PDM-520(SEQ ID NO.371)5′
gtgtgatggatatctgcagaattctcagaatgcg 3′
每对寡聚物被单独混合，然后退火。然后，该对寡聚物被连接在一起，并且1μl的连接混合物被用于下面的PCR条件：
10μl 10×Pfu缓冲液
1μl 10mM dNTPs
2μl 10μM每种寡聚物
83μL无菌水
1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)
96℃，2分钟
96℃，20秒，63℃，15秒，72℃，30秒×40个循环
72℃ 4分钟。
PCR产物用EcoRI消化，并且克隆到已经被Eco721和EcoRI消化的pPDM His中。通过序列分析证实该序列，然后该序列被转化到与CondonPlus RP共转化的BLR pLys S和BLR中。
对于实施例10-12，公开了下面的SEQ ID NO：
SEQ ID NO：337是测定的WT1_Tr1的cDNA序列；
SEQ ID NO：338是测定的WT1_Tr2的cDNA序列；
SEQ ID NO：339是测定的WT1_Tr3的cDNA序列；
SEQ ID NO：340是测定的WT1_Tr4的cDNA序列；
SEQ ID NO：341是测定的WT1_C的cDNA序列；
SEQ ID NO.342是预测的由SEQ ID No.337编码的氨基酸序列；
SEQ ID NO.343是预测的由SEQ ID No.338编码的氨基酸序列；
SEQ ID NO.344是预测的由SEQ ID No.339编码的氨基酸序列；
SEQ ID NO.345是预测的由SEQ ID No.340编码的氨基酸序列；
SEQ ID NO.346是预测的由SEQ ID No.341编码的氨基酸序列。
WT1 C序列代表具有TR2、TR3和TR4编码区的多核苷酸。
WT1 TR-1合成序列代表多核苷酸，其中可替换的脯氨酸密码子被置换成天然密码子，产生了能在大肠杆菌(E.coli)中表达WT1 TR-1的多核苷酸。
实施例13
小鼠WT1免疫的系统组织病理学和毒理学作用评价
该实施例的目的是分析在小鼠多剂量滴定中用WT1蛋白质免疫的免疫原性和潜在的系统组织病理学和毒理学作用。
表L中概述了用WT1蛋白质免疫小鼠的试验设计。
                          表L
                  小鼠WT1免疫的试验设计
  组织学分组  Corixa分组   处理   剂量水平   总数(雌性)
  1  0   无处理   0   4
  2  1.1   MPL-SE(单独的佐剂)，6×，1周间隔   10μg   4
  3  1.2   MPL-SE，3×，2周间隔   10μg   4
  4  2.1   Ra12-WT1+MPL-SE，6×   25μg   4
  5  2.2   Ra12-WT1+MPL-SE，3×   25μg   4
  6  3.1   Ra12-WT1+MPL-SE，6×   100μg   4
  7  3.2   Ra12-WT1+MPL-SE，3×   100μg   4
  8  4.1   Ra12-WT1+MPL-SE，6×   1000μg   4
  9  4.2   Ra12-WT1+MPL-SE，3×   1000μg   4
在多剂量滴定研究(剂量范围从25μg、100μg到1000μg WT1蛋白质)中利用MPL-SE作为佐剂，将WT1蛋白质接种在雌性C57/B6小鼠中激发了强WT1特异性抗体应答(图19)和细胞性T细胞应答(图20)。
没有观察到用WT1蛋白质免疫导致的系统组织病理学或毒理学作用。在下列组织：肾上腺、大脑、盲肠、结肠、十二指肠、眼睛、股骨和骨髓、胆囊、心脏、回肠、空肠、肾脏、喉、泪腺、肝脏、肺、淋巴结、肌肉、食管、卵巢、胰腺、甲状旁腺、唾腺、胸骨和骨髓、脾脏、胃、胸腺、气管、甲状腺、膀胱和子宫中没有观察到毒性的组织学证据。
对潜在造血毒性的评价处于重要地位。胸骨和股骨骨髓中骨髓/红细胞比率正常。所有可评价的血细胞计数和血液化学(BUN、肌酸酐、胆红素、白蛋白、球蛋白)都在正常范围内(表L1)。
已知患有白血病的一些患者中已现存有对WT1的免疫性，并且WT1蛋白质的接种可以激发小鼠中WT1特异性Ab和细胞性T细胞应答，且该接种对正常组织没有毒性作用，这些试验均证实WT1可作为肿瘤/白血病疫苗。
                                       表LI
                              临床化学和血液学分析
表LI：WT1剂量滴定研究
临床化学和血液学分析
Animal#   K/uLWBC   M/uLRBC   g/dlHg.   ％HCT   fLMCV   pgMCH   ％MCHC
  NormalGroup11(0)2(0)3(0)4(0)MeanSTDGroup25(1.5)6(1.6)7(1.7)8(1.8)MeanSTDGroup39(2.5)10(2.6)11(2.7)12(2.8)MeanSTDGroup413(3.5)14(3.6)15(3.7)16(3.8)MeanSTDGroup517(4.5)18(4.6)19(4.7)20(4.8)Mean   5.4-16.05.65.57.53.95.61.56.65.27.86.36.51.18.3548.26.42.26.16.19.34.86.61.93.15.75.35.34.9   6.7-12.58.419.129.229.279.00.498.589.21NA8.90.39.168.788.94NA9.00.28.828.648.938.198.60.38.489.128.58NA8.7   10.2-16.612.813.413.513.613.30.413.112.613.6NA13.10.513.61313.2NA13.30.313.112.913.212.613.00.312.613.713NA13.1   32-5443.547.5484646.32.04644464144.32.450.344.248.34146.04.24646484446.01.6464844.54044.6   31-625353545253.00.8545353NA53.30.6555054NA53.02.65454555554.50.6545455NA54.3   9.2-20.815.214.714.714.714.80.314.514.714.7NA14.60.114.914.814.7NA14.80.114.91514.815.315.00.214.91515.2NA15.0   22.0-35.529.428.228.129.628.80.828.528.629.6NA28.90.627.129.327.3NA27.91.228.52827.528.628.20.527.528.529.2NA28.4
表中animal＝动物，normal＝正常值，mean＝均值，Group＝组(下同)
表LI：WT1剂量滴定研究
临床化学和血液学分析
Animal#   K/uLWBC   M/uLRBC   g/dlHg.   ％HCT   fLMCV   pgMCH   ％MCHC
  NormalSTDGroup621(1.1)22(1.2)23(1.3)24(1.4)MeanSTDGroup725(2.1)26(2.2)27(2.3)28(2.4)MeanSTDGroup829(3.1)30(3.2)31(3.3)32(3.4)MeanSTDGroup933(4.1)34(4.2)35(4.3)36(4.4)MeanSTD   5.4-16.01.23.56.93.6NA4.71.947.44.55.85.41.55.17.63.46.15.61.8NA4.53.94.74.40.4   6.7-12.50.39.368.938.3NA8.90.5NA9.128.198.258.50.58.538.428.458.118.40.2NA8.638.858.148.50.4   10.2-16.60.613.513.612.5NA13.20.6NA13.212.112.312.50.612.61312.612.312.60.3NA12.81312.312.70.4   32-543.437.637.335.3NA36.71.34038.534.534.136.82.934.936.134.934.835.20.6NA36.236.633.835.51.5   31-620.6404243NA41.71.5NA42424141.70.64143414342.01.2NA42414241.70.6   9.2-20.80.214.415.315.1NA14.90.5NA14.514.814.914.70.214.715.414.915.215.10.3NA14.814.715.114.90.2   22.0-35.50.935.936.635.5NA36.00.6NA34.335.136.135.20.93635.936.135.535.90.3NA35.235.636.335.70.6
表LI(续)：WT1剂量滴定研究
临床化学和血液学分析
Animal#   yes/noPlt.clump   K/uLPlatelets   Abs.Baso   Abs.Eos   Abs.Bands   Abs.Polys   Abs.Lymph   Abs.Mono
  NormalGroup11(0)2(0)3(0)4(0)MeanSTDGroup25(1.5)6(1.6)7(1.7)8(1.8)MeanSTDGroup39(2.5)10(2.6)11(2.7)12(2.8)MeanSTDGroup413(3.5)14(3.6)15(3.7)16(3.8)MeanSTDGroup517(4.5)18(4.6)19(4.7)20(4.8)MeanSTD   noyesnonoyesnononoyesnononoyesnoyesyesyesnoyesyesyes   150-1500726860875902840.878.4119311661087NA1148.755.17051140952NA932.3218.278597393916221079.8370.6892966883NA913.745.5   0.0-0.15K/uL00000.00.000000.00.000000.00.000000.00.00570014.328.5   0.0-0.51K/uL5603750107.8180.113252234126136.074.8166150120164150.021.24880465192286.3233.4311145310676.040.4   0.0-0.32K/uL00000.00.000000.00.000000.00.000000.00.000000.00.0   8.0-42.9K/uL33655525156268.0207.07926241170126678.0433.1664500680656625.083.9732488558480564.5117.062085574253567.5356.2   8.0-18.0K/uL52085445652537445230.51144.852144472639659225501.0840.573874350320072165538.32090.646365307781240805458.81647.124494674445251414179.01188.5   0.0-1.5K/uL0075018.837.5462520126160.0207.9830016461.878.624430546548265.5172.40053013.326.5
表中clump＝凝块，Platelets＝血小板，yes＝有，no＝无
表LI(续)：WT1剂量滴定研究
临床化学和血液学分析
Animal#   yes/noPlt.clump   K/uLPlatelets   Abs.Baso   Abs.Eos   Abs.Bands   Abs.Polys   Abs.Lymph   Abs.Mono
  NormalGroup621(1.1)22(1.2)23(1.3)24(1.4)MeanSTDGroup725(2.1)26(2.2)27(2.3)28(2.4)MeanSTDGroup829(3.1)30(3.2)31(3.3)32(3.4)MeanSTDGroup933(4.1)34(4.2)35(4.3)36(4.4)MeanSTD   noyesyesyesNAyesyesyesyesyesyesyesyesNAyesyesyes   150-1500784806790NA793.311.4NA753725792756.733.7784512701631657.0115.1NA724758808763.342.3   0.0-0.15000NA0.00.000000.00.000000.00.0NA0000.00.0   0.0-0.513569180NA94.775.880090232100.596.51531520305152.5124.5NA1251174796.342.9   0.0-0.32000NA0.00.000000.00.000000.00.0NA0000.00.0   8.0-42.9385207396NA329.3106.1200518225754424.3263.0561304238305352.0142.8NA540429329432.7105.5   8.0-18.0287064862988NA4114.72054.537206734414048144852.01333.142336992309453684921.81663.3NA3780331540893728.0389.6   0.0-1.521013836NA128.087.4014845048.369.815315268122123.839.9NA4539235106.3111.5
表LI(续)：WT1剂量滴定研究
临床化学和血液学分析
Animal#   mg/dlBUN   mg/dlCreatinine   g/dlT.protein   g/dlAlbumin   g/dlGlobulin   mg/dlT.Bilirubin
  NormalGroup11(0)2(0)3(0)4(0)MeanSTDGroup25(1.5)6(1.6)7(1.7)8(1.8)MeanSTDGroup39(2.5)10(2.6)11(2.7)12(2.8)MeanSTDGroup413(3.5)14(3.6)15(3.7)16(3.8)MeanSTDGroup517(4.5)18(4.6)19(4.7)20(4.8)MeanSTD   13.9-28.3NA28252726.71.5343134NA33.01.7NA33NA3132.01.43234302430.04.32231232826.04.2   0.3-1.0NA0.50.50.50.50.00.50.40.6NA0.50.1NA0.5NA0.50.50.00.70.40.40.30.50.20.40.50.60.50.50.1   4.0-8.6NA4.94.94.74.80.14.64.64.9NA4.70.2NA4.6NA4.84.70.14.64.84.75.14.80.24.64.94.84.54.70.2   2.5-4.8NA3.73.83.73.70.13.63.34NA3.60.4NA3.6NA3.73.70.13.43.83.43.83.60.23.33.73.63.43.50.2   1.5-3.8NA1.21.111.10.111.30.9NA1.10.2NA1NA1.11.10.11.211.31.31.20.11.31.21.21.11.20.1   0.10-0.90NA0.30.20.20.20.10.20.20.3NA0.20.1NA0.3NA0.20.30.10.20.20.20.20.20.00.20.20.20.20.20.0
表中Creatinine＝肌酐，T.protein＝总蛋白，
Albumin＝白蛋白，Globulin＝球蛋白，T.Bilirubin＝总胆红素
表LI(续)：WT1剂量滴定研究
临床化学和血液学分析
Animal#   Mg/dlBUN   mg/dlCreatinine   g/dlT.protein   g/dlAlbumin   g/dlGlobulin   mg/dlT.Bilirubin
  NormalGroup621(1.1)22(1.2)23(1.3)24(1.4)MeanSTDGroup725(2.1)26(2.2)27(2.3)28(2.4)MeanSTDGroup829(3.1)30(3.2)31(3.3)32(3.4)MeanSTDGroup933(4.1)34(4.2)35(4.3)36(4.4)MeanSTD   13.9-28.3283632NA32.04.03224282727.83.332NA182625.37.025NA232925.73.1   0.3-1.00.30.30.4NA0.30.10.20.30.30.30.30.00.3NA0.30.20.30.10.2NA0.20.30.20.1   4.0-8.65.15.14.9NA5.00.154.24.854.80.44.9NA4.84.24.60.44.1NA4.74.74.50.3   2.5-4.83.43.83.5NA3.60.23.42.83.23.43.20.33.3NA3.12.93.10.22.7NA3.13.23.00.3   1.5-3.81.71.31.4NA1.50.21.61.41.61.61.60.11.6NA1.71.31.50.21.4NA1.61.51.50.1   0.10-0.900.20.20.1NA0.20.10.20.10.20.10.20.10.2NA0.200.10.10.3NA0.20.30.30.1
缩写：WBC：白细胞；RBC：红细胞；Hg：血红蛋白；HCT：血细胞比容；MCV：平均细胞比容；MCH：平均细胞血红蛋白；MCHC：平均细胞血红蛋白浓度；Plt.：血小板；Abs：绝对的；Baso：嗜碱性粒细胞；Eos：嗜伊红性粒细胞；Abs.Bands：未成熟的嗜中性白细胞；Polys：多形核细胞；Lymph：淋巴细胞；Mono：单核细胞；BUN：血尿素氮。
实施例14
通过完整基因体外致敏激发人类WT1特异性T细胞应答
该实施例证明可以在正常个体的血液中产生WT1特异性T细胞应答。
树突细胞(DC)是通过在含有10％人类血清、50ng/ml GMCSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-10天，从来源于正常供体的PBMC的单核细胞培养物分化而来的。培养后，DC被表达重组WT1的痘苗病毒以5M.O.I.感染16小时，或者被表达重组WT1的腺病毒以10M.O.I.感染3天(图21和22)。痘苗病毒被UV照射灭活。通过利用磁珠的阳性筛选分离CD8+T细胞，并且在96孔板中开始致敏培养物。每隔7-10天利用腺病毒或痘苗病毒感染的自身树突细胞再刺激培养物以表达WT1。3-6轮刺激后，可以鉴定CD8+细胞系，当用表达自身WT1的树突细胞或成纤维细胞刺激它时，它特异性地产生干扰素γ。这些细胞系的WT1特异性活性可以在另外的刺激循环后被维持。利用Elispot测定法证明这些细胞系特异性地识别腺病毒或痘苗病毒WT1感染的自身树突细胞，但是不识别腺病毒或痘苗病毒EGFP感染的自身树突细胞(图23)。
实施例15
用于注射的RA12-WT1制剂：使用赋形剂以稳定冻干产物
该实施例描述了可使冻干Ra12-WT1完全溶解的制剂。
下面的制剂可使重组蛋白质Ra12-WT1被冷冻干燥后被溶解在水介质中：重组Ra12-WT1浓度：0.5-1.0％mg/ml；缓冲液：10-20mM乙醇胺，pH10.0；1.0-5.0mM半胱氨酸；0.05％Tween-80(多聚乙氧基醚)；糖：10％海藻糖(T5251，Sigma，MO)10％麦芽糖(M9171，Sigma，MO)10％蔗糖(S7903，Sigma，MO)10％果糖(F2543，Sigma，MO)10％葡萄糖(G7528，Sigma，MO)。
发现具有糖赋形剂的冻干蛋白质的溶解显著多于没有糖赋形剂的冻干蛋白质。通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析表明在溶解的物质中没有残留固体的迹象。
实施例16
WT1蛋白质疫苗的制剂
该实施例描述了用WT1蛋白质和2种不同的佐剂制剂免疫后WT1特异性免疫应答的诱导。
根据该实施例，WT1蛋白质联合MPL-SE诱导对WT1应答的强Ab和干扰素γ(IFN-γ)。下面详细描述的是使用MPL-SE或Enhanzyn作为佐剂的，在C57/B6小鼠中进行WT1蛋白质免疫以诱导WT1特异性免疫应答的方法。
用20μg联合有MPL-SE或Enhanzyn佐剂的rRa12-WT1免疫C57BL/B6小鼠。用无佐剂的rRa12-WT1免疫一组对照小鼠，一组只用生理盐水免疫。间隔3周进行3次肌内(IM)免疫。最后免疫后2周收集脾脏和血清。在Ra12-WT1融合物，Ra12或WT1TRX包被的板上用ELISA分析血清的抗体应答。在Ra12-WT1+MPL-SE和Ra12-WT1+Enhanzyn免疫的小鼠中观察到了相似水平的IgG2a和IgG1抗体效价。用无佐剂的rRa12-WT1免疫的小鼠显示了较低水平的IgG2a抗体。
通过测定体外用rRa12-WT1、rRa12或WT1肽p6、p117和p287刺激脾细胞后干扰素γ的产生来评价CD4应答。两种佐剂都改进了只用rRA12-WT1免疫的小鼠的CD4应答。另外，结果表明rRA12-WT1+MPL-SE能诱导比rRA12-WT1+Enhanzyn诱导更强的CD4应答。IFN-γOD读数范围在用rRA12-WT1+MPL-SE免疫的小鼠中是1.4-1.6，相比较在用rRA12-WT1+Enhanzyn免疫的小鼠中是1-1.2。只观察到针对p117的肽应答，并且只在用rRA12-WT1+MPL-SE免疫的小鼠中观察到该应答。在所有的小鼠中都观察到了针对阳性对照、ConA的强IFN-γ应答。在用生理盐水免疫的阴性对照小鼠中只观察到了对ConA的应答，表明该应答对rRA12-WT1是特异的。
实施例17
随机突变WT1文库的构建
利用聚合酶链式反应方法在8-氧-dGTP和dPTP存在的情况下随机突变人类WT1的核酸序列(Molecular Biology期刊1996；255：589-603)。在SEQ ID NO：380中公开了完整未剪接的人类WT1基因，在SEQ ID NO：404中示出了相应的蛋白质序列。WT1剪接变异体被用作PCR反应的模板，并且被公开在SEQ ID NO：381(DNA)和408(蛋白质)中。选择条件以使核酸改变的频率能引起氨基酸序列的目的性改变，通常是PCR产物的5-30％。然后，在核苷酸类似物不存在的情况下，利用4个正常dNTPs扩增突变的PCR产物。该PCR产物被亚克隆到哺乳动物表达载体和病毒载体中用于免疫。因此，这个文库是包含随机突变的WT1克隆的混合群。筛选和测序几个克隆。在SEQ IDNO：377-379中公开了突变的WT1变异体DNA序列，并且在SEQ IDNO：405-407中示出了预测的变异体氨基酸序列。来自于文库的这些改变的序列和其它序列可以用作免疫原以诱导针对癌细胞的WT1蛋白质的更强T细胞应答。
实施例18
WT1-LAMP融合基因的构建
利用聚合酶链式反应和合成的寡核苷酸构建三联融合基因，该寡核苷酸包含人类溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)和人类WT1序列剪接变异体的所需接头。用于这些融合基因的WT1剪接变异体和LAMP-1序列在SEQ ID NO：381-383中被公开。具体地，LAMP-1的信号肽(LAMP的碱基对1-87)被融合到人类WT1开放阅读框的5-引物端(prime-end)(长1，290个碱基对)，然后LAMP-1的跨膜和胞质结构域(LAMP的碱基对1161到1281)被融合到WT1序列的3-引物端。在SEQ IDNO：382(DNA)和SEQ ID NO：409(蛋白质)中示出了所得到的WT1-LAMP构建体序列。将构建体设计成当使它在真核生物细胞中被表达时，信号肽向内质网(ER)引导蛋白质，内质网中LAMP-1的跨膜和胞质结构域中的定位信号引导融合蛋白质转运到溶酶体位置，在该位置肽被加载到II类MHC分子上。
实施例19
构建WT1-泛素融合基因用于增强的MHC I类呈递
人类泛素开放阅读框(SEQ ID NO：384)被突变以使编码最后氨基酸的核苷酸编码丙氨酸而不是甘氨酸。该突变的开放阅读框正好被克隆到人类WT1剪接变异体的第一个密码子上游符合阅读框的位置中(DNA和蛋白质分别是SEQ ID NO：381和408)。G-＞A突变防止通过蛋白酶进行的邻近蛋白质共翻译切割，该蛋白酶通常在翻译期间加工聚泛素。所得到的构建体的DNA和预测的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：385和410中所述。当它在人类细胞中被表达时，所得到的蛋白质表现出降低的细胞毒性。尽管不可能产生表达天然WT1的稳定细胞系，但是容易获得表达融合蛋白质的细胞系。由于添加的泛素分子，可预测所得到的蛋白质将被靶向蛋白体。这应该导致WT1特异性CD+8细胞对蛋白质更有效的识别。
实施例20
表达人类WT1的腺病毒载体的构建
人类WT1剪接变异体(SEQ ID NO：381)被克隆到E1和E3缺失的腺病毒血清型5载体中。通过介导高水平WT1蛋白质表达的CMV启动子控制WT1基因的表达。用这种试剂感染人类细胞引起了高水平的WT1蛋白质表达。在被导入到宿主细胞的过程中和感染后以低水平产生的腺病毒蛋白质的抗原性质可以起到以增强WT1作为免疫靶的免疫监测和免疫识别的作用。该载体当被引入到人类个体中时也可以用于产生抗WT1蛋白质的免疫应答。如果这些个体对表达WT1的肿瘤细胞是阳性，那么免疫治疗可以具有对疾病疗程的治疗或治愈作用。
实施例21
表达人类WT1的痘苗病毒的构建
利用pSC11穿梭载体，将全长人类WT1基因的剪接变异体(SEQID NO：381)克隆到痘苗病毒Western Reserve株系的胸苷激酶位点中。WT1基因受杂合痘苗病毒启动子控制，该启动子通过痘苗病毒感染过程介导基因表达。这种试剂可以用于体内或体外在人类细胞中表达WT1蛋白质。WT1是在一些人类肿瘤细胞上过表达的自身蛋白质。因此，针对作为蛋白质而被递送的WT1的免疫应答不可能产生主要组织相容性I类(MHC I类)介导的WT1识别。然而，通过痘苗病毒载体在细胞内区室中的蛋白质表达将允许高水平的MHC I类呈递和通过CD8+T细胞的WT1蛋白质识别。通过痘苗病毒载体表达WT1蛋白质也将引起MHC I类范围中的WT1肽的呈递，因此引起通过CD4+T细胞的识别。
本发明的用途包括将其作为癌症疫苗。免疫具有WT1阳性肿瘤的人类个体将引起治疗性或治愈性应答。细胞中WT1表达将引起通过CD4和CD8阳性T细胞的蛋白质识别。
实施例22
利用完整基因致敏使之产生WT1特异性CD8+T细胞克隆
树突细胞(DC)是通过在含有10％人类血清、50ng/ml GM-CSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-10天，从来源于正常供体的PBMC的单核细胞培养物分化来的。培养后，DC被表达重组WT1的痘苗病毒(如实施例21中所述)以感染复数(MOI)5感染16小时，或者被表达重组WT1的腺病毒以MOI.10感染3天。痘苗病毒经UV照射灭活。通过利用磁珠的阴性耗竭分离CD8+T细胞，并且在96孔板中开始致敏培养物。每隔7-10天利用人工改造的腺病毒或痘苗病毒感染的自身树突细胞再刺激培养物以表达WT1。4-5轮刺激后，可以鉴定CD8+T细胞系，当用表达自身WT1的树突细胞或成纤维细胞刺激它时，它特异性地产生干扰素γ。这些细胞系被克隆和通过Elispot分析证明这些细胞系特异性地识别WT1转导的自身成纤维细胞，但是不识别EGFP转导的成纤维细胞。
维尔姆斯瘤基因参与白血病生成，并且在多数人类白血病及几种实体肿瘤中被过表达。以前对人的研究已经证明了在所研究的AML和CML患者中存在WT1特异性抗体(Ab)应答，在AML患者中为16/63(25％)，在CML患者为15/81(19％)。以前在小鼠中的研究已经表明基于WT1肽的疫苗能激发WT1特异性Ab、Th和CTL应答。在人类中使用肽作为疫苗受限于它们的HLA限制性和激发肽特异性应答及只在少数患者中激发肿瘤特异性CTL的倾向。使用完整基因免疫的优点是几种辅助和CTL表位可以被包含在单个疫苗中，因此不将疫苗限于特定的HLA类型。这里所公开的数据证明使用完整基因在体外致敏，能诱导WT1特异性免疫应答，并且可以产生WT1特异性CD8+T细胞克隆。鉴于一些白血病患者中现存有WT1免疫性，同时鼠和人类的WT1在氨基酸水平上有96％是相同的，此外用WT1蛋白质、DNA或肽免疫可以在小鼠中激发WT1特异性Ab和细胞T细胞应答同时对小鼠的正常组织没有毒性，所以这些人类体外致敏试验提供了WT1可以作为肿瘤/白血病疫苗的进一步确证。而且，这种产生WT1特异性CD8+T细胞克隆的能力可以导致将基因改造的T细胞用于与WT1过表达有关的恶性肿瘤的治疗。
实施例23
制备用于临床的WT1重组构建体
如下面详述制备5种构建体，用于临床级别WT1的产生。
设计没有His标签的Ra12/WT-E(SEQ ID NO：388(cDNA)和391(蛋白质))和WT-1E(SEQ ID NO：386(cDNA)和395(蛋白质))：
利用下面引物PCR扩增无His非融合构建体的WT1-E阅读框：
PDM-780(SEQ ID NO：396)5′gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3′Tm 60℃
PDM-779(SEQ ID NO：397)5′cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3′Tm 63℃。
使用下面的PCR循环条件：1μl 10×Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 1μM每种寡聚物，83μL无菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，50ng DNA(无His的pPDMRa12 WT-1)。反应最初在96℃变性2分钟，接着96℃，20秒；62℃，15秒；72℃，1分钟40秒，进行40个循环。接着是72℃ 4分钟的最后延伸。PCR产物被NdeI和EcoRI消化，并且克隆到已经被NdeI和EcoRI消化的pPDM His中(经过修饰的pET28载体)。通过序列分析证实构建体，然后其被转化到BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞中。然后用NcoI和XbaI消化该构建体-pPDM WT-1 E，并且将其作为载体骨架用于来源于pPDM Ra12WT-1F的NcoI和XbaI插入片段(参见下文)。通过序列分析证实构建体，然后其被转化到BLR(DE3)pLys S和HMS174(DE 3)pLys S细胞中。通过考马斯染色的SDS-PAGE和N末端蛋白质序列分析证实蛋白质表达。
设计没有His标签的Ra12-WT-1-F(a.a.1-281)(SEQ ID NO：389(cDNA)和393(蛋白质))：
用下面的引物PCR扩增Ra12 WT-1阅读框：
PDM-777(SEQ ID NO：398)
5′cgataagcatatgacggccgcgtccgataac 3′Tm 66℃
PDM-779(SEQ ID NO：399)
5′cgcgtgaattcatcactgaatgcctcgaag 3′Tm 63℃。
使用下面的PCR循环条件：1μl 10×Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 1μM每种寡聚物，83μL无菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，50ng DNA(无His的pPDMRa12 WT-1)。反应最初在96℃变性2分钟，接着96℃，20秒；58℃，15秒；72℃，3分钟进行40个循环。接着是72℃ 4分钟的最后延伸。PCR产物被NdeI消化，并且克隆到已经被NdeI和Eco721消化的pPDM His中。通过序列分析验证该序列，然后其被转化到BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞中。通过考马斯染色SDS-PAGE和N末端蛋白质序列分析验证蛋白质表达。
没有His标签的Ra12-WT-1的设计(SEQ ID NO：390(cDNA)和392(蛋白质))：
用下面的引物PCR扩增Ra12 WT-1阅读框：
PDM-777(SEQ ID NO：400)5′cgataagcatatgacggccgcgtccgataac3′Tm 66℃
PDM-778(SEQ ID NO：401)5′gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3′Tm7℃。
使用下面的PCR循环条件：1μl 10×Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 1μM每种寡聚物，83μL无菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，50ng DNA(无His的pPDMRa12 WT-1)。反应最初在96℃变性2分钟，接着96℃，20秒；68℃，15秒；72℃，2分钟30秒进行40个循环。接着是72℃ 4分钟的最后延伸。PCR产物被NotI和NdeI消化，并且克隆到已经被NdeI和NotI消化的pPDM His中。通过序列分析证实该序列，然后其被转化到BLR(DE3)pLys S和HMS174(DE3)pLys S细胞中。通过考马斯染色SDS-PAGE和N末端蛋白质序列分析证实蛋白质表达。
大肠杆菌(E.coli)中无His标签的WT-1 C(a.a.69-430)的设计(SEQ ID NO：387(cDNA)和394(蛋白质))：
用下面的引物PCR扩增WT-1C阅读框：
PDM-780(SEQ ID NO：402)5′gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3′Tm6℃
PDM-778(SEQ ID NO：403)5′gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3′Tm7℃。
使用下面的PCR循环条件：1μl 10×Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 1μM每种寡聚物，83μL无菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)，50ng DNA(无His的pPDMRa12 WT-1)。反应最初在96℃变性2分钟，接着96℃，20秒；62℃，15秒；72℃，2分钟，进行40个循环。接着是72℃ 4分钟的最后延伸。PCR产物被NdeI和Eco721消化，并且克隆到已经被NdeI和Eco721消化的pPDM His中。通过序列分析证实该序列，然后其被转化到BLR(DE3)pLys S和HMS174(DE3)pLys S细胞中。通过考马斯染色SDS-PAGE和N末端蛋白质序列分析证实蛋白质表达。
实施例24
利用完整基因致敏以产生WT1特异性CD8+T细胞克隆和HLA A2限制的WT1表位的鉴定
在该实施例中，腺病毒和痘苗病毒递送载体被用于产生WT1特异性T细胞系。来源于该细胞系的T细胞克隆被证明是WT1特异性的，并且进一步鉴定了被该克隆识别的表位。
树突细胞(DC)是通过在含有10％人类血清、50ng/ml GM-CSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-10天，从来源于正常供体的PBMC的单核细胞培养物分化来的。培养后，DC被表达重组WT1的痘苗病毒以感染复数(MOI)5感染16小时，或者被表达重组WT1的腺病毒以MOI 3-10感染2-3天。痘苗病毒被UV照射灭活。通过先利用针对CD4、CD14、CD16、CD19和CD56+细胞的抗体，接着使用对这些抗体的Fc部分特异的磁珠通过阴性耗竭法分离CD8+T细胞。
在96孔板中起始致敏培养物。每隔7-10天利用人工改造的腺病毒或痘苗病毒感染的自身树突细胞再刺激培养物以表达WT1。4-5轮刺激后，可以鉴定CD8+T细胞系，当用表达自身WT1的树突细胞或成纤维细胞刺激它时，它特异性地产生干扰素γ(IFN-γ)。这些细胞系被克隆并且经Elispot分析证明这些细胞系特异性地识别WT1转导的自身成纤维细胞，但是不识别对照转导的成纤维细胞。
为了进一步分析这些WT1特异性CD8+T细胞克隆的HLA限制性，来源于另外供体(D475)的成纤维细胞被WT1转导，该供体与建立T细胞克隆所来源的供体(D349)仅共有HLA-A2等位基因。ELISPOT分析证明了T细胞克隆可识别这些D475靶细胞。为了进一步证明HLA A2限制性和证明该表位是由“天然”WT1过表达的肿瘤细胞所表达的(作为它们恶性转化的一部分)，检测白血病细胞系K562。K562被HLA A2分子转导，并且HLA-A2阴性K562细胞被用作非特异性IFN-γ释放的对照。ELIPSOT分析证明T细胞识别A2阳性K562细胞系，但是不识别A2阴性K562细胞。HLA-A2抗体阻断试验提供了识别的特异性和HLA-A2限制性的进一步证据。
为了进一步确定WT1表位，制备了4种截短的WT1逆转录病毒构建体。然后，供体475成纤维细胞被这些构建体转导。ELISPOT测定证明了能识别被WT1 Tr1构建体(aa2-aa92)转导的D475成纤维细胞，因此证明WT1表位位于WT1蛋白质最初91个N-末端氨基酸内。为了精确地作图表位，合成有11个氨基酸重叠的WT1蛋白质的15mer肽。WT1特异性T细胞克隆可识别两种重叠的15mer肽，肽9(QWAPVLDFAPPGASA(SEQ ID NO：412))和肽10(VLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO：413))。为了进一步表征所识别的最小表位，15mers中共有的9mer和10mer肽(总共5种)被用于分析克隆的特异性。该克隆特异地识别9mer VLDFAPPGA(SEQ ID NO：241)和10merVLDFAPPGAS(SEQ ID NO：411)。
实施例25
对来源于对WT1特异的CD8+T细胞克隆的TCR的α链和β链的克隆和测序
来源于对WT1特异的CD8+T细胞克隆的T细胞受体(TCR)α和β链被克隆。进行序列分析以证明TCRα和β链的家族来源。另外，鉴定其独特的多变性和连接片段(有助于应答的特异性)。
利用Trizol试剂从来源于WT1特异性CD8+T细胞克隆的2×106个细胞中分离总mRNA，并且利用Ready-to-go试剂盒(Pharmacia)合成cDNA。为了测定克隆中Vα和Vβ序列，一组Vα和Vβ亚型特异性引物(基于Clontech，Palo Alto，CA产生的引物序列)被合成，并且用在与来源于每种克隆的cDNA的RT-PCR反应中。RT-PCR反应证明每种克隆均表达Vβ和Vα。
为了从克隆进行全长TCRα和β链的克隆，设计了跨越编码TCR核苷酸的起始密码子和终止子的引物。利用从CTL克隆合成的cDNA和上述引物，以及利用校正热稳定的聚合酶PWO(Roche，Basel，Switzerland)建立标准的35轮循RT-PCR反应。所得到的特异性条带(对于α链是约850bp，对于β链是约950bp)被连接到PCR平端载体中(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并且转化到大肠杆菌(E.coli)中。鉴定用含有全长α和β链的质粒转化的大肠杆菌(E.coli)，进行相应质粒的大规模制备。然后，利用标准方法测序含有全长TCRα和β链的质粒。因此，测定了造成TCR特异性的多变-连接(DJ)区。
实施例26
WT1特异性CD8+T细胞的克隆裂解表达WT1的白血病原始细胞
进一步检测最初在实施例24中公开的识别肽序列VLDFAPPGA(人类WT1残基37-45；SEQ ID NO：241)的CD8+T细胞克隆以HLA A2限制性方式杀死(裂解)表达WT1的白血病靶细胞的能力。被HLA A2分子、GFP、A2Kb转导或未转导的K562靶细胞被使用在具有25∶1和5∶1效应细胞比靶细胞(E∶T)比率的标准4.5小时51Cr释放测定法中。在E∶T比率为25∶1时，CD8+T细胞的克隆裂解K562/A2和K562/A2Kb细胞(特异性裂解分别是40％和49％)，而GFP转导的对照和K562细胞没有被裂解。E∶T比率为5∶1时，对K562/A2和K562/A2Kb细胞的特异性裂解分别是21％和24％。因此，该CD8+T细胞的克隆以HLA-A2限制性的方式识别和裂解表达WT1的白血病细胞。可以利用基因工程改造的T细胞能产生WT1特异性CD8+T细胞克隆的能力，将其用于与WT1过表达有关的恶性肿瘤治疗。
实施例27
HLA-A2-肽-MHC四聚体复合物的构建
该实施例描述了可溶性HLA-A2在昆虫细胞中的克隆和表达，及HLA-A2纯化和组装成荧光多价肽MHC四聚体复合物以用于抗原特异性CD8T细胞的检测和分离。
这种系统与Altman等，(Altman，J.等，Science，1996 274(5284)：94-6)所开发和描述的系统相似，其相似之处在于可溶的HLA-A2在birA识别序列被单独地生物素化，并且随后在藻红蛋白缀合的链霉抗生物素蛋白支架上被装配成多聚体。这里所述材料的差异在于HLA-A2以糖基化的可溶形式从昆虫被表达，并且利用抗人类I类MHC抗体亲和性柱子纯化异源二聚体。
附加有birA生物素化序列的HLA-A2重链基因和人类β-2-微球蛋白基因被克隆到杆状病毒表达载体pFASTBAC-dual中。一旦昆虫细胞被感染，就伴随着基因从不同的启动子被转录和完全组装，糖基化的可溶的HLA-A2异源二聚体被分泌到生长培养基中。在收集上清液之前，在21℃，在细胞生物反应器培养感染的昆虫细胞4天。通过使用W6/32和生物素化的B9.12.1抗体的捕获性ELISA监测HLA-A2的产生。通过使用亲和性层析，在一个步骤中从培养上清液中纯化的HLA-A2达到＞90％纯度，该亲和性层析使用了连接琼脂糖凝胶小珠的两种抗人类I类MHC单克隆抗体。所用的抗体是PA2.1和W6/32。利用商购birA酶，纯化的HLA-A2在重链C-末端上birA识别序列上被单生物素化。基本如所述(Crawford等(1998)Immunity June；8(6)：675-82.)评价生物素化效率，并且通过大小排阻层析(SEC)进一步纯化该物质。用bio-HLA-A2饱和藻红蛋白缀合的链霉抗生物素蛋白，并且用SEC从游离的HLA-A2中纯化多价染色试剂。在加载有肽的四聚体和抗CD8抗体存在的情况下，在4℃下特异性T细胞克隆被染色30分钟，在此之前，HLA-A2四聚体在室温下与10倍摩尔过量的Her-2/neu E75肽或流感基质MI肽温育48小时。结果表明在摩尔过量的M1 58-66 M1流感肽存在的情况下温育的四聚体可特异地染色流感特异性的T细胞克隆，与过量Her-2/neu E75肽温育的四聚体可特异地染色Her-2/new特异性的T细胞克隆。
实施例28
利用WT1 MHC肽四聚体检测WT1特异性T细胞
实施例27中描述的HLA-A2四聚体与前面实施例24中所示的摩尔过量为HLA-A2所限制的WT1 p37-45肽(VLDFAPPGA)(人类WT1残基37-45；SEQ ID NO：241)温育。该四聚体用于染色实施例24中所述的WT1特异性CD8+T细胞克隆。证明该克隆特异地识别p37-45肽。当四聚体与过量的p37-45肽温育时，它们可特异地染色CD8+T细胞克隆，而一些四聚体与过量的无关HLA-A2肽(Her2/neu、WT1 p38-46、WT1 p39-47)温育，该四聚体不染色CD8+T细胞克隆。因此，WT1 p37-45特异性CD8+T细胞克隆可被HLA-A2-p37-45肽MHC四聚体特异地识别。
然后，如实施例24中所述产生的WT1特异性T细胞系被HLA-A2-p37-45、无关Her2/neu或WT1 p37-46四聚体染色。HLA-A2-p37-45四聚体染色了该WT1特异性T细胞系总数的1％，门控CD8+细胞数的7％，同时对照HLA-A2-p37-46四聚体以与对照HLA-A2-Her2/neu四聚体相同的背景水平染色。
这些结果表明MHC肽四聚体是用于检测WT1特异性免疫应答的高度敏感和特异性工具。肽-MHC四聚体可以用于WT1相关恶性肿瘤的早期检测、监测WT1特异性应答和用于监测微小残留病。通过四聚体染色来检测WT1特异性T细胞也是鉴定患有WT1相关疾病的患者群中处于更高风险复发或疾病进展群组的有用工具。
实施例29
利用完整基因致敏，从HLA-A24-阳性供体产生WT1特异性CD8+T细胞系
在该实施例中，腺病毒和痘苗病毒递送载体被用于从HLA-A24阳性供体产生WT1特异性T细胞系。该T细胞系表现为受MHC I类所限制。这些试验进一步证实了WT1蛋白质的免疫原性，并且支持将其用作疫苗和/或其它免疫治疗方法的靶。
树突细胞(DC)是通过在含有10％人类血清、50ng/ml GM-CSF和30ng/ml IL-4的RPMI培养基中生长4-10天，从来源于正常HLA-A24阳性供体的PBMC的单核细胞培养物分化来的。培养后，DC被表达重组WT1的痘苗病毒以感染复数(MOI)5感染16小时，或者被表达重组WT1的腺病毒以MOI 3-10感染2-3天。痘苗病毒被UV照射灭活。通过先利用CD4、CD14、CD16、CD19和CD56+细胞的抗体，接着使用对这些抗体的Fc部分特异的磁珠进行阴性耗竭，以此分离CD8+T细胞。
在96孔板中起始致敏培养物。每隔7-10天利用人工改造的腺病毒或痘苗病毒感染的自身树突细胞再刺激培养物以使之表达WT1。4-5轮刺激后，可以鉴定CD8+T细胞系，当用表达自身WT1的树突细胞或成纤维细胞刺激它时，它特异性地产生干扰素γ(IFN-γ)。这些细胞系被克隆，并且Elispot分析表明这些细胞系以MHC I类限制方式特异性地识别WT1转导的自身成纤维细胞，但是不识别对照转导的成纤维细胞。
这些试验表明WT1蛋白质可以用于产生T细胞应答，并且进一步证实了WT1抗原的免疫原性和支持了它作为疫苗和其它免疫治疗方法靶的用途。
实施例30
HLA-A2高亲和性WT1表位的鉴定
这个试验描述了WT1表位的计算机虚拟筛选(in silico)鉴定，预测该表位以比天然加工的表位更高的亲和性结合于HLA-A2。这里鉴定的表位可用于WT表达相关癌症治疗的疫苗和/或免疫治疗策略中。
如下面所详述的构建了具有基序的天然加工的HLA A2限制的WT1表位p37-45(VLDFAPPGA；人类WT1残基37-45；SEQ ID NO：241；以前实施例24中所示的为HLA-A2所限制)肽类似物，用于以比天然加工的肽更高的亲和性结合HLA-A2.1。
基于Rammensee等(Hans-Georg Rammensee，Jutta Bachmann，Niels Nikolaus Emmerich，Oskar Alexander Bachor，StefanStevanovic：SYFPEITHI：用于MHC配体和肽基序的数据库.Immunogenetics(1999)50：213-219)和Parker等(Parker，K.C.，M.A.Bednarek，和J.E.Coligan.1994.基于单独肽侧链的独立结合，用于分级潜在的HLA-A2结合肽的方案，J.Immunol.152：163.)所开发算法的肽基序检索程序被用于鉴定WT1 p37-45肽表位类似物，预测该类似物以比天然的p37-45肽更高的亲和性结合HLA-A2。表LII中所示的肽已经预测了等于或大于天然加工的p37-45肽的肽结合分值。该结合分值来源于预测的与HLA-A2 I类分子的解离半衰期。该分析是根据从Kenneth Parker博士kparker@atlas.niaid.nih.gov，NIAID，NIH所公开的文献推导出的系数表。
                     表LII
                 p37-45肽类似物
  修饰位置   序列   理论结合分值   SEQ IDNO：
  野生型   VLDFAPPGA   3.378   241
  P1   ILDFAPPGA   3.378   414
  P1   LLDFAPPGA   3.378   415
  P1   FLDFAPPGA   9.141   416
  P1   KLDFAPPGA   6.955   417
  P1   MLDFAPPGA   3.378   418
  P1   YLDFAPPGA   9.141   419
  P2   VMDFAPPGA   2.44   420
  P4   VLDEAPPGA   13.85   421
  P4   VLDKAPPGA   3.378   422
  P6   VLDFAVPGA   7.77   423
  P8   VLDFAPPKA   3.378   424
  P9   VLDFAPPGV   47.3   425
  P9   VLDFAPPGL   14.53   426
  P1和P4   FLDEAPPGA   37.48   427
  P1和P4   KLDEAPPGA   28.52   428
  P1和P4   YLDEAPPGA   37.48   429
  p1和P4   FLDKAPPGA   9.141   430
  P1和P4   KLDKAPPGA   6.955   431
  P1和P4   YLDKAPPGA   9.141   432
  P1和P9   FLDFAPPGV   128   433
  P1和P9   KLDFAPPGV   97.37   434
  P1和P9   YLDFAPPGV   128   435
  P1和P9   FLDFAPPGL   39.31   436
  P1和P9   KLDFAPPGL   29.91   437
  修饰位置   序列   理论结合分值   SEQ IDNO：
  P1和P9   YLDFAPPGL   39.31   438
  P1，P4和P9   FLDEAPPGV   524.7   439
  P1，P4和P9   KLDEAPPGV   399.2   440
  P1，P4和P9   YLDEAPPGV   524.7   441
  P1，P4和P9   FLDEAPPGL   161.2   442
  P1，P4和P9   KLDEAPPGL   122.6   443
  P1，P4和P9   YLDEAPPGL   161.2   444
在单独的分析中，计算机模型用于鉴定p37-45 WT1表位的肽表位类似物。从Brookhaven蛋白质数据库(pdbI.D.：3HLA)(L.L.Walsh，“带注释的PDB文件列表”，Protein Sciernce 1∶5，磁盘附件(1992))下载HLA-A2天然结构的等同物。该文件被用作使用SwissModel(Peitsch MC(1996)ProMod and SwissModel：用于自动比较蛋白质模型的基于互联网的工具，Biochem.Soc.Trans.24：274-279.)程序操作的模板，通过Expasy网站(Appel R.D.，Bairoch A.，Hochstrasser D.F.生物学家的新一代信息检索工具：ExPASy WWW服务器的例子。Trends Biochem.Sci.19：258-260(1994)可以获得该SwissModel程序。结合蛋白质的肽被人工突变以产生结合WTp37-45的肽。新的结构被提交给Swiss-PdbViewer的GROMOS96执行程序以进行3轮能量最小化；对完整结构进行2轮能量最小化，接着进行一轮不利残基的筛选。最后的评价显示了该模型总的有利的能量状态。Ramachandran绘图表明只有一个非甘氨酸基残基远离在不可接受的区域中。利用这里所述模型方法鉴定的肽如下表LIII中所示。
              表LIII
通过计算机模型鉴定的p37-45肽类似物
  修饰位置   序列   SEQ IDNO：
  野生型   VLDFAPPGA   241
  P6   VLDFAGPGA   445
  P6   VLDFATPGA   446
  P6和P9   VLDFATPGV   447
  P6和P9   VLDFATPGL   448
  P6和P9   VLDFATPGS   449
  P6和P9   VLDFATPGA   450
然后，检测利用上述两种方法鉴定的几种肽能被p37-45特异性CTL克隆识别的能力(参见实施例24)。ELISPOT分析表明肽p37-1(SEQ ID NO：426)和模型-1(SEQ ID NO：445)能被p37-45 CTL克隆识别。这些结果表明这两种肽类似物被预测以比天然加工的表位更高的亲和性结合HLA-A2，并且始终被天然T细胞受体所识别。
因此，这个试验描述了WT1表位的计算机虚拟筛选(in silico)鉴定，预测该表位以比天然加工的表位更高的亲和性结合HLA-A2。经检测，其中2个鉴定的表位可被天然WT1 cp37-45表位产生的CTL克隆识别。这里鉴定的表位可用于WT1表达相关癌症治疗的疫苗和/或免疫治疗策略中。
实施例31
WT1抗原的体内免疫原性
该实施例描述了3种体内免疫原性研究以评价小鼠中使用WT1的接种策略。3种策略包括：1)裸DNA疫苗致敏和加强免疫；2)减毒腺病毒致敏免疫，接着是减毒甲病毒的加强免疫；或3)裸DNA致敏免疫，接着是腺病毒加强免疫。这些研究中使用的WT1剪接变异体的全长cDNA被表示在SEQ ID NO：381中。这里所述的结果给WT1 DNA/DNA，DNA/腺病毒或腺病毒/甲病毒致敏/加强免疫的方案用作治疗与WT1表达相关癌症的疫苗策略提供了支持。
在第一个研究中，以2天的间隔，用100μg编码WT1的裸DNA免疫C57/BL6小鼠3次。最后一次免疫后2-3周处死小鼠，并且用标准铬释放测定法评价CTL。该第一个研究表明WT1 DNA免疫在这些小鼠中激发WT1特异性细胞毒性T细胞应答，具有25∶1E∶T比率，表现出40％的裂解。
在第二个研究中，HLA-A2/Kb转基因小鼠被5×108PFU的编码WT1的减毒腺病毒(如实施例20中所述)免疫一次，4周后被5×106PFU的编码WT1的甲病毒(AlphaVax)加强免疫一次。最后一次免疫后2-3周处死小鼠，并且用标准铬释放测定法评价CTL。结果表明HLA-A2/Kb转基因小鼠中WT1特异性CTL可特异性地裂解用表达WT1的病毒构建体转导的树突细胞(DC)及用WT1肽脉冲的DC。因此，这种免疫策略也能在体内有效地激发WT1特异性CTL。
在第三个研究中，用100μg裸WT1 DNA以2周间隔免疫C57/BL6和HLA-A2/Kb转基因小鼠2次，接着3周后用7×108PFU的编码WT1的腺病毒加强免疫。最后一次免疫后2-3周处死小鼠，并且用IFN-γELISPOT测定法评价CTL。结果表明WT1 DNA和腺病毒致敏-加强免疫在HLA-A2/Kb转基因小鼠中产生了WT1特异性CD8T细胞应答。用WT-1转导的DC刺激7天后，约42％的CD8阳性细胞染色是IFN-γ阳性。来自于C57/BL6小鼠的结果表明这种免疫策略在新的脾细胞中产生了可检测的CD8应答。用10种15mer肽的库刺激脾细胞6小时，该肽与完整WT1蛋白质重叠11个氨基酸。只有用p121-171刺激的细胞显示了IFN-γ染色。其中约1.1％的用p121-171肽库刺激的CD8T细胞染色呈IFN-γ阳性。用含有实施例3中所示的p117-139肽(SEQ ID NO：2)的肽在小鼠中激发CTL、T辅助细胞和抗体应答。
总之，这些结果表明这里所检测的3种免疫策略产生了体内T细胞应答。因此，这些研究进一步证实了WT1蛋白质的免疫原性，并且给WT1 DNA/DNA，DNA/腺病毒或腺病毒/甲病毒致敏/加强免疫的方案用作治疗与WT1表达相关癌症的疫苗策略提供了支持。
实施例32
在用WT1蛋白质免疫的HLA-A2/Kb转基因小鼠中WT1+肿瘤的生长被降低
该实施例描述了在用WT1疫苗免疫的转基因小鼠中WT1+肿瘤的减少。这些结果进一步证实了可用WT1作为疫苗靶，并且给WT1在用于治疗与WT1表达相关癌症的疫苗策略中的用途提供了支持。
鼠源树突细胞(DC)系DC2.4被WT1-LAMP构建体稳定地转导(参见实施例18，分别在SEQ ID NO：382和409中示出了cDNA和蛋白质序列)。然后，用2×106个细胞皮下(s.c.)或腹腔(i.p.)接种小鼠。这在80-100％小鼠中引起了肿瘤生长。小鼠体内建立的肿瘤保留了它们的WT1表达。因此，该模型提供了用以确证WT1疫苗策略效果的系统。
然后，如下以间隔2周免疫3组A2/Kb小鼠3次：
组1：单独的生理盐水s.c.(对照，n＝10只小鼠)
组2：单独的10μg MPL-SE(对照，n＝10只小鼠)
组3：Ra12/WT1蛋白质100μg+10μg MPL-SE s.c.(n＝9只小鼠)。
最后一次WT1免疫后2到3周，用2×106个过表达WT1的A2/KbDC2.4肿瘤细胞接种小鼠。肿瘤攻击后监测小鼠，并且每周2次监测肿瘤大小一直到接种肿瘤后4周为止。
结果表明在接受WT1蛋白质疫苗的组中，具有肿瘤生长的小鼠百分数从约100％(生理盐水对照)或90％(MPL-SE佐剂对照)减少到45％(WT1蛋白质免疫组)。而且，在该组中平均肿瘤体积从对照组中观察到的1233cmm(生理盐水对照)或753cmm(MPL-SE佐剂对照)平均肿瘤大小被减小到WT1蛋白质免疫组中226cmm的肿瘤大小。组织病理学分析表明在接种动物的肿瘤边缘处混合有包括组织细胞、嗜伊红性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞和浆细胞的宿主免疫反应。总之，该结果证明WT1蛋白质免疫抵抗或延迟了在用WT1免疫的动物中的WT1阳性肿瘤的生长。因此，这些结果支持将WT1蛋白质用作用于WT1表达相关恶性肿瘤的疫苗。
实施例33
天然加工的WT1细胞毒性T细胞表位的鉴定
该实施例描述了细胞毒性T细胞所识别的WT1蛋白质天然加工表位的鉴定。这个试验进一步证实了WT1蛋白质的免疫原性，并且给它作为疫苗和/或其它免疫治疗方法靶的用途提供了支持。另外，这个试验鉴定了在这些应用中可以使用的WT1蛋白质表位。
用100μg裸WT1 DNA以2周间隔免疫HLA-A2/Kb转基因小鼠，3周后用107PFU的编码WT1的腺病毒加强免疫。最后一次免疫后2-3周处死小鼠，并且用标准铬释放测定法评价CTL。如前面试验所观察到的，用WT1 DNA免疫，接着用腺病毒加强免疫可在HLA-A2转基因小鼠中激发WT1特异性CTL应答。为了鉴定哪种表位被T细胞识别，利用标准方法，通过极限稀释产生和克隆CTL系。然后，使用用肽脉冲的DC2.4 A2/Kb细胞作为靶细胞检测阳性克隆，该肽对应于前20个经预测性HLA-A2限制性CTL表位。结果表明WT1 p10-18 9mer肽(氨基酸：ALLPAVPSL，SEQ ID NO：451中所示)被该CTL克隆识别。该表位为以前被预测的如表XLVI中所描述的表位，SEQ ID NO：34。在另外的试验中，在所检测的5只WT1免疫的动物中有4只观察到对p10肽的CTL应答。因此，该试验证明了预测的p10-18 WT1表位是被天然加工的并且为CTL所识别。而且，该试验证实了WT1蛋白质的免疫原性，并且进一步确定了天然加工的HLA-A2限制的CTL表位，该表位可以用在用于WT1过表达相关恶性肿瘤治疗的疫苗和免疫治疗策略中。
实施例34
使用双精氨酸转运(TAT)信号肽的WT1表达构建体
该实施例描述了WT1-TAT载体的构建和从这些载体中表达WT1-TAT。用这些构建体表达WT1-TAT分子以使之用于接种策略中。
如下所述，WT-1-F(WT1蛋白质的a.a.2-281；WT1的2-281氨基酸序列分别如SEQ ID NO：460和461所示)和全长WT-1基因被构建成没有His标签的pTAT融合基因。所得到融合基因的cDNA和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：452和453及SEQ ID NO：454和455中所示。
用下面的引物PCR扩增WT-1-F开放阅读框：
PDM-439(SEQ ID NO：456)：
5’GGCTCCGACGTGCGGGACCTGAAC 3’Tm 66℃
PDM-779(SEQ ID NO：457)：
5’CGCGTGAATTCATCACTGAATGCCTCTGAAG 3’Tm 63℃
用下面的引物扩增WT1-1全长开放阅读框：
p37(SEQ ID NO：458)：
5’GGCTCCGACGTGCGGGACCTG 3’
p23(SEQ ID NO：459)：
5’GAATTCTCAAAGCGCCAGCTGGAGTTTGGT 3’。
PCR条件如下：1μl 10×Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 1μM每种寡聚物，83μL无菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)，50ng DNA(pPDM FL WT-1)。反应在96℃变性2分钟，接着96℃，20秒；64℃，15秒；72℃，2分钟，共进行40个循环。接着是72℃进行单次最后4分钟的延伸。
PCR产物被EcoRI消化，并且克隆到pTAT(具有双精氨酸转运(TAT)信号肽的修饰的pET28载体，该信号肽来源于大肠杆菌中N-末端上TorA信号肽，参见J.Mol.Microbiol.(2000)2(2)：179-189；Journal of Bacteriology，2001年1月，604-610页，183卷，2期；Journal of Biochemistry 276卷，2001年3月16日，8159-8164页)的Eco721和EcoRI位点。通过序列分析验证该序列，然后其被转化到BLR(DE3)pLys S和HMS 174(DE3)pLys S细胞中。通过Western分析验证WT1-TAT蛋白质的表达。
实施例35
WT1的N-末端是该蛋白质的体内优势免疫原性部分
在该实施例中，用与MPL-SE佐剂制备的不同WT-1蛋白质构建体(如实施例34中所述的F截短(2-281)和全长(2-430))制剂免疫小鼠。相对于全长蛋白质，由截短的构建体激发了更强的CD4应答。因此，这个实施例证明了跨越2到281个氨基酸的WT1蛋白质N-末端部分是WT1蛋白质体内优势免疫原性部分。
用20μg带有Ra12、HIS或TAT融合的WT1蛋白质：WT-1-F或WT-1全长(FL)按每组4只皮下免疫C57BL/6小鼠。在0、3和9周进行免疫，并且在11周收集脾脏。然后用单独的培养基、用15mer肽“p32”(ARMFPNAPYLPSCLE，WT-1的氨基酸125-139；是在p117-139肽中发现的，其序列如SEQ ID NO：2中所示)、用DC2.4-WT-1/LAMP细胞系或用rRa12体外刺激脾细胞6小时。然后，染色CD4细胞的细胞内干扰素γ，并且通过FACS分析定量该CD4细胞。计数CD4+T细胞后，这些脾细胞的一部分被体外刺激8天。用p32刺激6小时后，在用截短的N-末端构建体rWT1-F-TAT免疫的小鼠中有0.33％染色的CD4阳性细胞呈细胞内IFN-γ阳性。刺激8天后，在用rWT1-F-TAT构建体免疫的小鼠中有10.72％的CD4+细胞呈IFN-γ染色。相反，在用全长WT1-TAT构建体免疫的小鼠中有0.24％CD4阳性细胞染色呈细胞内I FN-γ阳性。这些数据表明相对于全长rWT1-TAT构建体，截短的rWT1-TAT构建体激发了更强的CD4应答。
在第二种测定法中，用23mer肽，p117-139(SEQ ID NO：2；PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE，含有已知的CD4表位和包含“P32”)刺激脾细胞3天，此后用ELISA测定上清液中分泌的IFN-γ。从用全长WT1构建体免疫的小鼠脾细胞中没有检测到IFN-γ分泌。相反，从用无HIS标签的rWT1-F免疫的小鼠脾细胞中检测到了平均2477pg/ml的IFN-γ。从用rWT1-F-TAT免疫的小鼠脾细胞中检测到了平均4658pg/ml的IFN-γ。这些数据进一步支持了相对于全长蛋白质，截短的N-末端WT1构建体能激发更强的CD4应答的观察结果。
WT1蛋白质是转录因子，其包含两个功能性结构域：在N-末端富含脯氨酸-谷氨酰胺的结构域和在C-末端包含4个锌指的锌指结构域，具有与EGR1/Sp1家族的转录因子同源性。WT1是自身蛋白质。C-末端与其它自身蛋白质同源，因此具有较低的免疫原性，即，个体对其具有更大程度的免疫耐受性。值得注意的是C-末端内4个锌指结构域与EGR家族成员具有同源性。该实施例中描述的结果表明耐受性可能取决于序列同源性和功能性结构域而将在蛋白质的不同部分之间变化。
总之，该实施例中描述的数据支持了最有效的WT1疫苗将包含作为重组蛋白质或基于基因构建体的WT1N-末端的观点。
实施例36
用于WT1N-末端片段(WT-1-F：氨基酸1-281)表达的杆状病毒表达构建体和利用昆虫细胞大规模生产蛋白质
通过PCR，利用WT1-F质粒作为模板(WT-1-F：被克隆到起始甲硫氨酸下游的WT1蛋白质的氨基酸2-281；WT1 2-281的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：460和461中所示，在实施例34中描述了用作这里所述试验中模板的pTAT融合构建体。该构建体的cDNA如SEQ IDNO：452中所示)获得WT-1N-末端片段的cDNA及Kozak共有序列。下面的引物用于扩增：
WT1F1(SEQ ID NO：466)：
5’CGGCTCTAGAGCCGCCACCATGGGCTCCGACGTGCG
WT1RV4(SEQ ID NO：467)：
5’CGGCTCTAGACTACTGAATGCCTCTGAAGACACCGTG。
除了使用WT1RV3(SEQ ID NO：468)作为反向引物(5′CGGCTCTAGACTAATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGATGCTGAATGCCTCTGAAGACACCGTG)外，通过上述类似的PCR获得具有相同ORF的以及加有C-末端10个His标签的GDNA。
将纯化的PCR产物被克隆到供体质粒pFastBacl的XbaI位点中。重组供体质粒pFBWT1-F(分别如SEQ ID NO：463和465中所示的cDNA和氨基酸序列)和pFBWT1-FH(具有10×His标签；分别如SEQ ID NO：462和464中所示的cDNA和氨基酸序列)被转化到大肠杆菌株系DH10Bac(Invitrogen，Carlsbad，CA)中以通过位点特异性转座在大肠杆菌(E.coli)中制备重组杆粒。用PCR分析证实重组杆粒，然后其被转染到Sf-9昆虫细胞中以制备重组杆状病毒BVWT1-F和BVWT1-FH。重组病毒在Sf-9细胞中被扩增到高效价病毒母液。
High Five昆虫细胞系被用于优化的蛋白质表达的条件和用于重组蛋白质的大规模生产。为了最优化蛋白质表达的条件，High Five昆虫细胞单层被重组杆状病毒BVWT1-F和BVWT1-FH以不同的感染复数(MOI)感染，并且在不同的时间段收集转导的细胞。通过用兔抗WT1多克隆抗体[#942-32(799L)]的Western印迹分析证实蛋白质的身份。当High 5细胞被重组病毒以1.0或2.0MOI感染时，WT1-F和WT1-FH重组蛋白质在感染后48小时或54小时被很好地表达。
然后，重组杆状病毒的扩增和重组WT1-F和WT1-FH蛋白质的表达被进一步最优化。在含有2％胎牛血清和0.5×PSF的ESF921培养基中，BVWT1-F和BVWT1-FH在Sf9昆虫细胞系中被扩增。在28℃，在0.05MOI进行4天扩增。High 5昆虫细胞系被用于最优化蛋白质表达的条件。收集前，High 5昆虫细胞被重组杆状病毒以0.5、1或2MOI感染30、48、54或72小时。通过用特异性抗WT1兔多克隆抗体(抗体#942-32)的Western印迹分析和通过毛细管LC-ESI-串联质谱法证实重组蛋白质的身份。这些试验表明当High 5细胞被重组病毒以0.5-1.0MOI感染时，大规模WT1-F和WT1-FH产生的最佳蛋白质表达出现在感染后43小时。
总之，上述WT1杆状病毒可以用于WT1 N-末端部分的大规模蛋白质生产，以在用于WT1表达相关的恶性肿瘤治疗的各种疫苗策略中使用。
实施例37
利用重组TRICOM疫苗和鸡痘载体在小鼠中体内诱导CD4和CD8 T细胞应答
该实施例描述了体内免疫原性研究以评价用WT1在小鼠中的接种策略。这些试验的目的是检测rV-WT1/TRICOM和rF-WT1/TRICOM诱导针对WT1的免疫性，特别是T细胞针对WT1免疫性的能力。这里所述的结果给表达WT1和含有三联体共刺激分子的TRICOM痘苗病毒和鸡痘病毒载体在用于治疗WT1表达相关癌症的疫苗策略中的用途提供了支持。
在第一个研究中，C57BI/6小鼠(每组12只)以在初次、第二次和第三次免疫之间14天的间隔被免疫2或3次。如下表1中所示。在第二次和第三次免疫后21天收集小鼠。如下面进一步所描述的，通过WT1肽激活的脾细胞的IFN-γ细胞内细胞因子染色测定CD8和CD4 T细胞应答。CD4 T细胞应答被来自于rWT1蛋白质刺激的脾细胞的IFN-γ释放另外测定。血清IgG1和IgG2b抗体应答通过ELISA测定。利用收集的脾细胞培养物评价T细胞应答(4只小鼠/组/时间点)。测定个体小鼠的抗体效价(4只小鼠/组/时间点)。
                   表1：接种策略
  组别：
  A.非免疫的
  B.rWT1+SE-载体
  C.rWT1+MPL-SE
  D.1°：WT1-DNA，2°：WT1-DNA，3°：WT1-腺病毒
  E.rF-WT1/TRICOM
  F.1°：rV-WT1/TRICOM，2°：rF-WT1/TRICOM，3°：rF-WT1/TRICOM，
  剂量
  rWT1：50μg
  MPL-SE 10μg
  WT1-DNA：100μg
  WT1-腺病毒：5×105pfu
  rF-WT1/TRICOM：1×108pfu
  rV-WT1/TRICOM：1×108pfu
  途径：
  蛋白质/佐剂和载体的皮下(200μl)免疫
  WT1-DNA的肌内免疫(50μl)
这些研究中使用的WT1剪接变异体的全长cDNA如SEQ ID NO：381中所示。这里所述的WT1腺病毒如实施例20中所述。表达WT1和含有三联体共刺激分子(B7-1、ICAM-1和LFA-3)的rF-WT1/TRICOM重组鸡痘和rV-WT1/TRICOM重组痘苗载体由Therion生物制品公司(Cambridge，MA，USA)生产。
为了评价T细胞应答，用已知含有CTL和辅助T细胞表位的WT1肽“p32”(ARMFPNAPYLPSCLE，WT-1的氨基酸125-139；其是在SEQID NO：2中所示的p117-139肽中发现的)，在第二次免疫后21天，p125-139的细胞内细胞因子IFN-γ染色表明用rV-WT1/TRICOM(致敏免疫)和rF-WT1/TRICOM(加强免疫)免疫的小鼠中具有显著百分比的WT1应答的CD4+和CD8+T细胞，而没有其它的组显示显著的WT1特异性T细胞应答。注意DNA组只用DNA致敏和加强免疫。相同的组随后用rWT1-Adv的第三次免疫。
第三次免疫后，评价对重叠的15mer肽库的应答，而不是对单个肽#32的应答。发现对肽库#32-36特异的WT1肽CD8+和CD4+T细胞在用rV-WT1/TRICOM(致敏免疫)和rF-WT1/TRICOM(加强免疫×2)接种的小鼠中以相似于第二次免疫后应答的水平应答。此外，发现来自于这些小鼠的CD4+和CD8+T细胞能应答但是是以比肽#32低得多的水平应答包含在两种重叠15mer肽#57-58(肽57：DNLYQMTSQLECMTWN(氨基酸224-239)；肽58：MTSQLECMTWNQMNL(氨基酸229-243)；重叠对应于WT1氨基酸残基224-243)内的第二个WT1表位。
利用标准ELISA评价抗体应答。在用rWT1+MPL-SE免疫的小鼠中，在第二次免疫后21天(1∶1350的效价)和第三次免疫后21天(1∶3325的效价)可以在所有8只小鼠中检测到对WT1的低水平血清IgG2b抗体。相反，在所有其它组中，血清IgG2b抗体效价＜1∶100(表2)。
                   表2：WT1免疫的小鼠中抗体应答
                       血清效价*
  组别非免疫的WT1+载体-SEWT1+MPL-SEWT1-DNA，WT1-DNAWT1-腺病毒rF-WT1/TRICOMrV-WT1/TRICOMrFWT1/TRICOM   第二次IgG1ND＜75＜50NDNDND IgG2bND＜1001350NDND＜50   第三次IgG1ND475338ND＜50＜50 IgG2bND＜503325ND＜50ND
*血清效价是每组4只小鼠的平均值。效价写作＜50、＜75或＜100也是平均值，但是在所有情况下，有可检测的效价的小鼠不到4只。ND表示在任何小鼠中没有检测到抗体。
总之，用rV-WT1/TRICOM(致敏免疫)，接着通过rF-WT1/TRICOM(加强免疫)的免疫或通过WT1-DNA(致敏免疫)，接着通过WT1-腺病毒(加强免疫)激发了针对WT1的CD8和CD4 T细胞应答。在实验设计上，相对于先用WT1-DNA，然后用WT1-腺病毒免疫，先用rV-WT1/TRICOM，然后用rF-WT1/TRICOM免疫，所产生的T细胞应答是等价的。不受理论束缚，rF-WT1/TRICOM的主要优点是多次加强免疫可以继续增加免疫性水平。因此，这些研究进一步证实了WT1蛋白质的免疫原性，并且给WT1 DNA/腺病毒或rV-WT1/TRICOM/rF-WT1/TRICOMM免疫方案在用于治疗与WT1表达相关癌症的疫苗策略中的用途提供了支持。
实施例38
用于大肠杆菌中WT1-F表达的粗短WT1-F载体的构建
该实施例描述了含有与WT1-F阅读框(WT1蛋白质的2-281 N-末端部分)融合的截短双精氨酸转运(TAT)信号肽的表达载体的构建。该载体可以用于产生单一种类截短的TAT-WT1-F蛋白质以在用于WT1表达相关恶性肿瘤治疗的免疫策略中使用。
如前面实施例34中所述，TAT信号序列被用于制备各种WT1载体。当这些TAT载体用于表达时，观察到了多种形式的蛋白质。这些形式的N-末端测序表明被表达的3种单独蛋白质中每种蛋白质都是TAT肽的截短物。这些切割出现在双精氨酸位点中每个位点。因此，截短的TAT载体被构建以将TAT信号肽从39个氨基酸缩短到12个氨基酸，以避免表达期间这些切割产物的产生。TAT“粗短(Stumpy)”载体是通过保持TAT信号肽的最初12个残基直到最初的双精氨酸而产生得到的。如下构建该载体：
下面成对的寡核苷酸被混合，然后退火：
对1：
粗短1(SEQ ID NO：486)：5′tatgaacaataacgatctgtttcaggc 3′
粗短3(SEQ ID NO：487)：5′CTGAAACAGATCGTTATTGTTCA3′
对2：
粗短4：(SEQ ID NO：488)：5′aattcttggtcattcacgtggcggctcgc3′
粗短2：(SEQ ID NO：489)：5′gagccgccacgtgaatgaccaag 3′。
成对的寡核苷酸然后与已经被NdeI和EcoRI消化的pPDM(修饰的pET28载体)连接在一起。在SEQ ID NO：471中示出了所得到的质粒pStumpy。截短的TAT蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：506中所示。全长TAT多核苷酸如SEQ ID NO：503中所示，并且编码SEQ ID NO：504中所示的TAT多肽序列。
然后，pStumpy载体被用于构建Stumpy-WT1-F载体以表达没有切割产物的WT1 N-末端部分。如下构建Stumpy-WT1-F载体：
用下面的引物组PCR扩增WT1-F编码区：
PDM-1005(SEQ ID NO：484)
5’GGCTCCGACGTTCGGGACCTGAACGCACTG 3’
PDM-1004(SEQ ID NO：485)
5’CTGCAGAATTCATCACTGAATGCCTCTGAAG 3’。
扩增反应含有10μl 10×Pfu缓冲液，1μl 10mM dNTPs，2μl 10μM的引物，83μL无菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)。反应在96℃首先变性2分钟，接着96℃，20秒；63℃，15秒；72℃，30秒，共进行40个循环。然后，反应在72℃进行4分钟的最后延伸。
然后，PCR产物被EcoRI消化，并且克隆到已经被Eco721和EcoRI消化的pStumpy载体中。通过序列分析验证该构建体，然后其被转化到BLR(DE3)pLys S细胞中。所得到截短的TAT WT1-F融合蛋白质表达为单一种类。pStumpy WT1-F编码区的多核苷酸序列如SEQ ID NO：469中所示，其编码SEQ ID NO：470中所示氨基酸序列。
实施例39
用于在大肠杆菌中表达的WT1-F GMP、WT1-G和WT1δG载体的构建
该实施例描述了被优化的用于大肠杆菌中蛋白质产生的WT1-F、WT1-G和WT1δG载体的构建。
通过Blue Heron Biotechnology(Bothel，WA)进行密码子优化和合成性地人工改造以使TAT WT-1 F DNA序列被最优化地用于在大肠杆菌中表达。WT1-F的这种密码子优化的cDNA序列如SEQ ID NO：477中所示，并且编码SEQ ID NO：479中所示的氨基酸序列。含有该序列的质粒然后被NdeI和EcoRI消化，并且被亚克隆到已经被NdeI和EcoRI消化的经过修饰的pET28载体中以在大肠杆菌中表达。该构建体经DNA序列分析验证是正确的，然后其被转化到BLR(DE3)pLys S细胞中用于表达。该构建体是TAT WT1-F模板DNA的纯合成的可追踪来源。
经过密码子优化的序列被用作PCR的模板，用以从N-末端区域缺失14个氨基酸的富含脯氨酸区域(SEQ ID NO：461中所示WT-1 F序列的氨基酸54-67缺失；对应于全长WT1的氨基酸55-68)，产生SEQID NO：473中所示的WT-1 G cDNA序列，其编码SEQ ID NO：478中所示的氨基酸序列。这是通过如下首先产生pTAT-WT-1 G构建体来完成的：
利用下面的引物组PCR扩增WT-1 G 5’编码区：
PDM-1007(SEQ ID NO：490)
5’caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc3’Tm 76℃
PDM-1006(SEQ ID NO：491)
5’cataaatttgcccgggcccgcccagagagccg 3’Tm 76℃
利用下面的引物组PCR扩增WT-1 G 3’编码区：
PDM-1008(SEQ ID NO：492)
5’cattcattcatcaaacaggagcc 3’Tm 61℃
PDM-1009(SEQ ID NO：493)
5’ccattaagaattcatcactgaatacc 3’Tm 60℃
用于WT1-G扩增的PCR反应含有10μl 10×Pfu缓冲液，1μl 10mMdNTPs，2μl每种10μM引物，83μL无菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)和50ng DNA模板(如SEQ ID NO：477中所示的经过密码子优化的pTAT WT1-F)。反应在96℃首先变性2分钟，接着96℃，20秒；63℃，15秒；72℃，30秒，共进行40个循环。然后，反应在72℃进行4分钟的最后延伸。
然后，最初的PCR产物被XbaI消化，并且克隆到已经被XbaI和Eco721消化的pPDM(修饰的pET28载体)中。所得到的构建体(pTATWT1-GA)然后被SrfI和EcoRI消化。第二个PCR构建体被EcoRI消化，并且克隆到pTAT WT1-GA质粒构建体中。同时，通过用XbaI和SrfI消化第一个PCR构建体，用EcoRI消化第二个PCR构建体，并且克隆到已经被XbaI和EcoRI消化的pPDM中进行3路连接。所得到的pTAT-WT1-G构建体经序列分析证实是正确的，然后被转化到表达宿主中。pTAT-WT1-G的cDNA如SEQ ID NO：475中所示，并且编码SEQ IDNO：482氨基酸序列。
由于上述第二种方法中的SrfI不完全消化，出现了意外形式的WT-1G(所产生的WT-1δG缺失了14个氨基酸(WT-1 F的氨基酸55-68)和添加了3个另外的氨基酸(SEQ ID NO：505中所示的WT-1δG多核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：502中所示的多肽序列))。与TAT WT-1 F构建体比较，该TAT WT-1δG构建体产生了意外的5倍过表达。pTAT WT-1δG构建体的cDNA如SEQ ID NO：476中所示，并且编码SEQ ID NO：481中所示的氨基酸序列。
pTAT WT-1 G产生后，利用pTAT WT-1 G作为模板在下述PCR反应中构建有或无His标记的pStumpy-WT1 G和WT1-G。
利用下面的引物组PCR扩增WT1-G区域的编码区：
PCR1：
PDM-1010(SEQ ID NO：494)
5’ggttcggatgtacgcgatctgaacg 3’Tm 68℃
PDM-1011(SEQ ID NO：495)
5’caaagaattcatcactgaataccgcg 3’Tm 63℃
PCR2：
PDM-1023(SEQ ID NO：496)
5’gcttttggcatatgggttcggatgtacgcgatc 3’Tm 71℃
PDM-1011(SEQ ID NO：497)
5’caaagaattcatcactgaataccgcg 3’Tm 63℃。
PCR反应和扩增条件如上所述，利用SEQ ID NO：475中所示pTAT-WT1 G作为模板。最初的PCR产物被EcoRI消化，并且克隆到被EcoRI和Eco721消化的pPDM(具有符合阅读框His标签的经修饰的pET28载体)和pSTUMPY(如SEQ ID NO：471中所示具有符合阅读框的12个氨基酸的截短的TAT前导肽的经修饰的pET28载体)中。第二个PCR产物被NdeI和EcoRI消化，并且克隆到已经被NdeI和EcoRI消化的修饰的pET28载体(pPDM)中。构建体经序列分析证实是正确的，然后其被转化到表达宿主中。所得到的构建体如下：具有His标签的WT1-G多核苷酸如SEQ ID NO：472中所示，并且编码SEQ ID NO：480中所示氨基酸序列。无His标签的WT1-G多核苷酸如SEQ ID NO：473中所示，并且编码SEQ ID NO：478中所示氨基酸序列。pSTUMPY-WT1-G多核苷酸序列如SEQ ID NO：474中所示，并且编码SEQ ID NO：483中所示氨基酸序列。
在相关的试验中，pStumpy WT1-F GMP(经过密码子优化的)载体被构建如下：
利用下面的引物扩增WT-1 F区域的编码区：
PDM-1010(SEQ ID NO：500)5′ggttcggatgtacgcgatctgaacg 3′
Tm 68℃
PDM-1011(SEQ ID NO：501)5′caaagaattcatcactgaataccgcg 3′
Tm 63℃
PCR反应和扩增条件如上所述，利用pTAT WT-1 F GMP作为模板。PCR产物被EcoRI消化和克隆到被EcoRI和Eco721消化的实施例38中所述的pStumpy载体中。构建体被序列分析证实是正确的，然后被转化到表达宿主中。pStumpy WT1-F GMP的多核苷酸序列如SEQ IDNO：498中所示，其编码SEQ ID NO：499中所示氨基酸序列。
总之，这里所述的表达载体可以用于WT1、截短的WT1和WT1融合蛋白质的最佳表达和生产，可以在用于WT1表达相关恶性肿瘤治疗的疫苗策略中使用。
实施例40
表达人类WT1-F的腺病毒载体的构建
包含起始密码子的WT1-F(包含起始密码子的WT1-F的DNA序列如SEQ ID NO：508中所示)被克隆到E1和E3缺失的腺病毒血清型5载体中。所得到的腺病毒载体如SEQ ID NO：507中所示。介导高水平WT1-F蛋白质表达的CMV启动子控制WT1-F的表达。用这种试剂感染人类细胞产生了高水平的WT1-F蛋白质表达。被导入到宿主细胞期间和感染后以低水平产生的腺病毒蛋白质的抗原性质可以起到增加WT1作为免疫靶的免疫监测和免疫识别作用。当该载体被导入到哺乳动物个体中时也可以用于产生抗WT1蛋白质的免疫应答。如果这些个体对表达WT1的肿瘤细胞是阳性，那么免疫应答可以具有对疾病疗程的治疗或治愈作用。
实施例41
用WT-1蛋白质加上各种佐剂免疫HLA-A2转基因小鼠产生的CTL应答
用混合有下面佐剂：10μg RC-529-SE，10μg Enhanzyn或10μgRC-529-AF+10μg QuilA之一的20μg WT1-F截短蛋白质(参见实施例35)以3周间隔按每4只小鼠一组皮下免疫HLA-A2/Kb转基因小鼠3次。阳性对照组被WT1-F DNA免疫2次，接着用107PFU的编码WT1-F的腺病毒加强免疫(参见实施例40)。最后一次免疫后2周处死小鼠，并且测定CTL。收集脾脏，用CD.24-A2Kb-WT-1-LAMP细胞体外刺激它(参见实施例18)，并且测定其抗表达全长WT1-F的JurkatA2Kb细胞，或者用WT-1 CD8表位肽(p10-18(ALLPAVPSL，SEQ IDNO：451)，p32(ARMFPNAPYLPSCLE，在p117-139 SEQ ID NO：2内发现的aa 125-139)和WT1 p37-45肽(VLDFAPPGA，人类WT1残基37-45；SEQ ID NO：241)脉冲它。用标准铬释放测定法测定CTL活性。如在以前的试验中所观察到的，用WT1 DNA免疫，接着用腺病毒加强免疫在HLA-A2转基因小鼠中激发了WT1特异性CTL应答。也从用WT1-F蛋白质联合Enhanzyn、RC-529-SE及联合RC-529-AF和QuilA免疫的小鼠脾脏检测到了CTL应答。诱导的应答量级与DNA-腺病毒免疫中观察到的量级相似。
从上述将认识到尽管为了示例的目的已经描述了本发明具体的实施方式，但是可以进行各种修改而不背离本发明的精神和范围。因此，除了所附权利要求外本发明不受限制。
                            序列表
                 序列表
<110>Corixa Corporation
     Gaiger，Alexander
     McNeill，Patricia D.
     Jaya，Nomalie
<120>用于WT1特异性免疫治疗的组合物和方法
<130>210121.61001PC
<140>PCT
<141>2004-04-29
<160>508
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>1
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
 1               5                  10              15
Gly
<210>2
<211>23
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
 1               5                  10                  15
Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
            20
<210>3
<211>23
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>3
Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
 1               5                  10                  15
Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
            20
<210>4
<211>19
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys
 1               5                  10                  15
Trp Thr Glu
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>智人
<400>5
gagagtcaga cttgaaagca gt                                               22
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>智人
<400>6
ctgagcctca gcaaatgggc                                                  20
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>智人
<400>7
gagcatgcat gggctccgac gtgcggg                                          27
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>智人
<400>8
ggggtaccca ctgaacggtc cccga                                            25
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>小鼠
<400>9
tccgagccgc acctcatg                                                    18
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>小鼠
<400>10
gcctgggatg ctggactg                                                    18
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>11
gagcatgcga tgggttccga cgtgcgg                                          27
<210>12
<211>29
<212>DNA
<213>小鼠
<400>12
ggggtacctc aaagcgccac gtggagttt                                        29
<210>13
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>13
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gly
<210>14
<211>19
<212>PRT
<213>小鼠
<400>14
Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys
 1               5                  10                  15
Trp Thr Glu
<210>15
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>15
Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
 1               5                  10                  15
<210>16
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
<400>16
Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
 1               5                  10                  15
<210>17
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠
<400>17
Val Arg Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
 1               5                  10
<210>18
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>18
Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
 1               5                  10
<210>19
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>19
Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His
 1               5                  10                  15
<210>20
<211>15
<212>PRT
<213>小鼠
<400>20
Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His
 1               5                  10                  15
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>21
cccaggctgc aataagagat a                                                21
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>22
atgttgtgat ggcggaccaa t                                                21
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>智人
<400>23
gtggggcgcc ccaggcacca                                                  20
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>智人
<400>24
gtccttaatg ctacgcacga tttc                                             24
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>25
ggcatctgag accagtgaga a                                                21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>26
gctgtcccac ttacagatgc a                                                21
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>智人
<400>27
tcaaagcgcc agctggagtt t                                                21
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>28
Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys
 1               5
<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>29
Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
 1               5
<210>30
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>30
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
 1               5
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>31
Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
 1               5
<210>32
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>32
Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp
 1               5
<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>33
Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr
 1               5
<210>34
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Ala Lau Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
 1               5
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>35
Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu
 1               5
<210>36
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>36
Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys
 1               5
<210>37
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>37
Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
 1               5
<210>38
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>38
Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
 1               5
<210>39
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>39
Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His
 1               5
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>40
Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
 1               5
<210>41
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>41
Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala
 1               5
<210>42
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>42
Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr
 1               5
<210>43
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>43
Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
 1               5
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>44
Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg
 1               5
<210>45
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>45
Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr
 1               5
<210>46
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>46
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser
 1               5
<210>47
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>47
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg
 1               5
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>48
Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
 1               5
<210>49
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>49
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
 1               5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>50
Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys
 1               5
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>51
Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
 1               5
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>52
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
 1               5
<210>53
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>53
Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met
 1               5
<210>54
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>54
Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala
 1               5
<210>55
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>55
Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe
 1               5
<210>56
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>56
Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr
 1               5
<210>57
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>57
Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr
 1               5
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>58
Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
 1               5
<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>59
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
 1               5
<210>60
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>60
Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg
1               5
<210>61
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>61
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu
 1               5
<210>62
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>62
Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu
 1               5
<210>63
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>63
Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala
 1               5
<210>64
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>64
Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser
 1               5
<210>65
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>65
Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr
 1               5
<210>66
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>66
Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys
 1               5
<210>67
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>67
Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr
 1               5
<210>68
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>68
Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser
 1               5
<210>69
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>69
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val
 1               5
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>70
Glu Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile
 1               5
<210>71
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>71
Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile
 1               5
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>72
Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln
 1               5
<210>73
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>73
Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met
 1               5
<210>74
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>74
Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
 1               5
<210>75
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>75
Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg
 1               5
<210>76
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>76
Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala
 1               5
<210>77
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>77
Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser
 1               5
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>78
Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His
 1               5
<210>79
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>79
Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
 1               5
<210>80
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>80
Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys
 1               5
<210>81
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>81
Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg
 1               5
<210>82
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>82
Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala
 1               5
<210>83
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>83
Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg
 1               5
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>84
Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg
 1               5
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>85
Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe
 1               5
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>86
Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu
 1               5
<210>87
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>87
Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys
 1               5
<210>88
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>88
Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala
 1               5
<210>89
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>89
Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala
 1               5
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>90
Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu
 1               5
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>91
Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe
 1               5
<210>92
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>92
Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val
 1               5
<210>93
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>93
Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro
 1               5
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>94
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala
 1               5
<210>95
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>95
Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser
 1               5
<210>96
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>96
Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser
 1               5
<210>97
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>97
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser
 1               5
<210>98
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>98
Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
 1               5
<210>99
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>99
Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala
 1               5
<210>100
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>100
Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr
 1               5
<210>101
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>101
Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala
 1               5
<210>102
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>102
Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr
 1               5
<210>103
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>103
Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
 1               5
<210>104
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>104
Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr
 1               5
<210>105
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>105
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Ala
 1               5
<210>106
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>106
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
 1               5
<210>107
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>107
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe
 1               5
<210>108
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>108
His His Asn Met His Gln Arg Asn Met
 1               5
<210>109
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>109
His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys
 1               5
<210>110
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>110
His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met
 1               5
<210>111
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>111
His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys
 1               5
<210>112
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>112
His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys
 1               5
<210>113
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>113
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
 1               5
<210>114
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>114
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr
 1               5
<210>115
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>115
His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala
 1               5
<210>116
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>116
Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
 1               5
<210>117
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>117
Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val
 1               5
<210>118
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>118
Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg
 1               5
<210>119
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>119
Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
 1               5
<210>120
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>120
Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys
 1               5
<210>121
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>121
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln
 1               5
<210>122
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>122
Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu
 1               5
<210>123
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>123
Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser
 1               5
<210>124
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>124
Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp
 1               5
<210>125
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>125
Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala
 1               5
<210>126
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>126
Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly
 1               5
<210>127
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>127
Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu
 1               5
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>128
Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg
 1               5
<210>129
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>129
Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
 1               5
<210>130
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>130
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser
 1               5
<210>131
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>131
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met
 1               5
<210>132
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>132
Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn
 1               5
<210>133
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>133
Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala
 1               5
<210>134
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>134
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu
 1               5
<210>135
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>135
Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser
 1               5
<210>136
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>136
Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr
 1               5
<210>137
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>137
Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr
 1               5
<210>138
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>138
Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp
 1               5
<210>139
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>139
 Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr
  1               5
<210>140
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>140
Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn
 1               5
<210>141
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>141
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
 1               5
<210>142
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>142
Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys
 1               5
<210>143
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>143
Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu
 1               5
<210>144
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>144
Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu
 1               5
<210>145
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>145
Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His
 1               5
<210>146
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>146
Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val
 1               5
<210>147
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>147
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
 1               5
<210>148
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>148
Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys
 1               5
<210>149
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>149
Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
 1               5
<210>150
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>150
Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe
 1               5
<210>151
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>151
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu
 1               5
<210>152
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>152
Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser
 1               5
<210>153
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>153
Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu
1                5
<210>154
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>154
Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala
 1               5
<210>155
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>155
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg
 1               5
<210>156
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>156
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys
 1               5
<210>157
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>157
Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile
 1               5
<210>158
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>158
Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe
 1               5
<210>159
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>159
Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg
 1               5
<210>160
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>160
Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr
 1               5
<210>161
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>161
Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
 1               5
<210>162
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>162
Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg
 1               5
<210>163
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>163
Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe
 1               5
<210>164
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>164
Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val
 1               5
<210>165
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>165
Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys
 1               5
<210>166
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>166
Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr
 1               5
<210>167
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>167
Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
 1               5
<210>168
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>168
Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys
 1               5
<210>169
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>169
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
 1               5
<210>170
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>170
Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
 1               5
<210>171
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>171
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val
 1               5
<210>172
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>172
Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His
 1               5
<210>173
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>173
Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu
 1               5
<210>174
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>174
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala
 1               5
<210>175
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>175
Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val
 1               5
<210>176
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>176
Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
 1               5
<210>177
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>177
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala
 1               5
<210>178
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>178
Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys
 1               5
<210>179
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>179
Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val
 1               5
<210>180
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>180
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn
 1               5
<210>181
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>181
Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val
 1               5
<210>182
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>182
Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg
 1               5
<210>183
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>183
Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu
 1               5
<210>184
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>184
Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr
 1               5
<210>185
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>185
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
 1               5
<210>186
<211>9
<212>PRT
<2I3>智人
<400>186
Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
 1               5
<210>187
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>187
Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu
 1               5
<210>188
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>188
Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe
 1               5
<210>189
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>189
Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr
 1               5
<210>190
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>190
Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
 1               5
<210>191
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>191
Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His
 1               5
<210>192
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>192
Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr
 1               5
<210>193
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>193
Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
 1               5
<210>194
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>194
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu
 1               5
<210>195
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>195
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
 1               5
<210>196
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>196
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe
 1               5
<210>197
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>197
Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg
 1               5
<210>198
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>198
Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
 1               5
<210>199
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>199
Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile
 1               5
<210>200
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>200
Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser
 1               5
<210>201
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>201
Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys
 1               5
<210>202
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>202
 Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu
  1               5
<210>203
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>203
 Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn
  1               5
<210>204
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>204
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu
 1                   5
<210>205
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>205
Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser
 1               5
<210>206
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>206
Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu
 1               5
<210>207
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>207
Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp
 1               5
<210>208
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>208
 Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala
  1               5
<210>209
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>209
Ser Glu Thr Ser G1u Lys Arg Pro Phe
 1               5
<210>210
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>210
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp
 1               5
<210>211
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>211
Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
 1               5
<210>212
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>212
Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn
 1               5
<210>213
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>213
Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn
 1               5
<210>214
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>214
Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
 1               5
<210>215
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>215
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala
 1               5
<210>216
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>216
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg
 1               5
<210>217
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>217
Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr
 1               5
<210>218
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>218
Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys
 1               5
<210>219
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>219
Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser
 1               5
<210>220
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>220
Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala
 1               5
<210>221
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>221
Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr
 1               5
<210>222
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>222
Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe
 1               5
<210>223
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>223
Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg
 1               5
<210>224
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>224
Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr
 1               5
<210>225
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>225
Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr
 1               5
<210>226
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>226
Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
 1               5
<210>227
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>227
Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr
 1               5
<210>228
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>228
Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe
 1               5
<210>229
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>229
Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
 1               5
<210>230
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>230
Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser
 1               5
<210>231
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>231
Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
 1               5
<210>232
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>232
Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg
 1               5
<210>233
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>233
Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys
 1               5
<210>234
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>234
Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp
 1               5
<210>235
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>235
Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
 1               5
<210>236
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>236
Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val
 1               5
<210>237
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>237
Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala
 1               5
<210>238
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>238
Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
 1               5
<210>239
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>239
Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys
 1               5
<210>240
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>240
Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn
 1               5
<210>241
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>241
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>242
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>242
Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val
 1               5
<210>243
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>243
Val Arg His His Asn Met His Gln Arg
 1               5
<210>244
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>244
Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
 1               5
<210>245
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>245
Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr
 1               5
<210>246
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>246
Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala
 1               5
<210>247
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>247
Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser
 1               5
<210>248
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>248
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
 1               5
<210>249
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>249
Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
 1               5
<210>250
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>250
Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
 1               5
<210>251
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>251
Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys
 1               5
<210>252
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>252
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
 1               5
<210>253
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>253
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
 1               5
<210>254
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>254
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
 1               5
<210>255
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>255
Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu
 1               5
<210>256
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>256
Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala
 1               5
<210>257
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>257
Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr
 1               5
<210>258
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>258
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
 1               5
<210>259
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>259
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
 1               5
<210>260
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>260
Asp Gly Ala Pro Ser Tyr Gly His Thr
 1               5
<210>261
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>261
Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
 1               5
<210>262
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>262
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
 1               5
<210>263
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>263
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu
 1               5
<210>264
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>264
Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu
 1               5
<210>265
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>265
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu
 1               5
<210>266
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>266
Glu Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile
 1               5
<210>267
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>267
Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
 1               5
<210>268
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>268
Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu
 1               5
<210>269
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>269
Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
 1               5
<210>270
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>270
Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
 1               5
<210>271
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>271
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Ala
 1               5
<210>272
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>272
His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met
 1               5
<210>273
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>273
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
 1               5
<210>274
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>274
Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr ArgIle
 1               5
<210>275
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>275
Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
 1               5
<210>276
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>276
Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu
 1               5
<210>277
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>277
Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
 1               5
<210>278
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>278
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met
 1               5
<210>279
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>279
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu
 1               5
<210>280
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>280
Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr
 1               5
<210>281
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>281
Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu
 1               5
<210>282
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>282
Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu
 1               5
<210>283
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>283
Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met
 1               5
<210>284
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>284
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
 1               5
<210>285
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>285
Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala Leu
 1               5
<210>286
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>286
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu
 1               5
<210>287
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>287
Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu
 1               5
<210>288
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>288
Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
 1               5
<210>289
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>289
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
 1               5
<210>290
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>290
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val
 1               5
<210>291
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>291
Glh Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val
 1               5
<210>292
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>292
Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
 1               5
<210>293
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>293
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
 1               5
<210>294
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>294
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu
 1               5
<210>295
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>295
Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu
 1               5
<210>296
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>296
Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile
 1               5
<210>297
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>297
Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser
 1               5
<210>298
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>298
Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu
 1               5
<210>299
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>299
Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
 1               5
<210>300
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>300
Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser
1               5
<210>301
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>301
Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile
 1               5
<210>302
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>302
Thr Leu His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
 1               5
<210>303
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>303
Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
 1               5
<210>304
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>304
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>305
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>305
Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr
 1               5
<210>306
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>306
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
 1               5
<210>307
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>307
Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys
 1               5
<210>308
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>308
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
 1               5
<210>309
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>309
Gly Ala Ala Gln Trp Ala
 1               5
<210>310
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>310
Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
 1               5                  10
<210>311
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>311
Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly
 1               5                  10                  15
<210>312
<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>312
His Ala Ala Gln Phe
 1               5
<210>313
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>313
Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
 1               5                  10                  15
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
            20                  25                  30
<210>314
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>314
Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg
 1               5                  10                  15
Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser
            20                  25                  30
<210>315
<211>4
<212>PRT
<213>智人
<400>315
Arg Tyr Phe Lys
 1
<210>316
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>316
Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
 1               5                  10
<210>317
<211>22
<212>PRT
<213>智人
<400>317
Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr
 1               5                  10                  15
His Thr Gly Lys Thr Ser
            20
<210>318
<211>21
<212>PRT
<213>智人
<400>318
Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn
 1               5                  10                  15
Met His Gln Arg Asn
            20
<210>319
<211>449
<212>PRT
<213>智人
<400>319
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
 1               5                  10                  15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
            20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
        35                  40                  45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
    50                  55                 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
                85                  90                  95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
            100                 105                 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
        115                 120                 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
    130                 135                 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
                165                 170                 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
            180                 185                 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
        195                 200                 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
    210                 215                 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
                245                 250                 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
            260                 265                 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
        275                 280                 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
    290                 295                 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305                 310                 315                 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
                325                 330                 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
            340                 345                 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
        355                 360                 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
    370                 375                 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385                 390                 395                 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
                405                 410                 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
            420                 425                 430
Arq His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
        435                 440                 445
Leu
<210>320
<211>449
<212>PRT
<213>小鼠
<400>320
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser
 1               5                  10                  15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
            20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
        35                  40                  45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
    50                  55                  60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe
                85                  90                  95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
            100                  105                110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
        115                 120                 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile
    130                 135                 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
                165                 170                 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
            180                 185                 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
        195                 200                 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
    210                 215                 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser
                    245                 250                 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu
            260                 265                 270
Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
        275                 280                 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser
    290                 295                 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305                 310                 315                 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
                 325                 330                 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
            340                 345                 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
        355                 360                 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
    370                 375                 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385                 390                 395                 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
                405                 410                 415
Arg Trp His Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
            420                 425                 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala
        435                 440                 445
Leu
<210>321
<211>9
<212>PRT
<213>智人和小鼠
<400>321
Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala
 1               5
<210>322
<211>9
<212>PRT
<213>智人和小鼠
<400>322
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro
 1               5
<210>323
<211>9
<212>PRT
<213>智人和小鼠
<400>323
Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
 1               5
<210>324
<211>9
<212>PRT
<213>智人和小鼠
<400>324
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro
 1               5
<210>325
<211>9
<212>PRT
<213>智人和小鼠
<400>325
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
 1               5
<210>326
<211>9
<212>PRT
<213>智人和小鼠
<400>326
Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
 1               5
<210>327
<211>1029
<212>DNA
<213>智人
<400>327
atgcagcatc accaccatca ccacatgagc gataaaatta ttcacctgac tgacgacagt    60
tttgacacgg atgtactcaa agcggacggg gcgatcctcg tcgatttctg ggcagagtgg    120
tgcggtccgt gcaaaatgat cgccccgatt ctggatgaaa tcgctgacga atatcagggc    180
aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat caaaaccctg gcactgcgcc gaaatatggc    240
atccgtggta tcccgactct gctgctgttc aaaaacggtg aagtggcggc aaccaaagtg    300
ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc cggttctggt    360
tctggccata tgcagcatca ccaccatcac cacgtgtcta tcgaaggtcg tgctagctct    420
ggtggcagcg gtctggttcc gcgtggtagc tctggttcgg gggacgacga cgacaaatct    480
agtaggcaca gcacagggta cgagagcgat aaccacacaa cgcccatcct ctgcggagcc    540
caatacagaa tacacacgca cggtgtcttc agaggcattc aggatgtgcg acgtgtgcct    600
ggagtagccc cgactcttgt acggtcggca tctgagacca gtgagaaacg ccccttcatg    660
tgtgcttacc caggctgcaa taagagatat tttaagctgt cccacttaca gatgcacagc    720
aggaagcaca ctggtgagaa accataccag tgtgacttca aggactgtga acgaaggttt    780
tttcgttcag accagctcaa aagacaccaa aggagacata caggtgtgaa accattccag    840
tgtaaaactt gtcagcgaaa gttctcccgg tccgaccacc tgaagaccca caccaggact    900
catacaggtg aaaagccctt cagctgtcgg tggccaagtt gtcagaaaaa gtttgcccgg    960
tcagatgaat tagtccgcca tcacaacatg catcagagaa acatgaccaa actccagctg    1020
gcgctttga                                                            1029
<210>328
<211>1233
<212>DNA
<213>智人
<400>328
atgcagcatc accaccatca ccacatgagc gataaaatta ttcacctgac tgacgacagt    60
tttgacacgg atgtactcaa agcggacggg gcgatcctcg tcgatttctg ggcagagtgg    120
tgcggtccgt gcaaaatgat cgccccgatt ctggatgaaa tcgctgacga atatcagggc    180
aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat caaaaccctg gcactgcgcc gaaatatggc    240
atccgtggta tcccgactct gctgctgttc aaaaacggtg aagtggcggc aaccaaagtg    300
ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc cggttctggt    360
tctggccata tgcagcatca ccaccatcac cacgtgtcta tcgaaggtcg tgctagctct    420
ggtggcagcg gtctggttcc gcgtggtagc tctggttcgg gggacgacga cgacaaatct    480
agtaggggct ccgacgttcg tgacctgaac gcactgctgc cggcagttcc gtccctgggt    540
ggtggtggtg gttgcgcact gccggttagc ggtgcagcac agtgggctcc ggttctggac    600
ttcgcaccgc cgggtgcatc cgcatacggt tccctgggtg gtccggcacc gccgccggca    660
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgccgcac tccttcatca aacaggaacc gagctggggt    720
ggtgcagaac cgcacgaaga acagtgcctg agcgcattca ccgttcactt ctccggccag    780
ttcactggca cagccggagc ctgtcgctac gggcccttcg gtcctcctcc gcccagccag    840
gcgtcatccg gccaggccag gatgtttcct aacgcgccct acctgcccag ctgcctcgag    900
agccagcccg ctattcgcaa tcagggttac agcacggtca ccttcgacgg gacgcccagc    960
tacggtcaca cgccctcgca ccatgcggcg cagttcccca accactcatt caagcatgag    1020
gatcccatgg gccagcaggg ctcgctgggt gagcagcagt actcggtgcc gcccccggtc    1080
tatggctgcc acacccccac cgacagctgc accggcagcc aggctttgct gctgaggacg    1140
ccctacagca gtgacaattt ataccaaatg acatcccagc ttgaatgcat gacctggaat    1200
cagatgaact taggagccac cttaaagggc tga                                 1233
<210>329
<211>1776
<212>DNA
<213>智人
<400>329
atgcagcatc accaccatca ccacatgagc gataaaatta ttcacctgac tgacgacagt    60
tttgacacgg atgtactcaa agcggacggg gcgatcctcg tcgatttctg ggcagagtgg    120
tgcggtccgt gcaaaatgat cgccccgatt ctggatgaaa tcgctgacga atatcagggc    180
aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat caaaaccctg gcactgcgcc gaaatatggc    240
atccgtggta tcccgactct gctgctgttc aaaaacggtg aagtggcggc aaccaaagtg    300
ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc cggttctggt    360
tctggccata tgcagcatca ccaccatcac cacgtgtcta tcgaaggtcg tgctagctct    420
ggtggcagcg gtctggttcc gcgtggtagc tctggttcgg gggacgacga cgacaaatct    480
agtaggatgg gctccgacgt tcgtgacctg aacgcactgc tgccggcagt tccgtccctg    540
ggtggtggtg gtggttgcgc actgccggtt agcggtgcag cacagtgggc tccggttctg    600
gacttcgcac cgccgggtgc atccgcatac ggttccctgg gtggtccggc accgccgccg    660
gcaccgccgc cgccgccgcc gccgccgccg cactccttca tcaaacagga accgagctgg    720
ggtggtgcag aaccgcacga agaacagtgc ctgagcgcat tcaccgttca cttctccggc    780
cagttcactg gcacagccgg agcctgtcgc tacgggccct tcggtcctcc tccgcccagc    840
caggcgtcat ccggccaggc caggatgttt cctaacgcgc cctacctgcc cagctgcctc    900
gagagccagc ccgctattcg caatcagggt tacagcacgg tcaccttcga cgggacgccc    960
agctacggtc acacgccctc gcaccatgcg gcgcagttcc ccaaccactc attcaagcat    1020
gaggatccca tgggccagca gggctcgctg ggtgagcagc agtactcggt gccgcccccg    1080
gtctatggct gccacacccc caccgacagc tgcaccggca gccaggcttt gctgctgagg    1140
acgccctaca gcagtgacaa tttataccaa atgacatccc agcttgaatg catgacctgg    1200
aatcagatga acttaggagc caccttaaag ggccacagca cagggtacga gagcgataac    1260
cacacaacgc ccatcctctg cggagcccaa tacagaatac acacgcacgg tgtcttcaga    1320
ggcattcagg atgtgcgacg tgtgcctgga gtagccccga ctcttgtacg gtcggcatct    1380
gagaccagtg agaaacgccc cttcatgtgt gcttacccag gctgcaataa gagatatttt    1440
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gacttcaagg actgtgaacg aaggtttttt cgttcagacc agctcaaaag acaccaaagg    1560
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gaccacctga agacccacac caggactcat acaggtgaaa agcccttcag ctgtcggtgg    1680
ccaagttgtc agaaaaagtt tgcccggtca gatgaattag tccgccatca caacatgcat    1740
cagagaaaca tgaccaaact ccagctggcg ctttga                              1776
<210>330
<211>771
<212>DNA
<213>智人
<400>330
atgcagcatc accaccatca ccacggctcc gacgttcgtg acctgaacgc actgctgccg    60
gcagttccgt ccctgggtgg tggtggtggt tgcgcactgc cggttagcgg tgcagcacag    120
tgggctccgg ttctggactt cgcaccgccg ggtgcatccg catacggttc cctgggtggt    180
ccggcaccgc cgccggcacc gccgccgccg ccgccgccgc  cgccgcactc cttcatcaaa   240
caggaaccga gctggggtgg tgcagaaccg cacgaagaac agtgcctgag cgcattcacc    300
gttcacttct ccggccagtt cactggcaca gccggagcct gtcgctacgg gcccttcggt    360
cctcctccgc ccagccaggc gtcatccggc caggccagga tgtttcctaa cgcgccctac    420
ctgcccagct gcctcgagag ccagcccgct attcgcaatc agggttacag cacggtcacc    480
ttcgacggga cgcccagcta cggtcacacg ccctcgcacc atgcggcgca gttccccaac    540
cactcattca agcatgagga tcccatgggc cagcagggct cgctgggtga gcagcagtac    600
tcggtgccgc ccccggtcta tggctgccac acccccaccg acagctgcac cggcagccag    660
gctttgctgc tgaggacgcc ctacagcagt gacaatttat  accaaatgac atcccagctt   720
gaatgcatga cctggaatca gatgaactta ggagccacct  taaagggctg a            771
<210>331
<211>567
<212>DNA
<213>智人
<400>331
atgcagcatc accaccatca ccaccacagc acagggtacg agagcgataa ccacacaacg    60
cccatcctct gcggagccca atacagaata cacacgcacg gtgtcttcag aggcattcag    120
gatgtgcgac gtgtgcctgg agtagccccg actcttgtac ggtcggcatc tgagaccagt    180
gagaaacgcc ccttcatgtg tgcttaccca ggctgcaata agagatattt taagctgtcc    240
cacttacaga tgcacagcag gaagcacact ggtgagaaac cataccagtg tgacttcaag    300
gactgtgaac gaaggttttt tcgttcagac cagctcaaaa gacaccaaag gagacataca    360
ggtgtgaaac cattccagtg taaaacttgt cagcgaaagt tctcccggtc cgaccacctg    420
aagacccaca ccaggactca tacaggtgaa aagcccttca gctgtcggtg gccaagttgt    480
cagaaaaagt ttgcccggtc agatgaatta gtccgccatc acaacatgca tcagagaaac    540
atgaccaaac tccagctggc gctttga                                        567
<210>332
<211>342
<212>PRT
<213>智人
<400>332
Met Gln His His His His His His Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu
                  5                  10                  15
Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
             20                  25                  30
Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala
         35                  40                  45
Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val
     50                 55                 60
Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly
 65                  70                  75                  80
Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
                 85                  90                  95
Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
            100                 105                 110
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Gln His His His
        115                 120                 125
His His His Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser
145                 150                 155                 160
Ser Arg His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile
                165                 170                 175
Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly
            180                 185                 190
Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg
        195                 200                 205
Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro
    210                 215                 220
Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser
225                 230                 235                 240
Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys
                245                 250                 255
Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg
            260                 265                 270
His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe
        275                 280                 285
Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu
    290                 295                 300
Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg
    305                 310             315                 320
Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr
                325                 330                 335
Lys Leu Gln Leu Ala Leu
            340
<210>333
<211>410
<212>PRT
<213>智人
<400>333
Met Gln His His His His His His Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu
                  5                  10                  15
Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
             20                  25                  30
Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala
         35                  40                  45
Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val
     50                  55                  60
Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly
 65                  70                  75                  80
Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
                 85                  90                  95
Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
            100                 105                  110
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Gln His His His
        115                 120                 125
His His His Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser
145                 150                 155                 160
Ser Arg Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
                165                 170                 175
Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala
            180                 185                 190
Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala
        195                 200                 205
Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro
    210                 215                 220
Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly
225                 230                 235                 240
Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His
                245                 250                 255
Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro
            260                 265                 270
Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
        275                 280                 285
Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala
    290                 295                 300
Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser
305                 310                 315                 320
Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser
                325                 330                 335
Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln
            340                 345                 350
Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp
        355                 360                 365
Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser
    370                 375                 380
Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn
385                 390                 395                 400
Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly
405                 410
<210>334
<211>591
<212>PRT
<213>智人
<400>334
Met Gln His His His His His His Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu
                  5                  10                  15
Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
             20                  25                  30
Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala
         35                  40                  45
Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val
     50                  55                  60
Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly
 65                  70                  75                  80
Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
                 85                  90                  95
 Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
             100                 105                 110
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Gln His His His
        115                 120                 125
His His His Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser
145                 150                 155                 160
Ser Arg Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala
                165                 170                 175
Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly
            180                 185                 190
Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser
        195                 200                 205
Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro
    210                 215                 220
Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp
225                 230                 235                 240
Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val
                245                 250                 255
His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly
            260                 265                 270
Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg
        275                 280                 285
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro
    290                 295                 300
Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro
305                 310                 315                 320
Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His
                325                 330                 335
Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu
            340                 345                 350
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr
        355                  360                 365
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser
    370                 375                 380
Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp
385                 390                 395                 400
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr
                405                 410                 415
Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg
            420                 425                 430
Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val
        435                 440                 445
Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu
    450                 455                 460
Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
465                 470                 475                 480
Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys
                485                 490                 495
Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser
            500                 505                 510
Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe
        515                 520                 525
Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys
    530                 535                 540
Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp
545                 550                 555                 560
Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His
                565                 570                 575
His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
            580                 585                 590
<210>335
<211>256
<212>PRT
<213>智人
<400>335
Met Gln His His His His His His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn
                  5                  10                  15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala
             20                  25                  30
Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala
         35                  40                  45
Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro
     50                  55                  60
Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys
 65                 70                   75                  80
Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
                 85                  90                  95
Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly
            100                 105                 110
Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser
        115                 120                 125
Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
    130                 135                 140
Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr
145                150                  155                 160
Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala
                165                 170                 175
Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln
            180                 185                 190
Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyl Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly
        195                 200                 205
Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
    210                 215                 220
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
225                 230                 235                 240
Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly
                245                 250                 255
<210>336
<211>188
<212>PRT
<213>智人
<400>336
Met Gln His His His His His His His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp
                  5                  10                  15
Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr
         20                      25                  30
His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val
         35                  40                  45
Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro
     50                  55                  60
Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser
 65                  70                 75                  80
His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln
                 85                  90                  95
Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu
            100                 105                 110
Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys
        115                 120                 125
Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr
    130                 135                 140
Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys
145                 150                 155                 160
Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met
                165                 170                 175
His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
            180                 185
<210>337
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>337
atgcagcatc accaccatca ccacggttcc gacgtgcggg acctgaacgc actgctgccg    60
gcagttccat ccctgggtgg cggtggaggc tgcgcactgc cggttagcgg tgcagcacag    120
tgggctccag ttctggactt cgcaccgcct ggtgcatccg catacggttc cctgggtggt    180
ccagcacctc cgcccgcaac gcccccaccg cctccaccgc ccccgcactc cttcatcaaa    240
caggaaccta gctggggtgg tgcagaaccg cacgaagaac agtgcctgag cgcattctga    300
gaattctgca gatatccatc acac                                            324
<210>338
<211>462
<212>DNA
<213>智人
<400>338
atgcagcatc accaccatca ccaccacgaa gaacagtgcc tgagcgcatt caccgttcac    60
ttctccggcc agttcactgg cacagccgga gcctgtcgct acgggccctt cggtcctcct    120
ccgcccagcc aggcgtcatc cggccaggcc aggatgtttc ctaacgcgcc ctacctgccc    180
agctgcctcg agagccagcc cgctattcgc aatcagggtt acagcacggt caccttcgac    240
gggacgccca gctacggtca cacgccctcg caccatgcgg cgcagttccc caaccactca    300
ttcaagcatg aggatcccat gggccagcag ggctcgctgg gtgagcagca gtactcggtg    360
ccgcccccgg tctatggctg ccacaccccc accgacagct gcaccggcag ccaggctttg    420
ctgctgagga cgccctacag cagtgacaat ttatactgat ga                       462
<210>339
<211>405
<212>DNA
<213>智人
<400>339
atgcagcatc accaccatca ccaccaggct ttgctgctga ggacgcccta cagcagtgac    60
aatttatacc aaatgacatc ccagcttgaa tgcatgacct ggaatcagat gaacttagga    120
gccaccttaa agggccacag cacagggtac gagagcgata accacacaac gcccatcctc    180
tgcggagccc aatacagaat acacacgcac ggtgtcttca gaggcattca ggatgtgcga    240
cgtgtgcctg gagtagcccc gactcttgta cggtcggcat ctgagaccag tgagaaacgc    300
cccttcatgt gtgcttaccc aggctgcaat aagagatatt ttaagctgtc ccacttacag    360
atgcacagca ggaagcacac tggtgagaaa ccataccagt gatga                    405
<210>340
<211>339
<212>DNA
<213>智人
<400>340
atgcagcatc accaccatca ccaccacagc aggaagcaca ctggtgagaa accataccag    60
tgtgacttca aggactgtga acgaaggttt tttcgttcag accagctcaa aagacaccaa    120
aggagacata caggtgtgaa accattccag tgtaaaactt gtcagcgaaa gttctcccgg    180
tccgaccacc tgaagaccca caccaggact catacaggtg aaaagccctt cagctgtcgg    240
tggccaagtt gtcagaaaaa gtttgcccgg tcagatgaat tagtccgcca tcacaacatg    300
catcagagaa acatgaccaa actccagctg gcgctttga                           339
<210>341
<211>1110
<212>DNA
<213>智人
<400>34l
atgcagcatc accaccatca ccaccactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt    60
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc    120
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg    180
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc    240
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac    300
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat    360
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat    420
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc    480
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag    540
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca    600
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt    660
caggatgtgc gacgtgtgcc tggagtagcc ccgactcttg tacggtcggc atctgagacc    720
agtgagaaac gccccttcat gtgtgcttac ccaggctgca ataagagata ttttaagctg    780
tcccacttac agatgcacag caggaagcac actggtgaga aaccatacca gtgtgacttc    840
aaggactgtg aacgaaggtt ttttcgttca gaccagctca aaagacacca aaggagacat    900
acaggtgtga aaccattcca gtgtaaaact tgtcagcgaa agttctcccg gtccgaccac    960
ctgaagaccc acaccaggac tcatacaggt gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt    1020
tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga    1080
aacatgacca aactccagct ggcgctttga                                     1110
<210>342
<211>99
<212>PRT
<213>智人
<400>342
Met Gln His His His His His His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn
                  5                  10                  15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala
             20                  25                  30
Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala
         35                  40                  45
Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro
     50                  55                  60
Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys
 65                 70                   75                  80
Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
                 85                  90                  95
Ser Ala Phe
<210>343
<211>152
<212>PRT
<213>智人
<400>343
Met Gln His His His His His His His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala
                  5                  10                  15
Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys
             20                  25                  30
Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly
         35                  40                  45
Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
     50                  55                  60
Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp
 65                  70                  75                  80
Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe
     85                              90                  95
Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser
            100                 105                 110
Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His
        115                  120                125
Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr
    130                 135                 140
Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
145                 150
<210>344
<211>133
<212>PRT
<213>智人
<400>344
Met Gln His His His His His His Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro
                  5                  10                  15
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
             20                  25                  30
Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr
         35                  40                  45
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln
     50                  55                  60
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
 65                  70                  75                  80
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
                 85                  90                  95
Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg
            100                 105                 110
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly
        115                 120                 125
Glu Lys Pro Tyr Gln
    130
<210>345
<211>112
<212>PRT
<213>智人
<400>345
Met Gln His His His His His His His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu
                  5                  10                  15
Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg
             20                  25                  30
Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro
         35                  40                  45
Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu
     50                  55                  60
Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg
 65                  70                  75                  80
Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg
                 85                  90                  95
His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
            100                 105                 110
<210>346
<211>369
<212>PRT
<213>智人
<400>346
Met Gln His His His His His His His Ser Phe Ile Lys Gln Glu pro
                  5                  10                  15
Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe
             20                  25                  30
Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg
         35                  40                  45
Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln
     50                  55                  60
Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser
 65                  70                  75                  80
Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly
                 85                  90                  95
Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro
            100                 105                 110
Ash His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
        115                 120                 125
Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr
    130                 135                 140
Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
                165                 170                 175
Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr
            180                 185                 190
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln
        195                 200                 205
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
    210                 215                 220
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
225                 230                 235                 240
Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg
                245                 250                 255
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly
            260                 265                 270
Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe
        275                 280                 285
Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys
    290                 295                 300
Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His
305                 310                 315                 320
Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys
                325                 330                 335
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
            340                 345                 350
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
        355                 360                 365
Leu
<210>347
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>347
ggctccgacg tgcgggacct g                                                21
<210>348
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>348
gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt                                       30
<210>349
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>349
ggctccgacg tgcgggacct g                                                21
<210>350
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>350
 gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt                                      30
<210>351
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>351
cacagcacag ggtacgagag c                                                21
<210>352
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>352
gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt                                       30
<210>353
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>353
cacgaagaac agtgcctgag cgcattcac                                        29
<210>354
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>354
ccggcgaatt catcagtata aattgtcact gc                                    32
<210>355
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>355
caggctttgc tgctgaggac gccc                                             24
<210>356
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>356
cacggagaat tcatcactgg tatggtttct  cacc                                 34
<210>357
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>357
cacagcagga agcacactgg tgagaaac                                         28
<210>358
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>358
ggatatctgc agaattctca aagcgccagc                                       30
<210>359
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>359
cactccttca tcaaacagga ac                                               22
<210>360
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>360
ggatatctgc agaattctca aagcgccagc                                       30
<210>361
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>361
ggttccgacg tgcgggacct gaacgcactg ctg                                   33
<210>362
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>362
ctgccggcag cagtgcgttc aggtcccgca cgtcggaacc                           40
<210>363
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>363
ccggcagttc catccctggg tggcggtgga ggctg                                 35
<210>364
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>364
cggcagtgcg cagcctccac cgccacccag ggatggaa                              38
<210>365
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>365
cgcactgccg gttagcggtg cagcacagtg ggctc                                 35
<210>366
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>366
cagaactgga gcccactgtg ctgcaccgct aac                                   33
<210>367
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>367
cagttctgga cttcgcaccg cctggtgcat ccgcatac                              38
<210>368
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>368
cagggaaccg tatgcggatg caccaggcgg tgcgaagtc                             39
<210>369
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>369
ggttccctgg gtggtccagc acctccgccc gcaacgcc                              38
<210>370
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>370
ggcggtgggg gcgttgcggg cggaggtgct ggaccacc                              38
<210>371
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>371
cccaccgcct ccaccgcccc cgcactcctt catcaaacag                            40
<210>372
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>372
ctaggttcct gtttgatgaa ggagtgcggg ggcggtgga                             39
<210>373
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>373
gaacctagct ggggtggtgc agaaccgcac gaagaaca                              38
<210>374
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>374
ctcaggcact gttcttcgtg cggttctgca ccaccccag                             39
<210>375
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>375
gtgcctgagc gcattctgag aattctgcag at                                    32
<210>376
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>376
gtgtgatgga tatctgcaga attctcagaa tgcg                                  34
<210>377
<211>1292
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>253，256，517，518，520，521，522，743，753，754，
     758
<223>n＝A，T，C或G
<400>377
atgggctccg acgttcgtga cctgagcgcg ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtgat     60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc     120
gcaccgccgg gtgcatccgc acacggtccc ctgggtggtc cggcgccgcc gtcggcaccg     180
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac agggaccgag ctggggtggc     240
gcggaactgc ackaakaaca gtacctgagc gcgttcaccg ttcactcctc cggtcaggtt     300
cactggcacg gccggggcct gtcgctacgg gcccctcggc ccccctccgc ccagccaggc     360
gtcatccggc caggccagga tgtctcctag cgcgccctgc ctgcccagcc gcctcgagag     420
ccagcccgct acccgcaatc ggggctacag cacggtcacc ttcgacgggg cgtccggcta     480
cggtcacacg ccctcgcacc atgcggcgca gttctcsmar yyactcgtta ggcgtgagga     540
tcccatgggc cagcagggtc cgctgggtga gcagcagtgc tcggcgccgc ccccggcctg     600
tggccgccac acccccgccg acagctgcgc cggcagccag gctttgctgc tgagggcgcc     660
ctgtagcagc gacggtttat accaagtgac gtcccagctt gagtgcatgg cctggagtca     720
gatgagcctc ggggccgcct tamcgggcca cakyacargg tacgagagcg atgatcacac     780
aacgcccggc ctctgcggag cccaatacag aatacacacg cacggtgcct tcaggggcgt     840
tcagggtgtg cgccgtgtgc ctggagtagc cccgactctt gtacggtcgg catctgaggc     900
cagtgaggaa cgccccctca tgtgtgctta cccaggctgc aataggaggt atctgaagct     960
gccccgctta cagatgcacg gtaggaagca cgctggtgag agaccatacc agtgtgactt     1020
caaggactgt ggacggaggt ttttctgctc agaccggctc aaaagacacc aggggaggca     1080
tacagatgtg aagccattcc agcgtaagac ctgtcagcga gggttctccc ggcccaacca     1140
cctgaagacc cacgccagga ctcatgcagg tgaaaagccc cccagctgtc ggtggtcaga     1200
ttgtcagaga aagcctgccc ggtcaagtga gttggtccgc catcgcgaca tgcatcagag     1260
gggcatgacc gaactccagc tggcgctttg aa                                   1292
<210>378
<211>1291
<212>DNA
<213>智人
<400>378
atgggctccg acgttcgtga cctaaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cccgggtggt     60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcaacacagt gggctccggt tctggacttc     120
gtaccgccgg gtgcgcctgt atgcggttcc ctgggtggcc cggcaccgcc gccagcgccg     180
ccgccgctgc cgccgccgcc gtcgcactcc ttcaccaaac aggaaccgag ttggggtggt     240
acagagccgc acgcaggaca gggccggagc gcactcgtcg ctcactcctc cggccagttc     300
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg     360
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc     420
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac     480
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcatccaa gcatgaggac     540
cccatgggcc agcagggctc gccgggtgag cagcagtact cggcgccgcc cccggtctgc     600
ggctgccgca cccccaccgg cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gagggcgccc     660
tacagcggtg gcgatctaca ccaaacgaca tcccagcttg gacacatggc ctggaatcag     720
acgaacttag gagccacctt aaagggccac ggcacagggt acgagagcga tgaccacaca     780
acgcccatcc tctgcggaac ccagtacagg atacgcgcgc gcggcgtcct ccggggtact     840
caggatgtgc ggtgtgtgcc tggggtggcc ccgactcttg tgcggtcggc atctgagacc     900
agtgagaagc gccccctcat gtgtgcctac ccaggctgca ataagagaca ctttaagccg     960
tcccgcttgc gggtgcgcgg cagggagcgc actggtgaga aaccatacca gcgcgacttc     1020
aaggaccgtg gacgagggct tctccgtcca gaccagctca aaaggcacca gagggggcat     1080
acaggtgtga aacctctcca gtgtgaagct tgacggcgga ggcccccccg acccggccac     1140
ctgaaggtcc acaccaggac ccatacaggt ggagagccct tcagttgtcg gtggccaagt     1200
tgtcaggaga agtctgcccg gccagatgaa tcagcccgcc gtcataacat gcatcagaga     1260
aacatgacca aactccagct ggcgctttga a                                    1291
<210>379
<211>1281
<212>DNA
<213>智人
<400>379
atgggctccg acgttcgtga cctgagtgca ttgctaccga cggccccgtc cctgggtggt     60
ggcggtgact gcacactgcc ggttagcggt acagcacagt gggctccggt cccggcctcc     120
gcaccgccgg gcgcatccgc atacgattcc ctgggtggcc cggcaccgcc gccggcgccg     180
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc tgcggcgaac aggggccgag ctggggtggt     240
gcagaaccgc gcgaggggca atgcctgagt gcgcccgccg tccgcttctc cggccggttc     300
accggcacag tcggagcctg tcgctatggg cccctcggtc ctcctccgcc cagccaggcg     360
ccatccggcc agaccaggat gttgcccagc gcgccctatc tgtcgagttg cctcaggagc     420
cggtccgcta tccgtagtca gggtcgcagc acggcacctt cagcggggcg cccagctatg     480
gcacccaccc tcgcaccacc ggcgcagtcc cactactccc aacatggggt cctacatggg     540
ccagcagggc tcgctgggtg agcagcagta ctcggtgccg cccccggtct atggctgcca     600
cacccccacc gacagctgca ccggcagcca ggctttgctg ctgaggacgc cctacagcag     660
tgacaattta taccaaatga catcccagct tgaatgcatg acctggaatc agatgaactt     720
aggagccacc ttaaagggcc acagcacagg gtacgagagc gataaccaca caacgcccat     780
cctctgcgga gcccaataca gaatacacac gcacggtgtc ttcagaggca ttcaggatgt     840
gcgacgtgtg cctggagtag ccccgactct tgtacggtag cacctgagac cagtgagaac     900
gccccttggt gtgtgttacc ggggctgcag taaggggtat tttaagccgt cccacttacg     960
ggtgcacagc aggaagcgca ttggtgagac gccacgccag tgcgactcca agggccgtgg     1020
acgagggcct ctccgttcgg gaccagccca agggacacca aaggagacat acaggtacgc     1080
aaccactcca gtgtaaggct tgtcagcgaa ggttcccccg gtccgaccac ctgagggccc     1140
acgccagggc ccacacgggt gggaagcccc tcagctgccg gtggccaagc tgccagagag     1200
ggttcgccca gtcagacgaa ttagtccgtc atcacaacat gtatcagcga aacatgacta     1260
aactccagct ggcgctttga a                                               1281
<210>380
<211>3020
<212>DNA
<213>智人
<400>380
gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc gaccgcctgt ccgctccccc     60
acttcccgcc ctccctccca cctactcatt cacccaccca cccacccaga gccgggacgg     120
cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat cctggacttc ctcttgctgc     180
aggacccggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca gcacacgctc cgctccgggc     240
ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga cccgggcggc atctgggcca     300
agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtctccaggg ccggaggagc cgcggggcgt     360
ccgggtctga gcctcagcaa atgggctccg acgtgcggga cctgaacgcg ctgctgcccg     420
ccgtcccctc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc tgtgagcggc gcggcgcagt     480
gggcgccggt gctggacttt gcgcccccgg gcgcttcggc ttacgggtcg ttgggcggcc     540
ccgcgccgcc accggctccg ccgccacccc cgccgccgcc gcctcactcc ttcatcaaac     600
aggagccgag ctggggcggc gcggagccgc acgaggagca gtgcctgagc gccttcactg     660
tccacttttc cggccagttc actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc     720
ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc     780
tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct     840
tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc     900
actcattcaa gcatgaggat cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact     960
cggtgccgcc cccggtctat ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg     1020
ctttgctgct gaggacgccc tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg     1080
aatgcatgac ctggaatcag atgaacttag gagccacctt aaagggagtt gctgctggga     1140
gctccagctc agtgaaatgg acagaagggc agagcaacca cagcacaggg tacgagagcg     1200
ataaccacac aacgcccatc ctctgcggag cccaatacag aatacacacg cacggtgtct     1260
tcagaggcat tcaggatgtg cgacgtgtgc ctggagtagc cccgactctt gtacggtcgg     1320
catctgagac cagtgagaaa cgccccttca tgtgtgctta cccaggctgc aataagagat     1380
attttaagct gtcccactta cagatgcaca gcaggaagca cactggtgag aaaccatacc     1440
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aaaggagaca tacaggtgtg aaaccattcc agtgtaaaac ttgtcagcga aagttctccc     1560
ggtccgacca cctgaagacc cacaccagga ctcatacagg taaaacaagt gaaaagccct     1620
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ctgacccttc ccttcttttt ttatgctcgt tttcgctggg gatggaatta ttgtaccatt     2100
ttctatcatg gaatatttat aggccagggc atgtgtatgt gtctgctaat gtaaactttg     2160
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aaggaaaaaa aaaaaaaaaa                                                 3020
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<213>智人
<400>390
atgacggccg cgtccgataa cttccagctg tcccagggtg ggcagggatt cgccattccg     60
atcgggcagg cgatggcgat cgcgggccag atcaagcttc ccaccgttca tatcgggcct     120
accgccttcc tcggcttggg tgttgtcgac aacaacggca acggcgcacg agtccaacgc     180
gtggtcggga gcgctccggc ggcaagtctc ggcatctcca ccggcgacgt gatcaccgcg     240
gtcgacggcg ctccgatcaa ctcggccacc gcgatggcgg acgcgcttaa cgggcatcat     300
cccggtgacg tcatctcggt gacctggcaa accaagtcgg gcggcacgcg tacagggaac     360
gtgacattgg ccgagggacc cccggccgaa ttcccgctgg tgccgcgcgg cagcccgatg     420
ggctccgacg ttcgggacct gaacgcactg ctgccggcag ttccgtccct gggtggtggt     480
ggtggttgcg cactgccggt tagcggtgca gcacagtggg ctccggttct ggacttcgca     540
ccgccgggtg catccgcata cggttccctg ggtggtccgg caccgccgcc ggcaccgccg     600
ccgccgccgc cgccgccgcc gcactccttc atcaaacagg aaccgagctg gggtggtgca     660
gaaccgcacg aagaacagtg cctgagcgca ttcaccgttc acttctccgg ccagttcact     720
ggcacagccg gagcctgtcg ctacgggccc ttcggtcctc ctccgcccag ccaggcgtca     780
tccggccagg ccaggatgtt tcctaacgcg ccctacctgc ccagctgcct cgagagccag     840
cccgctattc gcaatcaggg ttacagcacg gtcaccttcg acgggacgcc cagctacggt     900
cacacgccct cgcaccatgc ggcgcagttc cccaaccact cattcaagca tgaggatccc     960
atgggccagc agggctcgct gggtgagcag cagtactcgg tgccgccccc ggtctatggc     1020
tgccacaccc ccaccgacag ctgcaccggc agccaggctt tgctgctgag gacgccctac     1080
agcagtgaca atttatacca aatgacatcc cagcttgaat gcatgacctg gaatcagatg     1140
aacttaggag ccaccttaaa gggccacagc acagggtacg agagcgataa ccacacaacg     1200
cccatcctct gcggagccca atacagaata cacacgcacg gtgtcttcag aggcattcag     1260
gatgtgcgac gtgtgcctgg agtagccccg actcttgtac ggtcggcatc tgagaccagt     1320
gagaaacgcc ccttcatgtg tgcttaccca ggctgcaata agagatattt taagctgtcc     1380
cacttacaga tgcacagcag gaagcacact ggtgagaaac cataccagtg tgacttcaag     1440
gactgtgaac gaaggttttt tcgttcagac cagctcaaaa gacaccaaag gagacataca     1500
ggtgtgaaac cattccagtg taaaacttgt cagcgaaagt tctcccggtc cgaccacctg     1560
aagacccaca ccaggactca tacaggtgaa aagcccttca gctgtcggtg gccaagttgt     1620
cagaaaaagt ttgcccggtc agatgaatta gtccgccatc acaacatgca tcagagaaac     1680
atgaccaaac tccagctggc gctttga                                         1707
<210>391
<211>344
<212>PRT
<213>智人
<400>391
Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly
                  5                  10                  15
Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Lys
             20                  25                  30
Leu Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val
         35                  40                  45
Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val Gly Ser
     50                  55                  60
Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Thr Ala
 65                  70                  75                  80
Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu
                 85                  90                  95
Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys
            100                 105                 110
Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro
        115                 120                 125
Ala Glu Phe His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala
    130                 135                 140
Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser
145                 150                 155                 160
Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly
                165                 170                 175
Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro
            180                 185                 190
Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg
        195                 200                 205
Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly
    210                 215                 220
His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys
225                 230                 235                 240
His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr
                245                 250                 255
Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys
            260                 265                 270
Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn
        275                 280                 285
Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met
   290                 295                 300
Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp
305                 310                 315                 320
Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr
                325                 330                 335
His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
            340
<210>392
<211>568
<212>PRT
<213>智人
<400>392
Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly
                  5                  10                  15
Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Lys
             20                  25                  30
Leu Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val
         35                  40                  45
Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val Gly Ser
     50                  55                  60
Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Thr Ala
65                  70                  75                  80
Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu
                 85                  90                  95
Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys
            100                 105                 110
Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro
        115                 120                 125
Ala Glu Phe Pro Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Met Gly Ser Asp Val
    130                 135                 140
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
                165                 170                 175
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
            180                 185                 190
Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
        195                 200                 205
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
    210                 215                 220
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
225                 230                 235                 240
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
                245                 250                 255
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
            260                 265                 270
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
        275                 280                 285
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
    290                 295                 300
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
305                 310                 315                 320
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
                325                 330                 335
Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln
            340                 345                 350
Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
        355                 360                 365
Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala
    370                 375                 380
Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
385                 390                 395                 400
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
                405                 410                 415
Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
            420                 425                 430
Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala
        435                 440                 445
Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
    450                 455                 460
 His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys
 465                 470                 475                 480
 Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
                 485                 490                 495
 Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg
             500                 505                 510
 Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr
         515                 520                 525
Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe
    530                 535                 540
Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn
545                 550                 555                 560
Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
                565
<210>393
<211>420
<212>PRT
<213>智人
<400>393
Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly
                  5                  10                  15
Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Lys
             20                  25                  30
Leu Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val
         35                  40                  45
Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val Gly Ser
     50                  55                  60
Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Thr Ala
 65                  70                  75                  80
Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu
                 85                  90                  95
Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys
            100                 105                 110
Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro
        115                 120                 125
Ala Glu Phe Pro Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Met Gly Ser Asp Val
    130                 135                 140
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
                165                 170                 175
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
            180                 185                 190
Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
        195                 200                 205
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
        210                 215                 220
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
225                 230                 235                 240
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
                245                 250                 255
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
            260                 265                 270
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
        275                 280                 285
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
    290                 295                 300
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
305                 310                 315                 320
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
                325                 330                 335
Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln
            340                 345                 350
Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
        355                 360                 365
Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala
    370                 375                 380
Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
385                 390                 395                 400
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
                405                 410                 415
Arg Gly Ile Gln
            420
<210>394
<211>362
<212>PRT
<213>智人
<400>394
Met His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro
                  5                  10                  15
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln
             20                  25                  30
Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
         35                  40                  45
Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
     50                  55                  60
Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln
 65                  70                  75                  80
Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr
                 85                  90                  95
Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu
            100                 105                 110
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
        115                 120                 125
Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly
    130                 135                 140
Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
145                 150                 155                 160
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
                165                 170                 175
Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His
            180                 185                 190
Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly
        195                 200                 205
Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro
    210                 215                 220
Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met
225                 230                 235                 240
Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu
                245                 250                 255
Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp
            260                 265                 270
Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg
        275                 280                 285
His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys
    290                 295                 300
Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr
305                 310                 315                 320
His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys
                325                 330                 335
Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln
            340                 345                 350
Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
        355                 360
<210>395
<211>214
<212>PRT
<213>智人
<400>395
Met His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro
                  5                  10                  15
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln
             20                  25                  30
Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
         35                  40                  45
Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
     50                  55                  60
Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln
 65                  70                  75                  80
Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr
                 85                  90                  95
Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu
            100                 105                 110
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
        115                 120                 125
Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly
    130                 135                 140
Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
145                 150                 155                 160
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
                165                 170                 175
Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His
            180                 185                 190
Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly
        195                 200                 205
Val Phe Arg Gly Ile Gln
    210
<210>396
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<213>人工序列
<220>
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<220>
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<400>399
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<210>400
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<220>
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<400>400
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<400>402
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<220>
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<400>403
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<210>404
<211>449
<212>PRT
<213>智人
<400>404
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
 1               5                  10                  15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
            20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
        35                  40                  45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
    50                  55                  60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
                85                  90                  95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
            100                 105                 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
        115                 120                 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
    130                 135                 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
                165                 170                 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
            180                 185                 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
        195                 200                 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
    210                 215                 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
                245                 250                 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
            260                 265                 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
        275                 280                 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
    290                 295                 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305                 310                 315                 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
                325                 330                 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
            340                 345                 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
        355                 360                 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
    370                 375                 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385                 390                 395                 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
                405                 410                 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
            420                 425                 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
        435                 440                 445
Leu
<210>405
<211>428
<212>PRT
<213>智人
<400>405
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
 1               5                  10                  15
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Thr
            20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Val Pro Pro Gly Ala Pro Val Cys
        35                  40                  45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro
    50                  55                  60
Pro Pro Pro Ser His Ser Phe Thr Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Thr Glu Pro His Ala Gly Gln Gly Arg Ser Ala Leu Val Ala His Ser
                85                  90                  95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
            100                 105                 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
        115                 120                 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
    130                 135                 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Ser
                165                 170                 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gln
            180                 185                 190
Tyr Ser Ala Pro Pro Pro Val Cys Gly Cys Arg Thr Pro Thr GIy Ser
        195                 200                 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Ala Pro Tyr Ser Gly Gly
    210                 215                 220
Asp Leu His Gln Thr Thr Ser Gln Leu Gly His Met Ala Trp Asn Gln
225                 230                 235                 240
Thr Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Gly Thr Gly Tyr Glu Ser
                245                 250                 255
Asp Asp His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Thr Gln Tyr Arg Ile Arg
            260                 265                 270
Ala Arg Gly Val Leu Arg Gly Thr Gln Asp Val Arg Cys Val Pro Gly
        275                 280                 285
Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg
    290                 295                 300
Pro Leu Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg His Phe Lys Pro
305                 310                 315                 320
Ser Arg Leu Arg Val Arg Gly Arg Glu Arg Thr Gly Glu Lys Pro Tyr
                325                 330                 335
Gln Arg Asp Phe Lys Asp Arg Gly Arg Gly Leu Leu Arg Pro Asp Gln
            340                 345                 350
Leu Lys Arg His Gln Arg Gly His Thr Gly Val Lys Pro Leu Gln Cys
        355                 360                 365
Glu Ala Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Gly His Leu Lys Val His Thr
    370                 375                 380
Arg Thr His Thr Gly Gly Glu Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys
385                 390                 395                 400
Gln Glu Lys Ser Ala Arg Pro Asp Glu Ser Ala Arg Arg His Asn Met
                405                 410                 415
 His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
             420                 425
<210>406
<211>414
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>VARIANT
<222>85，86，172，173，242，245，246，247
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>406
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Ser Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
 1               5                  10                  15
Ser Leu Gly Asp Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
            20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala His
        35                  40                  45
Gly Pro Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Ser Ala Pro Pro Pro Pro Pro
    50                  55                  60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Gly Pro Ser Trp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Ala Glu Leu His Xaa Xaa Gln Tyr Leu Ser Ala Phe Thr Val His Ser
                85                  90                  95
Ser Gly Gln Val His Trp His Gly Arg Gly Leu Ser Leu Arg Ala Pro
            100                 105                 110
Arg Pro Pro Ser Ala Gln Pro Gly Val Ile Arg Pro Gly Gln Asp Val
        115                 120                 125
Ser Arg Ala Leu Pro Ala Gln Pro Pro Arg Glu Pro Ala Arg Tyr Pro
    130                 135                 140
Gln Ser Gly Leu Gln His Gly His Leu Arg Arg Gly Val Arg Leu Arg
145                 150                 155                 160
Ser His Ala Leu Ala Pro Cys Gly Ala Val Leu Xaa Xaa Thr Arg Ala
                165                 170                 175
Gly Ser His Gly Pro Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ala Val Leu Gly Ala
            180                 185                 190
Ala Pro Gly Leu Trp Pro Pro His Pro Arg Arg Gln Leu Arg Arg Gln
        195                 200                 205
Pro Gly Phe Ala Ala Glu Gly Ala Leu Gln Arg Arg Phe Ile Pro Ser
    210                 215                 220
Asp Val Pro Ala Val His Gly Leu Glu Ser Asp Glu Pro Arg Gly Arg
225                 230                 235                 240
Leu Xaa Gly Pro Xaa Xaa Xaa Val Arg Glu Arg Ser His Asn Ala Arg
                245                 250                 255
Pro Leu Arg Ser Pro Ile Gln Asn Thr His Ala Arg Cys Leu Gln Gly
            260                 265                 270
Arg Ser Gly Cys Ala Pro Cys Ala Trp Ser Ser Pro Asp Ser Cys Thr
        275                 280                 285
Val Gly Ile Gly Gln Gly Thr Pro Pro His Val Cys Leu Pro Arg Leu
    290                 295                 300
Gln Glu Val Ser Glu Ala Ala Pro Leu Thr Asp Ala Arg Glu Ala Arg
305                 310                 315                 320
Trp Glu Thr Ile Pro Val Leu Gln Gly Leu Trp Thr Glu Val Phe Leu
                325                 330                 335
Leu Arg Pro Ala Gln Lys Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Arg Cys Glu Ala
            340                 345                 350
Ile Pro Ala Asp Leu Ser Ala Arg Val Leu Pro Ala Gln Pro Pro Glu
        355                 360                 365
Asp Pro Arg Gln Asp Ser Cys Arg Lys Ala Pro Gln Leu Ser Val Val
    370                 375                 380
Arg Leu Ser Glu Lys Ala Cys Pro Val Lys Val Gly Pro Pro Ser Arg
385                 390                 395                 400
His Ala Ser Glu Gly His Asp Arg Thr Pro Ala Gly Ala Leu
                405                 410
<210>407
<211>417
<212>PRT
<213>智人
<400>407
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Ser Ala Leu Leu Pro Thr Ala Pro
 1               5                  10                  15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Asp Cys Thr Leu Pro Val Ser Gly Thr Ala
            20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Pro Ala Ser Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
        35                  40                  45
Asp Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
    50                  55                  60
Pro Pro Pro Pro His Ser Cys Gly Glu Gln Gly Pro Ser Trp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro Arg Glu Gly Gln Cys Leu Ser Ala Pro Ala Val Arg Phe
                85                  90                  95
Ser Gly Arg Phe Thr Gly Thr Val Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Leu
            100                 105                 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Pro Ser Gly Gln Thr Arg Met Leu
        115                 120                 125
Pro Ser Ala Pro Tyr Leu Ser Ser Cys Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile
    130                 135                 140
Arg Ser Gln Gly Arg Ser Thr Ala Pro Ser Ala Gly Arg Pro Ala Met
145                 150                 155                 160
Ala Pro Thr Leu Ala Pro Pro Ala Gln Ser His Tyr Ser Gln His Gly
                165                 170                 175
Val Leu His Gly Pro Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Val Leu Gly Ala
            180                 185                 190
Ala Pro Gly Leu Trp Leu Pro His Pro His Arg Gln Leu His Arg Gln
        195                 200                 205
Pro Gly Phe Ala Ala Glu Asp Ala Leu Gln Gln Gln Phe Ile Pro Asn
    210                 215                 220
Asp Ile Pro Ala Met His Asp Leu Glu Ser Asp Glu Leu Arg Ser His
225                 230                 235                 240
Leu Lys Gly Pro Gln His Arg Val Arg Glu Arg Pro His Asn Ala His
                245                 250                 255
Pro Leu Arg Ser Pro Ile Gln Asn Thr His Ala Arg Cys Leu Gln Arg
            260                 265                 270
His Ser Gly Cys Ala Thr Cys Ala Trp Ser Ser Pro Asp Ser Cys Thr
        275                 280                 285
Val Ala Pro Glu Thr Ser Glu Asn Ala Pro Trp Cys Val Leu Pro Gly
    290                 295                 300
Leu Gln Gly Val Phe Ala Val Pro Leu Thr Gly Ala Gln Gln Glu Ala
305                 310                 315                 320
His Trp Asp Ala Thr Pro Val Arg Leu Gln Gly Pro Trp Thr Arg Ala
                325                 330                 335
Ser Pro Phe Gly Thr Ser Pro Arg Asp Thr Lys Gly Asp Ile Gln Val
            340                 345                 350
Arg Asn His Ser Ser Val Arg Leu Val Ser Glu Gly Ser Pro Gly Pro
        355                 360                 365
Thr Thr Gly Pro Thr Pro Gly Pro Thr Arg Val Gly Ser Pro Ser Ala
    370                 375                 380
Ala Gly Gly Gln Ala Ala Arg Glu Gly Ser Pro Ser Gln Thr Asn Ser
385                 390                 395                 400
Val Ile Thr Thr Cys Ile Ser Glu Thr Leu Asn Ser Ser Trp Arg Phe
                405                 410                 415
Glu
<210>408
<211>429
<212>PRT
<213>智人
<400>408
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
 1               5                  10                  15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
            20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
        35                  40                  45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
    50                  55                  60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
                85                  90                  95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
            100                 105                 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
        115                 120                 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
    130                 135                 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
                165                 170                 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
            180                 185                 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
        195                 200                 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
    210                 215                 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser
                245                 250                 255
Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His
            260                 265                 270
Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly
        275                 280                 285
Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg
    290                 295                 300
Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu
305                 310                 315                 320
Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr
                325                 330                 335
Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln
            340                 345                 350
Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys
        355                 360                 365
Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His
    370                 375                 380
Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser
385                 390                 395                 400
Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn
                405                 410                 415
Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
            420                 425
<210>409
<211>495
<212>PRT
<213>智人
<400>409
Met Ala Ala Pro Gly Ala Arg Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala
 1               5                  10                  15
Gly Leu Ala His Gly Ala Ser Ala Leu Phe Glu Asp Leu Met Gly Ser
            20                  25                  30
Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly
        35                  40                  45
Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala
    50                  55                  60
Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
                85                  90                  95
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
            100                 105                 110
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
        115                 120                 125
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
    130                 135                 140
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
145                 150                 155                 160
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
                165                 170                 175
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
            180                 185                 190
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
        195                 200                 205
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
    210                 215                 220
Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln
225                 230                 235                 240
Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
                245                 250                 255
Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala
            260                 265                 270
Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
        275                 280                 285
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
    290                 295                 300
Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
305                 310                 315                 320
Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala
                325                 330                 335
Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
            340                 345                 350
His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys
        355                 360                 365
Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
    370                 375                 380
Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg
385                 390                 395                 400
Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr
                405                 410                 415
Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe
            420                 425                 430
Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn
        435                 440                 445
Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu Leu Asn Asn Met Leu Ile Pro Ile
    450                 455                 460
Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile Val Leu Ile Ala
465                 470                 475                 480
Tyr Leu Ile Gly Arg Lys Arg Ser His Ala Gly Tyr Gln Thr Ile
                485                 490                 495
<210>410
<211>504
<212>PRT
<213>智人
<400>410
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
 1               5                  10                  15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
            20                  25                  30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
        35                  40                  45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
    50                  55                  60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Ala Met Gly Ser Asp
65                  70                  75                  80
Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly
                85                  90                  95
Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro
            100                 105                 110
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly
        115                 120                 125
Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
    130                 135                 140
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
145                 150                 155                 160
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
                165                 170                 175
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
            180                 185                 190
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
        195                 200                 205
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
    210                 215                 220
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
225                 230                 235                 240
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
                245                 250                 255
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
            260                 265                 270
Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln
        275                 280                 285
Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
    290                 295                 300
Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala
305                 310                 315                 320
Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
                325                 330                 335
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
            340                 345                 350
Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
        355                 360                 365
Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala
    370                 375                 380
Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
385                 390                 395                 400
His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys
                405                 410                 415
Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
            420                 425                 430
Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg
        435                 440                 445
Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr
    450                 455                 460
Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe
465                 470                 475                 480
Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn
                485                 490                 495
Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
            500
<210>411
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>411
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser
 1               5                  10
<210>412
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>412
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala
 1               5                  10                  15
<210>413
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>413
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu
 1               5                  10                  15
<210>414
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>414
Ile Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>415
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>415
Leu Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>416
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>416
Phe Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>417
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>417
Lys Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>418
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>418
Met Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>419
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>419
Tyr Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>420
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>420
Val Met Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>421
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>421
Val Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>422
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>422
Val Leu Asp Lys Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>423
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>423
Val Leu Asp Phe Ala Val Pro Gly Ala
 1               5
<210>424
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>424
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Lys Ala
 1               5
<210>425
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>425
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Val
 1               5
<210>426
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>426
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Leu
 1               5
<210>427
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>427
Phe Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>428
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>428
Lys Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>429
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>429
Tyr Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>430
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>430
Phe Leu Asp Lys Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>431
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>431
Lys Leu Asp Lys Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>432
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>432
Tyr Leu Asp Lys Ala Pro Pro Gly Ala
 1               5
<210>433
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>433
Phe Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Val
 1               5
<210>434
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>434
Lys Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Val
 1               5
<210>435
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>435
Tyr Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Val
 1               5
<210>436
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>436
Phe Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Leu
 1               5
<210>437
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>437
Lys Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Leu
 1               5
<210>438
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>438
Tyr Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Leu
 1               5
<210>439
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>439
Phe Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Val
 1               5
<210>440
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>440
Lys Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Val
 1               5
<210>441
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>441
Tyr Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Val
 1               5
<210>442
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>442
Phe Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Leu
 1               5
<210>443
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>443
Lys Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Leu
 1               5
<210>444
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>444
Tyr Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Leu
 1               5
<210>445
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>445
Val Leu Asp Phe Ala Gly Pro Gly Ala
 1               5
<210>446
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>446
Val Leu Asp Phe Ala Thr Pro Gly Ala
 1               5
<210>447
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>447
Val Leu Asp Phe Ala Thr Pro Gly Val
 1               5
<210>448
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>448
Val Leu Asp Phe Ala Thr Pro Gly Leu
 1               5
<210>449
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>449
Val Leu Asp Phe Ala Thr Pro Gly Ser
 1               5
<210>450
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>450
Val Leu Asp Phe Ala Thr Pro Gly Ala
 1               5
<210>451
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>451
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
 1               5
<210>452
<211>969
<212>DNA
<213>智人
<400>452
atgaacaaca acgacctgtt ccaggcttct cgtcgtcgtt tcctggctca gctgggtggt     60
ctgaccgttg ctggtatgct gggtccgtct ctgctgaccc cgcgtcgtgc taccgctgct     120
cacggctccg acgttcggga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt     180
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc     240
gcaccgccgg gtgcatccgc atacggttcc ctgggtggtc cggcaccgcc gccggcaccg     300
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt     360
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc     420
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg     480
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc     540
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac     600
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat     660
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat     720
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc     780
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag     840
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca     900
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt     960
cagtgatga                                                             969
<210>453
<211>1410
<212>DNA
<213>智人
<400>453
atgaacaaca acgacctgtt ccaggcttct cgtcgtcgtt tcctggctca gctgggtggt     60
ctgaccgttg ctggtatgct gggtccgtct ctgctgaccc cgcgtcgtgc taccgctgct     120
cacggctccg acgtgcggga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt     180
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc     240
gcaccgccgg gtgcatccgc atacggttcc ctgggtggtc cggcaccgcc gccggcaccg     300
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt     360
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc     420
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg     480
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc     540
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac     600
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat     660
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat     720
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc     780
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag     840
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca     900
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt     960
caggatgtgc gacgtgtgcc tggagtagcc ccgactcttg tacggtcggc atctgagacc     1020
agtgagaaac gccccttcat gtgtgcttac ccaggctgca ataagagata ttttaagctg     1080
tcccacttac agatgcacag caggaagcac actggtgaga aaccatacca gtgtgacttc     1140
aaggactgtg aacgaaggtt ttttcgttca gaccagctca aaagacacca aaggagacat     1200
acaggtgtga aaccattcca gtgtaaaact tgtcagcgaa agttctcccg gtccgaccac     1260
ctgaagaccc acaccaggac tcatacaggt gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt     1320
tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga     1380
aacatgacca aactccagct ggcgctttga                                      1410
<210>454
<211>469
<212>PRT
<213>智人
<400>454
Met Asn Asn Asn Asp Leu Pne Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
                  5                  10                  15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
             20                  25                  30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
         35                  40                  45
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
     50                  55                  60
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
 65                  70                  75                  80
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
                 85                  90                  95
Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile
            100                 105                 110
Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys
        115                 120                 125
Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala
145                 150                 155                 160
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
                165                 170                 175
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val
            180                 185                 190
Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
        195                 200                 205
Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln
    210                 215                 220
Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
225                 230                 235                 240
Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu
                245                 250                 255
Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln
            260                 265                 270
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys
        275                 280                 285
Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu
    290                 295                 300
Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
305                 310                 315                 320
Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
                325                 330                 335
Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly
            340                 345                 350
Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
        355                 360                 365
Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu
    370                 375                 380
Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His
385                 390                 395                 400
Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser
                405                 410                 415
Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys
            420                 425                 430
Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser
        435                 440                 445
Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys
    450                 455                 460
Leu Gln Leu Ala Leu
465
<210>455
<211>321
<212>PRT
<213>智人
<400>455
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
                  5                  10                  15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
             20                  25                  30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
         35                  40                  45
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
     50                  55                  60
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
 65                  70                  75                  80
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
                 85                  90                  95
Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile
            100                 105                 110
Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys
        115                 120                 125
Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala
145                 150                 155                 160
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
                165                 170                 175
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val
            180                 185                 190
Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
        195                 200                 205
Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln
    210                 215                 220
Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
225                 230                 235                 240
Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu
                245                 250                 255
Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln
            260                 265                 270
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys
        275                 280                 285
Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu
    290                 295                 300
Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
305                 310                 315                 320
Gln
<210>456
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>456
ggctccgacg tgcgggacct gaac                                         24
<210>457
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>457
cgcgtgaatt catcactgaa tgcctctgaa g                                 31
<210>458
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>458
ggctccgacg tgcgggacct g                                            21
<210>459
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>459
gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt                                    30
<210>460
<211>843
<212>DNA
<213>智人
<400>460
ggctccgacg ttcgggacct gaacgcactg ctgccggcag ttccgtccct gggtggtggt     60
ggtggttgcg cactgccggt tagcggtgca gcacagtggg ctccggttct ggacttcgca     120
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tccggccagg ccaggatgtt tcctaacgcg ccctacctgc ccagctgcct cgagagccag     420
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agcagtgaca atttatacca aatgacatcc cagcttgaat gcatgacctg gaatcagatg     720
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tga                                                                   843
<210>461
<211>280
<212>PRT
<213>智人
<400>461
Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser
 1               5                  10                  15
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln
            20                  25                  30
Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly
        35                  40                  45
Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro
    50                  55                  60
Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala
65                  70                  75                  80
Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser
                85                  90                  95
Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly
            100                 105                 110
Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro
        115                 120                 125
Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg
    130                 135                 140
Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly
145                 150                 155                 160
His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys
                165                 170                 175
His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr
            180                 185                 190
Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys
        195                 200                 205
Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn
    210                 215                 220
Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met
225                 230                 235                 240
Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp
                245                 250                 255
Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr
            260                 265                 270
His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
        275                 280
<210>462
<211>876
<212>DNA
<213>智人
<400>462
atgggctccg acgtgcggga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt    60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc    120
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tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag    720
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca    780
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt    840
cagcatcatc accatcatca tcaccatcac cattag                              876
<210>463
<211>846
<212>DNA
<213>智人
<400>463
atgggctccg acgtgcggga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt    60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc    120
gcaccgccgg gtgcatccgc atacggttcc ctgggtggtc cggcaccgcc gccggcaccg    180
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt    240
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc    300
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg    360
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc    420
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac    480
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat    540
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat    600
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc    660
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag    720
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca    780
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt    840
cagtag                                                               846
<210>464
<211>291
<212>PRT
<213>智人
<400>464
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
                  5                  10                  15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
             20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
         35                  40                  45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
     50                  55                  60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
 65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
                 85                  90                  95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
            100                 105                 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
        115                 120                 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
    130                 135                 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
                165                 170                 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
            180                 185                 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
        195                 200                 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
    210                 215                 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser
                245                 250                 255
Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His
            260                 265                 270
Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln His His His His His His His
        275                 280                 285
His His His
    290
<210>465
<211>281
<212>PRT
<213>智人
<400>465
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
                  5                  10                  15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
             20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
         35                  40                  45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
     50                  55                  60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
 65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
                 85                  90                  95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
            100                 105                 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
        115                 120                 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
    130                 135                 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
                165                 170                 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
            180                 185                 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
        195                 200                 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
    210                 215                 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225                 230                 235                 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser
                245                 250                 255
Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His
            260                 265                 270
Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
        275                 280
<210>466
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>466
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<210>467
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>467
cggctctaga ctactgaatg cctctgaaga caccgtg                               37
<210>468
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>468
cggctctaga ctaatggtga tggtgatgat gatggtgatg atgctgaatg cctctgaaga      60
caccgtg                                                                67
<210>469
<211>882
<212>DNA
<213>智人
<400>469
atgaacaata acgatctgtt tcaggcgagc cgccacggct ccgacgttcg ggacctgaac      60
gcactgctgc cggcagttcc gtccctgggt ggtggtggtg gttgcgcact gccggttagc     120
ggtgcagcac agtgggctcc ggttctggac ttcgcaccgc cgggtgcatc cgcatacggt     180
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agcgcattca ccgttcactt ctccggccag ttcactggca cagccggagc ctgtcgctac     360
gggcccttcg gtcctcctcc gcccagccag gcgtcatccg gccaggccag gatgtttcct     420
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gagcagcagt actcggtgcc gcccccggtc tatggctgcc acacccccac cgacagctgc     660
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cacagcacag ggtacgagag cgataaccac acaacgccca tcctctgcgg agcccaatac     840
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<210>470
<211>292
<212>PRT
<213>智人
<400>470
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg His Gly Ser Asp Val
                  5                  10                  15
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
             20                  25                  30
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
         35                  40                  45
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
     50                  55                  60
Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
 65                  70                  75                  80
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
                 85                  90                  95
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
        115                 120                 125
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
    130                 135                 140
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
                165                 170                 175
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
            180                 185                 190
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
        195                 200                 205
Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln
    210                 215                 220
Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
225                 230                 235                 240
Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala
                245                 250                 255
Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
            260                 265                 270
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
        275                 280                 285
Arg Gly Ile Gln
    290
<210>471
<211>5315
<212>DNA
<213>大肠杆菌(E.Coli)
<400>471
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg     60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc     120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg     180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc     240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt     300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc     360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta     420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt     480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta     540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat     600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa     660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc     720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga     780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc     840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac     900
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cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg     2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta     2160
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atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg     3840
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gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct     4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg     4200
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tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc     4320
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tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg     4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct     4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga     4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg     4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc     4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg     4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg     4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga     4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa     5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgaacaat aacgatctgt ttcaggcgag     5100
ccgccacgtg aatgaccaag aattctgcag atatccatca cactggcggc cgctcgagca     5160
ccaccaccac caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc     5220
tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag     5280
gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggat                                5315
<210>472
<211>828
<212>DNA
<213>智人
<400>472
atgcagcatc accaccatca ccacggttcg gatgtacgcg atctgaacgc gcttcttccg     60
gcggtcccaa gcttgggcgg gggaggtgga tgcgccctgc ccgtgagcgg cgccgcgcaa     120
tgggccccgg tccttgattt tgctccgccg ggtgcgagcg catacggctc tctgggcggg     180
ccccattcat tcatcaaaca ggagcccagc tggggtggcg ccgaacctca tgaagaacaa     240
tgtctgtctg cttttaccgt acatttttca ggccagttta ccggaactgc cggtgcatgt     300
cgctatggcc cattcggtcc gccgccaccg tcacaagcct cttcgggaca agcccgcatg     360
tttccgaatg caccctacct gccgtcttgt ctggaaagcc aacccgcgat ccgtaaccaa     420
ggctacagca ccgtcacgtt tgatggtacc ccgagctatg gtcatacgcc gagtcatcat     480
gcagcacagt tcccgaacca ctcgttcaaa cacgaagatc ctatgggcca gcagggtagt     540
ctgggcgaac aacagtatag cgtcccacca ccagtttatg gttgccatac cccaacggat     600
tcctgtactg gtagccaagc gctcctgctc cgcaccccct attcttctga taatctctat     660
cagatgacca gccaactgga atgtatgacg tggaaccaaa tgaacctggg cgcaaccctg     720
aaaggccaca gtaccggcta tgagtcagat aaccacacaa cacccatttt gtgcggcgct     780
caatatcgta ttcataccca tggcgttttt cacagtattc aatgatga                  828
<210>473
<211>811
<212>DNA
<213>智人
<400>473
atgggttcgg atgtacgcga tctgaacgcg cttcttccgg cggtcccaag cttgggcggg     60
ggaggtggat gcgccctgcc cgtgagcggc gccgcgcaat gggccccggt ccttgatttt     120
gctccgccgg gtgcgagcgc atacggctct ctgggcgggc cccattcatt catcaaacag     180
gagcccagct ggggtggcgc cgaacctcat gaagaacaat gtctgtctgc ttttaccgta     240
catttttcag gccagtttac cggaactgcc ggtgcatgtc gctatggccc attcggtccg     300
ccgccaccgt cacaagcctc ttcgggacaa gcccgcatgt ttccgaatgc accctacctg     360
ccgtcttgtc tggaaagcca acccgcgatc cgtaaccaag gctacagcac cgtcacgttt     420
gatggtaccc cgagctatgg tcatacgccg agtcatcatg cagcacagtt cccgaaccac     480
tcgttcaaac acgaagatcc tatgggccag cagggtagtc tgggcgaaca acagtatagc     540
gtcccaccac cagtttatgg ttgccatacc ccaacggatt cctgtactgg tagccaagcg     600
ctcctgctcc gcacccccta ttcttctgat aatctctatc agatgaccag ccaactggaa     660
tgtatgacgt ggaaccaaat gaacctgggc gcaaccctga aaggccacag taccggctat     720
gagtcagata accacacaac acccattttg tgcggcgctc aatatcgtat tcatacccat     780
ggcgtttttc gcggtattca gtgatgaatt c                                    811
<210>474
<211>844
<212>DNA
<213>智人
<400>474
atgaacaata acgatctgtt tcaggcgagc cgccacggtt cggatgtacg cgatctgaac     60
gcgcttcttc cggcggtccc aagcttgggc gggggaggtg gatgcgccct gcccgtgagc     120
ggcgccgcgc aatgggcccc ggtccttgat tttgctccgc cgggtgcgag cgcatacggc     180
tctctgggcg ggccccattc attcatcaaa caggagccca gctggggtgg cgccgaacct     240
catgaagaac aatgtctgtc tgcttttacc gtacattttt caggccagtt taccggaact     300
gccggtgcat gtcgctatgg cccattcggt ccgccgccac cgtcacaagc ctcttcggga     360
caagcccgca tgtttccgaa tgcaccctac ctgccgtctt gtctggaaag ccaacccgcg     420
atccgtaacc aaggctacag caccgtcacg tttgatggta ccccgagcta tggtcatacg     480
ccgagtcatc atgcagcaca gttcccgaac cactcgttca aacacgaaga tcctatgggc     540
cagcagggta gtctgggcga acaacagtat agcgtcccac caccagttta tggttgccat     600
accccaacgg attcctgtac tggtagccaa gcgctcctgc tccgcacccc ctattcttct     660
gataatctct atcagatgac cagccaactg gaatgtatga cgtggaacca aatgaacctg     720
ggcgcaaccc tgaaaggcca cagtaccggc tatgagtcag ataaccacac aacacccatt     780
ttgtgcggcg ctcaatatcg tattcatacc catggcgttt ttcgcggtat tcagtgatga     840
attc                                                                  844
<210>475
<211>927
<212>DNA
<213>智人
<400>475
atgaacaata acgatctctt ccaagcttcc cgtcgtcgtt tcctggcgca gctcggcggc     60
cttaccgtgg ccggtatgct gggtccgtcg cttttaacac cgcgccgcgc aaccgccgct     120
catggttcgg atgtacgcga tctgaacgcg cttcttccgg cggtcccaag cttgggcggg     180
ggaggtggat gcgccctgcc cgtgagcggc gccgcgcaat gggccccggt ccttgatttt     240
gctccgccgg gtgcgagcgc atacggctct ctgggcgggc cccattcatt catcaaacag     300
gagcccagct ggggtggcgc cgaacctcat gaagaacaat gtctgtctgc ttttaccgta     360
catttttcag gccagtttac cggaactgcc ggtgcatgtc gctatggccc attcggtccg     420
ccgccaccgt cacaagcctc ttcgggacaa gcccgcatgt ttccgaatgc accctacctg     480
ccgtcttgtc tggaaagcca acccgcgatc cgtaaccaag gctacagcac cgtcacgttt     540
gatggtaccc cgagctatgg tcatacgccg agtcatcatg cagcacagtt cccgaaccac     600
tcgttcaaac acgaagatcc tatgggccag cagggtagtc tgggcgaaca acagtatagc     660
gtcccaccac cagtttatgg ttgccatacc ccaacggatt cctgtactgg tagccaagcg     720
ctcctgctcc gcacccccta ttcttctgat aatctctatc agatgaccag ccaactggaa     780
tgtatgacgt ggaaccaaat gaacctgggc gcaaccctga aaggccacag taccggctat     840
gagtcagata accacacaac acccattttg tgcggcgctc aatatcgtat tcatacccat     900
ggcgtttttc gcggtattca gtgatga                                         927
<210>476
<211>936
<212>DNA
<213>智人
<400>476
atgaacaata acgatctctt ccaagcttcc cgtcgtcgtt tcctggcgca gctcggcggc     60
cttaccgtgg ccggtatgct gggtccgtcg cttttaacac cgcgccgcgc aaccgccgct     120
catggttcgg atgtacgcga tctgaacgcg cttcttccgg cggtcccaag cttgggcggg     180
ggaggtggat gcgccctgcc cgtgagcggc gccgcgcaat gggccccggt ccttgatttt     240
gctccgccgg gtgcgagcgc atacggctct ctgggcgggc ccgggcaaat tcattcattc     300
atcaaacagg agcccagctg gggtggcgcc gaacctcatg aagaacaatg tctgtctgct     360
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caactggaat gtatgacgtg gaaccaaatg aacctgggcg caaccctgaa aggccacagt     840
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catacccatg gcgtttttcg cggtattcag tgatga                               936
<210>477
<211>969
<212>DNA
<213>智人
<400>477
atgaacaata acgatctctt ccaagcttcc cgtcgtcgtt tcctggcgca gctcggcggc     60
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ggaggtggat gcgccctgcc cgtgagcggc gccgcgcaat gggccccggt ccttgatttt     240
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cctccaccgc caccgccgcc gccgcattca ttcatcaaac aggagcccag ctggggtggc     360
gccgaacctc atgaagaaca atgtctgtct gcttttaccg tacatttttc aggccagttt     420
accggaactg ccggtgcatg tcgctatggc ccattcggtc cgccgccacc gtcacaagcc     480
tcttcgggac aagcccgcat gtttccgaat gcaccctacc tgccgtcttg tctggaaagc     540
caacccgcga tccgtaacca aggctacagc accgtcacgt ttgatggtac cccgagctat     600
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cctatgggcc agcagggtag tctgggcgaa caacagtata gcgtcccacc accagtttat     720
ggttgccata ccccaacgga ttcctgtact ggtagccaag cgctcctgct ccgcaccccc     780
tattcttctg ataatctcta tcagatgacc agccaactgg aatgtatgac gtggaaccaa     840
atgaacctgg gcgcaaccct gaaaggccac agtaccggct atgagtcaga taaccacaca     900
acacccattt tgtgcggcgc tcaatatcgt attcataccc atggcgtttt tcgcggtatt     960
cagtgatga                                                             969
<210>478
<211>267
<212>PRT
<213>智人
<400>478
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
                  5                  10                  15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
             20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
         35                  40                  45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp
     50                  55                  60
Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val
 65                  70                  75                  80
His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly
                 85                  90                  95
Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg
            100                 105                 110
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro
        115                 120                 125
Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro
    130                 135                 140
Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His
145                 150                 155                 160
Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu
                165                 170                 175
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr
            180                 185                 190
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser
        195                 200                 205
Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp
    210                 215                 220
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr
225                 230                 235                 240
Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg
                245                 250                 255
Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
            260                     265
<210>479
<211>321
<212>PRT
<213>智人
<400>479
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
                  5                  10                  15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
             20                  25                  30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
         35                  40                  45
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
     50                  55                  60
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
 65                  70                  75                  80
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
                 85                  90                  95
Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile
            100                 105                 110
Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys
        115                 120                 125
Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala
    130                 135                 140
Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala
145                 150                 155                 160
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
                165                 170                 175
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val
            180                 185                 190
Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
        195                 200                 205
Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln
    210                 215                 220
Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
225                 230                 235                 240
Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu
                245                 250                 255
Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln
            260                 265                 270
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys
        275                 280                 285
Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu
    290                 295                 300
Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
305                 310                 315                 320
Gln
<210>480
<211>274
<212>PRT
<213>智人
<400>480
Met Gln His His His His His His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn
                  5                  10                  15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala
             20                  25                  30
Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala
         35                  40                  45
Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro His Ser Phe
     50                  55                  60
Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln
 65                  70                  75                  80
Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr
                 85                  90                  95
Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln
            100                 105                 110
Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro
        115                 120                 125
Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr
    130                 135                 140
Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His
145                 150                 155                 160
Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly
                165                 170                 175
Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val
            180                 185                 190
Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu
        195                 200                 205
Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser
    210                 215                 220
Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu
225                 230                 235                 240
Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile
                245                 250                 255
Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly
            260                 265                 270
Ile Gln
<210>481
<211>310
<212>PRT
<213>智人
<400>481
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
                  5                  10                  15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
             20                  25                  30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
         35                  40                  45
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
     50                  55                  60
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
 65                  70                  75                  80
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Gly Gln
                 85                  90                  95
Ile His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro
            100                 105                 110
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln
        115                 120                 125
Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
    130                 135                 140
Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
145                 150                 155                 160
Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln
                165                 170                 175
Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr
            180                 185                 190
Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu
        195                 200                 205
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
    210                 215                 220
Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly
225                 230                 235                 240
Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
                245                 250                 255
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
            260                 265                 270
Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His
        275                 280                 285
Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly
    290                 295                 300
Val Phe Arg Gly Ile Gln
305                 310
<210>482
<211>307
<212>PRT
<213>智人
<400>482
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
                  5                  10                  15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
             20                  25                  30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
         35                  40                  45
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
     50                  55                  60
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
 65                  70                  75                  80
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro His Ser
                 85                  90                  95
Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu
            100                 105                 110
Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser
    130                 135                 140
Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser
                165                 170                 175
Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His
            180                 185                 190
His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met
        195                 200                 205
Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro
    210                 215                 220
Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala
225                 230                 235                 240
Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr
                245                 250                 255
Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr
            260                 265                 270
Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro
        275                 280                 285
Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg
    290                 295                 300
Gly Ile Gln
305
<210>483
<211>278
<212>PRT
<213>智人
<400>483
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg His Gly Ser Asp Val
                  5                  10                  15
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
             20                  25                  30
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
         35                  40                  45
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
     50                  55                  60
Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro
 65                  70                  75                  80
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln
                 85                  90                  95
Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
            100                 105                 110
Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
        115                 120                 125
Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln
    130                 135                 140
Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu
                165                 170                 175
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
            180                 185                 190
Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly
        195                 200                 205
Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
    210                 215                 220
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
225                 230                 235                 240
Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His
                245                 250                 255
Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly
            260                 265                 270
Val Phe Arg Gly Ile Gln
        275
<210>484
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>484
ggctccgacg ttcgggacct gaacgcactg                                       30
<210>485
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>485
ctgcagaatt catcactgaa tgcctctgaa g                                    31
<210>486
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建TAT“粗短”载体的寡核苷酸
<400>486
tatgaacaat aacgatctgt ttcaggc                                         27
<210>487
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建TAT“粗短”载体的寡核苷酸
<400>487
ctgaaacaga tcgttattgt tca                                             23
<210>488
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建TAT“粗短”载体的寡核苷酸
<400>488
aattcttggt cattcacgtg gcggctcgc                                       29
<210>489
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于构建TAT“粗短”载体的寡核苷酸
<400>489
gagccgccac gtgaatgacc aag                                             23
<210>490
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>490
caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc c                                     31
<210>491
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>491
cataaatttg cccgggcccg cccagagagc cg                                    32
<210>492
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>492
cattcattca tcaaacagga gcc                                              23
<210>493
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>493
ccattaagaa ttcatcactg aatacc                                           26
<210>494
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>494
ggttcggatg tacgcgatct gaacg                                            25
<210>495
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>495
caaagaattc atcactgaat accgcg                                           26
<210>496
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>496
gcttttggca tatgggttcg gatgtacgcg atc                                   33
<210>497
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>497
caaagaattc atcactgaat accgcg                                           26
<210>498
<211>882
<212>DNA
<213>智人
<400>498
atgaacaata acgatctgtt tcaggcgagc cgccacggtt cggatgtacg cgatctgaac      60
gcgcttcttc cggcggtccc aagcttgggc gggggaggtg gatgcgccct gcccgtgagc      120
ggcgccgcgc aatgggcccc ggtccttgat tttgctccgc cgggtgcgag cgcatacggc      180
tctctgggcg gtccggcacc tcctccagca ccgcctccac cgccaccgcc gccgccgcat      240
tcattcatca aacaggagcc cagctggggt ggcgccgaac ctcatgaaga acaatgtctg      300
tctgctttta ccgtacattt ttcaggccag tttaccggaa ctgccggtgc atgtcgctat      360
ggcccattcg gtccgccgcc accgtcacaa gcctcttcgg gacaagcccg catgtttccg      420
aatgcaccct acctgccgtc ttgtctggaa agccaacccg cgatccgtaa ccaaggctac      480
agcaccgtca cgtttgatgg taccccgagc tatggtcata cgccgagtca tcatgcagca      540
cagttcccga accactcgtt caaacacgaa gatcctatgg gccagcaggg tagtctgggc      600
gaacaacagt atagcgtccc accaccagtt tatggttgcc ataccccaac ggattcctgt      660
actggtagcc aagcgctcct gctccgcacc ccctattctt ctgataatct ctatcagatg      720
accagccaac tggaatgtat gacgtggaac caaatgaacc tgggcgcaac cctgaaaggc      780
cacagtaccg gctatgagtc agataaccac acaacaccca ttttgtgcgg cgctcaatat      840
cgtattcata cccatggcgt ttttcgcggt attcagtgat ga                         882
<210>499
<211>292
<212>PRT
<213>智人
<400>499
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg His Gly Ser Asp Val
                  5                  10                  15
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
             20                  25                  30
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
         35                  40                  45
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
     50                  55                  60
Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
 65                  70                  75                  80
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
                 85                  90                  95
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
        115                 120                 125
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
    130                 135                 140
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
                165                 170                 175
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
            180                 185                 190
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
        195                 200                 205
Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln
    210                 215                 220
Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
225                 230                 235                 240
Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala
                245                 250                 255
Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
            260                 265                 270
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
        275                 280                 285
Arg Gly Ile Gln
    290
<210>500
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>500
ggttcggatg tacgcgatct gaacg                                            25
<210>501
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>501
caaagaattc atcactgaat accgcg                                           26
<210>502
<211>270
<212>PRT
<213>智人
<400>502
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
 1               5                  10                  15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
            20                  25                  30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
        35                  40                  45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Gly Gln Ile His Ser Phe Ile Lys Gln Glu
    50                  55                  60
Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala
65                  70                  75                  80
Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys
                85                  90                  95
Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
        115                 120                 125
Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp
    130                 135                 140
Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe
145                 150                 155                 160
Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser
                165                 170                 175
Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His
            180                 185                 190
Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr
        195                 200                 205
Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys
    210                 215                 220
Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser
225                 230                 235                 240
Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala
                245                 250                 255
Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
            260                 265                 270
<210>503
<211>5400
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>503
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg       60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc      120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg      180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc      240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt      300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc      360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta      420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt      480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta      540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat      600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa      660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc      720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga      780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc      840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac      900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac      960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat     1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag     1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca     1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac     1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg     1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca     1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac     1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa     1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga     1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg     1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc     1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag     1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc     1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg     1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac     1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga     1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt     1980
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<210>504
<211>39
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<220>
<221>VARIANT
<222>31，32，33，34，35，36，37，38，39
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>504
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
 1               5                  10                  15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35
<210>505
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<212>DNA
<213>智人
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<212>PRT
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Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg His
 1               5                  10
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<211>31880
<212>DNA
<213>智人
<400>507
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tgcaaggtgc tgctcaaaaa atcaggcaaa gcctcgcgca aaaaagaaag cacatcgtag     30960
tcatgctcat gcagataaag gcaggtaagc tccggaacca ccacagaaaa agacaccatt     31020
tttctctcaa acatgtctgc gggtttctgc ataaacacaa aataaaataa caaaaaaaca     31080
tttaaacatt agaagcctgt cttacaacag gaaaaacaac ccttataagc ataagacgga     31140
ctacggccat gccggcgtga ccgtaaaaaa actggtcacc gtgattaaaa agcaccaccg     31200
acagctcctc ggtcatgtcc ggagtcataa tgtaagactc ggtaaacaca tcaggttgat     31260
tcacatcggt cagtgctaaa aagcgaccga aatagcccgg gggaatacat acccgcaggc     31320
gtagagacaa cattacagcc cccataggag gtataacaaa attaatagga gagaaaaaca     31380
cataaacacc tgaaaaaccc tcctgcctag gcaaaatagc accctcccgc tccagaacaa     31440
catacagcgc ttccacagcg gcagccataa cagtcagcct taccagtaaa aaagaaaacc     31500
tattaaaaaa acaccactcg acacggcacc agctcaatca gtcacagtgt aaaaaagggc     31560
caagtgcaga gcgagtatat ataggactaa aaaatgacgt aacggttaaa gtccacaaaa     31620
aacacccaga aaaccgcacg cgaacctacg cccagaaacg aaagccaaaa aacccacaac     31680
ttcctcaaat cgtcacttcc gttttcccac gttacgtcac ttcccatttt aagaaaacta     31740
caattcccaa cacatacaag ttactccgcc ctaaaaccta cgtcacccgc cccgttccca     31800
cgccccgcgc cacgtcacaa actccacccc ctcattatca tattggcttc aatccaaaat     31860
aaggtatatt attgatgatg                                                 31880
<210>508
<211>846
<212>DNA
<213>智人
<400>508
atgggctccg acgttcggga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt     60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc     120
gcaccgccgg gtgcatccgc atacggttcc ctgggtggtc cggcaccgcc gccggcaccg     180
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt     240
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc     300
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg     360
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc     420
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac     480
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat     540
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat     600
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc     660
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag     720
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca     780
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt     840
cagtga                                                                846

Claims (6)

1、一种用于增强或诱导患者中免疫应答的方法，该方法包括向患者给予组合物，该组合物包含：
(a)WT1多肽，其包含SEQ ID NO：461中所示截短的WT1-F多肽；和
(b)选自Enhanzyn、RC-529-SE及RC-529-AF与QuilA的组合的佐剂；
并由此增强或诱导患者中对WT1或表达WT1的细胞特异性的免疫应答。
2、如权利要求1所述的方法，其中该佐剂包含Enhanzyn。
3、如权利要求1所述的方法，其中该佐剂包含RC-529-SE。
4、如权利要求1所述的方法，其中该佐剂包含RC-529-AF和QuilA的组合。
5、一种用于刺激和/或扩增对WT1特异性的T细胞的方法，该方法包括在足以允许T细胞刺激和/或扩增的条件下和时间内用组合物接触T细胞，该组合物包含：
(a)WT1多肽，其包含SEQ ID NO：461中所示截短的WT1-F多肽；和
(b)选自Enhanzyn、RC-529-SE及RC-529-AF与QuilA的组合的佐剂。
6、一种用于治疗患者中与WT1相关的恶性肿瘤的方法，该方法包括向患者给予组合物，该组合物包含：
(a)WT1多肽，其包含SEQ ID NO：461中所示截短的WT1-F多肽；和
(b)选自Enhanzyn、RC-529-SE及RC-529-AF与QuilA的组合的佐剂；
并由此治疗患者中与WT1相关的恶性肿瘤。
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C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication