KR100752065B1 - Ｗｔ1 특이적 면역요법용 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 백혈병 및 암과 같은 악성 질환의 치료용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 WT1 폴리뉴클레오타이드, WT1 폴리펩타이드, WT1 폴리펩타이드를 제공하는 항원-제시 세포, WT1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 WT1 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포를 하나 이상 포함한다. 상기와 같은 조성물은 예를 들면, 전이성 질환의 예방 및 치료용으로 사용될 수 있다.
윌름 종양 유전자, WT1, 백혈병, 암, 항원 제시 세포, 항혈청, T 세포, 애주번트
Description
본 발명은 일반적으로 백혈병 및 암과 같은 악성 질환의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 상세하게 WT1에 대한 면역 반응을 발생 또는 향상시키기 위한 조성물, 및 악성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 상기와 같은 조성물의 용도에 관한 것이다.
암 및 백혈병은 미국 및 전세계적으로 심각한 건강 문제이다. 상기와 같은 질병의 검출 및 치료에 있어서 발전이 있었지만, 암 및 백혈병의 예방 또는 치료에 있어서 백신 또는 다른 범용적으로 성공적인 방법은 현재까지 없다. 현재는 상기 질병의 관리가 조기 진단 및 적극적 치료의 병용에 의존하고 있으며, 치료 방법은 외과시술, 방사선요법, 화학요법 및 호르몬 요법와 같은 여러가지 치료 방법 중 하나 이상을 포함한다. 특정 암에 대한 치료 과정은 통상적으로 특이적 종양 마커의 분석을 포함한, 진단적 인자의 다양성에 따라 선택된다. 그러나, 확립된 마커를 사용하면 통상적으로 해석이 어려우며, 수 많은 암 환자에 있어서의 높은 사망율이 계속 관찰된다.
면역요법은 암과 백혈병의 치료와 생존율을 실질적으로 개선시키는 가능성이 있다. 최근의 데이타는 백혈병이 골수 이식(예, 공여자 임파구 주입)의 경우 면역요법에 의해 치료될 수 있는 것으로 입증되었다. 상기와 같은 요법은 종양-관련 항원(TAA)에 대한 면역 반응의 발생 또는 향상을 포함할 수 있다. 그러나, 지금까지, 상대적으로 적은 수의 TAA가 공지되어 있으며 상기와 같은 항원에 대한 면역 반응의 발생은 드물게 예외가 있으나, 치료적으로 유익한 것으로 나타나지 않았다.
따라서, 당해 분야에는 백혈병 및 암의 예방 및 치료를 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 있다. 본 발명은 이러한 필요성에 따라 수행되었으며 기타 관련된 잇점을 제공한다.
간략해서, 본 발명은 백혈병 및 암과 같은 질병의 진단 및 치료용 조성물 및 방법을 제공한다. 하나의 양태로, 본 발명은 천연 WT1의 면역원성 부위를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력이 실질적으로 소멸되지 않도록 하는 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 중 하나 이상이 상이한 이의 변이체를 제공한다. 특정 양태로, 상기 폴리펩타이드는 천연 WT1 폴리펩타이드의 연속 아미노산 잔기 16개 이하를 포함한다. 다른 양태로, 상기 폴리펩타이드는 천연 WT1 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 1 내지 174번의 면역원성 부위 또는 이의 변이체를 포함하며, 이때 상기 폴리펩타이드는 천연 WT1 폴리펩타이드의 아미노산 175 내지 449번내에 존재하는 연속 아미노산 잔기를 16개 이하로 포함한다. 상기 면역원성 부위는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 특정 양태로, 상기 폴리펩타이드는 (a) 표 II 내지 XLVI중 하나 이상에 명기된 서열, (b) 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력이 실질적으로 소멸되지 않도록 하는 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 중 하나 이상이 상이한 전술한 서열의 변이체 및 (c) 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력이 실질적으로 소멸되지 않도록 하는, 전술한 폴리펩타이드의 모방체(mimetics)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다.
다른 양태로, 본 발명의 폴리펩타이드는 (a) ALLPAVPSL(서열 34), GATLKGVAA(서열 88), CMTWNQMNL(서열 49 및 258), SCLESQPTI(서열 199 및 296), SCLESQPAI(서열 198), NLYQMTSQL(서열 147 및 284), ALLPAVSSL(서열 35 및 255), RMFPNAPYL(서열 185 및 293), (b) 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력이 실질적으로 소멸되지 않도록 하는 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 중 하나 이상이 상이한 전술한 서열의 변이체 및 (c) 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력이 실질적으로 소멸되지 않도록 하는 전술한 폴리펩타이드의 모방체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다. 모방체는 아미노산 모방체 하나 이상과 함께 아미노산을 포함할 수 있거나 전부 비펩타이드 모방체일 수 있다.
추가의 양태로, 본 발명은 WT1 단백질의 면역원성 부위의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는데, 이때 상기 변이체는 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력이 천연 WT1 단백질에 비하여 향상되도록 하는 면역원성 부위내의 1 내지 3개의 아미노산 위치에서의 치환으로 인하여 면역원성 부위가 상이하다.
본 발명은 또한 상기한 바와 같은 WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 WT1 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 양태로, 본 발명은 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다. 약제학적 조성물은 상기한 바와 같은 폴리펩타이드 또는 모방체 및/또는 (i) WT1 폴리뉴클레오타이드; (ii) WT1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 이의 항체 또는 항원-결합 단편; (iii) WT1 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포 또는 (iv) WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포중 하나 이상을, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함할 수 있다. 백신은 상기한 바와 같은 폴리펩타이드 및/또는 (i) WT1 폴리뉴클레오타이드, (ii) WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포 또는 (iii) 항-개별특이형(idiotypic) 항체중 하나 이상, 및 비-특이적 면역 반응 증강제를 포함한다. 특정 양태로, 천연 WT1 폴리펩타이드의 연속 아미노산 잔기 23개 미만, 바람직하게는 17개 미만이 상기와 같은 약제학적 조성물 및 백신에 사용되는 WT1 폴리펩타이드내에 존재한다. 상기 면역 반응 증강제는 애주번트일 수 있다. 바람직하게는, 면역 반응 증강제가 T 세포 반응을 향상시킨다.
본 발명은 또한, 환자에게 상기한 바와 같은 약제학적 조성물 또는 백신을 투여함을 특징으로하는, 환자에서 면역 반응을 향상 또는 유발시키는 방법을 제공 한다. 특정 양태로, 환자는 사람이다.
본 발명은 또한 환자에게 전술한 바와 같은 약제학적 조성물 또는 백신을 투여함을 포함하여, 환자에서 악성 질환의 발달을 억제하는 방법을 제공한다. 악성 질환은 비제한적으로, 백혈병(예, 급성 골수성, 급성 임파구성 및 만성 골수성) 및 암(예, 유방암, 폐암, 갑상선암 또는 위장암, 또는 흑색종)이다. 환자는 악성 질환에 걸릴 수 있으며, 약제학적 조성물 또는 백신의 투여는 상기와 같은 질병의 발병을 억제할 수 있거나, 존재하는 질병의 진행 및/또는 전이를 억제할 수 있다.
본 발명은 또한, 다른 양태로, WT1 포지티브 세포가 골수, 말초 혈액 또는 분획물중 골수 또는 임파구 세포의 수의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만으로 제거되기에 충분한 조건 및 시간 하에 골수, 말초 혈액, 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물을 WT1 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포와 함께 접촉시킴을 포함하여, 골수 및/또는 말초 혈액 또는 이의 분획물로부터 WT1 발현 세포를 제거하는 방법을 제공한다. 골수, 말초 혈액 및 분획물은 WT1 발현과 관련있는 질병에 걸린 환자로부터 수득할 수 있거나, 상기와 같은 질병에 걸리지 않은 사람 또는 비-사람 포유동물로부터 수득할 수 있다.
관련 양태로, 본 발명은 상기한 바와 같이 제조된 골수, 말초 혈액, 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 악성 질병의 발달을 억제하는 방법을 제공한다. 상기와 같은 골수, 말초 혈액 또는 분획물은 자가(autologus)일 수 있거나, 관련있거나 관련없는 사람 또는 비-사람 동물로부터 유래된 것일 수 있다(예, 유전적 동계성 또는 동종이형성).
다른 양태로, 본 발명은 T 세포의 자극 및/또는 증대를 허용하는 충분한 조건 및 시간 하에서 T 세포를 WT1 폴리펩타이드와 접촉시킴을 포함하여, T 세포를 자극(또는 프라이밍)시키고/시키거나 증대시키는 방법을 제공한다. 상기와 같은 T 세포는 자가성, 동종이형성, 유전적 동계성 또는 비관련 WT1-특이적 T 세포일 수 있으며, 시험관내 또는 생체내에서 자극될 수 있다. 증대된 T 세포는 특정 양태로, 골수, 말초 혈액, 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물내에 존재할 수 있으며, (반드시 그럴 필요는 없으나) 클론성일 수 있다. 특정 양태로, T 세포는 자극 및/또는 증대중에 포유동물중에 존재할 수 있다. WT1-특이적 T 세포는 예를 들면, 공여체 임파구 주입물내에서 사용될 수 있다.
관련 양태로, 환자에게 상기한 바와 같이 제조된 T 세포를 투여함을 포함하여, 환자에서 악성 질환의 진행을 억제하는 방법이 제공된다. 상기와 같은 T 세포는 특정 양태로, 자가성, 유전적 동계성 또는 동종이형성일 수 있다.
본 발명은 또한, 다른 양태로, 환자에서 WT1 발현과 관련있는 악성 질환에 대한 면역화 또는 치료 효과를 모니터하는 방법을 제공한다. 상기와 같은 방법은 환자에서 항체, CD4+T 세포 및/또는 CD8+T 세포 반응을 모니터하는 것을 기본으로한다. 상기와 같은 양태로, 상기 방법은 (a) 치료 또는 면역화전에 환자로부터 수득한 제1의 생물학적 샘플을, (i) WT1 폴리펩타이드; (ii) WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (iii) WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포 중 하나 이상과, 면역 복합체가 형성되도록 하기에 충분한 조건 및 시간 동안 항온처리하는 단계; (b) WT1 폴리펩타이드와 WT1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 생물학적 샘플중의 항체 사이에 형성된 면역 복합체를 검출하는 단계; (c) 치료 또는 면역화 후 동일한 환자로부터 수득한 제2의 생물학적 샘플을 사용하여 상기 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2의 생물학적 샘플에서 검출된 면역 복합체의 수를 비교하고, 이로부터 환자에서 치료 또는 면역화의 효과를 모니터하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법의 특정 양태로, 검출 단계는 (a) 면역 복합체와 결합할 수 있는, 리포터 그룹을 포함하는 검출 시약과 면역 복합체를 항온처리하는 단계, (b) 미결합 검출 시약을 제거하는 단계, 및 (c) 리포터 그룹의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 검출 시약은 예를 들면, WT1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체에 결합할 수 있는 제2의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 단백질 A와 같은 분자일 수 있다. 다른 양태로, 리포터 그룹은 WT1 폴리펩타이드에 결합하며, 검출 단계는 미결합 WT1 폴리펩타이드를 제거하고, 이어서 리포터 그룹의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다.
추가의 양태로, 환자에서 WT1 발현과 관계있는 악성 질환에 대한 면역화 또는 치료의 효과를 모니터하는 방법은 (a) 치료 또는 면역화전에 환자로부터 수득한, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 제1의 생물학적 샘플을 T 세포의 특이적 활성화, 증식 및/또는 용해를 허용하기에 충분한 조건 및 시간하에서 (i) WT1 폴리펩타이드; (ii) WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (iii) WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포 중 하나 이상과 함께 항온처리하는 단계; (b) T 세포의 활성화, 증식 및/또는 용해 양을 검출하는 단계; (c) 치료 또는 면역화시킨 다음 동일한 환자로부터 수득한, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 제2의 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2의 생물학적 샘풀중 T 세포의 활성화, 증식 및/또는 용해 양을 비교하고, 이로부터 환자에서 치료 또는 면역화의 효과를 모니터하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 환자로부터 단리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 (i) WT1 폴리펩타이드; (ii) WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (iii) WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포 중 하나 이상과 함께 항온처리하는 단계; 및 (b) 증식된 T 세포의 유효량을 환자에게 투여하여, 이로부터 환자에서 악성 질환의 발달을 억제하는 단계를 포함하여, 환자에서 WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 발달을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 양태로, T 세포의 항온처리 단계를 1회 이상 반복할 수 있다.
다른 양태로, 본 발명은 (a) 환자로부터 단리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 (i) WT1 폴리펩타이드; (ii) WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (iii) WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포 중 하나 이상과 함께 항온처리하는 단계; (b) 증식된 세포 하나 이상을 클로닝하는 단계; 및 (c) 유효량의 상기 클로닝된 T 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 환자에서 WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 발달을 억제하는 방법을 제공한다.
다른 양태로, (a) 환자로부터 단리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 (i) WT1 폴리펩타이드; (ii) WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (iii) WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포 중 하나 이상과 함께 항온처리하는 단계; 및 (b) T 세포의 특이적 활성화의 존재 또는 부재를 검출하여, 이로부터 WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하여, 환자에서 WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 특정 양태로, 상기 검출 단계는 T 세포의 증식의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다.
추가 양태로, 본 발명은 (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 (i) WT1 폴리펩타이드; (ii) WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (iii) WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포 중 하나 이상과 함께 면역 복합체를 형성시키기에 충분한 조건 및 시간하에 항온처리하는 단계; 및 (b) WT1 폴리펩타이드와 WT1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 생물학적 샘플중의 항체 사이에 형성된 면역 복합체를 검출하여, 이로부터 WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하여, 환자에서 WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 기타 양태는 하기의 상세한 설명과 첨부되는 도면을 참고로하여 자명해질 것이다. 본원에서 기재되는 모든 참고 문헌은 각각 개별적으로 인용되는 경우와 같이 전문 참고로 인용된다.
도 1은 마우스(MO)와 사람(HU)의 WT1 단백질 서열(각각 서열 320 및 319) 비 교를 나타낸다.
도 2는 혈액학적 악성암(AML)을 갖고 있는 환자에서 WT1 특이적 항체의 검출을 설명하는 웨스턴 블롯이다. 레인 1은 분자량 마커를 나타낸다; 레인 2는 포지티브 대조군(WT1 특이적 항체로 면역침전시킨 WT1 포지티브 사람 백혈병 세포주)을 나타낸다; 레인 3은 네가티브 대조군(마우스 혈청으로 면역침전시킨 WT1 포지티브 세포주)을 나타낸다; 레인 4는 AML을 갖고 있는 환자의 혈청으로 면역침전시킨 WT1 포지티브 세포주를 나타낸다. 레인 2 내지 4의 경우, 면역침전물을 겔 전기영동법으로 분리시켜 WT1 특이적 항체로 프로브화시킨다.
도 3은 TRAMP-C, WT1 포지티브 종양 세포주로 면역시킨 B6 마우스에서 WT1 특이적 항체 반응의 검출을 설명하는 웨스턴 블롯이다. 레인 1, 3 및 5는 분자량 마커를 나타내고, 레인 2, 4 및 6은 WT1 특이적 포지티브 대조군(N180, Santa Cruz Biotechnology, WT1 단백질의 N-말단 영역의 아미노산 180개를 포함하는 폴리펩타이드, 52 kD에서 웨스턴 블롯상에서 이동)을 나타낸다. 사용되는 일차 항체는 레인 2에서의 WT180, 레인 4에서 비-면역화된 B6 마우스의 혈청 및 레인 6에서 면역화된 B6 마우스의 혈청이다.
도 4는 대표적인 WT1 펩타이드로 면역시킨 마우스에서 WT1 특이적 항체의 검출을 설명하는 웨스턴 블롯이다. 레인 1, 3 및 5는 분자량 마커를 나타내고 레인 2, 4 및 6은 WT1 포지티브 대조군(N180, Santa Cruz Biotechnology, WT1 단백질의 N-말단 영역의 아미노산 180개를 포함하는 폴리펩타이드, 52 kD에서 웨스턴 블롯상에서 이동)을 나타낸다. 사용되는 일차 항체는 레인 2에서의 WT180, 레인 4에서 비-면역화된 B6 마우스의 혈청 및 레인 6에서 면역화된 B6 마우스의 혈청이다.
도 5A 내지 5C는 대표적인 WT1 펩타이드로 면역시킨 마우스에서 증식성 T 세포 반응의 자극을 설명하는 그래프이다. 티미딘 혼입 검정은 상기 표시된 바와 같이, T 세포주 1개와 상이한 2개의 클론을 사용하여 수행하며 결과는 cpm으로 나타낸다. x축상에 표시된 대조군은 항원 없음(No Ag)과 B6/매질이며; 사용되는 항원은 p6-22 사람(p1), p117-139(p2) 또는 p244-262 사람(p3)이다.
도 6A 및 6B는 대표적인 WT1 펩타이드로 면역시킨 마우스에서 증식성 T 세포 반응의 자극을 설명하는 히스토그램이다. 3차 면역시킨지 3주 경과후, 백신 A 또는 백신 B로 접종한 마우스의 비장 세포를 배지 단독(배지) 또는 비장 세포와 배지(B6/항원 없음), 펩타이드 p6-22(p6), p117-139(p117), p244-262(p244)(백신 A; 도 6A) 또는 p287-301(p287), p299-313(p299), p421-435(p421)(백신 B; 도 6B)로 펄스시킨 B6 비장 세포 및 상관없는 대조군 펩타이드(상관없는 펩타이드)로 펄스시킨 비장 세포와 함께 25 ㎍/㎖로 배양시키고, 96시간 동안 증식시킨 후 (3H) 티미딘 혼입에 의해 검정한다. 막대(bar)는 자극 지수(SI)를 나타내며, 이는 실험 웰의 평균을 대조군(항원이 없는 B6 비장 세포)의 평균으로 나누어 계산한다.
도 7A 내지 7D는 p117-139 및 p6-22에 대해 특이적인 증식성 T-세포주와 클론의 발생을 설명하는 히스토그램이다. 생체내 면역시킨 후, 각각 백신 A 또는 B의 3종의 펩타이드를 모두 사용하여 초기 3회의 시험관내 자극(IVS)을 수행하였다. 후속 IVS는 2종의 관련 펩타이드 p117-139와 p6-22를 사용하여 단독 펩타이드 자극으로 수행하였다. 상기 표시된 바와 같이, p6-22 및 p117-139 특이적 T 세포주 둘다로부터 클론이 유도되었다. T 세포를 배지 단독(배지) 또는 비장 세포와 배지(B6/항원 없음), 펩타이드 p6-22(p6), p117-139(p117)로 펄스시킨 B6 비장 세포 또는 상관없는 대조군 펩타이드(상관없는 펩타이드)로 펄스시킨 비장 세포와 함께 25 ㎍/㎖로 배양시키고, 96시간 동안 증식시킨 후 (3H) 티미딘 혼입에 의해 검정한다. 막대(bar)는 자극 지수(SI)를 나타내며, 이는 실험 웰의 평균을 대조군(항원이 없는 B6 비장 세포)의 평균으로 나누어 계산한다.
도 8A 및 8B는 Th 반응을 도출시키는 잠재성을 갖는 펩타이드에 대한 사람의 WT1(서열 319)의 TSITES 분석 결과를 나타낸다. "A"로 표시된 영역은 블럭의 AMPHI 중간점이며, "R"은 로쓰바드(Rothbard)/테일러(Taylar) 모티프를 매치시키는 잔기이고, "D"는 IAd를 매치시키는 잔기이며 'd'는 IED 모티프를 매치시키는 잔기이다.
도 9A 및 9B는 WT1 펩타이드로 면역시킨 마우스에서 WT1 펩타이드-특이적 CTL의 도출을 설명하는 그래프이다. 도 9A는 동종이형 세포주에 의한 표적 세포의 용해를 설명하며 도 9B는 펩타이드 피복된 세포주의 용해를 나타낸다. 각 경우, 용해%(표준 크롬 방출 검정법에 의해 측정)는 3개의 표시된 효과기:표적 비율(effector:target ratio)로 나타낸다. 결과는 임파종 세포(LSTRA 및 E10)에 대해 제공될 뿐만 아니라, E10 + p235-243(E10+P235)에 대해 제공된다. E10 세포는 또한 EL-4 세포로도 언급된다.
도 10A 내지 10D는 B6 마우스를 WT1 펩타이드 P117로 백신화시킨 다음, WT1 포지티브 종양 세포주를 사멸시키지만 WT1 네가티브 세포주는 사멸시키지않는, WT1 특이적 CTL의 도출을 설명하는 그래프이다. 도 10A는 비-면역화된 B6 마우스의 T 세포가 WT1 포지티브 종양 세포주를 사멸시키지 않음을 설명한다. 도 10B는 동종이형 세포주에 의한 표적 세포의 용해를 설명한다. 도 10C 및 10D는 2개의 상이한 실험에서 WT1 네가티브 세포주와 비교한 바, WT1 포지티브 종양 세포주의 용해를 증명한다. 또한, 도 10C 및 10D는 펩타이드-피복된 세포주의 용해를 나타낸다(관련 WT1 펩타이드 p117로 피복시킨 WT1 네가티브 세포주 E10). 각 경우, 용해%(표준 크롬 방출 검정법에 의해 측정)는 3개의 표시된 효과기:표적 비율로 나타낸다. 결과는 임파종 세포(E10), 전립선암 세포(TRAMP-C), 형질전환된 섬유아세포 세포주(BLK-SV40), 뿐만 아니라 E10+p117에 대해 제공된다.
도 11A 및 11B는 대표적인 펩타이드 P117-139 특이적 CTL의 WT1 포지티브 종양 세포를 용해시키는 능력을 설명하는 히스토그램이다. 3차 면역시킨지 3주 경과후, 펩타이드 p235-243 또는 p117-139로 접종한 마우스의 비장 세포를 시험관내에서 관련 펩타이드로 자극시키고 WT1 펩타이드 뿐만 아니라 WT1 포지티브 및 네가티브 종양 세포와 함께 항온처리한 표적물을 용해시키는 능력에 대해 시험한다. 막대는 E:T 비율 25:1로 3회 수행된 크롬 방출 검정법에서 평균 특이적 용해%를 나타낸다. 도 11A는 표시된 바와 같이, WT1 네가티브 세포주 EL-4(EL-4, WT1 네가티브); 관련(면역화 뿐만 아니라 재자극용으로 사용) 펩타이드 p235-243으로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p235); 비관련 펩타이드 p117-139로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p117), p126-134로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p126) 또는 p130-138로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p130) 및 WT1 포지티브 종양 세포 BLK-SV40(BLD-SV40, WT1 포지티브) 및 TRAMP-C(TRAMP-C, WT1 포지티브)에 대한 p235-243 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 11B는 표시된 바와 같이, EL-4; 관련 펩타이드 P117-139로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p117) 및 비관련 펩타이드 p123-131로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p123) 또는 p128-136으로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p128); BLK-SV40 및 TRAMP-C에 대한 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다.
도 12A 및 12B는 냉 표적 억제(cold target inhibition)에 의해 증명된 바와 같은, WT1 포지티브 종양 세포의 용해 특이성을 설명하는 히스토그램이다. 막대는 E:T 비율 25:1로 3회 수행된 크롬 방출 검정법에서 평균 특이적 용해%를 나타낸다. 도 12A는 표시된 바와 같이, WT1 네가티브 세포주 EL-4(EL-4, WT1 네가티브); WT1 포지티브 종양 세포주 TRAMP-C(TRAMP-C, WT1 포지티브); 51Cr 표지시키지 않고 관련 펩타이드 p117-139로 펄스시킨 EL-4 10배 과량(뜨거운 표적물과 비교하여)과 함께 항온처리한 TRAMP-C 세포(TRAMP-C+p117 냉 표적물) 및 51Cr 표지시키지 않고 비관련 펩타이드로 펄스시킨 EL-4와 함께 항온처리한 TRAMP-C 세포(TRAMP-C + 비관련 냉 표적물)에 대한 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 12B는 표시된 바와 같이, WT1 네가티브 세포주 EL-4(EL-4, WT1 네가티브); WT1 포지티브 종양 세포주 BLK-SV40(BLK-SV40, WT1 포지티브); 관련 냉 표적물과 함께 항온처리한 BLK-SV40 세포(BLK-SV40+p117 냉 표적물) 및 비관련 냉 표적물과 함께 항온처리한 BLK-SV40 세포(BLK-SV40+비관련 냉 표적물)에 대한 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다.
도 13A 내지 13C는 p117-139내의 9mer CTL 에피토프의 평가를 표시하는 히스토그램이다. p117-139 종양 특이적 CTL 세포주를 적절한 H-2b 클래스 I 결합 모티프를 함유하거나 결여되어 있는 aa117-139내의 펩타이드에 대해 p126-139 또는 p130-138로 재자극시킨 다음 시험한다. 막대는 E:T 비율 25:1로 3회 수행된 크롬 방출 검정법에서 평균 특이적 용해%를 나타낸다. 도 13A는 표시된 바와 같이, WT1 네가티브 세포주 EL-4(EL-4, WT1 네가티브) 및 펩타이드 p117-139로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p117), p119-127로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p119), p120-128로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p120), p123-131로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p123), p126-134로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p126), p128-136으로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p128), 및 p130-138로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p130)에 대한 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 13B는 표시된 바와 같이, WT1 네가티브 세포주 EL-4, p117-139로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p117), p126-134로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p126) 및 WT1 포지티브 종양 세포주 TRAMP-C에 대한 p126-134로 자극시킨 후 CTL 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 13C는 EL-4, p117-139로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p117), p130-138로 펄스시킨 EL-4(EL-4+p130) 및 WT1 포지티브 종양 세포주 TRAMP-C에 대한 p130-139로 자극시킨 후 CTL의 세포독성 활성을 나타낸다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 일반적으로 악성 질환의 면역요법 및 진단용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 설명되어 있는 조성물은 WT1 폴리펩타이드, WT1 폴리뉴클레오타이드, WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포(APC, 예, 수지상 세포), WT1 폴리펩타이드에 결합하는 항체와 같은 제제 및/또는 WT1에 대해 특이적인 면역계 세포(예, T 세포)를 포함할 수 있다. 본 발명의 WT1 폴리펩타이드는 일반적으로 적어도 윌름 종양(Wilms tumor) 유전자 생성물(WT1) 또는 이의 변이체의 부분을 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 일반적으로 상기와 같은 폴리펩타이드를 모두 또는 일부를 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열, 또는 상기와 같은 서열에 대해 상보적인 것들을 포함한다. 항체는 일반적으로 WT1 폴리펩타이드의 부분에 결합할 수 있는 면역계 단백질, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 상기와 같은 조성물에 사용될 수 있는 T 세포는 일반적으로 WT1 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포(예, CD4- 및/또는 CD8+)이다. 본원에 기재된 특정 방법은 또한 본원에서 제공되는 바와 같은 WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포를 이용한다.
본 발명은 윌름 종양(WT) 유전자 생성물(예를 들면, WT1)에 대해 발생된 면역 반응이 WT1 유전자 발현을 증가시킴을 특징으로하는 악성 질환에 걸린 환자에게 예방적 및/또는 치료적 잇점을 제공할 수 있다는 발견을 기본으로한다. 상기와 같은 질환으로는, 비제한적으로, 백혈병(예, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 임파구성 백혈병(ALL) 및 유아 ALL), 뿐만 아니라 폐암, 유방암, 갑상선암 및 위장암, 및 흑색종과 같은 수 많은 암이 있다. WT1 유전자는 원래 윌름 종양 환자에서 염색체 11p13에서 세포유전학적 결실을 근거로 확인되어 단리되었다[참고: Call et al., 미국 특허 제5,350,840호]. 상기 유전자는 10개의 엑손으로 이루어져 있으며 징크 핑거 전사 인자(zinc finger transcription factor)를 암호화하고, 마우스와 사람의 WT1 단백질 서열은 도 1 및 서열 319 및 320으로 제공된다.
WT1 폴리펩타이드
본 발명의 명세서내에서, WT1 폴리펩타이드는 본 명세서에 설명된 바와 같이, 적어도 천연 WT1(즉, 유전적으로 변형되지 않은 유기체에 의해 발현된 WT1 단백질), 또는 이의 변이체의 면역원성 부위를 포함하는 폴리펩타이드이다. WT1 폴리펩타이드는 적어도 천연 단백질 또는 이의 변이체의 면역원성 부위를 포함하는 한, 어떠한 길이라도 상관없다. 다시 말해서, WT1 폴리펩타이드는 올리고펩타이드 (즉, 8 내지 10개 잔기와 같이, 펩타이드 결합에 의해 연결된, 상대적으로 적은 수의 아미노산 잔기로 이루어진 것), 전장 WT1 단백질(예, 사람 또는 비-사람 동물, 예를 들면, 마우스내에 존재하는 것) 또는 중간 크기의 폴리펩타이드일 수 있다. 특정 양태로, 천연 WT1 폴리펩타이드중 소수의 연속 아미노산 잔기를 함유하는 WT1폴리펩타이드를 사용하는 것이 바람직하다. 상기와 같은 폴리펩타이드는 T 세포 반응의 발생을 목적으로하는 특정한 용도에 있어서 바람직하다. 예를 들면, 상기와 같은 WT1 폴리펩타이드는 천연 WT1 폴리펩타이드중 연속 아미노산 잔기를 23개 미만, 바람직하게는 18개 미만, 더욱 바람직하게는 15개 미만으로 함유할 수 있다. 천연 WT1 폴리펩타이드의 연속 아미노산 잔기 9개를 포함하는 폴리펩타이드가 상기와 같은 목적에 대해 일반적으로 적합하다. 천연 단백질로부터 유래된 추가의 서열 및/또는 이종성 서열이 WT1 폴리펩타이드내에 존재할 수 있으며, 상기와 같은 서열은 추가의 면역원성 또는 항원성 특성을 소유할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 바와 같은 폴리펩타이드는 또한 다른 폴리펩타이드 또는 비-폴리펩타이드 화합물과 (공유결합적으로 또는 비공유결합적으로) 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "면역원성 부위"는 B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 수용체에 의해 인식되는(즉, 특이적으로 결합되는) 폴리펩타이드의 부위이다. 특정의 바람직한 면역원성 부위는 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 면역원성 부위는 당해 분야에 공지된 검정법을 사용하여 상기와 같은 결합이 검출될 수 있는 경우 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 "결합"하는 것으로 언급된다. 예를 들면, MHC 클래스 I에 대한 폴리펩타이드의 결합능은 125I 표지된 β2-마이크로글로불린(β2m)의 MHC 클래스 I/β2m/펩타이드 헤테로삼합체성 복합체중으로의 혼입을 촉진하는 능력을 모니터함으로써 간접적으로 평가할 수 있다[참고: Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994]. 달리, 당해 분야에 공지된 기능적 펩타이드 조성물 검정법을 사용할 수 있다. 특정 면역원성 부위는 표 II 내지 XIV중 1개 이상에서 표시된 서열중 하나 이상을 갖는다. 대표적인 면역원성 부위로는 비제한적으로, RDLNALLPAVPSLGGGG(사람의 WT1 잔기 6-22; 서열 1), PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(사람 및 마우스의 WT1 잔기 117-139; 각각 서열 2 및 3); GATLKGVAAGSSSSVKWTE(사람의 WT1 잔기 244-262; 서열 4), GATLKGVAA(사람의 WT1 잔기 244-252; 서열 88), CMTWNQMNL(사람 및 마우스의 WT1 잔기 235-243; 각각 서열 49 및 258), SCLESQPTI(마우스의 WT1 잔기 136-144; 서열 296), SCLESQPAI(사람의 WT1 잔기 136-144; 서열 198), NLYQMTSQL(사람 및 마우스의 WT1 잔기 225-233; 각각 서열 147 및 284), ALLPAVSSL(마우스의 WT1 잔기 10-18, 서열 255), 또는 RMFPNAPYL(사람 및 마우스의 WT1 잔기 126-134; 각각 서열 185 및 293)이 있다. 추가의 면역원성 부위가 본 발명에서 제공되며, 다른 것들은 일반적으로 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247(Raven Press, 1993)] 및 본원에서 언급된 참고문헌에 요약된 바와 같은, 숙지된 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 면역원성 부위를 확인하기위한 대표적인 기술은 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력에 대해 폴리펩타이드를 선별하는 것이다. 천연 WT1 폴리펩타이드의 면역원성 부위는 상기와 같은 항혈청 및/또는 T-세포와 전장 WT1의 반응성보다 실질적으로 적지 않은 수준으로 반응하는 부위이다(예, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 검정법에서). 다시 말해서, 면역원성 부위는 상기와 같은 검정법에서 전장 폴리펩타이드의 반응성과 유사 내지 더 큰 수준으로 반응할 수 있다. 상기와 같은 선별은 일반적으로 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기재된 바와 같은, 당해 분야의 숙련가에게 숙지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
달리, 면역원성 부위는 Tsites 프로그램[참조: Rothbard and Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996]과 같이, Th 반응을 도출시키는 잠재성을 갖는 펩타이드 모티프를 찾는 컴퓨터 분석을 이용하여 확인할 수 있다. 쥐 및 사람의 클래스 I 또는 클래스 II MHC에 결합하기에 적합한 모티프를 갖는 CTL 펩타이드는 BIMAS[Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994] 및 다른 HLA 펩타이드 결합 예측 분석법에 따라서 확인할 수 있다. 면역원성을 확인하기 위하여, HLA A2 유전자전이된(transgenic) 마우스 모델 및/또는 수지상 세포, 섬유아세포 또는 말초 혈액 세포를 사용한 시험관내 자극 검정법을 사용하여 펩타이드를 시험할 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 조성물은 천연 WT1 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 폴리펩타이드 "변이체"는 폴리펩타이드의 면역원성이 보유되도록 하는, 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 중 하나 이상에서 천연 폴리펩타이드와 구별되는 폴리펩타이드이다(즉, 변이체의 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력이 천연 폴리펩타이드에 대해 실질적으로 소멸되지 않는다). 다시 말해서, 변이체의 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력은 천연 폴리펩타이드와 비교하여, 향상되거나 또는 변화되지 않을 수 있거나, 천연 폴리펩타이드와 비교하여, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만으로 소멸될 수 있다. 상기와 같은 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩타이드 서열중 하나를 개질시키고 개질된 폴리펩타이드의 본원에 기재된 바와 같은 항혈청 및/또는 T-세포와의 반응성을 평가함으로써 확인할 수 있다. 본 발명내에서, WT1 폴리펩타이드의 면역원성 부위내에서 상대적으로 소수의 치환(예, 1 내지 3개)이 면역 반응을 일으키는 폴리펩타이드의 능력을 향상시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 적합한 치환은 일반적으로 상기한 바와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 확인할 수 있으며, 상기 효과는 개질된 폴리펩타이드의 본 명세서에 설명된 바와 같은 항혈청 및/또는 T-세포와의 반응성을 기준으로하여 확인한다. 따라서, 특정의 바람직한 양태로, WT1 폴리펩타이드는 면역원성 부위내의 아미노산 잔기 1 내지 3개가 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응 능력이 실질적으로 비개질된 폴리펩타이드에 대한 것 보다 통계상 크도록 치환된 변이체를 포함한다. 상기와 같은 치환은 상기한 바와 같이 확인할 수 있는, 폴리펩타이드의 MHC 결합 부위내에 존재하는 것이 바람직하다. 바람직한 치환은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자로의 결합을 증가시킨다.
특정 변이체는 보존적 치환을 함유한다. "보존적 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환된 것으로, 펩타이드 화학 분야의 숙련가들은 상기와 같은 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치료적 특성(hydropathic nature)은 실질적으로 변화되지 않을 것으로 생각한다. 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성도, 친수성도 및/또는 양쪽성 특성에서의 유사성을 기준으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 음으로 하전된 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 있으며; 양으로 하전된 아미노산으로는 라이신 및 아르기닌이 있고; 유사한 친수성 수치를 갖는 비하전 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산으로는 류신, 이소류신 및 발린; 글리신과 알라닌; 아스파라긴과 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌과 티로신이 있다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 다른 그룹의 아미노산으로는 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his가 있다. 변이체도, 또는 달리, 비보존적 변화를 함유할 수 있다. 변이체는 또한(또는 달리) 예를 들면, 폴리펩타이드의 면역원성, 2차 구조 및 수치료적 특정에 대한 영향이 최소인 아미노산 결실 또는 부가에 의해 개질될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, WT1 폴리펩타이드는 단백질의 전이를 동시-해독적으로 또는 후-해독적으로 지시하는 단백질의 N-말단에서 시그날(또는 리더)에 결합될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한, 또는 달리, 폴리펩타이드(예를 들면, poly-His)의 합성, 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위하여, 또는 폴리펩타이드의 고체 지지체로의 결합을 향상시키기 위하여 링커 또는 다른 서열에 결합시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드를 면역글로불린 Fc 영역에 결합시킬 수 있다.
WT1 폴리펩타이드는 여러가지 숙지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 WT1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 재조합 폴리펩타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드로부터 용이하게 제조할 수 있다. 일반적으로, 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있는 여러가지 발현 벡터를 사용하여 재조합 WT1 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 발현은 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 적절한 숙수 세포에서 수행할 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 진핵세포, 효모 및 고등 진핵세포가 있다. 바람직하게 이용되는 숙주 세포는 이. 콜라이, 효모 또는 COS 또는 CHO와 같은 포유동물 세포주이다. 재조합 단백질 또는 폴리펩타이드를 배양 배지중으로 분비하는 적합한 숙주/벡터 시스템으로부터의 상등액을 먼저 상업적으로 입수가능한 필터를 사용하여 농축시킬 수 있다. 이후 상기 농축물은 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 최종적으로, 1회 이상의 역상 HPLC 단계를 사용하여 재조합 폴리펩타이드를 추가로 정제할 수 있다. 상기와 같은 기술을 사용하여 천연 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 천연 폴리펩타이드의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 올리고뉴클레오타이드-지시된 부위-특이적 돌연변이유발과 같은 표준 돌연변이유발 기술을 사용하여 제조할 수 있으며, DNA 서열의 절편을 제거하여 절단된 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
특정 부위 및 기타 변이체를 또한 당해 분야의 숙련가에게 숙지된 기술을 사용하여, 합성 수단에 의해 발생시킬 수 있다. 예를 들면, 아미노산 500개 이하, 바람직하게는 약 100개 이하, 더욱 바람직하게는 약 50개 이하의 폴리펩타이드를 합성할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 고체상 기술, 예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고체상 합성법(여기서는 아미노산을 성장하는 아미노산 쇄에 연속적으로 부가한다)을 사용하여 폴리펩타이드를 합성할 수 있다. 문헌 참조[Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963]. 자동화된 폴리펩타이드 합성 장비를 제조원(Applied BioSystems, Inc. Foster City, CA)로부터 상업적으로 입수할 수 있으며, 제조업자의 지침에 따라서 작동할 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드가 단리된다. "단리된" 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들면, 천연 시스템에서 공존하는 물질의 일부 또는 모두로부터 분리할 경우 천연 단백질이 단리된다. 바람직하게는, 상기와 같은 폴리펩타이드가 약 90% 이상 순수하며, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상 순수하다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 천연 환경의 일부가 아닌 벡터중으로 클로닝할 경우 단리되는 것으로 판단된다.
추가의 양태로, 본 발명은 WT1 폴리펩타이드의 모방체를 제공한다. 상기와 같은 모방체는 아미노산 모방체중 하나 이상에 결합된 아미노산(즉, WT1 단백질내의 아미노산 하나 이상이 아미노산 모방체로 대체될 수 있다)을 포함할 수 있거나 전부 비펩타이드 모방체일 수 있다. 아미노산 모방체는 항원-특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과의 반응 능력을 실질적으로 소멸시키기 않으면서 WT1 폴리펩타이드내의 아미노산에 대해 치환될 수 있도록 하는 아미노산과 구조적으로 유사한 화합물이다. 비펩타이드 모방체는 아미노산을 함유하지 않으며, WT1 폴리펩타이드의 능력과 비교하여 모방체의 WT1-특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과의 반응 능력을 실질적으로 소멸시키지 않으면서 WT1 폴리펩타이드와 유사한 전체적인 구조를 갖는 화합물이다. 상기와 같은 모방체는 펩타이드 서열의 3차 구조를 평가하는 표준 기술(예를 들면, 핵 자기 공명 및 컴퓨터 기술)을 기준으로 하여 디자인할 수 있다. 모방체는 WT1 폴리펩타이드의 측쇄 기능성 중 하나 이상이 동일한 크기 또는 용적을 필수적으로 갖지는 않지만, 유사한 생물학적 반응을 일으키는 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성을 갖는 그룹으로 대체되도록 디자인될 수 있다. 본원에 기재된 양태로, 모방체는 WT1 폴리펩타이드를 치환할 수 있음을 알아야한다.
WT1 폴리뉴클레오타이드
본원에 기재된 바와 같은 WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 포괄되는 WT1 폴리뉴클레오타이드이다. 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄(암호화 또는 안티센스) 또는 이본쇄일 수 있으며, DNA(게놈성, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. 추가의 암호화 또는 비-암호화 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드내에 존재할 수 있으며, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결시킬 수 있으나, 반드시 그러하지는 않다.
WT1 폴리뉴클레오타이드는 천연 WT1 단백질을 암호화할 수 있거나, 본원에 기재된 바와 같은 WT1의 변이체를 암호화할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성이 천연 WT1 단백질과 비교하여, 소멸되지 않도록 하는 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 하나 이상 함유할 수 있다. 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다. 바람직한 변이체는 천연 WT1 서열의 면역원성 부위를 암호화하는 뉴클레오타이드 위치의 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만으로 뉴클레오타이드 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 함유한다. 특정 변이체는 천연 유전자, 또는 이들의 부분과 실질적으로 상동성이다. 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드 변이체는 WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 천연 DNA 서열(또는 상보적인 서열)에 대해 중간 정도로 엄격한 조건하에서 하이브리드화될 수 있다. 적합한 중간 정도 엄격한 조건은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)의 용액중에서의 예비 세척; 50 내지 65 ℃, 5X SSC에서 밤새 하이브리드화; 이어서 65 ℃에서 20분간 각각 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 2회 세척을 포함한다. 상기와 같은 하이브리드화 DNA 서열 또한 본 발명의 범주내에 있다.
유전자 암호의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여, WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 수 많은 뉴클레오타이드 서열이 있다는 것을 당해 분야의 숙련가들은 인식할 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드중 일부는 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과의 상동성을 최소로 포함한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용에서의 차이로 인하여 변화되는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 의해 특별하게 고려된다.
상기한 바와 같이, WT1의 면역원성 부위를 일단 확인한 다음, WT1 폴리뉴클레오타이드를 여러가지 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, WT1 폴리뉴클레오타이드는 WT1을 발현시키는 세포로부터 제조된 cDNA로부터 증폭시킬 수 있다. 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통하여 증폭시킬 수 있다. 이 경우, 면역원성 부위의 서열을 기준으로하여 서열-특이적 프라이머를 디자인할 수 있으며 구입하거나 합성할 수 있다. 예를 들면, 사람의 WT1 유전자의 PCR 증폭용으로 적합한 프라이머는 다음과 같다: 제1 단계 - P118: 1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3'(서열 5) 및 P135: 5' CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3'(서열 6); 제2 단계 - P136: 5' GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG 3'(서열 7) 및 P137: 5' GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3'(서열 8). 마우스 WT1 유전자의 PCR 증폭용 프라이머는 다음과 같다: 제1 단계 - P138: 5' TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3'(서열 9) 및 P139: 5' GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3'(서열 10), 제2 단계 - P140: 5' GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3'(서열 11) 및 P141: 5' GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3'(서열 12).
증폭된 부위를 사용하여 사람의 게놈성 DNA 라이브러리 또는 적합한 cDNA 라이브러리로부터, 숙지된 기술을 사용하여 전장 유전자를 단리시킬 수 있다. 달리, 다수의 PCR 단편으로부터 전장 유전자를 작제할 수 있다. WT1 폴리뉴클레오타이드는 또한 올리고뉴클레오타이드 성분을 합성하여, 성분을 함께 연결하여 완전한 폴리뉴클레오타이드를 생성시킴으로써 제조할 수 있다.
WT1 폴리뉴클레오타이드는 또한 화학적 합성법(예, 고체상 포스포르아미다이트 화학적 합성법)을 포함한, 당해 분야에 공지된 방법으로 합성할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 개질은 또한 올리고뉴클레오타이드-지시된 부위-특이적 돌연변이유발[참조: Adelman et al., DNA 2:183, 1983]과 같은 표준 돌연변이유발 기술을 사용하여 도입시킬 수 있다. 달리, RNA 분자는 WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 시험관내 또는 생체내 전사에 의해 발생시킬 수 있는데, 단 상기 DNA는 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터(예, T7 또는 SP6)를 갖는 벡터중으로 혼입시킨다. 특정 부위를 사용하여 본원에 기재된 바와 같이, 암호화된 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 또한, 달리, 암호화된 폴리펩타이드가 생체내에서 발생되도록 부위를 (예를 들면, 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포를 WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 작제물로 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 환자에게 투여함으로써) 환자에게 투여할 수 있다.
WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 시험관내 또는 생체내 폴리펩타이드의 생산용으로 사용할 수 있다. 암호화 서열에 대해 상보적인 WT1 폴리뉴클레오타이드(즉, 안티센스 폴리뉴클레오타이드)는 또한 프로브로서 또는 WT1 발현을 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 안티센스 RNA으로 전사될 수 있는 cDNA 작제물을 또한 조직 세포중으로 도입시켜 안티센스 RNA의 생산을 도모할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 추가로 개질시켜 생체내 안정성을 증가시킬 수 있다. 가능한 개질로는, 비제한적으로, 5' 및/또는 3' 말단에서 플랭킹 서열의 부가; 주쇄중에서 포스포디에스테라제 연결 그룹 보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용; 및/또는 이노신, 퀘오신 및 위부토신, 뿐만 아니라 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 기타 개질된 형태의 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘과 같은 비전통적 염기의 혼입이 있다.
본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 확립되어 있는 재조합 DNA 기술을 사용하여 여러가지 다른 뉴클레오타이드 서열에 연결할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드를 플라스미드, 파아지미드, 람다 파아지 유도체 및 코스미드를 포함한 여러가지 클로닝 벡터중으로 클로닝시킬 수 있다. 특정 벡터로는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 발생 벡터 및 서열화 벡터가 있다. 일반적으로, 벡터는 적어도 하나의 유기체 중에 복제 기능의 오리진, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 선택성 마커 하나 이상을 함유한다. 기타 요소는 목적하는 용도에 따르며, 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다.
특정 양태로, 포유동물의 세포중으로 혼입되도록하여 그곳에서 발현되도록 폴리뉴클레오타이드를 제형화할 수 있다. 상기와 같은 제형화는 하기한 바와 같이, 치료 목적에 특히 유용하다. 당해 분야의 숙련가들은 표적 세포중에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 수 많은 방법이 있으며, 적합한 방법을 사용할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드를 예를 들면, 비제한적으로, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 또는 백시니아 또는 기타 천연두 바이러스(예, 조류 천연두 바이러스)와 같은 바이러스성 벡터중으로 혼입시킬 수 있다. DNA를 상기와 같은 벡터중으로 혼입시키는 기술은 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있다. 레트로바이러스성 벡터는 추가로 선택성 마커(형질도입된 세포의 확인 또는 선택에 있어서 도움을 주기 위하여) 및/또는 표적화 부위용 유전자, 예를 들면, 특정 표적 세포상의 수용체를 위한 리간드를 암호화하는 유전자를 전이 또는 혼입시켜, 당해 벡터를 표적-특이성으로 만들 수 있다. 표적화는 또한 항체를 사용하여, 당해 분야의 숙련가에게 숙지된 방법으로 수행할 수 있다. 상기와 같은 벡터내의 cDNA 작제물은 예를 들면, 종양 보호 및 종양 또는 백혈병-성장 억제 또는 상기와 같은 세포의 용해를 증명하기 위한 면역요법 실험을 수행하기 위하여 사용될 수 있는 WT1 포지티브 종양 모델을 확립하는데 사용하기위한 사람 또는 동물 세포주를 형질감염시키는데 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드에 대한 기타 치료 제형으로는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미세구, 비드, 및 수중유 유제, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포좀을 포함한 지질-계 시스템과 같은, 콜로이드상 분산 시스템이 있다. 시험관내 및 생체내 운반 비히클로서 사용하기에 바람직한 콜로이드상 시스템은 리포좀(즉, 인공막 소낭)이다. 상기와 같은 시스템의 제조 및 사용은 당해 분야에 숙지되어 있다.
항체 및 이의 단편
본 발명은 추가로 WT1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편과 같은 결합제를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 결합제는 검출가능한 수준에서(예를 들면, ELISA내에서) WT1 폴리펩타이드와 반응시킬 경우 WT1 폴리펩타이드에 "특이적으로 결합하는 것"을 말하며, 유사한 조건하에서 비관련 단백질과는 검출가능하게 반응하지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "결합"은 "복합체"가 형성되는 것과 같이 2개의 별개의 분자간에 비공유결합성 결합을 말한다. 결합 능력은 예를 들면, 복합체 형성을 위한 결합 상수를 측정함으로써 평가할 수 있다. 결합 상수는 복합체의 농도를 성분 농도의 합으로 나눌 경우 수득되는 수치이다. 일반적으로, 복합체 형성에 대한 결합 상수가 약 103 L/몰을 초과할 경우, 본 발명에서 2종의 화합물이 "결합"한 것으로 언급된다. 결합 상수는 당해 분야에 숙지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
상기 요구조건을 만족시키는 제제라면 어느 것이라도 결합제일 수 있다. 바람직한 양태로, 결합제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 특정 항체는 예를 들면, 제조원(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)으로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 달리, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 여러가지 기술을 사용하여 항체를 제조할 수 있다. 문헌 참조[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 항체는 본원에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체의 발생을 포함한 세포 배양 기술에 의해, 또는 항체 유전자를 적합한 세균성 또는 포유동물 세포 숙주중으로 형질감염시켜, 재조합 항체를 생산함으로써 생산할 수 있다. 기술중 하나로, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 먼저 여러가지 포유동물(예, 마우스, 래트, 토끼, 양 또는 염소)중으로 주사한다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 개질시키지 않고 면역원으로 제공할 수 있다. 달리, 특히 상대적으로 짧은 폴리펩타이드의 경우, 폴리펩타이드를 소혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 담체 담백질에 연결할 경우 탁월한 면역 반응이 도출될 수 있다. 상기 면역원을 동물 숙주중으로, 바람직하게는 1회 이상의 부스터 면역화를 포함하는 설정된 스케쥴에 따라서 주사하고, 동물로 부터 주기적으로 채혈한다. 이후 폴리펩타이드에 대해 특이적인 폴리클로날 항체를 상기 항혈청으로부터 예를 들면, 적합한 고체 지지체에 커플링되어 있는 폴리펩타이드를 사용한 친화성 크로마토그라피에 의해 정제할 수 있다.
당해 항원성 폴리펩타이드에 대해 특이적인 모노클로날 항체는 예를 들면, 문헌의 기술[Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976], 및 이에 대한 개량법을 사용하여 제조할 수 있다. 간략하면, 이들 방법은 목적하는 특이성(즉, 당해 폴리펩타이드와의 반응성)을 갖는 항체를 생산할 수 있는 불멸 세포주를 제조하는 것이다. 상기와 같은 세포주는 예를 들면, 상기한 바와 같이 면역시킨 동물로부터 수득한 비장 세포로부터 생산할 수 있다. 이후, 상기 비장 세포를 예를 들면, 골수 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역시킨 동물과 유전적 동계성인 융합 파트너와의 융합에 의해 불멸화시킨다. 여러가지 융합 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, 비장 세포와 골수 세포를 비이온성 세제와 수분간 배합한 다음 하이브리드 세포의 성장은 조력하나 골수 세포의 성장은 조력하지 않는 선택성 배지상에서 저밀도로 플레이팅시킨다. 바람직한 선택 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선택을 사용한다. 충분한 시간, 통상 약 1 내지 2주 경과된 후, 하이브리드의 콜로니가 관찰된다. 단독 콜로니를 선택하여 이들의 배양 상등액을 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대해 시험한다. 반응성과 특이성이 높은 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체를 성장하는 하이브리도마 콜로니의 상등액으로부터 단리시킬 수 있다. 또한, 여러가지 기술, 예를 들면, 하이브리도마 세포주를 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복강내로 주사하는 것과 같은 기술을 이용하여 수율을 향상시킬 수 있다. 모노클로날 항체를 복수 유체 또는 혈액으로부터 회수할 수 있다. 크로마토그라피, 겔 여과, 침전, 및 추출과 같은 통상의 기술로 항체로부터 오염 물질을 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 정제 단계에서, 예를 들면, 친화성 크로마토그라피 단계에서 사용될 수 있다.
특정 양태로, 항체의 항원-결합 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 상기와 같은 단편으로는 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있는 Fab 단편이 있다. 간략해서, 면역글로불린은 단백질 A 비드 컬럼상에서의 친화성 크로마토그라피에 의해 토끼 혈청으로부터 정제하고[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988], 파파인으로 분해시켜 Fab 및 Fc 단편을 수득할 수 있다. Fab 및 Fc 단편은 단백질 A 비드 컬럼상에서의 친화성 크로마토그라피에 의해 분리할 수 있다.
모노클로날 항체 및 이의 단편을 치료제 하나 이상에 커플링시킬 수 있다. 이에 대해 적합한 약제로는 방사성 트레이서 및 화학요법제가 있으며, 예를 들면, 자가 골수를 시험관내 퍼징시키는데 사용할 수 있다. 대표적인 치료제로는 방사성핵종, 차동 유발제, 약물, 독소, 및 이들의 유도체가 있다. 바람직한 방사성핵종으로는 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At, 및 212Bi가 있다. 바람직한 약물로는 메토트렉세이트, 및 피리미딘 및 퓨린 유사체가 있다. 바람직한 차동 유발제로는 포르볼 에스테르 및 부티르산이 있다. 바람직한 독소로는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 슈도모나스 외독소, 쉬겔라 독소, 및 아메리카 자리공 잡초(pokeweed) 항바이러스성 단백질이 있다. 진단용으로, 방사성제의 커플링을 사용하여 암 전이(metastasis)의 추적을 용이하게 하거나 WT1-포지티브 종양의 위치를 측정할 수 있다.
치료제를 적합한 모노클로날 항체에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들면, 링커 그룹을 통하여) 커플링(예를 들면, 공유결합적으로 결합)시킬 수 있다. 치료제와 항체간의 직접적인 반응은 각각 다른 것과 반응할 수 있는 치환체를 갖는 경우 가능하다. 예를 들면, 아미노 또는 설프히드릴 그룹과 같은 친핵성 그룹은 다른 것중의 무수물 또는 산 할라이드와 같은 카보닐-함유 그룹, 또는 양호한 이탈 그룹(예, 할라이드)을 함유하는 알킬 그룹과 반응할 수 있다.
달리, 링커 그룹을 통하여 치료제와 항체를 커플링시키는 것이 바람직할 수 있다. 링커 그룹은 결합 성능의 방해를 피하도록 치료제로부터 항체를 이격시키기위한 스페이서로서 작용할 수 있다. 링커 그룹은 또한 치료제 또는 항체상 치환체의 화학적 반응성을 증가시켜, 커플링 효과를 증가시킬 수 있다. 화학적 반응성에서의 증가는 또한 그밖의 경우라면 불가능한 치료제, 또는 치료제상에서의 작용 그룹의 사용을 용이하게 할 수 있다.
당해 분야의 숙련가에게는 둘 다 동종기능성- 및 이종기능성인, 여러가지 이기능성 또는 다기능성 시약[예를 들면, catalog of the Pierce Chemical Co., Rockford, IL에 기재된 것들]을 링커 그룹으로서 사용할 수 있음이 자명할 것이다. 커플링은 예를 들면, 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프히드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통하여 수행될 수 있다. 상기와 같은 방법학이 기술되어 있는 수 많은 문헌[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)]이 있다.
본 발명의 면역접합체의 항체 부위로부터 유리될 경우 치료제가 더욱 강력하다면, 세포중으로의 내재화 동안 또는 내재화시 분리될 수 있는 링커 그룹을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 수 많은 상이한 분리가능한 링커 그룹이 기재되어 있다. 이들 링커 그룹으로부터 치료제를 세포내 방출시키는 메카니즘은 디설파이드 결합의 환원[예를 들면, 미국 특허 제4,489,710호; Spitler], 광불안정 결합에 대한 조사[예를 들면, 미국 특허 제4,625,014호; Senter et al.], 유도화된 아미노산 측쇄의 가수분해[예를 들면, 미국 특허 제4,638,045호; Kohn et al.], 혈청 보체-매개된 가수분해[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호; Rodwell et al.], 및 산-촉매된 가수분해[예를 들면, 미국 특허 제4,569,789호; Blattler et al.]에 의한 분해를 포함한다.
약제 하나 이상을 항체에 커플링시키는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 양태로, 약제 분자 다수 개를 항체 분자 1개에 커플링시킨다. 다른 양태로, 하나 이상의 약제를 항체 1개에 커플링시킬 수 있다. 특정 양태와는 상관없이, 약제 하나 이상을 갖는 면역접합체를 여러가지 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 약제 하나 이상을 항체 분자에 직접 커플링시킬 수 있거나, 다수의 부착 부위를 제공하는 링커를 사용할 수 있다. 달리, 담체를 사용할 수 있다. 담체는 공유결합을 포함한 직접적인 여러가지 방법으로 또는 링커 그룹을 통하여 약제를 보유할 수 있다. 적합한 담체로는 알부민과 같은 단백질[예를 들면, 미국 특허 제4,507,234호; Kato et al.], 펩타이드 및 아미노덱스트란과 같은 폴리사카라이드[예를 들면, 미국 특허 제4,699,784호; Shih et al.]가 있다. 담체는 또한 비공유결합에 의해 또는 리포좀 소낭내[예를 들면, 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,783,088호]와 같은 캡슐화에 의해 약제를 보유할 수 있다. 방사성핵종 시약에 대해 특이적인 담체로는 방사성 할로겐화된 소분자 및 킬레이트화 화합물이 있다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제4,735,792호]에는 대표적인 방사성 할로겐화된 소분자 및 이들의 합성법이 기재되어 있다. 방사성핵종 킬레이트는 금속, 또는 금속 산화물, 방사성핵종을 결합시키기 위한 공여체 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 것들인 킬레이트화 화합물로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제4,673,562호(Davison et al.)]에는 대표적인 킬레이트화 화합물 및 이들의 합성법이 기재되어 있다.
항체 및 면역접합체에 대해 여러가지 투여 경로를 사용할 수 있다. 전형적으로, 정맥내, 근육내, 피하 또는 절제된 종양층중 투여일 수 있다. 항체/면역접합체의 정확한 투여량은 사용되는 항체, 종양상의 항원 밀도, 및 항체의 제거 속도에 따라 변화되는 것이 자명할 것이다.
본원에는 또한, WT1의 면역원성 부위를 모방하는 항-개별특이형(anti-idiotype) 항체가 제공된다. 상기 항체는 공지된 기술을 사용하여 WT1의 면역원성 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대해 형성될 수 있다. WT1의 면역원성 부위를 모방하는 항-개별특이형 항체는 본원에 기재된 바와 같이, WT1의 면역원성 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 항체이다.
T 세포
면역요법 조성물은 또한, 또는 달리, WT1에 대해 특이적인 T 세포를 포함할 수 있다. 상기와 같은 세포는 일반적으로 표준 공정을 사용하여 시험관내 또는 생체외로 제조될 수 있다. 예를 들면, T 세포는 환자와 같은, 포유동물의 골수, 말초 혈액, 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물내에 존재할 수 있거나, 제조원(CellPro Inc., Bothell WA)으로부터 입수가능한 CEPRATE™ 시스템과 같은, 상업적으로 입수가능한 세포 분리 시스템을 사용하여 단리시킬 수 있다[참조: 미국 특허 제5,240,856호; 미국 특허 제5,215,926호; WO 제89/06280호; WO 제91/16116호 및 WO 제92/07243호]. 달리, T 세포는 관련 또는 비관련 사람, 비-사람 동물, 세포주 또는 배양물로부터 유도될 수 있다.
T 세포는 WT1 폴리펩타이드, WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포(APC)로 자극될 수 있다. 상기와 같은 자극은 WT1 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포가 발생되기에 충분한 조건 및 시간하에서 수행된다. WT1 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 미세구와 같은 운반 비히클내에 존재하여 항원-특이적 T 세포의 발생을 용이하게하는 것이 바람직하다. 간략해서, 환자 또는 관련 또는 비관련 공여체로부터 통상의 기술(예를 들면, 말초 혈액 임파구의 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리에 의해)로 단리될 수 있는 T 세포를 WT1 폴리펩타이드와 함께 항온처리한다. 예를 들면, T 세포를 2 내지 9일간(전형적으로 4일) 37 ℃에서 WT1 폴리펩타이드(예, 5 내지 25 ㎍/㎖) 또는 필적할만한 양의 WT1 폴리펩타이드를 합성하는 세포와 함께 시험관내에서 항온처리할 수 있다. 별개 분취량의 T 세포 샘플을 WT1의 부재하에서 항온처리하여 대조군으로 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
T 세포는 T 세포가 WT1 폴리펩타이드로 피복되거나 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 발현시키는 표적 세포를 사멸시킬 경우 WT1 폴리펩타이드에 대해 특이적인 것으로 판단한다. T 세포 특이성은 여러가지 표준 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들면, 크롬 방출 검정법 또는 증식 검정법내에서, 네가티브 대조군과 비교하여, 용해 및/또는 증식에 있어서 자극 지수가 2배 이상일 경우 T 세포 특이성을 나타낸다. 상기와 같은 검정법은 예를 들면, 문헌[Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 달리, T 세포 증식의 검출은 공지된 여러가지 기술로 수행할 수 있다. 예를 들면, T 세포 증식은 DNA 합성의 증가된 속도를 측정함으로써(예를 들면, T 세포의 배양물을 적정된 티미딘으로 펄스-표지시키고 DNA중으로 혼입된 적정 티미딘의 양을 측정함으로써) 수행할 수 있다. T 세포 증식을 검출하는 다른 방법은 인터류킨-2(IL-2) 생산량, Ca2+ 유입량, 또는 예를 들면, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨과 같은 염료 흡수량에서의 증가량을 측정하는 것이다. 달리, 림포카인 (예, 인터페론-감마)의 합성을 측정할 수 있거나 WT1 폴리펩타이드에 반응할 수 있는 T 세포의 상대적인 수를 정량할 수 있다. WT1 폴리펩타이드(200 ng/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 ng/㎖ 내지 25 ㎍/㎖)와 3 내지 7일간 접촉시키면 T 세포 증식이 2배 이상 증가하고/하거나 상기한 바와 같이 2 내지 3시간 접촉시키면, 사이토킨 방출(예, TNF 또는 IFN-γ) 수준에 있어서 2배 수준이 T 세포 활성화의 지표인 표준 사이토킨 검정법을 사용하여 측정한 바, T 세포가 활성화된다[참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience(Greene 1998)]. WT1 특이적 T 세포는 표준 기술을 사용하여 증대시킬 수 있다. 바람직한 양태로, T 세포는 환자 또는 관련 또는 비관련 공여체로부터 유도시켜, 자극시키고 증대시킨 후, 환자에게 투여한다.
WT1 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 WT1-발현 APC에 대한 반응으로 활성화되는 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+일 수 있다. CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 특이적 활성은 여러가지 방법으로 검출할 수 있다. 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 방법으로는 T 세포의 증식, 사이토킨(예, 림포카인)의 생산, 또는 세포용해 활성의 발생(즉, WT1에 대해 특이적인 세포독성 T 세포의 생성)을 검출하는 것이다. CD4+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 T 세포의 증식을 검출하는 것이다. CD8+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 세포용해 활성의 발생을 검출하는 것이다.
치료 목적의 경우, WT1 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 APC에 대한 반응으로 증식하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 수 많은 시험관내 또는 생체내로 증대시킬 수 있다. 상기와 같은 T 세포 시험관내 증식은 여러가지 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, T 세포를 인터류킨-2와 같은 T 세포 성장 인자 및/또는 WT1 폴리펩타이드를 합성하는 자극체 세포를 첨가하거나 첨가하지 않고 WT1 폴리펩타이드에 재-노출시킬 수 있다. CD8+ T 세포 반응을 발생시킬 경우 자극체 세포의 첨가가 바람직하다. T 세포는 WT1 폴리펩타이드를 사용한 간헐적 재자극에 대한 반응으로 특이성을 보유하면서 시험관내에서 다수로 성장시킬 수 있다. 간략해서, 1차 시험관내 자극(in vitro stimulation, IVS)의 경우, 다수의 임파구(예, 4 x 107 이상)를 사람의 혈청을 함유하는 배지와 함께 플라스크에 넣을 수 있다. WT1 폴리펩타이드(예, 10 ㎍/㎖의 펩타이드)를 직접, 파상풍 독소(예, 5 ㎍/㎖)와 함께 가할 수 있다. 이어서 플라스크를 항온처리할 수 있다(예, 37 ℃에서 7일간). 2차 IVS의 경우, T 세포를 회수하여 2 내지 3 x 107의 조사된 말초 혈액 단핵 세포와 함께 새로운 플라스크에 넣는다. WT1 폴리펩타이드(예, 10 ㎍/㎖)를 직접 가한다. 플라스크를 37 ℃에서 7일간 항온처리한다. 2차 IVS후 2일 및 4일째에, 인터류킨-2(IL-2) 2 내지 5 단위를 가할 수 있다. 3차 IVS의 경우, T 세포를 웰에 넣고 펩타이드로 피복시킨 각 개체 자체의 EBV 형질전환된 B 세포로 자극할 수 있다. IL-2를 각 사이클의 2일 및 4일째에 가할 수 있다. 세포가 특이적 세포독성 T 세포인 것으로 밝혀지면, 이들을 고농도의 IL-2(20 단위)를 사용하여 2일, 4일 및 6일째에 10일간의 자극 사이클을 사용하여 증대시킬 수 있다.
달리, WT1 폴리펩타이드의 존재하에서 증식하는 T 세포 하나 이상을 클로닝시켜 수적으로 증대시킬 수 있다. 세포를 클로닝시키는 방법은 당해 분야에 숙지되어 있으며, 제한 희석법이 있다. 반응체 T 세포를 감작된 환자의 말초 혈액으로부터 밀도 구배 원심분리 및 양(sheep) 적혈구로 세팅시켜 정제하여 조사시킨 자가 충전 세포의 존재하에서 공칭 항원으로 자극시켜 배양물에서 확립할 수 있다. CD4+ T 세포주를 발생시키기 위하여, WT1 폴리펩타이드를 항원성 자극체로 사용하고 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스로 감염시켜 불멸화시킨 자가 말초 혈액 임파구(PBL) 또는 임파아구 세포주(LCL)를 항원 제시 세포로 사용한다. CD8+ T 세포주를 발생시키기 위하여, WT1 폴리펩타이드를 생산하는 발현 벡터로 형질감염시킨 자가 항원-제시 세포를 자극체 세포로 사용할 수 있다. 확립된 T 세포주를 2 내지 4일간 클로닝시킨 다음 자극된 T 세포를 96개-웰 평판 플레이트중의 웰당 0.5 세포의 빈도로 조사시킨 PBL 또는 LCL 세포 및 재조합 인터류킨-2(rIL-2)(50 U/㎖)와 함께 플레이팅시켜 항원 자극시킬 수 있다. 클론 성장이 확립된 웰은 초기 플레이팅후 대략 2 내지 3주 후 확인하여 자가 항원-제시 세포의 존재하에서 적절한 항원으로 다시 자극시킨 다음, 항원 자극후 2 내지 3일 경과후 낮은 투여량의 rIL2(10 U/㎖)를 첨가하여 증대시킬 수 있다. T 세포 클론은 항원 및 rIL2로 주기적으로, 대략 2주 마다 재자극시켜 24개-웰 플레이트에 유지시킬 수 있다.
특정 양태로, 동종이형성 T-세포를 생체내 및/또는 시험관내에서 프라이밍(즉, WT1에 대해 감작)시킬 수 있다. 상기와 같은 프라이밍은 T 세포를, T 세포를 프라이밍시키기에 충분한 조건 및 시간하에서, WT1 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 생산하는 세포와 접촉시킴으로써 수행할 수 있다. 일반적으로, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 표준 증식법, 크롬 방출 및/또는 사이토킨 방출 검정법으로 측정한 바, WT1 폴리펩타이드와의 접촉으로 T 세포가 증식되고/되거나 활성화될 경우 T 세포가 프라이밍된 것으로 간주된다. 천연 대조군과 비교하여, 증식 또는 용해에 있어서의 증가가 2배 이상, 및 사이토킨 수준에서의 증가가 3배 이상인 자극 지수는 T-세포 특이성을 나타낸다. 시험관내로 프라이밍시킨 세포는 예를 들면, 골수 이식 또는 공여체 임파구 주입에 사용될 수 있다.
약제학적 조성물 및 백신
특정 양태로, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항체 및/또는 T 세포를 약제학적 조성물 또는 백신중에 혼입시킬 수 있다. 달리, 약제학적 조성물이 항원-제시 세포가 WT1 폴리펩타이드를 발현시키도록 WT1 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킨 항원-제시 세포(예, 수지상 세포)를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 상기와 같은 화합물 또는 세포 하나 이상과 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 특정 백신은 상기와 같은 화합물 또는 세포 하나 이상과 비-특이적 면역 반응 증강제, 예를 들면, (화합물이 혼입되어 있는) 애주번트 또는 리포좀을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물 및 백신은 추가로 문헌[미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호]에 기재되어 있는, 생물분해성 미세구와 같은 운반 시스템을 함유할 수 있다. 본 발명의 범주내의 약제학적 조성물 및 백신은 또한 생물학적으로 활성 또는 불활성일 수 있는 다른 화합물을 함유할 수 있다.
특정 양태로, 약제학적 조성물 및 백신은 사람과 같은 환자에서 WT1 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포 반응을 일으키도록 디자인된다. 일반적으로, T 세포 반응은 상대적으로 짧은 폴리펩타이드(예, 천연 폴리펩타이드의 연속적인 아미노산 잔기를 23개 미만, 바람직하게는 4 내지 16개, 더욱 바람직하게는 8 내지 16개, 더더욱 바람직하게는 8 내지 10개 포함하는 것)를 사용함으로써 유리해질 수 있다. 달리, 또는 추가로, 백신은 T 세포 반응을 우선적으로 증강시키는 비-특이적 면역 반응 증강제를 포함할 수 있다. 다시 말해서, 면역 반응 증강제는 항체 반응을 증강시키는 양 보다 크게 비례적인 양으로 WT1 폴리펩타이드에 대한 T 세포 반응의 수준을 증강시킬 수 있다. 예를 들면, CFA와 같은 표준 오일-계 애주번트와 비교할 경우, T 세포 반응을 우선적으로 증강시키는 면역 반응 증강제는 WT1-네가티브 대조군과 비교하여, 증식성 T 세포 반응을 적어도 2배 증강시키며, 용해성 반응을 적어도 10% 증강시키고/시키거나 T 세포 활성화를 적어도 2배 증강시킬 수 있는 반면, 항체 반응은 검출가능할 정도로 증강시키지 않는다. WT1 폴리펩타이드에 대한 T 세포 또는 항체 반응을 증강시키는 양은 일반적으로 본 명세서에 제공되는 기술과 같이, 당해 분야에 공지된 대표적인 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
약제학적 조성물 또는 백신은 상기한 바와 같은 폴리펩타이드 하나 이상을 암호화하는 DNA를 함유할 수 있으며, 상기 폴리펩타이드는 원위치(in situ)에서 생성된다. 상기한 바와 같이, DNA는 핵산 발현 시스템, 세균성 및 바이러스성 발현 시스템 및 포유동물 발현 시스템을 포함하여, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 여러가지 운반 시스템에 존재할 수 있다. 적합한 핵산 발현 시스템은 환자에서 발현에 필수적인 DNA, cDNA 또는 RNA 서열(예를 들면, 적합한 프로모터 및 종결 시그날)을 함유한다. 세균성 운반 시스템은 폴리펩타이드의 면역원성 부위를 이의 세포 표면상에서 발현시키는 세균(예를 들면, 바실루스-칼메테-구에린; Bacillus-Calmette-Guerrin)의 투여와 관계가 있다. 바람직한 양태로, 상기 DNA를 비-병원성(감염성), 복제 경쟁 바이러스를 사용할 수 있는 바이러스성 발현 시스템(예, 백시니아 또는 기타 천연두 바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스)를 사용하여 도입시킬 수 있다. DNA를 상기와 같은 발현 시스템중으로 도입시키는 기술은 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있다. DNA는 또한 예를 들면, 문헌[Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993]에 기재되어 있으며 문헌[Cohen, Science 259:1691-1692, 1993]에 의해 재고된 바와 같이 "나상(naked)" 것일 수 있다. 나상 DNA의 흡수는 세포중으로 효율적으로 운반하는 생물분해성 비드상에 DNA를 코팅시킴으로써 증가될 수 있다.
상기한 바와 같이, 약제학적 조성물 또는 백신은 WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 항원-제시 세포를 포함할 수 있다. 치료용일 경우, 본원에 기재된 바와 같이, 항원 제시 세포가 자가 수지상 세포인 것이 바람직하다. 상기와 같은 세포는 문헌[Reeves et al., Cancer Res. 56:5672-5677, 1996; Tuting et al., J. Immunol. 160:1139-1147, 1998; and Nair et al., Nature Biotechnol. 16:364-369, 1998]에 기재된 것들과 같은, 표준 기술을 사용하여 제조하여 형질감염시킬 수 있다. 항원-제시 세포의 표면상에서 WT1 폴리펩타이드의 발현은 본원에 기재된 바와 같은, 시험관내 자극 및 표준 증식법 뿐만 아니라 크롬 방출 검정법으로 확인할 수 있다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 적합한 담체를 본 발명의 약제학적 조성물에서 사용할 수 있는데, 담체의 종류는 투여 방식에 따라서 변화된다. 본 발명의 조성물은 예를 들면, 국소, 경구, 비강, 정맥내, 두개내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함한, 적절한 투여 방식에 따라 제형화할 수 있다. 피하 주사와 같은, 비경구 투여의 경우, 바람직한 담체는 물, 염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충제이다. 경구 투여의 경우, 상기 담체중 하나 또는, 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트와 같은 고체 담체를 사용할 수 있다. 생물분해성 미세구(예, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 또한 본 발명의 약제학적 조성물용 담체로 사용할 수 있다. 특정 국소용의 경우, 숙지된 성분을 사용하는 크림 또는 로션과 같은 제형이 바람직하다.
상기와 같은 조성물은 또한 완충제(예, 중성 완충된 염수 또는 인산염 완충된 염수), 탄수화물(예, 글루코오스, 만노오스, 슈크로오스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산(예, 글리신), 항산화제, 킬레이트화제(예, EDTA 또는 글루타티온), 애주번트(예, 수산화알루미늄) 및/또는 방부제를 포함할 수 있다. 달리, 본 발명의 조성물을 동결건조물로 제형화할 수 있다. 화합물을 또한 숙지된 기술을 사용하여 리포좀내에 캡슐화할 수 있다.
애주번트와 같은, 여러가지 비-특이적 면역 반응 증강제를 본 발명의 백신에서 사용할 수 있다. 대부분의 애주번트는 수산화알루미늄 또는 광유와 같이, 신속한 대사로부터 항원을 보호하도록 디자인된 물질, 및 지질 A, 보르타델라 퍼투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 유래된 단백질과 같이, 면역 반응의 자극체를 함유한다. 적합한 비-특이적 면역 반응 증강제로는 알루미늄-계 애주번트[예, 알하이드로겔(Alhydrogel), 레하이드라겔(Rehydragel), 인산알루미늄, 알가물린 (Algammulin), 수산화알루미늄]; 오일-계 애주번트[프로인트 애주번트(FA), 스페콜(Specol), RIBI, 타이터맥스(TiterMax), 몬타나이드(Montanide) ISA50 또는 세픽 몬타나이드(Seppic MONTANIDE) ISA 720]; 사이토킨(예, GM-CSF 또는 Flat3-리간드); 미세구; 비이온성 블록 공중합체-계 애주번트; 디메틸 디옥타데실 암모늄브로마이드(DDA)-계 애주번트 AS-1, AS-2(제조원: Smith Kline Beecham); Ribi 애주번트 시스템-계 애주번트; QS21(제조원: Aquila); 사포닌-계 애주번트(조질 사포닌, 사포닌 Quil A); SAF와 같은 무라밀 디펩타이드(MDP)-계 애주번트(미세유체화 형태의 Syntex 애주번트(SAF-m)); 디메틸-디옥타데실 암모늄 브로마이드(DDA); 사람의 보체-계 애주번트 엠. 백캐(m. vaccae) 및 유도체; 면역 자극 복합체(iscom)-계 애주번트; 불활성화된 독소; 및 약독화된 감염제(예, M. tuberculosis)가 있다.
상기한 바와 같이, 특정 양태로, 면역 반응 증강제(예, CD4+ 및/또는 CD8+)는 WT1 폴리펩타이드에 대한 T 세포 반응을 우선적으로 도출시키거나 증강시키는 능력에 따라 선택한다. 상기와 같은 면역 반응 증강제는 당해 분야에 숙지되어 있으며, 몬타나이드 ISA50, 세픽 몬타나이드 ISA 720, 사이토킨(예, GM-CSF, Flat3-리간드), 미세구, 디메틸 디옥타데실 암모늄브로마이드(DDA)-계 애주번트, AS-1(제조원: Smith Kline Beecham), AS-2(제조원: Smith Kline Beecham), Ribi 애주번트 시스템-계 애주번트, QS21(제조원: Aquila), 사포닌-계 애주번트(조질 사포닌, 사포닌 Quil A), 미세유체화된 형태의 Syntex 애주번트(SAF-m), MV, ddMV(Genesis), 면역 자극 복합체(iscom)-계 애주번트 및 불활성화된 독소가 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 조성물 및 백신은 서방출 제형(즉, 투여후 화합물을 느리게 방출시키는 캡슐 또는 스폰지와 같은 제형)의 일부로 투여할 수 있다. 상기와 같은 제형은 일반적으로 숙지된 기술을 사용하여 제조하고, 예를 들면, 경구, 직장 또는 피하 이식에 의해, 또는 목적하는 표적 부위에 이식함으로써 투여할 수 있다. 서방출 제형은 담체 매트릭스중에 분산되고/되거나, 속도 조절막으로 둘러싸인 저장소내에 함유되어 있는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항체 또는 세포를 함유할 수 있다. 상기와 같은 제형에서 사용하기 위한 담체는 생체적합성이며, 또한 생물분해성일 수 있고; 상기 제형이 상대적으로 일정한 활성 성분 방출 수준을 제공하는 것이 바람직하다. 서방출 제형내에 함유되어 있는 활성 화합물의 양은 이식 부위, 방출 속도 및 예측되는 방출 기간 및 치료 또는 예방할 질환의 특성에 따른다.
악성 질환의 치료
본 발명의 추가의 양태로, 본원에 기재된 조성물 및 백신을 사용하여 악성 질환(예, 진행성 또는 전이성 질환 또는 최소 잔류 질환과 같은 소종양으로 특징되는 질환)의 발달을 억제할 수 있다. 일반적으로, 상기와 같은 방법을 사용하여 WT1 발현과 관련있는 질환을 예방, 지연 또는 치료할 수 있다. 다시 말해서, 본 발명에서 제공되는 치료 방법을 사용하여 존재하는 WT1-관련 질환을 치료할 수 있거나, 질병이 없거나 WT1 발현과는 아직 관련되어 있지 않은 질병에 걸린 환자에 있어서 상기와 같은 질환의 발병을 방지 또는 지연시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 질환은 질병 과정중 일정 시점에서 질병에 걸린 세포(예, 종양 세포)가 동일조직의 정상 세포 보다 검출가능할 정도로 높은 수준의 WT1 폴리펩타이드를 발생시킬 경우 "WT1 발현과 관련된" 것이다. 악성 질환과 WT1 발현과의 연관은 WT1이 종양에 존재하는 것을 필요로하지 않는다. 예를 들면, WT1의 과발현은 종양의 개시와 연관될 수 있지만, 단백질 발현은 실질적으로 없을 수 있다. 달리, WT1 발현에서의 증가로 특징되지 않는 악성 질환은 더욱 이후에, 증가된 WT1 발현으로 특징되는 질환으로 진행될 수 있다. 따라서, 질병에 걸린 세포가 먼저 발현되었거나, 현재 발현시키거나 또는 증가된 수준의 WT1를 실질적으로 발현시킬 것으로 예상되는 악성 질환을 "WT1 발현과 관련된" 것으로 간주한다.
면역요법은 본 발명에서 제공되는 화합물 또는 세포가 환자로부터 WT1-발현 세포를 제거하는 작용을 하는, 여러가지 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 상기와 같은 제거는 WT1 또는 WT1을 발현시키는 세포에 대해 특이적인 환자에서의 면역 반응을 증강시키거나 유발시킬 수 있다. 달리, WT1-발현 세포를 (예를 들면, 자가 골수, 말초 혈액, 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물로 처리함으로써) 체외로 제거할 수 있다. 골수 또는 말초 혈액의 분획물은 당해 분야의 표준 기술을 사용하여 수득할 수 있다.
상기와 같은 방법에서, 약제학적 조성물 및 백신을 환자에게 투여할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "환자"는 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 말한다. 환자는 악성 질환에 걸릴 수 있거나 걸리지 않을 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물 및 백신을 사용하여 질병의 발병을 방지하거나(즉, 예방적으로), (예를 들면, 존재하는 질환의 진행 및/또는 전이를 방지 또는 지연시키기 위하여) 질병에 걸린 환자를 치료할 수 있다. 질환에 걸린 환자는 최소의 잔류 질병(예를 들면, 완전히 또는 부분적으로 치유된 백혈병 환자 또는 외과시술 방사선요법 및/또는 화학요법후 종양을 감소시킨 후의 암환자)을 가질 수 있다. 상기와 같은 환자를 면역시켜 재발을 억제(즉, 재발 방지 또는 지연, 또는 재발 심화도의 감소)할 수 있다. 특정의 바람직한 양태로, 환자는 WT1 포지티브(즉, 본원에서 제공되는 바와 같이, 항-WT1 항체와 검출가능하게 반응하거나, 본원에 기재된 바와 같은, RT-PCR에 의해 검출가능한 수준으로 WT1 mRNA를 발현시킴)인,백혈병(예, AML, CML, ALL 또는 소아기 ALL), 척수이형성 증후(MDS) 또는 암(예, 위장암, 폐암, 갑상선암 또는 유방암 또는 흑색종)에 걸린 환자이거나, WT1-발현 세포에 대해 유도된 자가면역 질환에 걸린 환자이다.
본 발명에서 제공되는 조성물은 단독으로 또는 외과시술, 방사선조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가, 유전적 동계성, 동종 이형성 또는 비관련)과 같은 통상의 치료 방법과 함께 사용할 수 있다. 이후 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 결합제 및 T 세포를 자가 줄기세포(stem cell)를 퍼징시키는데 사용할 수 있다. 상기와 같은 퍼징은 예를 들면, 골수 이식 또는 혈액 또는 이의 성분의 주입전에 유익할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 결합제, T 세포, 항원 제시 세포(APC) 및 조성물은 또한 자가, 동종 이형성, 유전적 동계성 또는 비관련 WT1-특이적 T-세포를 시험관내 및/또는 생체내 증대시키고 자극(또는 프라이밍)시키는데 사용할 수 있다. 상기와 같은 WT1-특이적 T 세포는 예를 들면, 공여체 임파구 주입에 사용될 수 있다.
투여 경로 및 빈도, 뿐만 아니라 투여량은 개체 마다 변화되며, 표준 기술을 사용하여 용이하게 확립할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예, 피부내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비강내로(예, 흡인에 의해) 또는 경구적으로 투여할 수 있다. 일부 종양에서는, 약제학적 조성물 또는 백신을 국소적으로(예를 들면, 직장결장경검사법, 위경검사법, 비디오내경검사법, 혈관조영법 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법으로) 투여할 수 있다. 52주에 걸쳐 1 내지 10회 투여량을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 1개월 간격으로 6회 투여량을 투여하고, 이후 주기적으로 부스터 백신접종하는 것이 바람직하다. 환자에 따라 다른 프로토콜이 적합할 수 있다. 적합한 투여량은 상기한 바와 같이 투여시, 항-종양 면역 반응을 기본(즉, 비처리) 수준 보다 10 내지 50% 이상 촉진시킬 수 있는 화합물의 양이다. 상기와 같은 반응은 환자에서 항-종양 항체를 측정하거나 환자의 종양 세포를 시험관내에서 사멸시킬 수 있는 세포파괴 효과기 세포의 백신-의존성 생성에 의해 모니터할 수 있다. 상기와 같은 백신은 또한 비-백신접종된 환자와 비교하여, 백신접종된 환자에서 임상적 결과를 개선시키는 면역 반응(예를 들면, 더욱 빈번한 완전 또는 부분적 치유 또는 더욱 장기간의 질병-없는 및/또는 전체적인 생존 기간)을 또한 일으킬 수 있어야 한다. 일반적으로, 폴리펩타이드 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물 및 백신의 경우, 투여량중에 존재하는 각 폴리펩타이드의 양의 범위는 약 100 ㎍ 내지 5 ㎎이다. 적합한 투여량 크기는 환자의 크기에 따라 변화되지만, 전형적으로 약 0.1 ㎖ 내지 약 5 ㎖ 범위이다.
일반적으로, 적절한 투여량과 치료 방법은 치료적 및/또는 예방적 잇점을 제공하기에 충분한 양으로 활성 화합물을 제공한다. 상기와 같은 반응은 비-치료 환자와 비교하여 치료된 환자에서 개선된 임상적 결과(예를 들면, 더욱 빈번한 완전 또는 부분적 치유 또는 더욱 장기간의 질병-없는 및/또는 전체적인 생존 기간)을 확립시킴으로써 모니터할 수 있다. WT1에 대한 이미 존재하는 면역 반응에서의 증가는 일반적으로 개선된 임상적 결과와 관계가 있다. 상기와 같은 면역 반응은 일반적으로 치료전 및 후의 환자로부터 수득한 샘플을 사용하여 수행할 수 있는, 표준 증식법, 세포독성 또는 사이토킨 검정법을 사용하여 평가할 수 있다.
추가의 양태로, WT1 발현과 관련된 악성 질환의 발달을 억제하는 방법은 상기한 바와 같이, WT1 폴리펩타이드 또는 WT1-발현 APC에 대한 반응으로 활성화되는 자가 T 세포를 투여하는 것이다. 상기와 같은 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+일 수 있으며, 상기한 바와 같이 증식시킬 수 있다. T 세포는 개체에게 악성 질환의 발달을 억제하는데 유효한 양으로 투여할 수 있다. 전형적으로 약 1 x 109 내지 1 x 1011 T 세포/M2를 정맥내, 공동내 또는 절제된 종양층내에 투여한다. 세포의 수와 투여 빈도가 환자의 반응에 따른다는 것은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다.
특정 양태로, 자가 골수 이식전에 T 세포를 자극할 수 있다. 상기와 같은 자극은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 시험관내 자극의 경우, 환자로부터 수득한 골수 및/또는 말초 혈액(또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물)을, 상기한 바와 같이 T 세포를 자극시키기에 충분한 조건 및 시간하에, WT1 폴리펩타이드, WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 APC와 접촉시킬 수 있다. 이후 골수, 말초 혈액 줄기세포 및/또는 WT1-특이적 T 세포를 환자에게 표준 기술을 사용하여 투여할 수 있다.
관련 양태로, 관련 또는 비관련 공여체의 T 세포를 유전적 동계성 또는 동종 이형성(관련 또는 비관련) 골수 이식전에 자극시킬 수 있다. 상기와 같은 자극은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 시험관내 자극의 경우, 관련 또는 비관련 공여체로부터 수득한 골수 및/또는 말초 혈액(또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물)을, 상기한 바와 같이 T 세포를 자극시키기에 충분한 조건 및 시간하에, WT1 폴리펩타이드, WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 APC와 접촉시킬 수 있다. 이후 골수, 말초 혈액 줄기세포 및/또는 WT1-특이적 T 세포를 환자에게 표준 기술을 사용하여 투여할 수 있다.
다른 양태로, 본원에 기재된 바와 같은 WT1-특이적 T 세포를 사용하여 자가 골수, 말초 혈액, 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물(예를 들면, 환자에게 투여전 CD34+ 강화된 말초 혈액(PB))로부터 WT1을 발현시키는 세포를 제거할 수 있다. 상기와 같은 방법은 골수 또는 PB를 상기와 같은 T 세포와, WT1 발현 세포를 골수 또는 말초 혈액 중 골수 또는 임파성 세포의 총수의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만으로 감소시키기에 충분한 조건 및 시간하에서 접촉시킴으로써 수행할 수 있다. 상기와 같은 세포가 제거되는 정도는 예를 들면, 정량적 및 정성적 PCR 분석, 형태학, 면역조직화학 및 FACS 분석과 같은 표준 방법으로 용이하게 측정할 수 있다. 이후, 골수 또는 PB(또는 이들의 분획물)를 환자에게 표준 기술을 사용하여 투여할 수 있다.
진단법
본 발명은 또한, WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 검출법, 및 상기와 같은 질환의 면역화 또는 치료 효과를 모니터하는 방법을 제공한다. 상기와 같은 방법은 본 발명에서, WT1 단백질에 대해 특이적인 면역 반응을 상기와 같은 질병에 걸린 환자에서 검출할 수 있다는 발견을 기본으로하며, 상기와 같은 면역 반응을 증강시키는 방법은 예방적 또는 치료적 잇점을 제공할 수 있다.
WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 존재 또는 부재를 결정하기 위하여, 환자를 WT1에 대해 특이적인 T 세포의 수준에 대해 시험할 수 있다. 특정 방법으로, 환자로부터 단리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 WT1 폴리펩타이드, WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 APC와 항온처리하고, T 세포의 특이적 활성화의 존재 또는 부재를 본원에 기재된 바와 같이 검출한다. 적합한 생물학적 샘플로는, 비제한적으로, 단리된 T 세포가 있다. 예를 들면, T 세포를 환자로부터 통상의 기술(예, 말초 혈액 임파구의 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리에 의해)로 단리시킬 수 있다. T 세포를 시험관내에서 2 내지 9일간(전형적으로 4일) 37 ℃에서 WT1 폴리펩타이드(예, 5 내지 25 ㎍/㎖)와 항온처리할 수 있다. T 세포의 다른 분취량을 WT1 폴리펩타이드 부재하에서 항온처리하여 대조군으로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. CD4+ T 세포의 경우, T 세포의 증식을 평가함으로써 활성화를 검출하는 것이 바람직하다. CD8+ T 세포의 경우, 세포용해 활성을 평가함으로써 활성화를 검출하는 것이 바람직하다. 질병이 없는 환자에서보다 증식 수준이 2배 이상이고/이거나, 세포용해 활성이 20% 이상일 경우 WT1 발현과 관련있는 악성 질환이 존재함을 나타낸다. 당해 분야에 숙지된 방법을 사용하여, 증식 및/또는 세포용해 활성의 수준과 치료에 대해 예측되는 반응간에 상관관계를 만들 수 있다. 특히, 더 높은 항체, 증식성 및/또는 용해성 반응을 나타내는 환자는 치료에 대해 더 큰 반응을 나타낼 것으로 예측할 수 있다.
다른 방법으로, 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 WT1에 대해 특이적인 항체 수준에 대해 시험한다. 생물학적 샘플을 WT1 폴리펩타이드, WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 APC와 면역 복합체를 형성시키기에 충분한 조건 및 시간하에서 항온처리한다. WT1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 생물학적 샘플중 WT1 폴리펩타이드와 항체간에 형성된 면역 복합체를 검출한다. 상기와 같은 방법에서 사용하기위한 생물학적 샘플은 항체를 함유할 것으로 생각되는 환자로부터 수득한 샘플일 수 있다. 적합한 생물학적 샘플로는 혈액, 혈청, 복수, 골수, 흉막 삼출액, 및 뇌척수액이 있다.
생물학적 샘플을 WT1 폴리펩타이드와 반응 혼합물로 폴리펩타이드와 WT1에 대해 특이적인 항체간에 면역 복합체를 형성시키기에 충분한 조건 및 시간하에 항온처리한다. 예를 들면, 생물학적 샘플과 WT1 폴리펩타이드를 4 ℃에서 24 내지 48시간 동안 항온처리할 수 있다.
항온처리후, 반응 혼합물을 면역 복합체의 존재에 대해 시험한다. WT1 폴리펩타이드와 생물학적 샘플중에 존재하는 항체간에 형성된 면역 복합체의 검출은 여러가지 공지된 기술로, 예를들면, 방사선면역검정법(RIA) 및 효소 결합된 면역흡착성 검정법(ELISA)로 수행할 수 있다. 적합한 검정법은 당해 분야에 숙지되어 있으며 과학 및 특허 문헌에 충분히 설명되어 있다[예를 들면, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 사용할 수 있는 검정법으로는, 비제한적으로, 데이비드 등의 이중 모노클로날 항체 샌드위치 면역검정 기술[David et al., 미국 특허 제4,376,110호]; 모노클로날-폴리클로날 항체 샌드위치 검정법[Wide et al., Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh, 1970]; 고든 등의 "웨스턴 블롯"법[Gordon et al., 미국 특허 제4,452,901호]; 표지된 리간드의 면역침전법[Brown et al., J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980]; 효소-결합된 면역흡착성 검정법[Raines and Ross, J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982]; 플루오로크롬의 사용을 포함하는 면역세포화학 기술[Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39:477, 1980]; 및 활성의 중화법[Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400, 1984]이 있다. 다른 면역검정법으로는, 비제한적으로, 문헌[미국 특허 제3,817,827호; 제3,850,752호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 및 제4,098,876호]에 기재된 것들이 있다.
검출을 위하여, WT1 폴리펩타이드를 표지시키거나 표지시키지 않을 수 있다. 비표지된 WT1 폴리펩타이드는 응집반응 검정법 또는 면역 복합체에 결합하는 표지된 검출 시약(예, WT1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체와 결합할 수 있는 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴 및 2차 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)과 함께 사용할 수 있다. WT1 폴리펩타이드를 표지시킨 경우, 리포터 그룹은 방사성동위원소, 형광 그룹, 발광 그룹, 효소, 바이오틴 및 염료 입자를 포함한, 당해 분야에 공지된 적합한 리포터 그룹일 수 있다.
특정 검정법에서, 비표지된 WT1 폴리펩타이드를 고체 지지체상에 고정화시킨다. 고체 지지체는 폴리펩타이드가 부착될 수 있는, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 재질일 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체가 미세역가 플레이트중의 시험 웰 또는 니트로셀룰로오스 또는 기타 적합한 막일 수 있다. 달리, 지지체가 유리, 유리섬유, 라텍스 또는 플라스틱재(예, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)와 같은, 비드 또는 디스크일 수 있다. 지지체는 또한 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,359,681호]에 기재된 바와 같은, 자기 입자 또는 섬유 광학 센서일 수 있다. 폴리펩타이드는 특허 및 과학 문헌에 상세하게 설명되어 있는, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 여러가지 기술을 사용하여 고체 지지체상에 고정화시킬 수 있다. 본 발명에서, 용어 "고정화"는 흡착과 같은 비공유결합성 결합과 공유결합성 부착(이는 항원과 지지체상의 작용 그룹간의 직접적인 결합일 수 있거나 가교-결합제에 의한 결합일 수 있다) 둘 다를 말한다. 미세역가 플레이트 중의 웰 또는 막으로의 흡착에 의한 고정화가 바람직하다. 상기와 같은 경우, WT1 폴리펩타이드를 적합한 완충액중에서, 고체 지지체와 적절한 시간 동안 접촉시킴으로써 흡착시킬 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 변화되지만, 전형적으로 약 1시간 내지 약 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 미세역가 플레이트(예, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 웰을 약 10 ng 내지 약 10 ㎍, 바람직하게는 약 100 ng 내지 약 1 ㎍ 범위 양의 폴리펩타이드와 접촉시키는 것이 적절한 양의 폴리펩타이드를 고정화시키는데 충분하다.
고정화시킨 다음, 지지체상의 나머지 단백질 결합 부위는 전형적으로 차단한다. 소혈청 알부민, Tween 20™(제조원: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 열-불활성화된 정상 염소 혈청(NGS), 또는 BLOTTO(방부제, 염, 및 거포제를 함유하는 탈지 건조 우유의 완충 용액)와 같은, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적합한 차단제가 있다. 이후 지지체를 특이적 항체를 함유할 것으로 생각되는 생물학적 샘플과 함께 항온처리한다. 샘플을 순수한 상태로 적용할 수 있거나, 더욱 흔하게는, 통상적으로 소량(0.1 내지 5.0 중량%)의 단백질(예, BSA, NGS, 또는 BLOTTO)을 함유하는 완충 용액중에 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적절한 접촉 시간(즉, 항온처리 시간)은 항체를 함유하는 샘플내에서 WT1과 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하기에 충분한 기간이다. 접촉 시간은 결합 및 미결합 항체간 평형에서 달성되는 결합 수준이 약 95% 이상 달성되기에 충분한 것이 바람직하다. 당해 분야의 숙련가들은 평형을 달성하는데 필요한 시간은 시간 경과에 따라 일어나는 결합 수준을 검정함으로써 용이하게 측정할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 실온에서 약 30분의 항온처리 시간이 일반적으로 충분하다.
이후 미결합 샘플은 0.1% Tween 20™을 함유하는 PBS와 같은, 적절한 완충액으로 고체 지지체를 세척함으로써 제거할 수 있다. 면역 복합체에 결합하며 리포터 그룹을 포함하는 검출 시약을 가할 수 있다. 검출 시약을 면역 복합체와 함께 결합된 항체를 검출하기에 충분한 시간 동안 항온처리한다. 적절한 시간은 일반적으로 시간 경과에 따라 일어나는 결합 수준을 검정함으로써 결정할 수 있다. 미결합 검출 시약을 제거하고 결합된 검출 시약은 리포터 그룹을 사용하여 검출한다. 리포터 그룹의 검출에 사용되는 방법은 리포터 그룹의 특성에 따른다. 방사성 그룹의 경우, 섬광 계수법 또는 방사선사진법이 일반적으로 적절하다. 분광법을 사용하여 염료, 발광 그룹 및 형광 그룹을 검출할 수 있다. 바이오틴은 상이한 리포터 그룹(통상적으로 방사성 또는 형광 그룹 또는 효소)에 커플링된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터 그룹(예, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제 및 글루코오스 옥시다제)는 일반적으로 기질을 첨가한 다음(일반적으로 특정 기간 동안), 반응 생성물을 분광 또는 기타 분석법으로 검출할 수 있다. 사용되는 특정 방법과는 상관없이, 기준치(즉, 질병이 없는 개체로부터 수득한 생물학적 샘플에 대해 관찰된 수준) 보다 2배 이상인 결합된 검출 시약 수준은 WT1 발현과 관련된 악성 질환이 존재함을 나타낸다.
일반적으로, 면역화 또는 치료 효과를 모니터하는 방법은 환자에 있어서 WT1에 대해 특이적인 항체 또는 T 세포의 수준에서의 변화를 모니터하는 것이다. 항체 수준을 모니터하는 방법은 (a) 치료 또는 면역화전의 환자로부터 수득한, 제1의 생물학적 샘플을 WT1 폴리펩타이드와 면역 복합체를 형성시키기에 충분한 조건 및 시간 동안 항온처리하는 단계; (b) WT1 폴리펩타이드와 WT1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 생물학적 샘플중의 항체간에 형성된 면역 복합체를 검출하는 단계; (c) 치료 또는 면역화시킨 후 환자로부터 채취한 제2의 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2의 생물학적 샘플중에서 검출되는 면역 복합체의 수를 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 달리, WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 APC를 WT1 폴리펩타이드 대신 사용할 수 있다. 상기와 같은 방법에서는, 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되거나, APC에 의해 발현되는 WT1 폴리펩타이드와 생물학적 샘플중의 항체간의 면역 복합체를 검출한다.
T 세포 활성화 및/또는 WT1 특이적 전구체의 수를 모니터하는 방법은 (a) 치료 또는 면역화전의 환자로부터 수득한, CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를 포함하는 제1의 생물학적 샘플(예를 들면, 골수, 말초 혈액 또는 이들의 분획물)을 WT1 폴리펩타이드와 T 세포의 특이적 활성화, 증식 및/또는 용해를 일으키기에 충분한 조건 및 시간 동안 항온처리하는 단계; (b) T 세포의 특이적 활성화, 증식 및/또는 용해 양을 검출하는 단계; (c) 치료 또는 면역화시킨 후 환자로부터 채취한, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 제2의 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2의 생물학적 샘플중에 T 세포의 활성화, 증식 및/또는 용해의 양을 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 달리, WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 WT1 폴리펩타이드를 발현시키는 APC를 WT1 폴리펩타이드 대신 사용할 수 있다.
상기와 같은 방법에서 사용하는 생물학적 샘플은 항체, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 함유할 것으로 생각되는 환자로부터 수득한 샘플일 수 있다. 적합한 생물학적 샘플로는 혈액, 혈청, 복수, 골수, 흉막 삼출액 및 뇌척수액이 있다. 제1의 생물학적 샘플은 치료 또는 면역화 개시전 또는 치료 또는 백신접종에 있어서 일부 방법 개시전에 수득할 수 있다. 제2 생물학적 샘플은 유사한 방법으로 수득하지만, 추가의 치료 또는 면역화시킨 다음 수득하여야 한다. 제2 생물학적 샘플은 치료 또는 면역화 완결시, 또는 이의 부분적 방법 완료시 수득하는데, 치료 또는 면역화의 적어도 일부는 제1 및 제2 생물학적 샘플의 단리 사이에 수행되어야 한다.
두 샘플에 대한 항온처리 및 검출 단계는 일반적으로 상기한 바와 같이 수행할 수 있다. 제1 샘플과 비교하여 제2 샘플중 면역 복합체의 수에 있어서 통계적으로 유의적인 증가는 성공적인 치료 또는 면역화를 반영하는 것이다.
다음 실시예는 설명을 목적으로 제한없이 제공된다.
실시예 1
혈액암 환자에 있어서 WT1에 대한 면역 반응의 확인
본 실시예는 혈액암 환자에 있어서 존재하는 면역 반응의 확인을 설명한다.
환자에서 이미 존재하는 WT1 특이적 항체 반응의 존재를 평가하기 위하여, AML, ALL, CML 및 심각한 재생불량성 빈혈 환자의 혈청을 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 분석하였다. 사람의 백혈구 세포주 K562(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 WT1을 면역침전시키는 능력에 대해 혈청을 시험하였다. 각 경우, 면역침전체를 겔 전기영동법에 의해 분리시키고, 막으로 이동시켜 항 WT-1 항체 WT180(제조원: Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)으로 프로브화시켰다. 상기 웨스턴 블롯 분석법으로 혈액암 환자에서 강력한 WT1 특이적 항체가 확인되었다. AML 환자에 대한 결과를 나타내는 대표적인 웨스턴 블롯을 도 2에 나타낸다. 환자 혈청을 사용하여 발생시킨 면역침전체중 52 kD 단백질은 WT1 특이적 항체에 의해 인식되었다. 52 kD 단백질은 포지티브 대조군과 동일한 크기로 이동하였다.
실시예 2
WT1을 발현시키는 세포주로 면역시킨 마우스에 있어서 WT1에 대한 항체의 유발
본 실시예는 생체내에서 WT1 특이적 항체 반응을 유발시키기 위한 WT1 발현 세포의 용도를 설명한다.
백혈병 환자에 있어서 WT1에 대해 존재하는 항체의 검출은 WT1에 대한 면역성을 도출시키기 위하여 WT1 단백질에 대해 면역시킬 수 있음을 강력하게 암시하는 것이다. WT1에 대한 면역성이 백신접종에 의해 발생될 수 있는지 시험하기 위하여, 마우스에게 TRAMP-C, B6 기원의 WT1 포지티브 종양 세포주를 주사하였다. 간략해서, 수컷 B6 마우스를 5 x 106 TRAMP-C 세포로 피하적으로 면역시키고 3주 간격으로 5 x 106 개의 세포로 2회 부스팅시켰다. 최종 면역후 3주 경과후, 혈청을 채취하여 비장의 단일 세포 현탁액을 β-2-머캅토에탄올 25 μM, ㎖당 페니실린 200 단위, 10 mM L-글루타민, 및 10% 태소 혈청이 보충되어 있는 RPMI 1640 배지(제조원: GIBCO)에 제조하였다.
TRAMP-C에 대해 면역시킨 다음, 면역시킨 동물에서 WT1 특이적 항체 반응을 검출할 수 있었다. 대표적인 웨스턴 블롯을 도 3에 나타낸다. 이들 결과는 WT1 단백질에 대한 면역화가 WT1 단백질에 대한 면역 반응을 도출시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 3
WT1 펩타이드로 면역시킨 마우스에서 Th 및 항체 반응의 유발
본 실시예는 WT1에 대해 특이적인 면역 반응을 도출시킬 수 있는, WT1 펩타이드를 사용한 면역화의 능력을 설명한다.
Ab 및 증식성 T 세포 반응을 일으키기에 적합한 펩타이드는 Th 반응을 일으키는 능력을 갖는 펩타이드 모티프를 찾는, Tsites 프로그램[Rothbard and Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996]에 따라서 확인되었다. 표 I에 나타낸 펩타이드가 합성되어 서열화되었다.
면역화용 펩타이드 그룹은 다음과 같다:
그룹 A: p6-22 사람: 1 ㎖중 10.9 ㎎(10 ㎕ = 100 ㎍)
p117-139 사람/마우스: 1 ㎖중 7.6 ㎎(14 ㎕ = 100 ㎍)
p244-262 사람: 1 ㎖중 4.6 ㎎(22 ㎕ = 100 ㎍)
그룹 B: p287-301 사람/마우스: 1 ㎖중 7.2 ㎎(14 ㎕ = 100 ㎍)
마우스 p299-313: 1 ㎖중 6.6 ㎎(15 ㎕ = 100 ㎍)
p421-435 사람/마우스: 1 ㎖중 3.3 ㎎(30 ㎕ = 100 ㎍)
대조군: (FBL 펩타이드 100 ㎍) + CFA/IFA
대조군: (CD45 펩타이드 100 ㎍) + CFA/IFA
그룹 A는 WT1의 아미노 말단 부위(엑손 1)내에 존재하는 펩타이드를 함유하며 그룹 B는 카복시 말단내에 존재하는 펩타이드를 함유하고, 다른 DNA-결합 단백질에 대해 상동성인 서열을 갖는 4개의 징크 핑거 영역(zinc finger region)을 함유하였다. 그룹 B내에, p287-301 및 p299-313은 엑손 7, 징크 핑거 1로부터 유래되며, p421-435는 엑손 10, 징크 핑거 IV로부터 유래되었다.
B6 마우스를 WT1 펩타이드 그룹 또는 대조군 펩타이드로 면역시켰다. 펩타이드를 주사용 멸균수 1 ㎖에 용해시키고, B6 마우스를 3주 간격으로 3회 면역시켰다. 사용되는 애주번트는 CFA/IFA, GM-CSF, 및 몬타나이드이다. WT1에 대해 특이적인 항체의 존재를 실시예 1 및 2에 설명된 바와 같이 측정하고, 증식성 T 세포 반응은 표준 티미딘 혼입 검정법을 사용하여 평가하는데, 이 방법은 세포를 항원의 존재하에서 배양하여 혼입된 방사성을 측정함으로써 증식을 평가하였다[Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]. 특히, 임파구를 96-웰 플레이트에서 웰 당 2x105 개 세포로 조사시킨(3000 rads) 유전적 동계성 비장 세포 4x105 개 및 분해된 펩타이드와 함께 배양시켰다.
그룹 A로 표시된 펩타이드 그룹으로 마우스를 면역시키면 WT1에 대한 항체 반응을 일어났다(도 4). 백신 B에 대해 면역시킨 다음에는 항체가 검출되지 않았는데, 이는 백신 B로 면역시키면 헬퍼 T 세포 반응이 없는 것과 일치하였다. P117-139는 증식성 T 세포 반응을 일으켰다(도 5A 내지 5C). 자극 지수(SI)는 8 내지 72로 변화되었다. 다른 펩타이드(P6-22 및 P299-313)가 또한 증식성 T 세포 반응을 일으키는 것으로 밝혀졌다. P6-22로 면역시키면 자극 지수(SI)가 2.3이 되며 P299-313으로 면역시키면 SI가 3.3이 되었다. 포지티브 대조군으로는 ConA 자극된 T 세포, 뿐만 아니라 공지된 항원, 예를 들면, CD45 및 FBL과 같은 것으로 자극된 T 세포, 및 동종 이형성 T 세포주[DeBruijn et al., Eur. Immunol. 21:2963-2970, 1991]가 있다.
도 6A 및 6B는 백신 A(도 6A) 및 백신 B(도 6B)내의 3개의 펩타이드 각각에 대해 관찰된 증식성 반응을 나타낸다. 백신 A는 면역화 펩타이드 p6-22 및 p117-139에 대한 증식성 T 세포 반응을 일으키며, 이때 자극 지수(SI)는 3 내지 8내에서 변화되었다(벌크 라인). p244-262에 대한 증식성 반응은 검출되지 않았다(도 6A).
후속되는 시험관내 자극은 p6-22 및 p117-139만을 사용하여 단일 펩타이드 자극으로 수행하였다. p117-139를 사용한 백신 A 특이적 T 세포주의 자극으로 p117-139에 대해 증식이 일어나지만 p6-22에 대한 반응은 없었다(도 7A). 상기 세포주로부터 유래된 클론은 p117-139에 대해 특이적이었다(도 7B). 대조적으로, p6-22를 사용하여 백신 A 특이적 T 세포주를 자극하면 p6-22에 대한 증식이 일어났지만 p117-139에 대한 반응은 없었다(도 7C). 상기 세포주로부터 유래된 클론은 p6-22에 대해 특이적이었다(도 7D).
이들 결과는 WT1 펩타이드로 백신접종하면 WT1 단백질에 대한 항체 반응 및 면역화 펩타이드에 대한 증식성 T 세포 반응을 일으킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
WT1 펩타이드로 면역시킨 마우스에서 CTL 반응의 유발
본 실시예는 WT1 펩타이드의 CTL 면역성 도출 능력을 설명한다.
클래스 I MHC에 결합하기에 적절한 모티프를 갖는 펩타이드(9-mers)는 BIMAS HLA 펩타이드 결합 예측 분석법[Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994]을 사용하여 확인하였다. 상기와 같은 분석법으로 확인된 펩타이드를 표 II-XLIV에 나타낸다. 이들 각각의 표에서, 득점은 표시된 MHC 분자에 대한 펩타이드의 이론적 결합 친화도(분리 반감기)를 반영하는 것이다.
Th 반응을 도출시키는 능력을 갖는 펩타이드 모티프를 찾는, Tsites 프로그램[Rothbard and Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996]을 사용하여 확인된 펩타이드를 또한 도 8A 및 8B, 및 표 XLV에 나타낸다.
특정 CTL 펩타이드(표 XLVI에 나타낸 것)는 추가 연구용으로 선택하였다. 표 XLVI중의 각 펩타이드의 경우, BIMAS HLA 펩타이드 결합 예측 분석법을 사용하여 수득한 점수를 제공한다.
C57B1/6 쥐의 MHC에 대한 펩타이드 결합은 문헌[Ljunggren et al., Nature 346:476-480, 1990]에 기재된 바와 같이, 백혈병 세포주 RMA-S를 사용하여 확인하였다. 간략하면, RMA-S 세포를 7시간 동안 26 ℃에서 1% FCS가 보충된 완전 배지중에서 배양시켰다. 총 106 개의 RMA-S 세포를 24-웰 플레이트의 각 웰에 가하고 단독으로 또는 분해된 펩타이드(25 ㎍/㎖)와 함께 16시간 동안 26 ℃에서 배양시키고 추가로 3시간 동안 37 ℃에 완전 배지중에서 배양시켰다. 이후 세포를 3회 세척하고 플루오레신 이소티오시아네이트-항 Db 또는 항-Kb 항체(제조원: PharMingen, San Diego, CA)로 착색시켰다. 표지된 세포를 2회 세척하고, 재현탁시켜 1% 파라포름알데하이드가 보충된 PBS 500 ㎕에 고정시켜 유동 세포계수기(제조원: Becton-Dickinson FACSCalibur
)중에서 형광 밀도에 대해 분석하였다. RMA-S 세포의 표면상에서의 Db 또는 Kb 분자의 증가%는 배지만에서 배양시킨 세포의 것과 비교하여 펩타이드와 함께 배양시킨 세포의 증가된 평균 형광 밀도로 측정하였다.
마우스를 쥐의 클래스 I MHC에 결합할 수 있는 펩타이드로 면역시켰다. 면역시킨 다음, 비장 세포를 시험관내로 자극시켜 WT1 펩타이드와 함께 항온처리한 표적물을 용해시키는 능력에 대해 시험하였다. CTL을 표준 크롬 방출 검정법[Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]으로 평가하였다. 106 개의 표적 세포를 37 ℃에서 150 μCi의 나트륨 51Cr과 함께 90분간 특정 펩타이드의 존재 또는 부재하에서 항온처리하였다. 세포를 3회 세척하고 5% 태소 혈청이 보충된 RPMI중에 재현탁시켰다. 검정을 목적으로, 104 개의 51Cr-표지된 표적 세포를 상이한 농도의 효과기 세포와 함께 최종 용적 200 ㎕로 U자형-기저 96-웰 플레이트중에서 항온처리하였다. 상등액을 4 내지 7시간 후 37 ℃에서 제거하고, 특이적 용해%를 다음식으로 측정하였다:
특이적 용해% = 100 x(실험적 방출량 - 동시 방출량)/(최대 방출량 - 동시 방출량).
표 XLVII에 제시된 결과는 WT1 펩타이드중 일부가 CTL을 발생시키는데 필수적인, 클래스 I MHC 분자에 결합할 수 있음을 나타낸다. 또한, 상기 펩타이드중 수 개는 크롬 방출 검정법을 사용하여 측정한 바, 펩타이드 특이적 CTL을 도출시킬 수 있었다(도 9A 및 9B). CTL 펩타이드 p10-18 사람, p136-144 사람, p136-144 마우스 및 p235-243에 대해 면역시킨 다음, 펩타이드 특이적 CTL 세포주를 발생시켜 클론을 확립하였다. 이들 결과는 펩타이드 특이적 CTL은 WT1을 발현시키는 악성 세포를 사멸시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 5
마우스에서 WT1 특이적 CTL을 도출시키기위한 WT1 폴리펩타이드의 용도
본 실시예는 대표적인 WT1 폴리펩타이드의 WT1 포지티브 종양 세포주를 사멸시킬 수 있는 CTL 면역성을 도출시키는 능력을 설명한다.
클래스 I 및 클래스 II MHC에 결합하기에 적절한 모티프를 갖는 펩타이드인 P117-139를 TSITES 및 BIMAS HLA 펩타이드 결합 예측 분석법을 사용하여 상기한 바와 같이 확인하였다. 마우스를 실시예 3에 기재된 바와 같이 면역시켰다. 면역시킨 다음, 비장 세포를 시험관내에서 자극시키고 WT1 펩타이드, 뿐만 아니라 WT1 포지티브 및 네가티브 종양 세포와 함께 항온처리한 표적물을 용해시키는 능력에 대해 시험하였다. CTL은 표준 크롬 방출 검정법으로 평가하였다. 도 10A 내지 10D에 제시된 결과는 P117이 WT1 포지티브 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 WT1 특이적 CTL을 도출시킬 수 있는 반면, WT1 네가티브 세포는 사멸시키지 않음을 나타낸다. 이들 결과는 펩타이드 특이적 CTL이 WT1을 발현시키는 악성 세포를 실제로 사멸시키며 백신 및 T 세포 요법이 WT1을 발현시키는 악성암에 대해 효과적임을 증명하였다.
9-mer 클래스 I MHC 결합 펩타이드 p136-144, p225-233, p235-243 뿐만 아니라 23-mer 펩타이드 p117-139를 사용하여 유사하게 면역시켰다. 면역시킨 다음, 비장 세포를 4종의 펩타이드 각각을 사용하여 자극하고 WT1 펩타이드와 함께 항온처리한 표적물을 용해시키는 능력에 대해 시험하였다. CTL이 p136-144, p235-243 및 p117-139에 대해 특이적으로 발생되나, p225-233에 대해서는 발생되지 않았다. p235-244 및 p117-139에 대한 CTL 데이타를 도 11A 및 11B에 제시하였다. 펩타이드 p136-144 및 p225-233에 대한 데이타는 제시하지 않았다.
CTL 용해작용은 표적 WT1 펩타이드가 내생적으로 프로세싱되어 종양 세포 클래스 I MHC 분자와 함께 제시될 것을 요구한다. 상기 WT1 펩타이드 특이적 CTL은 WT1 포지티브 대 네가티브 종양 세포주를 용해시키는 능력에 대해 시험하였다. p235-243에 대해 특이적인 CTL은 p235-244 펩타이드와 함께 배양시킨 표적물을 용해시키지만, WT1 단백질을 발현시키는 세포주는 용해시키지 못하였다(도 11A). 확실히 대조적으로, p117-139에 대해 특이적인 CTL은 p117-139 펩타이드와 함께 배양시킨 표적물을 용해시키고 또한 WT1을 발현시키는 악성 세포도 용해시켰다(도 11B). 네가티브 대조군으로, p117-139에 대해 특이적인 CTL은 WT1 네가티브 EL-4를 용해시키지 않았다(본원에서 E10으로도 지칭됨)
WT1 특이적 용해 작용의 특이성은 냉 표적 억제법으로 확인하였다(도 12A 내지 12B). 효과기 세포를 다양한 효과기:표적 비율로 96-웰 U자형 기저부 플레이트에 플레이팅하였다. 51Cr 표지시키지 않고 10배 과량(뜨거운 표적물과 비교하여)의 표지된 펩타이드-피복된 표적물을 가하였다. 최종적으로, 웰 당 104 개의 51Cr-표지된 표적 세포를 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 4시간 동안 배양시켰다. 웰 당 전체 용적은 200 ㎕이다.
p117-139 특이적 CTL에 의한 TRAMP-C의 용해작용은 관련 펩타이드 p117-139와 함께 배양시킨 EL-4에 의해 58%에서 36%까지 차단되지만, 비관련 펩타이드와 함께 배양시킨 EL-4에 의해서는 차단되지 않았다(도 12A). 유사하게, BLK-SV40의 용해작용은 관련 펩타이드 p117-139와 함께 배양시킨 EL-4에 의해서는 18%에서 0% 까지 차단되었다(도 12B). 이런 결과는 WT1 펩타이드 특이적 CTL이 프로세싱된 WT1의 인식에 의해 악성 세포를 특이적으로 사멸시킴을 증명하는 것이다.
추정적인 CTL 모티프를 갖는 수 개의 절편을 p117-139내에 포함시켰다. CTL 에피토프의 정확한 서열을 결정하기 위하여 p117-139내의 모든 잠재적인 9-mer 펩타이드를 합성하였다(표 XLVIII). 이들 펩타이드중 2개(p126-134 및 p130-138)는 H-2b 클래스 I 분자에 결합하는 것으로 밝혀졌다(표 XLVIII). p117-139로 면역시킴으로써 발생되는 CTL은 p126-134 및 p130-138과 함께 배양시킨 표적물을 용해시키지만, p117-139내의 다른 9-mer 펩타이드는 용해시키지 않았다(도 13A).
p117-139 특이적 CTL 세포주를 p126-134 또는 p130-138로 다시 자극하였다. p126-134 또는 p130-138로 다시 자극시킨 다음, T 세포주는 둘다 펩타이드 특이적 용해작용이 증명되었지만, p130-138 특이적 CTL만이 WT1 포지티브 종양 세포주의 용해작용을 나타냈다(도 13B 및 13C). 따라서, p130-138은 천연 프로세싱된 에피토프인 것으로 나타났다.
실시예 6
마우스 종양 세포주에 있어서 WT1 특이적 mRNA의 확인
본 실시예는 세포 및 세포주에 있어서 WT1 특이적 mRNA를 검출하기 위한 RT-PCR의 용도를 설명한다.
밀도 구배 원심분리법으로 단핵구 세포를 단리하고, 즉시 동결시켜 WT1 특이적 mRNA의 존재에 대해 RT-PCR 분석할 때까지 -80 ℃에 보관하였다. RT-PCR은 일반적으로 문헌[Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995]에 설명된 바와 같이 수행하였다. 전체 RNA를 표준 공정에 따라서 107 개의 세포로부터 추출하였다. RNA 펠릿을 디에틸피로카보네이트 처리된 물 25 ㎕에 재현탁시키고 역전사용으로 직접 사용하였다. 징크-핑거 영역(엑손 7 내지 10)을 PCR에 의해 330 bp 마우스 cDNA로 증폭시켰다. 증폭은 열순환기(thermocycler)중에서 1회 또는 경우에 따라, 2회의 PCR로 수행하였다. 전체 반응 용적 50 ㎕중 AmpliTaqDNA 폴리머라제(제조원: Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 2.5 mM MgCl2, 및 각 프라이머 20 pmol을 사용하였다. PCR 생성물 20 ㎕ 분취량을 에티듐 브로마이드로 착색시킨 2% 아가로스 겔상에서 전기영동시켰다. 상기 겔을 폴라로이드 필름(Polaroid 667, 제조원: Polaroid Ltd., Hertfordshire, England)로 사진을 찍었다. 교차 오염에 대한 예방은 문헌[Kwok and Higuchi, Nature 339:237-238, 1989]의 권장사항에 따라서 수행하였다. 네가티브 대조군으로는 각 실험에서 cDNA 대신 물과의 cDNA- 및 PCR-시약 믹스가 있다. 오류 네가티브를 피하기 위하여, 천연 RNA 및 적절한 cDNA 발생의 존재를 각 샘플에 대해 β-액틴 프라이머를 사용한 대조용 PCR에 의해 평가하였다. 이들 프라이머로 증폭되지 않는 샘플을 분석에서 제외하였다.
마우스 세포주에서 WT1의 증폭용 프라이머는 다음과 같다: P115:1458-1478: 5' CCC AGG CTG CAA TAA GAG ATA 3'(정방향 프라이머; 서열 21); 및 P116:1767-1787: 5' ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3'(역방향 프라이머; 서열 22)(참조: Inoue et al., Blood 88:2267-2278, 1996; Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995).
대조 시험에서 사용되는 베타 액틴 프라이머는 다음과 같다: 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3'(센스 프라이머; 서열 23); 및 5' GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3'(안티센스 프라이머; 서열 24).
사람의 WT1을 증폭시키는데 사용하기 위한 프라이머는 다음과 같다: P117:954-974: 5' GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3'(서열 25); 및 P118:1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3'(서열 5). 네스팅 RT-PCR의 경우, 프라이머는 다음과 같다: P119:1023-1043: 5' GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3'(서열 26); 및 P120:1345-1365: 5' TCA AAG CGC CAG CTG GAC TTT 3'(서열 27).
표 XLVIII은 마우스의 종양 세포주의 WT1 PCR 분석 결과를 나타낸다. 표 IV에서, (+++)는 제1 단계 RT PCR에서 강력한 WT1 PCR 증폭 생성물을 나타내며, (++)는 제1 단계 WT1 RT PCR에 의해 검출할 수 있는 WT1 증폭 생성물을 나타내고, (+)는 제2 단계의 WT1 RT PCR에서만 검출될 수 있는 생성물을 나타내며, (-)는 WT1 PCR 네가티브를 나타낸다.
전술한 내용으로부터, 본 발명의 특정 양태가 설명을 목적으로 명세서중에 기재되었지만, 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어나지 않게 다양하게 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부되는 특허청구의 범위를 제외하고는 제한되지 않는다.
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<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 1
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 2
Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
1 5 10 15
Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> Mus musculus
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Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
1 5 10 15
Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
20
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<212> PRT
<213> Homo sapien
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Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys
1 5 10 15
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<213> Homo sapien
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<213> Homo sapien
<400> 6
ctgagcctca gcaaatgggc 20
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<213> Homo sapien
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<212> DNA
<213> Homo sapien
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<213> Mus musculus
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<213> Mus musculus
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<213> Mus musculus
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<213> Mus musculus
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Gly
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<213> Mus musculus
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Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys
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<213> Homo sapien
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<213> Mus musculus
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Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
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Val Arg Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapien
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Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapien
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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atgttgtgat ggcggaccaa t 21
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<213> Homo sapien
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<213> Homo sapien
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<213> Homo sapien
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<212> DNA
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Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser
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<211> 9
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1 5
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<211> 9
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Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu
1 5
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<211> 9
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<400> 135
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 140
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 142
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1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 144
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1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 145
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1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 147
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 148
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1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
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1 5
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1 5
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<211> 9
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<211> 9
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Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
1 5
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<213> Homo sapien
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<400> 240
Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn
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<211> 9
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Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 242
Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 243
Val Arg His His Asn Met His Gln Arg
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 244
Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
1 5
<210> 245
<211> 9
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<400> 245
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1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 246
Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 247
Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 248
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 251
Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 252
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
1 5
<210> 253
<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 253
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
1 5
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<211> 9
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Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu
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<211> 9
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Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 257
Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 258
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
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Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
1 5
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<211> 9
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Asp Gly Ala Pro Ser Tyr Gly His Thr
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<211> 9
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Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
1 5
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<211> 9
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Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 264
Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 265
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 266
Glu Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 268
Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 269
Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 270
Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Ala
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 274
Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 275
Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu
1 5
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Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
1 5
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<213> Mus musculus
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Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met
1 5
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Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr
1 5
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Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu
1 5
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Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu
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Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
1 5
<210> 285
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 285
Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala Leu
1 5
<210> 286
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 286
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu
1 5
<210> 287
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 287
Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu
1 5
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 288
Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
1 5
<210> 289
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 289
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
1 5
<210> 290
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 290
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val
1 5
<210> 291
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 291
Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val
1 5
<210> 292
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 292
Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
1 5
<210> 293
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 293
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 294
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 294
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu
1 5
<210> 295
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 295
Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5
<210> 296
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 296
Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile
1 5
<210> 297
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 297
Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser
1 5
<210> 298
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 298
Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu
1 5
<210> 299
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 299
Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 300
Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser
1 5
<210> 301
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 301
Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile
1 5
<210> 302
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 302
Thr Leu His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
1 5
<210> 303
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 303
Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
1 5
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 304
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
1 5
<210> 305
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 305
Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr
1 5
<210> 306
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 306
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
1 5
<210> 307
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 307
Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys
1 5
<210> 308
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 308
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
1 5
<210> 309
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 309
Gly Ala Ala Gln Trp Ala
1 5
<210> 310
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 310
Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 311
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 311
Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
<210> 312
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 312
His Ala Ala Gln Phe
1 5
<210> 313
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 313
Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
20 25 30
<210> 314
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 314
Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg
1 5 10 15
Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser
20 25 30
<210> 315
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 315
Arg Tyr Phe Lys
1
<210> 316
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 316
Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
1 5 10
<210> 317
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 317
Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr
1 5 10 15
His Thr Gly Lys Thr Ser
20
<210> 318
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 318
Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn
1 5 10 15
Met His Gln Arg Asn
20
<210> 319
<211> 449
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 319
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
435 440 445
Leu
<210> 320
<211> 449
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 320
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp His Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala
435 440 445
Leu
<210> 321
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 321
Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala
1 5
<210> 322
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 322
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro
1 5
<210> 323
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 323
Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
1 5
<210> 324
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 324
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro
1 5
<210> 325
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 325
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5
<210> 326
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 326
Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
1 5
Claims (106)
- 서열 34 (ALLPAVPSL), 서열 88 (GATLKGVAA), 서열 49 (CMTWNQMNL), 서열 199 (SCLESQPTI), 서열 198 (SCLESQPAI), 서열 147 (NLYQMTSQL), 서열 35 (ALLPAVSSL), 서열 185 (RMFPNAPYL), 서열 2 (PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE) 및 서열 144 (NAPYLPSCL)로부터 선택된 서열로 이루어진 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, MHC 클래스 I 분자에 결합하는 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, MHC 클래스 II 분자에 결합하는 폴리펩타이드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따르는 폴리펩타이드를 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따르는 폴리펩타이드를 비-특이적 면역 반응 증강제와 함께 포함하는, 사람 환자에게서 WT1에 대한 면역 반응을 향상 또는 유발시키는 방법에 사용하기 위한 백신.
- 삭제
- 삭제
- 제15항에 있어서, 면역 반응 증강제가 애주번트인 백신.
- 삭제
- 삭제
- (a) 서열 34 (ALLPAVPSL), 서열 88 (GATLKGVAA), 서열 49 (CMTWNQMNL), 서열 199 (SCLESQPTI), 서열 198 (SCLESQPAI), 서열 147 (NLYQMTSQL), 서열 35 (ALLPAVSSL), 서열 185 (RMFPNAPYL), 서열 2 (PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE) 및 서열 144 (NAPYLPSCL)로부터 선택된 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드; 및(b) 환자에게서 T 세포 반응을 우선적으로 향상시키는 비-특이적 면역 반응 증강제를 포함하는, 사람 환자에게서 면역 반응을 향상 또는 유발시키는 방법에 사용하기 위한 백신.
- 제21항에 있어서, 면역 반응 증강제가 몬타나이드(Montanide) ISA50, 세픽 몬타나이드(Seppic MONTANIDE) ISA 720, 사이토킨(예, GM-CSF, Flat3-리간드), 미세구, 디메틸 디옥타데실 암모늄브로마이드(DDA)-계 애주번트, AS-1, AS-2, Ribi 애주번트 시스템-계 애주번트, QS21, 사포닌-계 애주번트, 미세유체화된 형태의 신텍스(Syntex) 애주번트, MV, ddMV, 면역 자극 복합체(iscom)-계 애주번트 및 불활성화된 독소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 백신.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따르는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- (a) 서열 34 (ALLPAVPSL), 서열 88 (GATLKGVAA), 서열 49 (CMTWNQMNL), 서열 199 (SCLESQPTI), 서열 198 (SCLESQPAI), 서열 147 (NLYQMTSQL), 서열 35 (ALLPAVSSL), 서열 185 (RMFPNAPYL), 서열 2 (PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE) 및 서열 144 (NAPYLPSCL)로부터 선택된 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드; 및(b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
- (a) 서열 319의 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및(b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
- (a) 서열 319의 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포; 및(b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
- (a) 서열 34 (ALLPAVPSL), 서열 88 (GATLKGVAA), 서열 49 (CMTWNQMNL), 서열 199 (SCLESQPTI), 서열 198 (SCLESQPAI), 서열 147 (NLYQMTSQL), 서열 35 (ALLPAVSSL), 서열 185 (RMFPNAPYL), 서열 2 (PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE) 및 서열 144 (NAPYLPSCL)로부터 선택된 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포; 및(b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
- (a) 서열 34 (ALLPAVPSL), 서열 88 (GATLKGVAA), 서열 49 (CMTWNQMNL), 서열 199 (SCLESQPTI), 서열 198 (SCLESQPAI), 서열 147 (NLYQMTSQL), 서열 35 (ALLPAVSSL), 서열 185 (RMFPNAPYL), 서열 2 (PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE) 및 서열 144 (NAPYLPSCL)로부터 선택된 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및(b) 비-특이적 면역 반응 증강제를 포함하는, 사람 환자에게서 면역 반응을 향상 또는 유발시키는 방법에서 사용하기 위한 백신.
- (a) 서열 34 (ALLPAVPSL), 서열 88 (GATLKGVAA), 서열 49 (CMTWNQMNL), 서열 199 (SCLESQPTI), 서열 198 (SCLESQPAI), 서열 147 (NLYQMTSQL), 서열 35 (ALLPAVSSL), 서열 185 (RMFPNAPYL), 서열 2 (PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE) 및 서열 144 (NAPYLPSCL)로부터 선택된 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포; 및(b) 비-특이적 면역 반응 증강제를 포함하는, 사람 환자에게서 면역 반응을 향상 또는 유발시키는 방법에서 사용하기 위한 백신.
- (a) 서열 34 (ALLPAVPSL), 서열 88 (GATLKGVAA), 서열 49 (CMTWNQMNL), 서열 199 (SCLESQPTI), 서열 198 (SCLESQPAI), 서열 147 (NLYQMTSQL), 서열 35 (ALLPAVSSL), 서열 185 (RMFPNAPYL), 서열 2 (PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE) 및 서열 144 (NAPYLPSCL)로부터 선택된 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 특이적으로 결합된 항-개별특이형(anti-idiotypic) 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및(b) 비-특이적 면역 반응 증강제를 포함하는, 사람 환자에게서 면역 반응을 향상 또는 유발시키는 방법에서 사용하기 위한 백신.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응 증강제가 애주번트인 백신.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응 증강제가 환자에게서 T 세포 반응을 우선적으로 향상시키는 백신.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제11항 또는 제26항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 환자에게서 WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 발달을 억제하기 위한 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
- 삭제
- 제15항, 제18항, 제21항, 제22항 또는 제30항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 환자에게서 WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 발달을 억제하기 위한 방법에 사용하기 위한 백신.
- 삭제
- 제11항 또는 제26항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 암 또는 악성 질환이 백혈병인 조성물.
- 제43항에 있어서, 백혈병이 급성 골수성 백혈병, 급성 임파구성 백혈병 또는 만성 골수성 백혈병인 조성물.
- 삭제
- 제43항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 갑상선암 또는 위장암, 또는 흑색종인 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- WT1 포지티브 세포가 골수, 말초 혈액, 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물 중 골수 세포 또는 임파구 세포의 수의 10% 미만으로 제거되기에 충분한 조건 및 시간하에서, 골수, 말초 혈액, 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물을 서열 319의 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포와 접촉시킴을 포함하여, 골수, 말초 혈액, 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물로부터 WT1을 발현하는 세포를 제거하는 시험관내 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- T 세포를 자극하거나 증대시키거나, 또는 자극 및 증대시키는 충분한 조건 및 시간하에서, 서열 34 (ALLPAVPSL), 서열 88 (GATLKGVAA), 서열 49 (CMTWNQMNL), 서열 199 (SCLESQPTI), 서열 198 (SCLESQPAI), 서열 147 (NLYQMTSQL), 서열 35 (ALLPAVSSL), 서열 185 (RMFPNAPYL), 서열 2 (PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE) 및 서열 144 (NAPYLPSCL)로부터 선택된 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드, 이러한 WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이러한 WT1 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포를 T 세포와 접촉시킴을 포함하여, T 세포를 자극하거나 증대시키거나, 또는 자극 및 증대시키는 시험관내 방법.
- 제63항에 있어서, T 세포가 골수, 말초 혈액, 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획물을 포함하는 샘플 내에 존재하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제63항에 있어서, T 세포를 증대시키기전에 클로닝시키는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제63항의 방법에 따라서 제조된 T 세포를 포함하는, 환자에서 WT1 발현과 관련있는 악성 질환의 발달을 억제하기 위한 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 서열 34 (ALLPAVPSL), 서열 88 (GATLKGVAA), 서열 49 (CMTWNQMNL), 서열 199 (SCLESQPTI), 서열 198 (SCLESQPAI), 서열 147 (NLYQMTSQL), 서열 35 (ALLPAVSSL), 서열 185 (RMFPNAPYL), 서열 2 (PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE) 및 서열 144 (NAPYLPSCL)로부터 선택된 서열로 이루어진 WT1 폴리펩타이드, 이러한 WT1 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이러한 WT1 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포를 포함하는, WT1 발현과 관련있는 악성 질환에 대한 면역화 또는 치료의 효과를 모니터하는데 사용하기 위한 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제73항에 있어서, 악성 질환이 암 또는 백혈병인 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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