TWI285648B

TWI285648B - Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy

Info

Publication number: TWI285648B
Application number: TW094123744A
Authority: TW
Inventors: Martin Cheever; Alexander Gaiger
Original assignee: Corixa Corp; Alexander Gaiger
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2007-08-21
Also published as: AU6407899A; MXPA01003344A; NZ510600A; JP4235984B2; CN100486995C; KR100752065B1; CA2349442C; WO2000018795A9; WO2000018795A3; JP4243792B2; CA2349442A1; MY139226A; NO20011613D0; NO20011613L; JP2002525099A; HK1039782A1; PL348595A1; DE69938970D1; BR9914116A; IL142216A

Description

1285648 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本么月般係有關惡性疾病（如：白血病及癌症）之免疫療法。本發明更明確言之係有關一種可產生或加強對之免疫反應之組合物，及此等組合物於預防及/或治療惡性疾病上之用途。發明背景癌症與白血病為美國及全世界之普遍健康問題。雖然在楦測及治療此疾病上已有進步，但仍沒有疫苗或其他普遍成功之方法可以預防或治療癌症及白血病。目前的疾病處理仍依賴早期診斷及積極治療之組合，其可包括一種或多種處理如：手術、放射性療法、化學療法及激素療法。特定癌症之治療過程通常根據多種預後參數選擇，包括分析特異性腫瘤標記物。然而使用已確立之標記物經常造成很難解析之結果，且在許多癌症病患中造成高死亡率。免疫療法有潛力可大幅改善癌症與白血病之治療與存活性。近來的數據證實白血病可利用骨髓移植之免疫療法治療（例如：輸入供體之淋巴球）。此等療法可涉及產生或加強對腫瘤相關性抗原（TAA)之免疫反應。然而，目前已知之 TAAs相當少，且除了少數例外，針對此等抗原產生之免疫反應仍未展現醫療效益。因此，相關技藝上需要一種預防及治療白血病與癌症之改良方法。本發明可滿足這些需求且再提供其他相關優點。【先前技術】 103376.doc 1285648 簡言之，本發明提供用於診斷及治療疾病（如：白血病與癌症）之組合物及方法。本發明一方面提供含有天然WT1之免疫原部份之多肽，或其變異體，其差異在於一處或多處取代、刪除、加成及/或嵌插，使得其與抗原特異性抗血清及/或T-細胞株或純系反應之能力實質上未減低。在某些具體實施例中，多肽中包含天然WT1多肽之不超過16個連續胺基酸殘基。在其他具體實施例中，多肽包含天然WT1多肽之胺基酸殘基1至174之免疫原部份或其變異體，其中多肽包含天然WT1多肽之胺基酸175至449中所含不超過16個連續胺基酸殘基。該免疫原部份最好結合MHC I級與/或II 級分子。在某些具體實施例中，多肽包含選自下列之序列： (a)表II至XLVI中一個或多個表中所示之序列，（b)上述序列之變異體，其相異處在於一處或多處之取代、刪除、加成及/或嵌插，但實質上未減低該變異體與抗原特異性抗血清及/或T-細胞株或純系反應之能力，及（c)上述多肤之擬似物，但實質上未減低該擬似物與抗原特異性抗血清及/或T-細胞株或純系反應之能力。其他具體實施例中，多肽包含選自下列之序列：（a) ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34)，GATLKGVAA (SEQ ID NO:88)，CMTWNQMNL (SEQ ID Nos: 49 與 258)， SCLESQPTI (SEQ ID Nos: 199與 296)，SCLESQPAI (SEQ ID NO:198)，NLYQMTSQL (SEQ ID Nos: 147 與 284)， ALLPAVSSL(SEQIDNos:3 5與 25 5)，RMFPNAPYL(SEQID Nos: 185與293)，（b)上述序列之變異體，其相異處在於一

• 103376.doc 1285648 〆夕處取代、删除、加成及/或巍插，但實質上未減低變異體與抗原特異性抗血清及/或τ-細胞株或純系之反應能力及（c)上述多肽之擬似物，但實質上未減低該擬似物與二原特”丨生抗血清及/或細胞株或純系反應之能力。擬似物可包含胺基酸與一種或多種胺基酸擬似物之組合，或可完全非肽擬似物。本發明另一方面提供含WT1蛋白質之免疫原部份之變異體之多肽，其中該變異體不同於免疫部份之處在於其免疫原邛伤中1至3個胺基酸位置經取代，使得變異體與抗原特 …丨生抗血π及/或τ細胞株或純系反應之能力比天然wt 1蛋白質加強。本發明尚提供編碼上述WT1多肽之WT1聚核答酸。本奄明其他方面提供醫藥組合物與疫苗。醫藥組合物可 b s上述夕肽或擬似物及/或下列一種或多種：（丨）wt 1聚核苷酸；（ii)與WT1多肽特異性結合之抗體或其結合抗原之片段；（iii)與WT1多肽特異性反應之τ_細胞或（w)表現WT1# 肽之含抗原細胞，與醫藥上可接受之載體或賦形劑組合。疫苗包含上述多肽及/或下列一者或多者：（I) WT1多肽，（ii) 表現WT1多肽之含抗原細胞或（iii)抗遺傳型抗體，及非特異性免疫反應加強劑。某些具體實施例中，此等醫藥組合物與疫苗中使用之WT1多肽含有天然WT1多肽之23個以下連續胺基酸殘基，以17個以下胺基酸殘基較佳。免疫反應加強劑可為輔劑。較佳者，免疫反應加強劑加強丁_細胞反應。本發明尚提供在患者體内加強或誘發免反應之方法，其 103376.doc 1285648 包括對患者投與上述定義之醫藥組合物或疫苗。某些具體實施例中，患者為人類。本發明尚提供抑制患者之惡性疾病發展之方法，其包括對患者投與上述醫藥組合物或疫m疾病包括例如（但不限於）：白血病（例如：急性脊髓性、急性淋巴球性及慢性脊髓性）及癌症（例如：乳癌、肺癌、甲狀腺癌或胃腸癌或黑色素瘤）。患者不一定要罹患該惡性疾病，且投與醫藥組合 # 4勿或疫苗可抑制此等疾病引發，或可抑制現有疾病之進展及/或轉移。本發明其他方面尚提供自骨髓及/或周邊血液或其部份排除表現WT1之細胞之方法，其包括使骨髓、周邊血液或骨髓或周邊血液之一部份與可與WT1多肽特異性反應之τ 、’、田胞反應，其中該進行接觸步驟之條件及時間足以排除 WT1陽性細胞至骨髓、周邊血液或其部份中骨髓性或淋巴性細胞之數目之1〇%以下，以5%以下較佳，以1%以下更 ► 佳。骨髓、周邊血液及其部份可得自罹患與WT1表現相關之疾病之患者，或可得自未罹患此等疾病之人類或非人類哺乳動物。本發明之相關方面，提供抑制患者惡性疾病之發展之方法’其包括對患者投與如上述製備之骨髓、周邊血液或骨髓或周邊血液之一部份。此等骨髓、周邊血液或其部份可為自體性’或可衍生自相關或未相關之人類或非人類動物 (例如：同基因性或同種異基因性）。本發明另一方面提供一種刺激（或引發）及/或擴增T細胞 I03376.doc 1285648 ^方法’其包括由τ細胞與WT1多肽於足以刺激及/或擴增τ (条件及時間下接觸。此等τ細胞可為自體性、同種異因性、同基因性或不相關之想特異性丁細胞，且可於 =管内或活體内刺激。某些具體實施例中，擴增之了細胞可子在於骨髓、周邊血液或骨髓或周邊血液之一部份，且可㈣不定為）純系。某些具體實施例中，在刺激及/或擴 :功間，Τ細胞可存在於哺乳動物體内。WT1特異性Τ細胞可用於例如：捐輸者之淋巴球輸液中。相關方面中，提供抑制患者惡性疾病發展之方法，其包括對患者投與依上述製備之T細胞。某些具體實施例中^這種τ細胞可為自體性、同基因性或同種異基因性。本發明其他方面尚提供追踪免疫接種法或醫療法對與州表現有關之惡性疾病患者之有效性。這種方法係根據追踪患者之抗體、CD4+T細胞及/或CD8+T細胞之反應。此方面中’-種方法可包括下列步驟：（a)由第—個生物樣本與下者或多者培養：⑴WT1多肽；（ii)編碼WT1多肤之聚核芬酸；或（iii)可表現WT1多肽之含抗原細胞，其中第一個生物樣本得自接受治療或免疫接種以前之患者，且其中該培養法係於足以形成免疫複合物之條件及時間下進行； (b)檢測WT1多肽與生物樣本上與WT1多肽特異性結合之抗體之間形成之免疫複合物；⑷採用自相同患者接受治療或免疫接種後取得之第二個生物樣本重覆步驟⑷與（b);及⑷ 比較第一個與第二個生物樣本中檢測到之免疫複合物數目藉以追&患者之療法或免疫接種法之有效性。 103376.doc •10- 1285648 述方法之某些具體實施例中，檢測步驟包括⑷由免疫劑，：與可結合免疫複合物之檢測試劑培養，丨中檢測試報導者基團，峨除未結合之檢測試劑，及⑷檢測 =存在㈣者基團。檢測試劑可包含例如：第二抗體，二二。广原片段’其可與特異性結合wti多肽之抗體結 :，或…蛋白質A之分子。其他具體實施例中，報導者，團係結合WT⑽，且檢測步驟包括排除未結合之㈣夕肽’隨後檢測是否含有報導者基團。

為其他方面中，追踪患者之與wti表現有關之惡性疾病接 :免疫接種或醫療法之有效性之方法包括下列步驟:⑷由個生物樣本與下列一者或多者培養··⑴多肤；⑴) 、，WT1夕肽之聚核菩酸;或（m)表現多肽之含抗原細也其中生物樣本包含⑶㈠與/或CD8+ τ細胞，且得自接文治療或免疫接種之前之患者，且其中該培養法在足以特異1±活化增殖及/或溶解τ細胞之條件及時間下進行；（b) 、、J满I之活化、增殖及/或溶解之量，（C)採用含匸04+與 /或CD8+ τ細胞之第：個生物樣本重覆步驟⑷與⑻，其中第-個生物樣本得自相同患者接受治療或免疫接種之後； ()t·較弟個與第二個生物樣本之間T細胞之活化、增殖/、/或溶解之f ’並藉以追踪患者接受治療或免疫接種之有效性。本發明尚提供抑制患者之與WT1表現有關之患性疾病發展之方法’其包括下列步驟：（a)由自患者單離之CD4+與/ 或CD8+ T細胞與下列一者或多者培養：⑴WT1多肽； 103376.doc -11 - 1285648 ’扁馬WT1夕肤之聚核菩酸·，或（丨⑴表現wTl多肽之含抗原細匕使τ、屈胞〜殖，及（b)對患者投與有效量之增殖之T細月包’藉以抑制患者之惡性疾病發展。某些具體實施例中，培養T細胞之步驟可重覆一次或多次。本杳明其他方面’提供抑制患者之與WT1表現有關之惡 1*生疾病發展之方法’其包括下列步驟：⑷由自患者單離之 CD4 +與/或CD8+T細胞與下列一 |或多者培# : (i)WT1多月太，（11)編碼WT1多月太之聚核嘗酉曼；或⑽表現WT1多肽之含抗原細胞，使T細胞增殖；（b)選殖一株或多株增殖之細月已，及（c)對患者投與有效量之選殖之τ細胞。其他方面提供一種方法，供測定患者是否出現與WT1表現有關之惡性疾病，其包括下列步驟··⑷由自患者中單離之CD4+與/或CD8+ τ細胞與下列一者或多者培養：⑴Μη 夕肽，（11)編碼WT1多肽之聚核苷酸；或（丨⑴表現WT丨多肽之含抗原細胞；及（b)檢測是否出現T細胞之特異性活化，藉以敎是否出現與州表現有關之惡性疾病。某些具體實施例中，檢測步驟包括檢測是否出現T細胞之增殖作用。本發明其他方面中提供測定患者是否出現與WT1表現有關之惡性疾病之方法，其包括下列步驟··（a)由來自患者之生物樣本與下列一者或多者培養··⑴WTi多肽，·（⑴編碼 WT1多肽之聚核:y：酸；或（Hi)表現WT1多肽之含抗原細胞，其中孩坧養法係於足以形成免疫複合物之條件及時間下進行；及（b)檢測WT1#肽與生物樣本中特異性結合wti多肽之抗體之間形成之免疫複合物,·藉以測定是否出現與WT1 103376.doc -12·

1285648 表現有關之惡性疾病。本發明此等方面及其他方面將可參考下列詳細說明及附圖了解。本文揭示之所有參考文獻將以提及之方式併入本文中，如同其個別併入本文一般。圖式之簡要說明圖1說明小白鼠（M0)與人類（HU) WT1蛋白質序列之比較 (分別為 SEQ ID NOS: 320與 319)。圖2為說明血液惡性病（Aml)患者之WT1特異性抗體檢測法之西方墨點。第丨線表示分子量標記物；第2線表示陽性對照組（與wti特異性抗體形成免疫沉澱之WT1陽性人類白血病細胞株）；第3線表示陰性對照組（與小白鼠血清形成免疫沉澱之WT1陽性細胞株）；及第4線表示與AML患者之血清形成免疫沉澱之WT1陽性細胞株。第2至4線之免疫沉澱物利用凝膠電泳法分離，並以WT1特異性抗體偵測。圖3為說明接受TRAMp_c(一種WT1陽性腫瘤細胞株）免疫接種之B6小白鼠之WT1特異性抗體反應檢測法之西方墨點。第1、3及5線表示分子量標記物，及第2、4與6線表示 WT1特異性陽性對照組（N丨8〇，聖塔克魯茲生物科技

Cruz Bi〇technol〇gy)，WT1蛋白質之N-末端區180個胺基酸靶圍之多肽，於西方墨點上52 kD處移動）。採用之第一抗體為第2線之WT180，第4線之未免疫接種之B6小白鼠之血〆月，及第6線之有免疫接種之B6小白鼠之血清。圖4為說明接受代表性WT1肽免疫接種之小白鼠體内 WT1特異性抗體檢測法之西方墨點。第1、3與5線表示分子 103376.doc -13- 1285648 量標記物，第2、4及6線表示WTi特異性陽性對照組（N180，聖*合克魯兹生物科技，WT1蛋白質之N-末端區180個胺基酸範圍之多肽，於西方墨點上52 kD處移動）。採用之第一抗體為第2線之WT1 80，第4線之未免疫接種之B6小白鼠之血清’及第6線之有免疫接種之B6小白鼠之血清。圖5A至5C說明對接受代表性WT1肽免疫接種之小白鼠增殖性T細胞反應之刺激作用。採用一株τ細胞株及指定之二株不同純系進行胸芬吸收分析法，其結果以cpm表示。以 X軸代表之對照組為無抗原（N〇/^)與]36/介質；採用之抗原為 p6_22 人類（P1)，P117-139 (p2)或 P244-262 人類（P3)。圖6A與6B為說明對接受代表性WT1肽免疫接種之小白乳增殖性T細胞反應之刺激作用之直方圖。第三次免疫接種一週後’由已接種疫苗A或疫苗b之小白鼠之脾細胞單獨與培養基（培養基組）或與脾細胞及培養基（B6/無抗原組），經 25微克/毫升肽ρ6-22 (ρ6)，ρ117·139 (pll7)，p244_262(p24句 B6脾細胞（疫苗 a，圖 6A)或 p287_301(p287)，p299-313 (p299) ’ p421-435 (p421)脈衝處理之B6脾細胞（疫苗B ;圖 6B)及經25微克/毫升不相關之對照組肽（不相關肽組）脈衝處理之脾細胞共同培養，並於96小時後，利用吸收之（3h) 胸誓分析增殖作用。長條圖代表刺激指數（SI)，其計算法為貫驗組之平均值除以對照組（不含抗原之B(5脾細胞）之平均值。圖7A-7D為說明產生pll7_139及p6-22之特異性增殖性丁_ 細胞株與純系之直方圖。於活體内免疫接種後，分別使用 103376.doc 14 1285648 疫田A或B之所有三種肽進行初次三種試管内刺激作用 (IVS)。P过後僅使用二種相關肽pl丨7·139及進行單一肽刺激作用之IVS。自p6-22與!)117-139特異性丁細胞中衍生出純系，如圖所示，丁細胞與培養基單獨培養（培養基組）或與脾細胞及培養基（B6/無抗原組），經25微克/升肽p6_22 (P6)，pi 17-139 (pi 17)或不相關之對照組肽（不相關肽組）脈衝處理之脾細胞培養，於96小時後，利用（3H)胸站之吸收， • 分析增殖作用。長條圖代表刺激指數（SI)，其計算法為實驗組之平均值除以對照組（不含抗原之B6脾細胞）之平均值。圖8A與8B出示人類WTl (SEQ ID NO:319)之TSITES分析結果’測定肽是否有誘發！^反應之潛力。以” A”指出之區域為該嵌段之AMPHI中點，”R"表示符合R〇thbard/Tayl〇r要素之殘基’ ’’D”表示符合iAd要素之殘基，且"d"表示符合iEd 要素之殘基。圖9A與9B說明接受WT1肽免疫接種之小白鼠誘發WT1肽 · -特異性CTL之反應。圖9A說明同種異基因細胞株對目標細胞之溶胞作用’圖9B說明包覆肽之細胞株之溶胞作用。各溶胞°/。（由標準鉻釋出分析法測定）以三種指定效應物：目標物比例表示。圖中提供淋巴瘤細胞（LSTRA與E10)及 E10+p235·243(E10+P235)之結果。E10細胞在本文中亦稱為 EL-4細胞。圖10A-10D說明B6小白鼠接種WT1肽P117後，所誘發之 WT1特異性CTL細胞，其殺死WT1陽性腫瘤細胞，但不殺死 WT1陰性細胞株。圖l〇A說明未免疫接種之B6小白鼠之T細 103376.doc 15 1285648 胞不會殺死WT1陽性腫瘤細胞株。圖1〇B說明同種異基因細胞株對目標細胞之溶胞作用。圖1 〇C與1 〇d證實二個不同試驗中，WT1陽性腫瘤細胞株與WT1陰性細胞株之溶胞作用之比較。此外’圖1 0C與10D出示包覆肽之細胞株之溶胞作用（包覆相關WT1肽p 11 7之WT1陰性細胞株e 1 〇)。各溶胞 %(由標準鉻釋出分析法測定）以三種指定效應物：目標物比例表示。圖中提供淋巴瘤細胞（E10)、攝護腺癌細胞 (TRAMP-C)、轉形之纖維母細胞細胞株（BlK-SV40)及 E10+pll7之結果。圖11A與11B為說明代表性肽P117-139特異性CTL溶解 WT1陽性腫瘤細胞之能力之直方圖。第三次免疫接種三週後，以相關肽於試管内刺激經接種肽p235-243或pll7-139 之小白鼠之脾細胞並與WT1肽及WT1陽性與陰性腫瘤細胞培養，測試其溶解目標細胞之能力。長條圖代表使用25 :1 之E:T比例進行三重覆之鉻釋出分析法時之平均特異性溶胞％。圖11A出示p23 5-243特異性T細胞株對抗WT1陰性細胞株EL-4 (EL-4，WT1陰性）；經相關（用於免疫接種及再刺激作用）肽P23 5-243脈衝處理之EL_4(EL4+p235);經不相關肽 pll7-139 (EL4+pll7)，pl26-134(EL-4+pl26)或 pl30-138 (EL-4+pl30)脈衝處理之EL-4及WT1陽性腫瘤細胞 BLK-SV40 (BLK_SV40，WT1 陽性）及 TRAMP-C (TRAMP - C (TRAMP-C，WT1陽性）等之細胞毒性活性，如圖所示。圖 1^出示？117-139特異性丁細胞株對抗£1^4;經相關肽 P117-139脈衝處理之EL-4(EL-4+pll7)及經不相關肽 103376.doc -16 - 1285648 pl23-131 (EL-4+pl23)或 pl28-136(EL-4+pl28)脈衝處理之 EL-4 ; BLK-SV40及TRAMP_C等之細胞毒性活性，如圖所示。圖12A與12B為說明由冷目標物抑制作用證明之WT1陽性腫瘤細胞之溶胞作用特異性之直方圖。長條圖代表以 25:1之Ε··Τ比例進行三重覆之鉻釋出分析法之平均特異性洛胞％。圖12Α出示ρ 11 7-13 9特異性Τ細胞對抗WT1陰性細 • 胞株EL-4 (EL-4，WT1陰性）；WT1陽性細胞株TRAMP-C (TRAMP-C，WT1陽性）；與過量1〇倍（相對於熱目標物）之經未標識51Cr之相關肽pi 1 7-139脈衝處理之EL-4細胞培養之 TRAMP-C細胞（TRAMP-C+pl 17冷目標物）及與經未標識 51Cr之不相關肽脈衝處理之el-4培養之TRAMP-C細胞 (TRAMP-C+不相關冷目標物）等之細胞毒性活性，如圖所示。圖12B出示Ρ117·139特異性T細胞株對抗WT1陰性細胞株EL-4 (EL-4，WT1陰性）；WT1陽性腫瘤細胞株BLK_Sv40 _ (BLK-SV40，WT1陽性）；與相關冷目標物培養之BLK-SV40 細胞（BLK-SV40+pll7冷目標物）及與不相關冷目標物培養之BLK-SV40細胞（BLK-SV40+不相關冷目標物）之細胞毒性活性，如圖所示。圖13八-13(：為分析？117-139中9聚體（：1^抗原決定基之直方圖。試驗pi 17-139腫瘤特異性CTL株經P126-134或 pl3(M3 8再刺激後，對抗aall7-139中含有或缺乏適當I^2bI 類結合性特點之肽。直條圖代表使用25:1之E:T比例進行三重覆之鉻釋出分析法中平均特異性溶胞％。圖13 A出示 103376.doc 17 1285648 pll7-139特異性T細胞株對抗WT1陰性細胞株EL-4 (EL-4， WT1 陰性）及經肽 pll7-139 (EL-4+pll7)，pll9-127 (EL-4+pll9) ， pl20-128(EL-4+pl20) ， p 123-131 (EL-4+pl23)，pl26-134 (EL-4+pl26)，pl28-136 (EL-4+pl28) 及pl30-138(EL-4+pl30)脈衝處理之EL-4細胞之細胞毒性活性。圖13B出示CTL株經卩126-134再刺激後對抗\^丁1陰性細胞株EL4，經pll7-139(EL-4+pll7)，pl26-134 (EL-4+pl26) 脈衝處理之EL-4細胞及WT1陽性腫瘤細胞株traMP-C之細胞毒性活性。圖13C出示CTL株經pl3(M38再刺激後對抗 EL-4，經pll7-139(EL-4+pll7)，pl30-138(EL-4+pl30)脈衝處理之EL-4細胞及WT1陽性腫瘤細胞株TRAMP-C 4細胞毒性活性。【發明内容】如上已述，本發明一般係有關用於惡性疾病之免疫治療及診斷之組合物及方法。本文說明之組合物可包括WT i多肽，WT1聚核铝酸，表現WT1多肽之含抗原細胞（APC，例如：樹枝狀細胞），如：抗體之製劑，其可與WT1多肽及/ 或WT1特異性免疫系統細胞（例如：τ細胞）結合。本發明之 WT1多肽通常包含至少一部份威氏（Wilms)腫瘤基因產物 (WT1)或其變異體。本發明之核酸序列通常包含編碼此等多肤全部或一部份之DNA或RNA序列，或與此等序列互補之序列。抗體通常為免疫系統蛋白質，或其結合抗原片段，其可結合-部份WT1多肽。此等組合物可使用之丁細胞=常為WT1多肽之特異性τ細胞（例如·· CD4 +及/或CD8+)。本文 103376.doc -18- 1285648 5兒明之某些方法進一步使用本文所提供之表現WT1多肽之含抗原細胞。本發明之根據係發現針對威氏腫瘤（WT)基因產物（例如：WT1)產生之免疫反應可為罹患出現WT1基因表現增加之特徵之惡性疾病患者提供預防及/或醫療效益。此等疾病包括（但不限於）：白血病（例如：急性骨髓性白血病（AML)，慢性骨髓性白血病（CML)，急性淋巴球性白血病（all)及幼年型ALL) ’及多種癌症如··肺癌、乳癌、甲狀腺癌及胃腸癌與黑色素瘤。WT1基因最初係根據威氏腫瘤患者之11P13 染色體之細胞遺傳刪除作用鑑別及單離（參見卡爾（Call)等人’美國專利案No. 5，350,840)。該基因包含1〇個表現序列且編碼鋅指型（zinc finger region)轉錄因子，且小白鼠與人類\¥丁1蛋白質之序列示於圖1及犯(^1〇]^〇8:319與320。 WT1多肽本發明内容中，WT1多肽為至少包含天然WT1 (亦即由未經基因修飾之生物體表現之WT1肽）之免疫原部份之多肽’或其變異體（如本文所述）。WT1多肽可呈任何長度，但其條件為其中應至少包含天然蛋白質之免疫原部份，或其變異體，換言之，WT1多肽可為募肽（亦即由相當少數胺基酸殘基（如：8至10個殘基）利用肽鍵結合組成），全長度WT1 蛋白質（例如：含在人類或非人類動物中，如：小白鼠）或中間大小之多肽。某些具體實施例甲，最好使用含有天然WT1 多肽之少數連續胺基酸殘基之WT1多肽。這種多肽較適於某些需要產生T細胞反應之用途上。例如：這種WT1多肽可 103376.doc -19- 1285648 包含天然WT1多肽之23個以下，以不超過18個較佳，不超過15個更佳之連續胺基酸殘基。含有天然WT1多肽之9個連續胺基酸殘基之多肽通常適合此目的。其他來自天然蛋白質及/或異種序列之序列亦可出現在任何WT1多肽中，且此等序列可以（但不一定）擁有其他免疫性或抗原性。本文所提供之多肽可再與其他多肽或多肽化合物組合（共價或非共價結合）。本文採用之π免疫原部份π為可由細胞及或T-細胞表面抗原受體辨識（亦即特異性結合）之多肽之一部份。某些較佳免疫原部份與MHC I組或II級分子結合。本文中採用之’’免疫原部份”意指π結合’’MHC I級或II級分子，若這種結合作用可採用相關技藝已知之任何分析法檢測時。例如，多肽與MHC I級結合之能力可間接經由追腙其促進標識1251之/3 2-小球蛋白（β2 m)進入MHC I級/β2 m/肽雜三聚體複合物中之能力來評估（參見派克（Parker)等人，J. /mmwwo/· 152:163, 1994)。或者，可使用相關技藝上已知之官能性肽競爭分析法。某些免疫原部份具有表II-XIV中一個或多個表所列之一個或多個序列。代表性免疫原部份包括（但不限於）： RDLNALLPAVPSLGGGG(人類 WT1 殘基 6-22 ; SEQ ID N0:1)，PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(人類與小白鼠 WT1 殘基 117-139 ;分別為 SEQ ID N0s:2 與 3)， GATLKGVAAGSSSSVKWTE(人類 WT1 殘基 244-262 ; SEQ ID NO: 4)，GATLKGVAA(人類 WT1 殘基 244-252; SEQ ID NO: 88)，CMTWNQMNL(人類與小白鼠WT1殘基235-243 ;分另ij 103376.doc -20- 1285648 為 SEQ ID NOs: 49與 25 8)，SCLESQPTI(小白鼠 WT1 殘基 136-144 ; SEQ ID NO: 296)，SCLESQPAI(人類 WT1 殘基 13 6-144 ; SEQ ID NO: 198)，NLYQMTSQL(人類與小白鼠 WT1 殘基 225-233 ;分別為 SEQ ID NOs: 147 與 284); ALLPAVSSLpJdaWTHUlO-lSiSEQIDNOAS);* RMFPNAPYL(人類與小白鼠WT1殘基126-134 ;分另|J為SEQ ID NOs: 185與293)。本文尚提供其他免疫原部份，而其他則通常可採用習知技術鑑別，如：綜合說明於保羅（Paul) 之’’基礎免疫學，第3版， 243-247(拉文出版社（Raven Press)，1993)，及其中摘錄之文獻。鑑別免疫原部份之代表性技術包括篩選多肽與抗原特異性抗血清及/或T-細胞株或純系之反應能力。天然WT1多肽之免疫原部份為與此等抗血清及/或T-細胞之反應程度實質上未低於全長度WT1反應性之部份（例如：以ELISA及/或 T-細胞反應性分析法測試）。換言之，在此等分析法中，免疫原部份之反應程度大於或類似全長度多肽之反應性。這種篩選法通常可採用相關技藝專家習知之方法進行，如述於哈洛與雷恩（Harlow and Lane)，抗體學：實驗室手冊 d Manwa/)，冷泉港實驗室（Cold

Spring Harbor Laboratory)，1988 〇或者，可採用電腦分析法鑑別免疫原部份，如：Tsites 程式（參見羅巴德（Rothbard)與泰勒（Taylor), EMBO J· 7:93-100，1988 ;戴文（Deain)等人，Mo/· 33: 145-155，1996)，該程式可搜尋有潛力誘發Th反應之肽要 103376.doc -21 - 1285648 素。具有適合結合老鼠及人類I級或II級MHC要素之CTL肽可根據 BIMAS(派克等人，j· ^2:163，1994)及其他HLA肽結合預估分析法鑑別。為了確認免疫原性，可採用HLA A2導入外來基因之小白鼠模式及/或於試管内使用樹枝狀細胞、纖維母細胞或周邊血液細胞進行刺激作用分析法來試驗肽。如上已知，組合物可包含天然WT1蛋白質之變異體。本 φ 文採用之多肽’’變異體，，為該多肽與天然多肽之相異處在於一處或多處取代、·刪除、加成及/或嵌插，但仍保留多肽之免疫原性（亦即該變異體與抗原特異性抗血清及/或τ_細胞或純系之反應能力實質上未低於天然多肽之反應能力）。換言之，該變異體與抗原特異性抗血清及/或丁細胞或純系之反應能力可能比天然多肽加強或未改變，或比天然多肽之反應能力降低之程度小於5〇%，以小於2〇%較佳。這種變異體通常可經由修飾上述一種多肽序列，並依本文所述，分 • 析該經修飾之多肽與抗血清及/或Τ細胞之反應性來鑑別。本發明内谷中已發現，WT丨多肽之免疫原部份中相當少數取代（例如：1至3處）可加強多肽誘發免疫反應之能力。合適之取代作用通常可採用如上述電腦程式鑑別，並根據本文說明之經修飾之多肽與抗血清及/或丁細胞之反應性確認其效果。因此，某些較佳具體實施例中，WT1多肽包含之變異體中，免疫原部份中1至3個胺基酸殘基經取代，使得其與抗原特異性抗血清及/或丁細胞株或純系之反應能力在統計上大於未修飾之多肽之反應能力。這種取代作用最好位 103376.doc

-22- 1285648 在多肽之MHC結合位置中，其可依上述方法鑑別。較佳取代作用可以提高與MHCI級或Π級分子結合之能力。某些變異體含有保留性取代作用。”保留性取代作用"係指其中一個胺基酸被具有類似性質之另一個胺基酸取代，因此肽化學技藝之專家即可預期該多肽之二級結構及趨水性質實質上未改變。胺基酸取代作用通常可根據殘基在極性、電價、溶解性、疏水性、親水性及/或趨兩性之性質之 • 相似性進行。例如：帶負電價之胺基酸包括天冬胺酸及麵胺酸，帶正電價之胺基酸包括離胺酸與精胺酸；具有不帶電饧之極性頭端基團且具有類似親水性之胺基酸包括白胺酸、異白酸與纈胺酸；甘胺酸與丙胺酸；天冬醯胺與麵醯月女，及絲胺酸、蘇胺酸、苯基丙胺酸及酪胺酸。其他可代表保留性變化之胺基酸族群包括⑴ala，pr〇, gly，glu，asp， gln5 asn5 ser5 thr; (2) cys, ser, tyr5 thr; (3) val, ile? leu, met, ala, phe, (4) lys, arg, his;及（5) phe，tyr，trp，his。變異體亦 ® 可包含’或者包含非保留性變化。變異體亦可（或者）經修飾，例如：刪除或增加對多肽之免疫原性、二級結構及趨水性之影響最小之胺基酸。如上所述，WT1多肽可與共同轉譯或轉譯後指揮蛋白質轉移之蛋白質N-末端上訊號（或前導）序列共軛。多肽亦可以（或者可以）與連接基或其他序列共輛，以方便合成，純化或鑑別多肽（例如：聚_His)，或加強多肽與固體擔體之結合。例如：多肽可與免疫球蛋白以區共軛。 WT1多肤可採用任何已知技術製備。如本文說明之由 103376.doc

-23- 1285648 WT1聚核：y：酸編碼之重組多肽很容易由聚核驻酸製備。通节’相關技藝專家們習知之任何表現媒介體均可用於表現重組WT1多肽。可在經含編碼重組多肽之DNA分子之表現媒’丨體轉形或轉感染之任何適當宿主細胞中表現。合適之宿主細胞包括原核生物、酵母及較高等真核生物細胞。較佺者，採用之宿主細胞為大腸桿菌（E· c〇li)，酵母或哺乳動物細胞株如·· COS4CH〇。由合適宿主/媒介體系統分泌重組蛋白質或多肽至培養基中得到之上澄液可先使用市售濾器濃縮。濃縮液再加至合適純化基質（如：親和性基質或離子交換樹脂）中。最後，採用一個或多個逆相HPLC步驟進一步純化重組多肽。這種技藝可用於製備天然多肽或其變異體。例如：編碼天然多肽之變異體之聚核苷酸通常可採用私準誘變技術製備，如：寡核甞酸主導之位置特異性誘變法’且可脫除部份DNA序列，製成截斷之多肽。某些部份及其他變異體亦可利用相關技藝專家習知之技術，採用合成法產生。可以合成例如：胺基酸少於約5〇〇個，以少於約100個胺基酸較佳，少於約50個胺基酸更佳之多肽。多肽可採用任何市售固相技術合成，如：梅利菲德 (Merrifield)固相合成法，其中胺基酸係依序加至加長中之胺基酸鏈上。參見梅利菲德，j. Am. Chem. s〇e. & 2149-2146，1963。多肽之自動合成法之儀器可自市售商品取得，如：應用生物系統公司（Applied Bi〇Systems，ΐη、 Foster City，CA)，且可根據製造商之指示操作。通常，本文說明之多肽及聚核苷酸係單離出。，，單離，，之 103376.doc -24- 1285648 多肽或聚核苷酸係指自其原有環境中脫離者。例如··單離之天然蛋白質係自天然系統中與其部份或所有共同存在之物貝刀離者。較佳者，此等多肽之純度至少約，至少約95%更佳，至少約99°/。最佳。若聚核苷酸係例如··選殖至不屬於天然環境中一部份之媒介體中時，則視之為，，單離，，。本發明其他方面提供WT1多肽之擬似物。這種擬似物可包έ連接一個或多個胺基酸擬似物之胺基酸（亦即1蛋白貝中一個或多個胺基酸可被胺基酸擬似物置換）或可為儿全非肽擬似物。胺基酸擬似物為構形上類似胺基酸之化合物，因此可取代WT1#肽中之胺基酸，但實質上未降低其與抗原特異性抗血清及/或τ細胞株或純系之反應能力。非肽擬似物為一種不含胺基酸之化合物，其具有類似wti 多肽之完整構形，因此該擬似物與WT1特異性抗血清及/或 T細胞株或純系之反應能力實質上未低於冒以多肽之反應月b力。這種擬似物可根據分析肽序列立體結構之標準技術 (例如：核磁共振及推算技術）設計。設計擬似物時，可利用不一定具有相同大小或體積，但具有類似化學及/或物理性質之基團置換WT1多肽一個或多個側鏈官能基，以產生類似生物反應。咸了解，本文說明之某些具體實施例中，擬似物可替代WT1多肽。 WT1聚核:y：酸本文說明之編碼w T丨多肽之任何聚核茹酸均為本發明範圍内之WT1聚核苷酸。此等聚核甞酸可為單股（編碼用，或為反義）或雙股，且可為DNA(基因組，CDNA或合成性）或 103376.doc -25- 1285648 RNA分子。本發明聚核甞酸中可含有（但不一定含有）其他編碼或非編碼序列，且聚核苷酸可連接（但不一定連接）其他分子及/或擔體材料。 WT1聚核甞酸可編碼天然冒丁丨蛋白質，或可編碼本文說明之WT1之變異體。聚核苷酸變異體可包含一處或多處取代、加成、刪除及/或嵌插，但其所編碼之多肽之免疫原性未低於天然WT1蛋白質。對所編碼多肽之免疫原性之影響 # 通常可依本文說明之方法分析。較佳變異體包含之核苷酸取代、刪除、嵌插及/或加成不超過編碼天然貨71序列之免疫原部份之核苷酸位置之20%，以不超過1〇%較佳。某些變異體貫貝上與天然基因為同系物，或為其一部份。這種聚核知酸變異體可在中度嚴格條件下與編碼WTi多肽之天然 DNA序列（或互補序列）雜交。合適之中度嚴苛條件包括於$ X SSC ’ 0.5% SDS，1.0 mM EDTA (pH 8.0)溶液中預洗滌；於50C-60C，5 X SSC中雜交一夜；然後於65〇c下，分別 ►以2X，〇·5Χ，及〇.找含〇1% SDS之ssc洗務2次，各2〇分鐘。此等雜交DNA序列亦在本發明範圍内。相關技藝專家們咸了解，由於遺傳字碼之簡併性，造成多種編碼WT1多肽之核铝酸序列。其中有些聚核钻酸與任何天然基因之核苷酸序列具有最小程度之同質性。但是因子碼子用法不同而有差異變化之聚核苷酸則特別包括在本發明範圍内。一旦如上述鑑定WT1之免疫原部份，即可使用任何不同技術製備WT1聚核答酸。例如··可自表現wti之細胞製得 I03376.doc -26- 1285648 之cDNA擴增WT1聚核钻酸。這種聚核苷酸可利用聚合酶鏈反應（PCR)擴增。因此可根據免疫原部份之序列設計序列特異性引子，且可購買或合成。例如：人類WT1基因之PCR 擴增法之合適引子包括：第一步-P1 1 8: 1434-1414: 5’ GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3,（SEQ ID N0:5)及 P135: 5* CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC3* (SEQ ID N0:6);第二步-P136: 51 GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG3’（SEQ ID NO:7)及 P137: 5* GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3,（SEQ ID N0:8)。小白鼠 WT1 基因之PCR 擴增法之引子包括：第一步邛138:5|丁(：0 0八0 0：€0 0八€ CTC ATG 3,（SEQ ID N0:9)與 P139: 5, GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3,（SEQ ID NO: 10)，第二步-PI40: 5; GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3’（SEQ ID NO: 11)及 PI41:51 GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGTTT 3f (SEQ ID NO: 12)。然後可使用擴增之部份，採用相關技藝已知之技術，自人類基因組cDNA集合庫或自合適cDNA集合庫中單離全長度基因。或者，可自多重PCR片段構築全長度基因。WT1 聚核茫酸之製法亦可由寡核苷酸成份合成，並共同黏接成份，產生完整之聚核铝酸。 WT1聚核甞酸亦可採用相關技藝已知之方法合成，包括化學合成法（例如：固相亞胺基磷酸酯化學合成法）。亦可採用樣準誘變技術（如：募核苷酸主導之位置特異性誘變法），修飾聚核苷酸序列（參見艾得曼（Adelman)等人，DNA 2:183, 103376.doc -27- 1285648 1983)。或者，可於試管内或活體内，由編碼wti多肽之序列進行轉錄，產生RNA分子，但其條件為DNA係引進具有合適RNA聚合酶促進子（如：丁7或8]?6)之媒介體内。某些部份可依本文所述，用於製備編碼之多肽。此外，或另可對患者投與此部份，於活體内產生編碼之多肤（例如：轉感染含抗原之細胞，如：具有編碼WT1多肽之〇〇1^八構築體之樹枝狀細胞，·並對患者投與此轉感染之細胞）。 • 編碼wti多肽之聚核甞酸通常可用於試管内或活體内生產多肽。亦可使用與編碼序列互補之WT1聚核苷酸（亦即反義聚核苷酸）作為探針或抑制WT1表現。亦可使用可轉錄至反義RNA中之cDNA構築體引進組織細胞中，促進生產反義 RNA。任何聚核苷酸可進一步修飾，提供其於活體内之安定性。可行之修飾法包括（但不限於）：增加5,與/或3，末端之側面序列，在主幹中使用硫代碟酸酯或2,〇_甲基替代磷酸二 » 酯酶鏈結；及/或包含非傳統性鹼基如··肌站、 wybutosine ’及腺苷、胞：y：、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶核芬之乙醯基-、甲基_、硫-及其他修飾型式。本文說明之核苷酸序列可採用已建立之重組DNA技術連接多種其他核苷酸序列。例如：可選殖聚核站酸至任何多種選殖媒介體中，包括質體、噬菌體質體、入_噬菌體衍生物及黏接質體。特別值得注意之媒介體包括表現媒介體、複製媒介體、形成探針之媒介體及序列分析媒介體。通常，媒介體包含在至少一種生物體中有功能之複製源，合宜之 103376.doc -28- 1285648 限制核酸内切酶位置及—個或多個可選拔標記物。其他元件則根據所需用途而異，且係相關技藝習知者。 λ某些具體實施财，可調配聚核料，使之得以進入哺礼動物之細胞，並在其中表現。這類調配物特別適於醫療目的，如下文所述。相關技藝專家們咸了解，有許多方法可在目標細胞中表現聚核菩酸，且可使用任何合適方法。 =:聚核_可進人病毒媒介财，如（㈣限於）：腺病毋/、腺、、，口口之病毋、反轉錄病毒或牛殖或其他殖病毒（例如：鳥類殖病毒）。在此等媒介體中引進職之技術係相關技藝專家習知者。反轉錄病毒媒介體可再經轉移或引進一個^因作為可選拔標記物（協助鑑別或選拔轉導細胞）及域目‘#伤’如：編碼特異性目標細胞上報導者之配位體之基因，以賦與媒介體目標特異性。可採用相關技藝已知之方法使用抗體哥找目標。可採用在此等媒介體内之 f築體合】如.轉感染人類或動物細胞株，用於建立WT1 =性腫瘤模式’可用於進行腫瘤保護作用及用於免疫療法貫驗α月此等細胞對腫瘤或白血病發展之抑制作用或溶胞作用。、聚核芬酸之其他醫療調配物包括膠體勻散系統，如··大刀子複口物’宅微膠囊，微小粒、小珠及脂質系統，包括 t乳液、膠束、混合膠束及微脂粒。較適用於試管内及活體内作為傳送載劑之膠體系統為微脂粒（亦即人造膜囊胞)。此等系統之製法與用法係相關技藝習知者。抗體及其 103376.doc •29- 1285648 本發明尚提供結合劑，如··與WT1多肽特異性結合之抗體及其結合抗原片段。本文中採用之製劑若與wti多肤反應達可檢測之程度（例如：ELISA檢測範圍内），但在類似條 T下與不相關之反應未達可檢測之程度時，則稱為與冒以多肽”特異性結合，，。本文採用之"結合"係指二個分開之分子之間之非共價結合，因此形成，，複合物”。結合之能力可利用例如：測定形成複合物之結合常數來評估。結合常數之 • 取得係由複合物濃度除以成份濃度之乘積。通常，本發明内容中，當形成複合物之結合常數超過約1〇3升/莫耳時，則稱此二種成份”結合”。結合常數可使用相關技藝習知之方法測定。任何符合上述條件之製劑均可用為結合劑。較佳具體實施例中’結合劑為抗體或其結合抗原片段。某些抗體可購自例如：聖塔克魯茲生物科技（Santa Cruz Biotechn。丨。gy， Santo Cruz，CA)。或者，可依相關技藝已知之各種技術製験備抗體。參見例如：哈洛（Harl〇w)與雷恩（Lane)，抗體學：貫驗至手冊（Antibodies: A Laboratory Manual)，冷臬港實驗至（Cold Spring Harbor Laboratory)，1988，通常可依細胞培養技術產生抗體，包括如本文所述，產生單株抗體，或使抗體基因轉感染至合適細菌或哺乳動物細胞宿主中，以產生重組抗體。在一項技術中，先將包含多肽之免疫原注入任一種哺乳動物中（例如：小白鼠、老鼠、兔子、綿羊或山羊）°此步驟中，本發明之多肽不需修飾即可作為免疫原。或者’特別針對相當短型多肽，若多肽連結載體蛋白質 103376.doc -30- 1285648 (如··牛血清白蛋白或眼孔蜮血藍質)時，則可誘發優越之免疫反應。最好根據預定計劃，包括一劑或多劑追加接種，將免疫原注入動物宿主體内，並為動物定期抽血。然後採用，例如·使用與合適固體擔體偶合之多肤進行親和性層析法，自此等血清中純化多肤之特異性多株抗體。值得注意之抗原性多肽之特異性多株抗體可採用例如：柯勒（K〇hler)與米斯坦（Milstein)，Eur· j· Immun〇1· • 6:511_519, 1976之技術及其改良法製備。簡言之，這些方法/y及製備可生產具有所需特異性（亦即與所需多月太之反應性）之抗體之永續細胞株。此等細胞株可由例如··得自依上述免疫接種之物物之脾細胞。脾細胞再經永續處理，例如·與骨髓瘤細胞融合對象融合，該對象與經接種免疫之動物同基因者較佳。可採用多種融合技術。例如：脾細胞及骨髓瘤細胞可與非離子性清潔劑組合數分數，然後依低密度塗佈在支持雜交細胞生長，但不支持骨髓瘤細胞生長 _ 之選拔介質上，較佳選拔技術採用HAT(次黃嘌呤、胺基碟呤、胸腺核苷）選拔法。經過一段充份時間後，通常約丨至2 週後，會觀察到雜種純系。選拔單一純系，測試其培養物上澄液對抗多肽之結合活性。以具有高反應性及特異性之雜交體較佳。可自生長中之雜交體純系上澄液單離單株抗體。此外，可採用各種技術加強收量，如：將雜交體細胞株注射至合適脊椎動物（如：小白鼠）之腹膜腔。然後自腹水液體或血液中收集單株抗體。依一般技術排除抗體中之雜質，如··層 103376.doc -31- 1285648 、政膠過濾法、沉源法、及萃取法於純化法，例如:親和性層析步驟。…趾了用 =具體實施例中，最好使用抗體之結合抗原片段。此 =:叫段，其可使用標準技術製傷。簡言之，免 ^蛋白純化法可於蛋白fA球珠管柱上進行親和性層析 :表港實=中純化(哈如 ” ’至1988)，並利用木爪酵素分解，產生Fab虫 ==於蛋白fA球珠管柱上進行親和性層析法分離触、早株抗體與其片段可偶合—種多種醫療劑。此方面之合適製劑包括放射性追踪劑及化學醫療劑，其可用於例如：於試管内清除自體性骨髓。代表性醫療劑包括放射性核種、分化誘發劑、藥物、毒素、及其衍生物。較佳放射性核種包括9〇Y，⑵1，％，1311，18〜，…Re，⑴^及212則。較佳樂物包括胺甲碟吟’及㈣與以類似物。較佳分化誘杳劑包括大戟二萜醇酯及丁酸。較佳毒素包括：蓖麻毒素雞母珠毒蛋白、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin，假單胞菌内毒素，志賀菌毒素及美洲商陸抗病毒蛋白質。用於診斷時，可採用放射活性劑之偶合作用協助追踪轉移或測定 WT1陽性腫瘤之位置。醫療劑可直接或間接（例如：利用連接基）偶合（例如：共價鍵結）合適單株抗體。當製劑與抗體各具有可互相反應之取代基時，其之間可直接反應。例如：其中一者具有之親核性基團（如：胺基或氫硫基）可與另一者所含艘基基團 I03376.doc -32- 1285648 (如：酸酐或醯基i化物）反應，或與含良好之脫離基(例如：鹵離子）之烷基反應。或者，可能需要利用連接基偶合醫療劑及抗體。連接基之功能為間隔基，分隔抗體與製劑，以避免干擾結合能力。連接基亦可提高製劑或抗體上取代基之化學反應性，因此提高偶合效率。提高化學反應性亦有助於使用原本不可能使用之製劑，或製劑上之官能基。 # 相關技藝專家咸了解，可採用多種不同雙官能或多官能 5式劑（包括同官能或雜官能）（如述於皮爾斯化學公司（piaa Chemical Co·，Rockfor，IL)目錄者）作為連接基。可利用例如·胺基、羧基、氫硫基或氧化之碳水化合物殘基進行偶合。有許多參考文獻說明此等方法，例如：美國專利案1^〇· 4,671，95 8(洛德威（Rodwell)等人）。若醫療劑不含本發明免疫共軛物之抗體部份時較有效時，可此需要使用可在細胞内化期間或内化時裂解之連接 • 基團。已有文獻說明多種不同可裂解之連接基。自這些連接基中，於細胞内釋出製劑之機轉包括利用還原二硫化物鍵裂解（例如··史畢特（Spitler)之美國專利案ν〇· 4,489,71〇，照射光敏感性鍵結裂解（例如：山特（Sente〇等人之美國專利案No. 4,625,014)，水解衍化之胺基酸側裂解 (例如·柯恩（Kohn)等人之美國專利案ν〇· 4,638,045)，利用血清補體調節之水解作用裂解（例如··洛德威（R〇dweU)等人之美國專利案No· 4,671，95 8)及利用酸催化之水解作用裂解 (例如：巴拉特勒（Blattler)等人之美國專利案No. 103376.doc -33- 1285648 4,569,789) ° 可旎需要在抗體上偶合一種以上之製劑。一項具體實施例中，由製劑之多重分子偶合一個抗體分子。另一項具體實施例中，在一種抗體上偶合一種以上之製劑。不考慮特定具體實施例下，可依多種不同方式製備與一種以上製劑形成之免疫共軛物。例如：可由一種以上製劑直接偶合抗體分子，或可使用提供多重附接位置之連接基。或可使用載體。載體可依多種不同方式帶有製劑，包括直接共價鍵結或利用連接基鍵結。合適載體包括蛋白質如：白蛋白（例如：卡特（Kato)等人之美國專利案Ν〇· 4,5〇7,234)，肽及多醣如：胺基葡聚糖（例如：希（Shih)等人之美國專利案ν〇· 4,699,784)。載體亦可帶有利用非共價鍵結或利用包埋法而帶有製劑，如：包埋在微脂粒囊胞内（例如：美國專利案1^仍· 4,429，_及4,873，G88)。放射性核種之特異性載體包括放射性鹵化小分子及螯合性化合物。例如··美國專利案Ν〇· 4,735,792揭示代表性放射性幽化小分子及其合成法。放射性核種螯合物可由螯合性化合物形成，該化合物包括彼等含有氮及硫原子作為供體原子與金屬或金屬氧化物放射性核種結合之化合物。例如··戴維森（Davids〇n)等人之美國專利案No. 4,673,562揭示代表性螯合性化合物及其合成法。有多種不同投與抗體及免疫共軛物之途徑可以使用。典型之投藥法可為靜脈内、肌内、皮下或切除腫瘤處。咸了解，抗體/免疫共軛物之正確劑量將隨所採用抗體之劑量、腫瘤上之抗原密度、及抗體之排空速率等變化。 103376.doc -34- 1285648 本文亦提供模擬WT1免疫原部份之抗遺傳型抗體。這種抗體可利用習知技術，針對與WT1之免疫原部份特異性結合之抗體或其抗原結合片段產生。模擬WT1免疫原部份之抗遺傳型抗體為彼等與本文所述WT1免疫原部份特異性結合之抗體或其抗原結合片段結合之抗體。 T細胞免疫醫療組合物亦可包含，或者包含WT1之特異性T細 • 胞。這種細胞通常採用標準方法，於試管内或活體外製備。例如：T細胞可出現在（或單離自）哺乳動物之骨髓、周邊血液或骨髓或周邊血液之一部份，其係採用市售細胞分離系統進行’如：CEPRATEtm系統，購自 Cellpr〇公司（Ceiipr〇 Inc，

Bothell WA)(亦參見美國專利案N〇. 5,24〇,856 :美國專利案

No. 5,215,926 ; W0 89/06280 ; W0 91/16116 及 W0 92/07243)。或者，τ細胞可衍生自相關或不相關人類、非人類動物、細胞株或培養物。 _ Τ使用WT1多肽、編碼WT1多肤之聚核誓酸及/或表現 wT1多肽之含抗原細胞（APC)刺激τ細胞。這種刺激作用係在足以產生WT1多肽之特異性丁細胞之條件及時間下進订。WT1多肽或聚核:y：酸最好含在傳送載劑（如：微小粒）中，以促進產生抗原特異性，胞。簡言之，由利用例行技術自患者相關或不相關供體單離（如：由周邊血液淋巴球進行Ficoll/Hypaque密度梯度離心法單離）之τ細胞與wti多肽培養。例如：τ細胞可於試管内，37t下，與咖多肤（例如.5至25微克/毫升)或可合成相當多量㈣多肽之細胞培 ^3376^00 -35- !285648 養2至9天（典型4天）。需要另取一多Μ下iiL盖 a 4 77 T、、、田胞樣本於沒有WT1 夕肽下培養，作為對照組。若τ細胞殺死包覆WT1多肤之 .^ ^ 0, ^ A m 4胞或殺死表現編碼因之目標細胞時’則視了細胞為咖多肽之特異性細胞。可採隸何標準技術評針細胞特異性。例如：在鉻釋出分析法或增殖分析法中1溶胞作用及/或增殖作用之刺激指數比陰性對照組提高2倍以上時，則表示且τ细胞特異性。此等分析法可依例如：陳（chen)等人，ca_rRe、s. 54:1065-1G70, 1994所述之方法進行。或者，可利用多種不同已知技術檢測τ細胞之增殖作用。例如：測定dna合成法提高之速率來檢測T細胞之增殖作用（例如：以氣化胸嘗脈衝標識τ細胞培養物，測定進入DNA中之氚化胸茹之量）。其他檢測T細胞增殖作用之方法包括測定間白素-2(IL_2)之生產、Ca2+流入量、或染料吸收量（如：3_(4,5_二甲基嘧唑 -2·基）-2,5-二苯基四唑鏘）等之提高程度。或者，可測定淋巴細胞活素（如·· r-干擾素）之合成或定量對WT1多肽有反應之T細胞相對量）。與WT1多肽（200毫微克/毫升至1〇〇微克 /¾升’以100¾微克/毫升至25微克/毫升較佳）接觸3至7天時，應使T細胞之增殖作用至少提高2倍且/或依上述方法接觸2至3小時後，應可活化T細胞，此係採用標準細胞素分析法測定，其中細胞素（例如：TNF或IFN- r )釋出量提高2倍時，表示T細胞被活化（參見考力根（Coligan)等人，最新免疫學方法（Current Protocols in Immunology)，vol. 1，威利科際公司（Wiley Interscience，Green，1998)。WT1 特異性T細胞 103376.doc -36- 1285648 可採用標準技術擴增。較佳具體實施例中，τ細胞衍生自患者或相關或不相關供體，且繼刺激及擴增之後，投與患者。受WT1多肽，聚核苷酸或表現WT1之Apc活化之τ細胞可為CD4+及/或CD8+。CD4+或CD8+ 丁_細胞之特異性活化作用可依多種不同方式檢測。檢測特異性τ細胞活化作用之方法包括檢測丁細胞之增殖作用，細胞素（例如：淋巴細胞活素）之產生，或細胞溶解活性之產生（亦即：針對WT1之特異性 • 產生細胞毒性T細胞）。對CD4+ T細胞·而言，檢測特異性τ 細胞活化作用之較佳方法為檢測τ細胞之增殖作用。對 CD8+ Τ細胞而言，檢測特異性τ細胞活化作用之較佳方法為檢測細胞溶解活性之產生。用於醫療目的之因應WT1多肽、聚核苷酸或Apc而增殖之CD4+或CD8+T細胞可於試管内或活體内大量擴增。此等 τ細胞於試管内增殖之方法可利用多種方式完成。例如·· τ 細胞可在添加或不添加T細胞生長因子（如：間白素_2)及/ # 或合成WT1多肽之刺激物細胞下，再曝露至WT丨多肽。若要產生CD8+T細胞反應時，最好添加刺激物細胞。τ細胞可因應WT1多肽之間歇性再刺激作用在試管内大量生長，並保留特異性。簡言之，進行試管内之初次刺激作用（以§) 時，可將大量淋巴細胞（例如：超過4χ1〇7個）置入含有含人類血清之培養基之燒瓶中。直接添加WT1多肽（例如：⑺微克肽/毫升）及破傷風毒素（例如：5微克/毫升）。然後培養燒瓶（例如：37°C下7天）。進行第二次IVS時，收集丁細胞，置入含2至3x10個經照射之周邊血液單核血球細胞之新燒瓶 103376.doc -37 - 1285648 中。直接添加WT1多肽（例如：10微克/毫升）。燒瓶於37t 下培養7天。第二次IVS後第2天及第4天時，添加2至5單位間白素-2(IL-2)。進行第三次][VS時，將丁細胞置入凹孔中.，以包覆肽之個人自己之EBV轉型B細胞刺激。於每次循環之第2天及第4天時添加IL-2。一旦細胞出現特異性細胞毒性τ 細胞時，即於第2、4及6天時，使用更高量IL_2(2〇單位）進行10天之刺激作用循環，擴增細胞。 • 或者，利用選殖法，可大量擴增在WT1多肽存在下增殖之一種或多種T細胞。選殖細胞之方法係相關技藝習知者，且包括限制稀釋法。自敏化患者之周邊血液純化效應物τ 細胞之方法為密度梯度離心法及綿羊紅血球細胞瓣狀體形成法（resetting)，並於經照射之自體填充細胞之存在下，使用公認之抗原刺激，於培養物中確認。為了產生CD4+ τ細胞株，採用WT1多肽作為抗原性刺激物，並採用經感染伊斯坦巴爾病毒（Epstein Barr virus)而永續處理之自體周邊血，液淋巴球（PBL)或類淋巴母細胞株作為含抗原細胞。為了產生CD8+ T細胞株，可採用經生產WT1多肽之表現媒介體轉感染之自體性含抗原細胞作為刺激物細胞。以1 χ J 〇6 個經照射之PBL或LCL細胞及重組間白素·2 (riL2)(50單位/ 毫升），依每孔0.5個細胞之頻率，塗佈含在96孔平底板中之叉刺激之T細胞上，進行抗原刺激作用，2至4天後即可選殖確立之T細胞株。初步塗佈後約2至3週時可鑑別確定有純系生長之凹孔，並於自體性含抗原細胞之存在下，使用適當抗原再刺激，然後在抗原刺激作用之後添加低劑量rIL2 ( J 〇 !〇3376.(!〇〇 -38-

1285648 單位/毫升）2至3天，進行擴增。約每2週使用抗原及rIL2定期再刺激，可使T細胞保持在24凹孔板中。某些具體實施例中，可於活體内及/或試管内引發（亦即對 WT1敏化）同種異基因性τ細胞。進行這種引發作用時，可由T細胞與WT1多肽、編碼此等多肽之聚核站酸或產生此等多肽之細胞於足以引發τ細胞之條件及時間下接觸。通常，若例如·與WT1多肽接觸時，引發之τ細胞會造成τ細胞增

殖及/或活化，其可採用本文說明之標準增殖法、鉻釋出分析法及/或細胞素釋出分析法測定。與陰性對照組比較時，在增殖或溶胞作用上之刺激指數提高2倍以上，在細胞素含量上提高3倍以上，表示具丁細胞特異性。於試管内引發之細胞可用於例如··骨髓移植或作為供體淋巴細胞輸液。醫藥組合物及疴钴在某些方面，醫藥組合物或疫苗中可包含多肽、聚核芬 I抗體及/或T細胞。或者’醫藥組合物可包含經WT1聚核#酸轉感染之含抗原細胞(例如：樹枝狀細胞)，因此含抗原細胞可表現WT1多肽。醫藥組合物包含一種或多種此等化合物或細胞及生理上可接受之载體或賦形劑。某些疫苗可包含-種或多種此等化合物或細胞及非特異性免疫反應加強劑…輔劑或微脂粒(其中包含化合物醫藥組合物與疫苗可另包含傳送系紡 A ·丄一 k糸、，先如·生物可降解之微小粒，直揭示於例如：美國專利案NGS 4,897,268b,G75，1G9e_ 明範圍内之醫藥組合物亦可包含i 」」巴3具他具生物活性或不具生物活性之化合物。 103376.doc -39- 1285648 某些具體實施例中，醫藥組合物與疫苗之設計為在患者體内（如：人類），誘發WT1多肽之特異性T細胞反應。通常，透過使用相當短多肽（例如：包含天然WT1多肽之23個以下之連續胺基酸殘基，以4至16個連續殘基較佳，8至16個連績殘基更佳，8至1 〇個連續殘基更佳），有利於τ細胞反應。或者’或另外’疫苗可包含優先加強T細胞反應之非特異性免疫反應加強劑。換言之，免疫反應加強劑可加強τ細胞對 WT1多肤之反應程度，其加強程度在比例上大於所加強之抗體反應程度。例如··當與標準油性輔劑（如·· CFA)比較時， k先加強τ細胞反應之免疫反應加強劑之增殖性τ細胞反應比WT1陰性對照組細胞株至少加強2倍，其溶胞反應至少加強10 /❶，及/或其T細胞活化作用至少加強2倍，同時未檢測到加強之抗體反應。針對WT1多肽所加強之τ細胞或抗體反應私度通常採用相關技藝上已知之任何代表性技術測定，如本文提供之技術。 Φ 醫藥組合物或疫可包含如上述編碼一種或多種多肽之

症或其他症病毒，畜），其細胞表面上表現多肽之免疫原部施例中，可使用病毒表現系統（例如：牛反轉錄病毒，或腺病毒）引進DNA，其涉 103376.doc 1285648 及使用非病原性（有缺陷）之複製成份病毒。引進DNA進入此等表現系統中之技術係相關技藝習知者。DNA亦可為，，裸露的π，如述於例如：烏莫（Ulmer)等人，Science 259:1745-1749，1993及柯亨（Cohen)，Science 259:1691-1692, 1993之概述。使DNA塗佈在生物可降解之小珠上可提高吸收*’裸露的"DNA，可有效地運送至細胞内。如上已述，醫藥組合物或疫苗可包含表現WT1多肽之含抗原細胞。如本文所述，用於醫療目的之含抗原細胞最好為自體性樹枝狀細胞。這種細胞可採用標準技術製備及轉感染，如：彼等述於李弗（Reeves)等人，Cancer Res. 56:5672-5677, 1996 ;杜丁（Tuting)等人，J. Immunol· 16〇: 1139-1147，1998 ;及奈爾（Nair)等人，Biotechnol. 16: 3 64-3 69, 1998)。利用本文說明之試管内刺激作用及標準增殖法’及鉻釋出分析法，確認含抗原細胞表面上WT丨多月太之表現。雖然本發明醫藥組合物中可使用相關技藝習知之任何合適載體，但載體型式可依投藥模式而異。本發明組合物可調配供任何適當投藥方式，包括例如：局部、經口、鼻、靜脈内、顱内、腹膜内、皮下或肌内投藥。供非經腸式投藥（如：皮下注射）時，載體最好包括水、食鹽水、醇、脂肪、峨或緩衝劑。供經口投藥時，上述任何載體或固體載體均可使用，如：甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖纖素、葡萄糖、蔗糖、及碳酸鎂。亦可使用生物可降解性微小粒（例如：聚乳酸酯聚二醇酯）作為本發明醫藥 103376.doc -41 - 1285648 組合物之載體。對某些局部施藥法，調配物為使用習知成份形成之乳霜或洗液較佳。此等組合物亦可包含緩衝液（例如··中性緩衝食鹽水或碟酸鹽緩衝食鹽水)、碳水化合物(例如··葡萄糖、甘露糖、.奔糖或葡聚糖）、甘露糖醇、蛋白f、多肽或胺基酸（如··甘胺酸）、抗氧化劑、螯合劑（如：EDTA或谷胱甘肽），輔劑⑽ 如：氫氧化鋁）及/或防腐劑。或者，本發明組合物可調配成 • 冷凍乾燥物。化合物亦可使用習知技術包埋在微脂粒令。本發明疫苗可使用任何多種非特異性免疫反應加強劑，如··輔劑。大多數輔劑包含一種物質，經設計可保護抗原免於快速代謝，如：氳氧化鋁或礦物油，及免疫反應之刺激劑，如：脂質A，百曰咳博德桿菌（B〇rtadella pertussis) 或、、口核刀枝才干卤（Mycobacterium tuberculosis)衍生之蛋白質。合適之非特異性免疫反應加強劑包括以鋁為主之輔劑 (例如紹水合膠（Alhydrogel)，Rehydragel，碟酸|呂， _ Algammulln’氫氧化鋁），油質輔劑（弗洛伊氏輔劑（Freund，s adjuvant) (FA)，Specol，RIBI，TiterMax，Montanide ISA50或 Seppic MONTANIDE ISA 720 ;細胞素（例如：GM-CSF或

Flat3-配位體）；微小粒；以非離子性嵌段共聚物為主之輔劑；以二甲基二-十八烷基銨化溴（DDa)為主之辅劑as-1， AS_2(史克必占藥廠（Smith Kline Beecham);以里必（Ribi) 輔劑系統為主之輔劑；QS21(亞克藥廠（Aquila);以皂角苷為主之輔劑（粗皂角苷，皂角苷Quil A);以胞壁基二肽（MDP) 為主之輔劑如：SAF(呈其微流化型之Syntex辅劑 103376.doc -42- 1285648 (SAF-m));二甲基-二-十八烷基銨化溴（DDA);以人類補體為主之輔劑m· vaccae及衍生物；以免疫刺激複合物（isc〇m) 為主之輔劑；去活性毒素；及減毒之傳染劑（如：結核分枝桿菌）。 :口上已述，某些具體實施例中，根據其優先誘發或加強τ 細胞對WT1多肽之反應（例如：CD4 +及/或CD8+)之能力來選

擇免疫反應加強劑。這種免疫反應加強劑係相關技藝習知者’且包括（但不限於）·· M〇ntanide ISA5〇，Seppic MONTANIDEISA 720，細胞素（例如：GM-CSF，Fiat3-配位體），微小粒，以二甲基二_十八烷基銨化溴（D〇A)為主之輔对J AS-1(史必克占藥廠），AS-2(史必克占藥廠），以里必輔劑系統為主之辅劑，QS21(亞克藥廠），以皂角苷為主之輔劑（粗皂角铱，皂角苷QuilA)，呈其微流化型之輔劑 (SAF-m)，Mv，ddMV(金尼斯藥廠（Genesis)，以免疫刺激複合物（isc〇m)為主之輔劑及去活性毒素。本文說明之組合物與疫苗可作為持續釋出調配物之一部份投藥（亦即膠囊或海綿，投藥後可緩緩釋出化合物）。這種調配物通常採用相關技藝習知之技術製備，且利用例如·· 經口、直腸或皮下植入，或植入所需目標位置投藥。持與釋出之調配物可於載體基質中包含勻散之多肽、聚核^ 酸、抗體或細胞及/或包含在被控制速率膜包圍之儲存j 中。用於此等調配物之載體為生物可相容者，且亦可為 $可降解者；調配物最好可提供相#穩定之活性成份釋^ ϊ °持續釋出之調配物中活性化合物之含量依植入位置， 103376.doc 1285648 ==期望之釋出持續時間，及待治療或預防之病症明另一方面，可採用本文說明之組合物及r一來* 制惡性疾病發展（例及田末抑性疾病，如.最^/ 瘤負擔之漸進性或轉移防、延、帶以 3性疾病）。通常，這種方法可用於預延滞或處理與WT1表現有關之疾 :貝供之醫療法可用於户瘆Λ 本文如於為… 與州有關之疾病，或可用 ; 淮〜、疾病或已罹患與WT1表現# 1 Μ ^ 預防或延緩此等疾病發病。表現尚無關之疾病之患者本^述及之錢者在疾賴財些時候，疾病細如：腫瘤組胞)產生之可檢測WT1多肽量高於相同組織之正常細胞時’則稱該疾病"與WT1表現有關"。WTi表現與惡性疾病之相關性不要求WT1必須出現在腫瘤上。例如：州之過度表現可能涉及腫瘤之引發，但隨後可能喪失蛋白質表現。或者，沒有WT1表現提高之特徵之惡性疾病可能在後來逐漸變成有WT1表現提高之特徵之疾病。因此過去、目前或將來可能提高WT1表現程度之疾病細胞之任何惡性疾病均視為’’與WT1表現有關π。免疫療法可採用任一種技術進行，其中本文提供之化合物或細胞之功能在於自患者體内排除|71表現細胞。當在患者體内針對WT1或表現WT1之細胞加強或誘發特異性免疫反應時’即可造成這種排除結果。或者，可於活體外排除表現WT1細胞（例如··處理自體性骨髓、周邊血液或骨髓 103376.doc -44- 1285648 之任何標準技術得或周邊血液之一部份）。可採用相關技藝到骨髓或周邊血液之一部份。

此等方法中，可對患者投與醫藥組合物及疫苗。本文採用之"患者”係指任何溫血動物，以人類較佳。該患者可羅患或未罹患惡性疾病。因此，上述醫藥組合物及疫苗可用於預防疾病引發（亦即預防性）或治療已罹患疾病之患者⑽ 如··預防歧緩财疾狀進展及/或轉移）。罹患疾病之患者可能具有最小殘留疾病（例如：完全或部份緩和病情之白血病患者或接受手術放射療法及/或化學療法後而減少腫瘤負擔之癌症患者之低腫瘤負擔）^這種患者可免疫接種抑制復發（亦即預防或延緩復發，或降低復發之嚴重性某些較佳具體實施例中，患者罹患白▲病（例如：aml，⑽卜 ALL或幼年型ALL)，#髓發育不良症候群（mds)或癌症（例如.月腸肺、甲狀腺或乳癌或黑色素瘤），其中癌症或白血病為WT1陽性（亦即如本文所述，與抗WT1抗體達可檢測之反應，或如本文所述，由111^1>(:11檢測到表現WT1 mRNA) 或罹患與對抗WT1表現細胞有關之自體免疫疾病。本文提供之組合物可單獨使用或併用一般醫療法如··手術、照射、化療及/或骨髓移植（自體、同基因、同種異基因、或不相關）。如下文中更詳細之討論，本文提供之結合劑與 T細胞可用於清除自體幹細胞。在例如：骨髓移植或輸送血液成份之前，這種清除法可能有利。本文提供之結合劑、T 細胞、含抗原細胞（APC)及組合物可用於試管内及/或活體内擴增及刺激（或引發）自體、同種異基因、同基因或不相關 103376.doc -45-

1285648 之WT1特異性T細胞。這種WT1特異性T細胞可用於例如：供體淋巴球輸液中。投藥途徑與頻率及劑量將隨個體而異，且很容易採用標準技術確立。通常，醫藥組合物與疫苗可利用注射（例如·· 皮内、肌内、靜脈内或皮下）、鼻内（例如··吸入）或經口投藥。對某些腫瘤，可局部投與醫藥組合物或疫苗（例如··利用直腸鏡、胃鏡、内視鏡、血管照像、或相關技藝習知之其他方法）。較佳者，在52週内投與！至丨〇個劑量之間。較佳者，每間隔1個月，共投與6個劑量，之後定期追加接種

诏里。亦可採用適合個別患者之方法。合適劑量為當依上述方法投藥之化合物用量可以促進抗腫瘤免疫反應至少高於底線（亦即未處理）值之10至5〇%。這種反應可利用測量患 =體内抗腫瘤抗體追腙，或於試管内追踪隨疫苗產生之殺死患者腫瘤細胞之溶解細胞性效應物細胞。這種疫苗應亦可引發免疫反應，對接種疫苗之患者所造成之臨床結： =未接種疫苗之患者改善（例如：更常完全或部份減緩病情，或無病時間較長及/或完全存活）。通常，含有_種 2肽之醫藥組合物或疫苗中，各多肽之劑量範圍約⑽ 完克。合適劑量大小將依患者體型變化，但典型範圍在約0.1毫升至約5毫升。通常適當劑量與療程提供之活性化合物广或預防效益。這種反應之追踪法係比較有處理= :交：未處理之患者之臨床結果改善程度(例如:更；'二 μ減緩病情，或無病時間較長及/或完全存活)。先前存' 103376.doc -46 - 1285648 對w二之免疫反應提高程度通常與改善之臨床結果呈⑼ 2 ^種免疫反應通常採用標準增殖法、細胞毒性或細胞素分析法評估，其可您、知用自處理則與處理後之患者所得之樣本進行。其他方面中，抑制與WT1表現有關之惡性疾病發展之方法涉及依上述投與自體性T細胞，其已針對和多肽或表現 WT1之APC活化。這種丁細胞可為CD4+及/或⑽+，且可依述曰殖T、、.田胞與個體之量可有效抑制惡性疾病之發展。典型地’經靜脈内、顱内或在腫瘤切除處投與約】_9至^ 1011個T細胞/m2e相關技藝專家咸了解，投藥之細胞數及頻率依患者之反應而異。某些具體實施例中，可在自體移植骨髓之前先刺激T細胞。這種刺激作用可於活體内或試管内進行。進行試管内刺激時，自患者取得之骨髓及/或周邊血液（或骨髓或周邊血液之一部份可與WT1多肽、編碼WT1多肽之聚核钻酸及/或表現WT1多肽之APC於足以依上述刺激T細胞之條件與時間下接觸。然後採用標準技術，將骨髓、周邊血液幹細胞及/WT1特異性T細胞投與患者。相關之具體實施例中，可在同基因或同種異基因（相關或不相關）骨髓移植之前先刺激相關或不相關供體之τ細胞。這種刺激作用可於活體内或試管内進行。進行試管内刺激作用時，自相關或不相關供體得到之骨髓及/或周邊血液（或骨髓或周邊血液之一部份）與WT1多肽、WT1聚核：y：酸及/ 或表現WT1多肽之APC於足以依上述刺激T細胞之條件與 103376.doc -47- 1285648 周邊血液幹細時間下接觸。然後採用標準技術，將骨胞及/或WT1特異性τ細胞投與患者。其他具體實施例中，採用本文說明之WT1特異性τ細胞，

自自體㈣、周邊域或㈣或周邊錢之—部份（例如：投與患者前之富含CD341邊血液（PB)巾排除表現WT1之細胞K亍此方法時，由骨髓或PB與這種了細胞在足使WT1 表現細胞減少至佔骨髓或周邊血液中骨髓樣細胞或淋巴細胞總數之H)%以下’ 5%以下較佳’及1%以下更佳時之條件與時間下接觸。此等細胞之排除程度很容易由標準方法決定’如’例如：定性及定量PCR分析法、形態學、免疫：織化學及FACS分析法。然後採㈣準技術對患者投與骨趙或PB(或其一部份）。診斷方法本發明尚提供檢測與WT1表現有關之惡性疾病之方法，及追腙免疫接種或醫療法對此等疾病之有效性之方法。此等方法之根據為本發明發現WT1蛋白質之特異性免疫反應可在罹患此等疾病之患者體内檢測到，且加強此等免疫反應之方法可提供預防或醫療效益。為了測定是否出現與WT1表現有關之惡性疾病時，測試患者之WT1特異性T細胞含量。某些方法中，自患者取得含 CD4 +及/或CD8+T細胞之生物樣本，與貨丁丨多肽、編碼wti 多肽之聚核甞酸及/或表現WT1多肽之APC培養，並依本文所述，檢測是否出現T細胞之特異性活化作用。合適之生物樣本包括（但不限於）·早離之τ細胞。例如··可利用例行技 103376.doc -48- 1285648 術（如··利用Ficoll/Hypaque密度梯度離心法處理周邊血液淋巴球）自患者單離τ細胞。τ細胞可與wti多肽（例如·· 5至25 微克/毫升）於37°C下培養2至9天（典型為4天）。可能需再取一份τ細胞樣本，於不含WT1多肽下培養，作為對照組。cd4+ T細胞之活化作用最好經由分析τ細胞之增殖作用進行檢測。CD8+ T細胞之活化作用最好經由分析細胞溶解性進行檢測。若增殖作用程度比無疾病患者至少高2倍且/或細胞 • 溶解活性至少高20%時，表示已出現與WT1表現有關之惡性疾病。進一步採用相關技藝習知之方法，探討增殖作用及/ 或細胞溶解活性程度與預估對醫療之反應之間之相關性。特定言之，抗體、增殖性及/或細胞溶解反應較高之患者則可能對醫療法有較高反應。其他方法中，測試患者之生物樣本中WT1特異性抗體之含量。由生物樣本與WT1多肽、編碼WT1多肽之聚核苷酸及/或表現WT1多肽之APC，於足以形成免疫複合物之條件 _ 與時間下培養。然後檢測WT1多肽與生物樣本中特異性結合WT1多肽之抗體之間形成之免疫複合物。此等方法採用° 之生物樣本可為來自預期含有抗體之患者之任何樣本。合適生物樣本包括血液、血清、腹水、骨髓、胸膜渗液、及腦脊髓液。由生物樣本與WT1多肽，於反應混合物中，在足使多肽與WT1之特異性抗體之間形成免疫複合物之條件鱼時間下培養。例如：生物樣本與WT1多肽可於代下培養24至時。 103376.doc 1285648 培養後，測試反應混合物是否含有免疫複合物。檢測WTl 多肽與生物樣本中抗體之間形成之免疫複合物之方法可採用多種已知技術進行，如：放射性免疫分析法（RIA)及酵素連結性免疫吸附分析法（ELISA)。合適分析法係相關技藝習知者，且廣泛說明於科學及專利文獻中（例如：哈洛與雷恩，抗體學：實驗室手冊，冷泉港實驗室，1988)。可採用之分析法包括（但不限於）：戴維（David)等人（美國專利案 4,376,110)之雙重單株抗體夾心免疫分析技術；單株-多株抗體夾心分析法（懷德（Wide)等人述於克漢（Kikham)與亨特 (Hunter)編輯之”放射免疫分析法"(Radioimmunoassay Methods)，愛丁堡E&S·李文斯東出版社作.&11(18· Livingstone，Edinburgh, 1970);哥登（Gordon)等人之’’西方墨點法’’（美國專利案4,452,901);有標記之配位體之免疫沉澱法（布朗（Brown)等人，J· Biol. Chem·，255: 4980-4983, 1980);如述於例如··萊恩斯（Raines)與羅斯（Ross)之酵素連結性免疫吸附分析法（J· Biol. Chem· 257:5154-4160, 1982);免疫細胞化學技術，包括採用螢光物（布魯克斯 (Brooks)等人，Clin. Exp· Immunol· 39:477，1980);及活性中和法，（包文-波普（Bowen-Pope)等人 ’ Proc. Natl. Acad· Sci. USA 81:2396-2400，1984)。其他免疫分析法包括（但不限於）：彼等述於美國專利案Nos·: 3,817,827; 3,850,752; 3,901，654; 3,935,074; 3,984,533; 3.996,345; 4,034,074;及 4,098,876 之方法。用於檢測目的之WT1多肽可標記或未標記。未標記之 103376.doc -50- 1285648 WT1多肽可用於凝集作用分析法或併用與免疫複合物鈐合之有標記之檢測試劑（例如··抗免疫球蛋白，蛋白質G 白質A或外源凝集素及可與特異性結合WT1多肽之广· $ 合之第二抗體，或其結合抗原之片段）。若WT1多肤有時，報導者基團可為相關技藝上已知之任何合適報導者爲團，包括放射性同位素、螢光基團、發光基團、酵素、= 物素及染料粒子。 • 某些分析法中，由未標記之WT1多肽固定在固體擔體上。固體擔體可為可附接多肽之相關技藝專家習知之任何材料。例如··固體擔體可為微滴定板之試驗凹孔，或為硝基纖維素或其他合適膜。或者，擔體可為小球珠或碟形，如··玻璃、玻璃纖維、膠乳或塑膠材料如：聚苯乙烯或聚乙烯氯。擔體亦可為磁性粒子或纖維感光劑，如述於例如：美國專利案No· 5,359,681者。多肽可採用相關技藝專家已知之多種技術固定在固體擔體上，此等技術已廣泛說明於藝專利案與科學文獻中。本發明内容中，，，固定化，，一詞係指非共價結合（如：吸附）及共價結合（其可為抗原與擔體上官月b基之間之直接鏈結，或可為利用交鏈劑形成之鏈結）。以利用吸附作用固定在微滴定板凹孔中或固定在膜上較佳。 k種情況下’於合適緩衝液。由WT1多肽與固體擔體接觸 ^又適當時間’即可完成吸附過程。接觸時間隨溫度而異，彳一典型在約1小時至約1天之間。通常，由塑膠微滴定板 (如·聚苯乙烯或聚乙烯氣）之凹孔與約10毫微克至約10微克 (以約100毫微克至約1微克較佳）之多肽接觸，即足以固定適 103376.doc -51 - 1285648 量多肽。固定後，典型地封阻擔體上其餘蛋白質結合位置。相關技藝上已知之任何合適封端劑均可，如··牛血清白蛋白， Tween 20TM(希格馬化學公司（Sigma Chemical c〇i，以

Louis，MO)，經加熱去活性之正常山羊血清（NGs)，或 BLOTTO(無脂奶粉之緩衝液，其亦包含防腐劑、鹽及消泡劑）。擔體再與懷疑含有特異性抗體之生物樣本培養。樣本 • 可在未稀釋或經常在稀釋後施用，通常在含少量重量％)蛋白質（如：BSA，NGS或BLOTTO)之緩衝液中稀釋，通常，適當接觸時間（亦即培養時間）為足以使之在含與 WT1特異性結合之抗體之樣本中檢測此種抗體之存在之時間。較佳者，接觸時間足以使結合抗體與未結合抗體之間達平衡時，達到至少約95%之結合程度。相關技藝專家們咸了解，達到平衡時所需之時間很容易在這段時間期内分析所進行之結合程度來決定。室溫下之培養時間約…分齡鐘，通常即已足夠。然後以適當緩衝液，如：含〇1% Tween 2〇TM2Pbs洗滌固體擔體，排除未結合之樣本。然後可添加與免疫複合物、、’口口且包含報導者基團之檢測試劑。檢測試劑與物培養一段足以檢測到結合抗體之時間。這段適當時間1 常由分析這段時間内發生之結合程度來決定。然後排除未結合之檢測試劑，採用報導者基團檢測結合之檢測試劑。才欢測報導者基團所採用之方法依報導者基團之性質而異。若為放射活性基團時，通常適合採用閃爍計數法或自動放 103376.doc -52· 1285648 射性照像法。光度測定法可用於檢測染料、發光基團及榮光基團。可採用與不同報導者基團（通常為放射活性或螢光性基團《酵素）偶合之抗生物素蛋白㈣生物素。酵素報導者基團（例如：辣根過氧化酶、β_半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶及葡萄糖氧化酶）之一般檢測法為添加受質（通常經過一段特定時間），然後利用光度計或其他分析反應產物之方法檢測。不論採用何種特定方法，若結合之檢測試劑量高於背 • 景值（亦即得自無疾病個體之生物樣本觀察到之結合量）至少2倍時，表示出現了與WT1表現有關之惡性疾病。通常，追踪免疫接種或醫療法有效性之方法涉及追踪患者體内WT1特異性抗體或τ細胞含量變化。追腙抗體含量之方法包括下列步驟：⑷自接種疫苗或接受醫療之前之患者取得第一個生物樣本，與WT1多肽接觸，其中在足以形成免疫複合物之條件與時間下進行接觸；（b)檢測WT1多肽與生物樣本中與WT1多肽特異性結合之抗體之間形成之免疫 • 複合物；（C)採用自接受醫療或免疫接種後之患者之第二個生物樣本重覆步驟如)與（1));及（〇1)比較第一個與第二個生物樣本中檢測到之免疫複合物數量。或者，可改用編碼Wh 多肽之聚核苷酸，或表現WT1多肽之APC替代WT1多肽。此等方法中，在生物樣本中檢測聚核苷酸編碼之wti多肽或APC表現之WT1多肽與抗體之間所形成免疫複合物。追踪τ細胞活化作用及/或WT1特異性前體數量之方法可包括下列步驟··（a)自接受醫療或免疫接種之前之患者取得第一個含CD4+及/或CD8 +細胞之生物樣本（例如··骨髓、周 103376.doc -53- 1285648 邊血液或其部份），與WT1多肽培養，其中該培養過程係於足以達特異性活化、增殖及/或溶解T細胞之條件及時間下進行；（b)檢測T細胞之活化、增殖及/或溶胞量；⑷採用自接受醫療與免疫接種後之相同患者取得之第二個含CD4+及 /或CD8+ T細胞之生物樣本重覆步驟（“與邙）；及（b)比較第一個與第二個生物樣本之間T細胞之活化、增殖及/或溶胞量。或者，可改用編碼wti多肽之聚核甞酸或表現WT1多肽之APC替代WT1多肽。用於此等方法之生物樣本可為得自懷疑含有抗體、CD4+ 、、、田I及/或CD8 T細胞之患者之任何樣本。合適生物樣本包括血液、血清、腹水、骨髓、胸膜滲液及腦脊髓液。第一個生物樣本可得自開始醫療或免疫接種之前或在醫療或免疫接種療程之中途。第二個生物樣本應依類似方式，但在進行另一次醫療或免疫接種之後取得。取得第二個生物樣本之時間可在醫療或免疫接種完成時或半途中，但其條件為在取得第—個生物樣本與第二個生物樣本之間進二至少一部份醫療或免疫接種過程。這二個樣本之培養與檢測步驟通常依上述進行。若第二個樣本中免疫複合物數量比第—個樣本在統計上顯著增加時’表示醫療或免疫接種成功。下列實例僅供說明，並未加以限制·· 實例1 103376.doc -54- 1285648 本實例說明血液惡性病患者現存免疫反應之鑑定法。為了評估患者現存之WT1特異性抗體反應，採用西方墨點分析法分析AML、ALL、CML及嚴重發育不全性貧血患者之血清。測試血清中人類白血病細胞株K562(美國菌種培養物收集處（American Type Culture Collection，Manassas， VA))形成免疫沉澱物WTl之能力。各情況下分別利用凝膠電泳法分離免疫沉澱物，移至膜上，以抗WT1抗體WT180 為探針檢測（聖塔克魯茲生物科技公司（Santa Cruz Biotechnology，Inc” Santa Cruz，CA))。此西方墨點分析法鑑別血液惡性病患者中潛在之WT1特異性抗體。展現AML 患者結果之代表性西方墨點示於圖2。以WT1特異性抗體辨識採用患者血清產生之免疫沉澱物中之52 kD蛋白質。採用在相同分子大小處移動之52 kD蛋白質為陽性對照組。實例2 在接受表現WT1細胞姝免癌接種之止_白鼠體内諸發WT1之抗艚本實例說明採用表現WT1之細胞於活體内誘發WT1特異性抗體反應之用途。在白血病患者體内檢測到現存針對WT1之抗體即強力表示有可能免疫接種WT1蛋白質來誘發對WT1之免疫性。為了測試是否可利用免疫接種法產生對WT1之免疫性，因此為小白鼠注射TRAMP-C，係來自B6之WT1陽性腫瘤細胞株。簡言之’為雄性B6小白鼠皮下接種5xl〇6個TRAMP-C 細胞，並每間隔3週共追加二劑5χ 1 〇6個細胞。最後一次免疫接種後3週’取得血清，於含25 μΜ β-2-氫硫基乙醇、每 103376.doc -55- 1285648 毫升200單位青黴素、10 mM L-麩醯胺及10%胎牛血清之 RPMI 1640培養基（GIBCO)中製備之脾單細胞懸浮液。接種TRAMP-C後，可在免疫接種後之動物體内檢測到 WT1特異性抗體反應。代表性西方墨點示於圖3。這些結果顯示免疫接種WT1蛋白質可誘發WT1蛋白質之免疫反應。實例3 在免疫接種WT 1觖之小白鼠體内諉發Th及抗體反應本實例說明免疫接種WT1肽誘發WT1之特異性免疫反應之能力。根據Tsites程式（羅巴德（Rothbard)與泰勒（Taylor), EMBO J· 7:93-100，1988 ;戴文（Deavin)等人，Mol Immunol. 33: 145-155，1996)鑑別適合誘發Ab及增殖性T細胞反應之肽，該程式可搜尋具有誘發Th反應潛力之肽要素。合成表I所示之肽並分析序列。

表I WT1肽肽序列註解小白鼠：p心2$ RDLNALLPAVSSLGGGG (SEQIDNO:13) 與人類WT1序列有1處不相符人類·:ρ6·22 RDLNALLPAVPSLGGGG (SEQIDNOrl) 人類/小白鼠:. Ρ117-139 PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (SEQ ID NOs: 2 與 3) 小白鼠：244-262. GATLKGMAAGSSSSVKWTE (SEQ ID NO:14) 與人類WT1序列有1處不相符人類：ρ244-262 GATLKGVAAGSSSSVKWTE (SEQ ID NO:4) 人類/小白鼠： ρ287-301 RIHTHGVFRGIQDVR (SEQ ID N〇s: 15 與 16) 小白鼠：ρ299·313 VRRVSGVAPTLVRS (SEQ ID NO: 17) 與人刼WT1序列有1處不相符人類/小白鼠： ρ42Μ35 CQKKPARSDELVRHH (SEQ ID N〇s: 19 與 20) 103376.doc -56- 1285648 用於免疫接種之肽分成下列幾組： AJi_·· P6·22人類·· 1毫升中含ι〇·9毫克（10微升=100微克） P117-l39人類/小白鼠：；[毫升中含7·6毫克（14微升:=；[〇〇微克） ρ244_262人類：1毫升中含4·6毫克（22微升=1〇〇毫克） ϋ : Ρ287-301人類/小白鼠：1毫升中含7.2毫克（14微升 = 100微克） • 小白鼠ρ299-3 13 : 1毫升中含6.6毫克（15微升=100微克） Ρ421-435人類/小白鼠：1毫升中含3·3毫克（3〇微升=1〇〇微克）数腹袒:(FBL肽100微克）+ CFA/IFA .赴照組：(CD45肽 100微克）+ CFA/IFA Α組含有出現在WT1胺基末端部份之肽（表現序列丨），β組含有出現在羧基末端之肽，其包含四個鋅指形區，其序列與其他DNA結合性蛋白質具同質性。b組中，p287-301及 • P299-313衍生自表現序列7,辞指形區i，且p421_435衍生自表現序列10，鋅指形區IV。以WT1肽或對照組為B6小白鼠進行免疫接種。肽溶毫升注射用無菌水中，每間隔3週為B6小白鼠接種，共3次。採用之輔劑為CFA/IFA，GM/CSF及Montinide。依實例工與2 所述測定WT1之特異性抗體之存在，並採用標準胸苷吸收分析法評估增殖性T細胞反應，其中細胞於抗原之存在下培養，測定吸收之放射活性，評估增殖作用（陳（Chen)等人，

CanCerRes.54:1065_1070, 1994)。特定言之，於％孔板中， 103376.doc -57- 1285648 由2x105個淋巴細胞/孔與4x105個經照射（3000 rads)之同基因性脾細胞及指定之肽培養。接受A組肽免疫接種之小白鼠誘發出WT1之抗體反應（圖 4)。免疫接種疫苗B者則未檢測到抗體，此點與接種疫苗b 後缺少助手T細胞之結果一致。pi 17-139誘發增殖性T細胞反應（圖5A-5C)。刺激指數（SI)在8與72之間變化。其他肽 (p6-22及p299-3 13)亦顯示可誘發增殖性T細胞反應。接種 P6-22得到之刺激指數（SI)為2.3，而接種p299-313得到之SI 則為3 ·3。陽性對照組包括ConA刺激之T細胞，及經已知抗原刺激之T細胞，如：CD45及FBL，及同種異基因性T細胞 (狄布魯因（DeBruijn)等人，Eur· J· Immunol. 21:2963-2970, 1991)。圖6A與6B出示疫苗A(圖6A)與疫苗B(圖6B)中三種肽分別得到之增殖性反應。疫苗A誘發增殖性T細胞對免疫肽 p6-22及pll7-139之反應，刺激指數（SI)在3與8之間變化（粗線）。未檢測到對244-262之增殖性反應（圖6A)。隨後僅使用p6-22及pi 17-139進行試管内單一肽刺激作用。採用P117-139刺激疫苗A特異性T細胞株時，pll7-139 有增殖反應，而p6-22則無反應（圖7A)。衍生自此細胞株之純系對P117-139具特異性（圖7B)。反之，採用p6-22刺激疫苗A特異性T細胞株時，對p6-22有增殖反應，但對pi 17-139 則無反應（圖7C)。衍生自該細胞株之純系對p6-22具特異性 (圖 7D)。這些結果顯示接種WT1肽可誘發對WT1蛋白質之抗體反 103376.doc -58 - 1285648 應，及對免疫性肽之增殖性τ細胞反應。實例4 在免癌接種WT1肽之小白鼠體内諉發CTL反應本實例說明WT1肽誘發CTL免疫性之能力。

採用BIMAS HLA肽結合性預估分析法（派克（Parker)等人，J· Immunol. 1 52:163，1 994)鑑別具有適合結合I級MHC 之要素之肽（9聚體）。此等分析法鑑別之肽示於表II-XLIV。各該表中，分數代表肽與指定之MHC分子之理論結合親和性（解離作用半衰期）。採用搜尋具有誘發Th反應之潛力之肽要素之Tsites程式 (羅巴德與泰勒，EMBO J. 7-93-100, 1988 ;戴文等人，Mol. Immunol. 33:145-155, 1996)鑑另丨J之肽亦示於圖8A與8B，及表 XLV。

表II

人類WT1肽輿人類HLA A1結合作用之BIMAS HLA 肽結合作用預估分析法結果分.¼ 別序列吒基到A 分n(含此副序到之分子之科離半a期 1 137 CLESQPAlR(SE〇!D NO:47) 18.000 2 80 OAEPHEEQC (SEQ ID N〇:87) 9.000 3 40 FAPPGASA Y (SEQ IDNO:74) 5.000 4 354 QCDFKJDCER (SEQ ID NO: 162) 5.000 5 2 GSDVRDLNA (SEQ IDNO:!0l) 3.750 6 152 VTFDGTPSY(SEQID NO:244) 2.500 7 260 WTEGQSNHS (SEQ IDNO:247) 2.250 8 409 TSEKPFSCR(SEQID NO:232) 1.350 w 103376.doc -59- 1285648 9 73 KQEPSWGGA (SEQ IDNO:125) 1.350 10 386 KTCQRKFSR(SEQ 1DN0:128) 1.250 11 37 VLDFAPPGA (SEQ ID NO:241) 1.000 12 325 CAYPGCNKR (SEQ ID NO:44) 1.000 13 232 QLECMTWNQ (SEQ ID NO: 167) 0:900 14 272 ESDNHTTPI (SEQ ID NO:71) 0.750 15 366 RSDQLKRHQ (SEQ ID NO: 193) 0.750 16 222 SSDNLYQMT (SEQ ID NO:217) 0.750 17 427 RSDELVRHH (SEQ ID NO:191) 0.750 18 394 RSDHLKTHT (SEQ ID NO: 192) 0.750 19 317 TSEKRPFMC (SEQ ID NO:233) 0.675 20 213 QALLLRTPY (SEQ ID NO: 160) 0.500

表III 人類WT1多肽與人類HLA A 0201結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果>

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時問） 1 126 RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185) 313.968 2 187 SLGEQQYSV (SEQ ID NO:214) 285.163 3 10 ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34) 181.794 4 . 242 NLGATLKGV (SEQ ID NO:146) 159.970 5 225 NLYQMTSQL (SEQ IDNO:147) 68.360 6 292 GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 103) 51.790 - 103376.doc 60- 1285648 7 191 QQYSVPPPV (SEQ ID NO:171) 22.566 8 280 ILCGAQYRI (SEQ ID NO: 116) 17.736 9 235 CMTWNQMNL (SEQ ID NO:49) 15.428 10 441 NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149) 15.428 11 7 DLNALLPAV (SEQ IDNO:58) 11:998 12 227 YQMTSQLEC (SEQ IDNO:251) 8.573 13 239 NQMNLGATL (SEQ ID NO:151) 8.014 14 309 TLVRSASET (SEQ ID NO:226) 7.452 15 408 KTSEKPFSC (SEQ ID NO: 129) 5.743 16 340 LQMHSRKHT (SEQ ID NO: 139) 4.752 17 228 v QMTSQLECM (SEQ ID NO: 169) 4.044 18 93 TVHFSGQFT (SEQ ID NO:235) 3.586 19 37 VLDFAPPGA (SEQ ID NO:241) •3.378 20 86 EQCLSAFTV (SEQ ID NO:69) 3.068

表IV

人類WT1肽與人類HLA A 0205結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果「分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半褒期估算時間） 1 10 ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34) 42.000 2 292 GVFRGIQDV (SEQ ID NO:103) 24.000 3 126 RMFPNAPYL (SEQ ID NO:185) 21.000 4 225 NLYQMTSQL (SEQ . ID NO: 147) 21.000 v 103376.doc -61 - 1285648 5 239 NQMNLGATL (SEQ IDNO:151) 16.S00 6 302 RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195) 14.000 Ί 441 NMTICLQLAL (SEQ ID NO: 149) 7.000 8 235 CMTWNQMNL (SEQ ID NO:49) 7.000 9 187 SLGEQQYSV (SEQ ID • NO:214) 6.000 10 191 QQYSVPPPV (SEQ ID NO:171) 4.800 · 11 340 LQMHSRKHT (SEQ IDNO:139)' 4:0S0 12 242 NLGATLKGV (SEQ ID NO:146) 4.000 13 227 YQMTSQLEC (SEQ ID NO:251) 3.600 14 194 SVPPPVYGC (SEQ ID NO:218) 2.000 15 93: TVHFSGQFT (SEQ ID NO:235) 2.000 16 280 ILCGAQYRJ (SEQ ID NO: 116) 1.700 17 98 GQFTGTAGA (SEQ ID NO:99) 1.200 18 309 TLVRSASET (SEQ ID N〇:226) 1.000 19 81 AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30) 0.980 20 73 KQEPSWGGA (SEQ ID NO:125) 0.960

表V

人類WT1肽與人類HLA A 24結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果分級起點位置！副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 302 RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195) 16.800 2 218 RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194) 12.000 w. 103376.doc 62· 1285648

3 356 DFKDCERRF (SEQ ID NO:55) 12.000 4 126 RMFPNAPYL (SEQ IDNO:185) 9.600 5 326 AYPGCNKRY (SEQ ID NO:42) 7.500 6 270 GYESDNHT (SEQ ID NO:106)T 7.500 7 239 NQMNLGATL (SEQ ID NO:151) 7.200 8 10 ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34) 7.200 9 130 NAPYLPSCL (SEQ ID NO:144) 7.200 10 329 GCNKRYFKL (SEQ ID NO:90) 6.600 11 417 RWPSCQKKF (SEQ ID NO: 196) 6.600 12 47 , 、AYGSLGGPA (SEQ ID NO:41) 6.000 13 180 DPMGQQGSL (SEQ ID NO:59) 6.000 14 4 DVRDLNALL (SEQ ID NO:62) 5.760 15 285 QYRIHTHGV (SEQ IDN〇:175) 5.000 16 192 QYSVPPPVY (SEQ ID NO: 176) 5.000 17 207 DSCTGSQAL (SEQ ID NO:6l) 4.800 18 441 NMTKLQLAL (SEQ IDNO:149) 4.800 19 225 NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147) * 4.000 20 235 CMTWNQMNL (SEQ ID N〇:49) 4.000 103376.doc 63- 1285648

表VI 人類WT1肽與人類HLA A 3結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預佔分析果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） I 436 NMHQRNMTK (SEQ IDNO:148) 40,000 2 240 QMNLGATLK(SEQ IDNO:168) 20.000 3 88 CLSAFTVHF (SEQ ID NO:48) 6.000 4 126 RiMFPNAPYL (SEQ IDNO:185) 4.500 5 169 AQFPNHSFK(SEQ IDNO:36) 4.500 6 10 ALLPAVPSL(SEQID N〇:34) 4.050 7 137 CLESQPAIR(SEQ ID N〇:47) 4.000 8 225 NLYQMTSQL (SEQ IDNO:147) 3.000 9 32 AQWAPVLDF (SEQ IDNO:37) 2.700 10 280 ILCGAQYRJ (SEQ ID NO: 116) 2.700 11 386 . KTCQRKFSR (SEQ IDNO:128) 1.800 12 235 CMTWNQiMNL (SEQ ID NO:49) 1.200 13 441 NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149) 1.200 14 152 VTFDGTPSY (SEQ ID NO:244) 1.000 15 187 SLGEQQYSV (SEQ IDNO:214) 0.900 16 383 FQCKTCQRK (SEQ IDNO:80) 0.600 17 292 GVFRGIQDV (SEQ IDNO:103) 0.450 18 194 SVPPPVYGC (SEQ ID N〇:218) 0.405 19 287 RIHTHGVFR (SE〇 ID 0.400 103376.doc 64- 1285648 NO: 182) 20 263 GQSNHSTGY (SEQ IDNO:100) 0.360

表VII

人類WT1肽與人類HLA A 68.1結合作用之 BIMAS HLA肽結合K用預估分析法結I

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時問） · 1 100 FTGTAGACR(SEQ IDN〇:84) 100.000 2 386 KTCQRKFSR (SEQ ID.NO:128) 50.000 3 368 DQLKRHQRR (SEQ ID NO:60) 30.000 4 312 RSASETSEK(SEQID NO: 190) 1S.000 5 337 # 4 LSHLQMHSR (SEQ ID NO:141) 15.000 6 • 364 FSRSDQLKR (SEQ ID NO:83) 15.000 7 409 TSEKPFSCR (SEQ ID NO:232) · 15.000 8 299 DVRRVPGVA (SEQ ID NO:63) 12.000 .9 4 DVRDLNALL (SEQ ID NO:62) 12.000 10 118 SQASSGQAR (SEQ ID NO:216) 10,000 11 343 HSRKHTGEK (SEQ IDNO:ll.l) 9.000 12 169 AQFPNHSFK (SEQ IDNO:36) 9.000 13 292 GVFRGIQDV (SEQ IDN〇:103) 8.000 14 325 CAYPGCNKR (SEQ ID NO:44) 7.500 15 425 FARSDELVR (SEQ ID NO:75) 7.500 16 354 QCDFKDCER (SEQ ID NO: 162) 7.500 17. 324 MCAYPGCNK (SEQ . 6.000 103376.doc 65- 1285648 IDNO.-142) 18 251 AAGSSSSVK(SEQ IDNO:28) 6.000 19 379 GVKPFQCKT (SEQ ID NO: 104) 6.000 20 137 CLESQPAIR(SEQID N〇:47) 5.000 表vm 人類WT1肽與人類HLA A 1 101結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 386 KTCQRKFSR(SEQ 1DN〇:128) 1.S00 . 2 169 AQFPNHSFK (SEQ ID NO:36) 1.200 j 436 NMHQRNiMTK (SEQ IDNO:14S) 0.S00 4 391 KFSRSDHLK (SEQ ID NO: 120) 0.600 5 373 HQRRHTGVK (SEQ ID NO: 109) 0.600 6 383 FQCKTCQRK (SEQ ID NO:80) 0.600 7 363 RFSRSDQLK (SEQ ID NO: 178) 0.600 8 240 QMNLGATLK (SEQ IDN〇:168) 0.400 9 287 RIHTHGVFR (SEQ ID NO: 182) 0.240 10 100 FTGTAGACR (SEQ IDNO:84) 0.200 11 324 MCAYPGCNK (SEQ IDNO:142) 0.200 12 251 AAGSSSSVK(SEQ IDN〇:28) 0.200 13 415 SCRWPSCQK(SEQ IDNO:201) 0.200 14 118 SQASSGQAR(SEQ IDNO:216) 0.120 · 15 292 GVFRGIQDV (SEQ 0.120 103376.doc 66· 1285648 IDNO.-103) 16 137 CLESQPAIR(SEQID NO:47) 0.080 17 425 FARSDELVR (SEQ IDNO:75) O.OSO 18 325 CAYPGCNKR (SEQ IDNO:44) O.OSO 19 . 312 RSASETSEK (SEQ ID NO: 190) 0.060 20 . 65 PPPPHSF1 (SEQ ID NO:156)K 0.060

表IX 人類WT1多肽與人類HLA A 3101結合作用之 FIMAS HLA肽結合作^預估分析法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 386 KTCQRKFSR (SEQ IDNO:128) 9.000 2 2S7 RIHTHGVFR (SEQ ID NO: 182), · 6.000 3 137 CLESQPAIR(SEQID N〇:47) 2.000 4 11S SQASSGQAR (SEQ IDNO:216) 2.000 5 368 DQLKRHQRR (SEQ IDNO:60) 1.200 6 100 FTGTAGACR (SEQ IDNO:S4) 1.000 7 293 VFRGIQDVR(SEQID N〇:238) 0.600 8 325 CAYPGCNKR (SEQ IDNO:44) 0.600 9 169 AQFPNHSFK(SEQ IDNO:36) 0.600 10 279 PILCGAQYR(SEQID NO:155) 0.400 11 436 NMHQRNMTK (SEQ IDNO:148) 0.400 12 425 FARSDELVR (SEQ · IDNO-.75) 0.400 13 32 AQWAPVLDF(SEQ 0.240 103376.doc 67- 1285648

1DN〇:37) 14 240 QMNLGATLK(SCQ IDN0:168) • 0.200 15 354 QCDFKDCER(SI3Q IDN0:162) 0.200 16 373 HQRRHTGVK(SEQ ID NO: 109) 0.200 17 383 FQCKTCQRK (SEQ ID NO:80) 0.200 18 313 SASETSEKR (SEQ ID N〇:197) 0.200 19 358 KDCERRFSR (SEQ IDN0.1I8) 0.1 SO 20 391 KFSRSDHLK(SEQ IDNO:120) 0.1 SO • 表χ 人類WT1肽與人類HLA A 3302結合作用之 ^IMAS HLA肽結合作用預估分析法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時問） 1 337 LSHLQMHSR (SEQ IDNO:141) 15.000 2 409 TSEKPFSCR(SEQID NO:232) 15.000 气 364 FSRSDQLKR(SEQID NO:83) 15.000 4 137 CLESQPAIR (SEQ ID NO:47) 9.000 5 368 DQLKRHQRR(SEQ ID NO:60) 9.000 6 287 RIHTHGVFR (SEQ ID NO: 182) 4.500 7 210 TGSQALLLR (SEQ ID NO:223) 3.000 8 425 FARSDELVR (SEQ IDN〇:75) 3.000 9 313 SASETSEKR (SEQ ID NO: 197)· 3.000 10 293 VFRGIQDVR(SEQID N〇:238) 3.000 11 354 QCDFKDCER (SEQ 3.000 103376.doc 68-

1285648 IDNO:162) 12 100 FTGTAGACR (SEQ IDNO:S4) • 3.000 13 118 SQASSGQAR(SEQ IDNO:2I6) 3.000 14 325 CAYPGCNKR(SEQ IDNO:44) 3.000 15 207 DSCTGSQAL(SEQ IDNO:61) 1.500 16 139 ESQPAIRNQ (SEQ ID NO:72) 1.500 17 299 DVRRVPGVA (SEQ IDN〇:63) 1.500 18 419 PSCQKKFAR (SEQ ID NO: 159) 1.500 19 272 ESDNHTTPI(SEQID N〇:71) » 1.500 20 4 DVRDLNALL (SEQ ID NO:62) 1.500

表XI 人類WT1/1太與人類HLA B14結合作用之 BIMAS HLA月太結合作用預估分—柝法結果分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估郛時間） 1 362 RRFSRSDQL(SEQID NO: 187) 1000.000 2 332 KRYFKLSHL (SEQ IDN〇:127) 300.000 J 423 KKPARSDEL (SEQ ID NO: 122) 150.000 1 4 390 RKFSRSDHL (SEQ ID NO:183) 150.000 5 439 QRNMTKLQL (SEQ IDN〇:173) * 20.000 6 329 GCNKRYFKL (SEQ ID N〇:90) 10.000 7 10 ALLPAVPSL (SEQ ID N〇:34) 10.000 8 180 DPMGQQGSL (SEQ ID NO:59) 9.000 9 301 RRVPGVAPT(SEQ 6.000 103376.doc 69- 1285648 IDN0:I89) 10 126 RjMFI)NAPYL(SEQ IDNO.IS5) • 5.000 11 371 KRHQRRHTG(SEQ IDNO:126) 5.000 12 225 NLYQMTSQL(SEQ IDNO:147) 5.000 13 144 IRNQGYSTV (SEQ ID NO: 117) 4.000 14 429 DELVRHHNM (SEQ IDNO:53) 3.000 15 437 MHQRNMTKL (SEQ IDN〇:143) 3.000 16 125 ARMFPNAPY (SEQ IDNO:38) 3.000 17 239 NQMNLGATL (SEQ IDNO:151) 3.000 18 286 YRJHTHGVF(SEQID NO;252) 3.000 19 174 HSFKHEDPM (SEQ IDNOrllO) 3.000 20 .372 RHQRRHTGV (SEQ IDNO.iSI) 3.000

表XII

人類WT1肽與人類HLA B40結合作用之 BlhAS HLA月大結合作用預估分yfTFlF果分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半褎期估苏時間） 1 81 AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30) 40.000 2 429 DELVRHHNM (SEQ IDNO:53) 24.000 3 410 SEKPFSCRW (SEQ IDN〇:207) 20.000 4 318 SEKRPFMCA (SEQ IDNO:208) * 15.000 5 233 LECMTWNQM (SEQ IDN〇:131) 12.000 6 SDVRDLNAL (SEQ 1DN〇:206) 10.000 7 349 GEKPYQCDF(SEQ 8.000 103376.doc 70- 1285648 IDNO:9I) 8 6 RDLNALLPA (SEQ 1DN〇:177) • 5.000 9 85 EEQCLSAFT (SHQ ID NO:65) 4.000 10 315 SETSEKRPF(SEQID NO:209) 4.000 11 261 TEGQSNHST(SEQID N〇:221) Λ 4.000 12 23 GCALPVSGA (SEQ ID NO:S9) 3.000 13 38 LDFAPPGAS (SEQ.1D NO: 130) 3.000 14 273 SDNHTTPIL (SEQ ID NO:204) 2.500 15 206 TDSCTGSQA (SEQ IDNO:220) 2.500 16 24 CALPVSGAA (SEQ 1DN0:43) 2.000 17 9S GQFTGTAGA (SEQ IDNO:99) 2.000 18 30 GAAQWAPVL(SEQ IDNO:S6) 2.000 19 84 HEEQCLSAF (SEQ ID NO: 107) 2.000 20 26 LPVSGAAQ\V(SEQ IDN〇:138) 2.000 表 Xlll 人類WT1肽與人類HLA B60結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 81 AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30) 160.000 2 3 SDVRDLNAL (SEQ IDNO:206) 40.000 气 j 429 DELVRHHNM (SEQ IDN〇:53) 40.000 4 233 LECMTWNQM (SEQ IDN〇:131) 22.000 5 273 SDNHTTPIL (SEQ ID 20.000 103376.doc -71 1285648 1 NO:204) 6 209 CTGSQALLL(SEQID NO:52) .8.000 7 30 GAAQWAPVL(SEQ IDNO:86) 8.000 8 318 SEKRPFMCA (SEQ IDNO:208) 8.000 9 180 DPMGQQGSL (SEQ ID NO:59) 8.000 10 138 LESQPAIRN(SEQID NO: 132) 5.280 11 239 NQMNLGATL (SEQ IDNO:151) 4.400 12 329 GCNKRYFKL (SEQ ID NO:90) 4.400 13 130 NAPYLPSCL (SEQID N〇:144) 4.400 . 14 85 EEQCLSAFT (SEQID NO:65) 4.400 15 208 SCTGSQALL(SEQID NO:202) 4.000 16 .207 DSCTGSQAL (SEQ IDKO:61) 4.000 17 218 RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194) 4.000 18 261 TEGQSNHST (SEQID NO:221) 4.000 19 18 LGGGGGCAL(SEQ IDNO:134) 4.000 20 221 YSSDNLYQM (SEQ IDNO:253) 2.200

_ 表 XIV

人類WT1肽與人類HLA B61結合作用之 HLA肽結合作‘用預估分析法結果分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 318 SEKRPFMCA (SEQ IDNO:208) 20.000 2 429 DELVRHHNM (SEQ IDNO:53) 16.000 j 298 QDVRRVPGV (SEQ 10.000 103376.doc 72 1285648

ID NO:164) 4 81 ALPIIEEQCL(SEQID NO:30) 8.000 5 233 LECMTWNQM (SEQ IDN0:131) 8.000 6 6 RDLNALLPA (SEQ IDNO:177) * 5.500 7 85 EEQCLSAFT (SEQ ID NO:65) 4.000 8 261 TEGQSNHST (SEQ ID NO:221) 4.000 9 206 丁DSCTGSQA (SEQ ID NO:220) 2.500 10 295 RGIQDVRRV (SEQ IDNO:179) 2.200 11 3 Η SDVRDLNAL (SEQ ID NO:206) 2.000 12 250 VAAGSSSSV (SEQ ID NO:236) 2.000 13 29 SGAAQWAPV (SEQ IDN〇:211) 2.000 14 .315 SETSEKRPF(SEQID NO:209) 1.600 15 138 LESQPAIRN(SEQID N〇:132) 1.200 16 244 GATLKGVAA (SEQ ID NO简 1.100 17 20 GGGGCALPV (SEQ IDNO:92) 1.100 i8 440 RNMTKLQLA (SEQ ID NO: 186) 1.100 19 23 GCALPVSGA (SEQ IDNO:89) 1.100 20 191 QQYSVPPPV (SEQ ID ΝΟ.Ί71) 1.000 表XV 人類WT1肽與人類HLA B62結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分柄果分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半袞期佔筇时間） 1 146 NQGYSTVTF(SEQ 211.200 103376.doc 73- 1285648

ID NO:150) 2 32 AQWAPVLDF (SEQ IDNO:37) 96.000 3 263 GQSNHSTGY (SEQ IDNO:100) 96.000 4 88 CLSAFTVHF(SEQID NO:48) 96.000 5 17 SLGGGGGCA (SEQ IDNO-.215) 9.600 6 239 NQNiNLGATL (SEQ IDNO.-15I) 8.S00 7 191 QQYSVPPPV (SEQ IDNO:171) 8.000 8 98 GQFTGTAGA (SEQ ID NO:99) 8.000 9 384 QCKTCQRKF (SEQ IDNO:163) 6.000 10 40 FAPPGASAY(SEQ IDNO:74) 4.800 11 227 ： YQMTSQLEC (SEQ IDNO:251) 4.800 12 187 SLGEQQYSV(SEQ IDNO:214) 4.400 13 86 EQCLSAFTV (SEQ ID N〇:69) 4.400 14 152 VTFDGTPSY(SEQID NO:244) 4.400 15 101 TGTAGACRY(SEQ ID N〇:224) 4.000 16 242 NLGATLKGV (SEQ IDNO:146) 4.000 17 92 FTVHFSGQF(SEQID N〇:S5) 4.000 18 7 DLNALLPAV(SEQ IDNO:58) 4.000 19 123 GQARMFPNA (SEQ IDN〇:98) .4.000 20 280 ILCGAQYRJ (SEQ ID NO: 116) 3.120 103376.doc 74- 1285648

表XVI 人類WT1肽與人類HLA B7結合作用之· BlMAS HLA/1大結合作用預怙分析"711#果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時問） 1 180 DPMGQQGSL (SEQ ID NO:59) 240.000 2 4 DVRDLNALL (SEQ ID NO:62) 200.000 气 j 302 RVPGVAPTL (SEQ IDNO:195) 20.000 4 30 GAAQWAPVL (SEQ IDN〇:86) 12.000 5 239 NQMNLGATL (SEQ IDNO:15I) 12.000 6 130 NAPYLPSCL(SEQID NO:144) 12.000 7 10 ALLPAVPSL(SEQID NO:34) 12.000 8 .299 DVRRVPGVA (SEQ IDNO:63) 5.000 9 208 SCTGSQALL (SEQ ID N〇:202) 4.000 10 303 VPGVAPTLV (SEQ IDNO:242) 4.000 11 18 LGGGGGCAL (SEQ IDNO:134) 4.000 12 218 RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194) 4.000 13 207 DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61) 4.000 14 209 CTGSQALLL (SEQ ID N〇:52) 4.000 15 329 GCNKRYFKL (SEQ ID NO:90) • 4.000 16 235 CMTWNQMNL (SEQ IDNO:49) 4.000 17 441 NMTKLQLAL (SEQ IDNO:149) 4.000 18 126 RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 185) 4.000 19 225 NLYQMTSQL (SEQ 4.000 ..· 103376.doc 75- 1285648 IDNO:147) 20 143 AIRNQGYST (SEQ ID NO:33) .3.000

表 XVII 人類WT1肽與人類HLA B8結合作用之 BIMAS HLA月太結合作用預估分析ΤΠέ果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） i 329 GCNKRYFKL (SEQ IDNO:90) 16.Q00 2 4 DVRDLNALL (SEQ IDNO.-62) 12.000 勹 j 316 ETSEKRPFM (SEQ ID NO:73) 3.000 4 180 DPMGQQGSL (SEQ IDN〇:59) 1.600 5 208 SCTGSQALL (SEQ ID N〇:202) 0.800 6 130 NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144) 0.800 7 244 GATLKGVAA (SEQ ID NO:88) 0.S00 8 30 GAAQWAPVL (SEQ ID NO:86) 0.800 9 299 DVRRVPGVA (SEQ 1DN〇:63) 0.400 10 420 SCQKKFARS (SEQ ID NO:200) ϋ·40ϋ 11 387 TCQRKFSRS (SEQ ID NO:219) 0.400 12 225 NLYQMTSQL (SEQ IDN〇:147) 0.400 13 141 QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170) 0.400 14 10 ALLPAVPSL(SEQID NO:34) 0.400 15 207 DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61) 0.400 16 384 QCKTCQRKF (SEQ ID NO: 163) 0.400 17 136 SCLESQPAI (SEQ ID 0.300 103376.doc 76- 1285648 N〇:198) 18 347 irrGEKPYQC(SEQ IDNO:112) • 0.300 19 401 HTRTHTGKT (SEQ IDN0:1I4) 0.200 20 332 KRYFKLSHL(SIiQ IDNO:127) 0.200 表xvm 人類WT1肽與人類HLA B2702結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果

分級起點位1 副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時問） 1 332 KRYFKLSHL(SEQ IDNO:127) 1 900.000 2 362 RRFSRSDQL(SEQID NO: 187) 900.000 n J 286 YR1HTHGVF(SEQID NO:252) 200.000 4 125 ARMFPNAPY (SEQ ID NO:38) 200.000 5 375 RRHTGVKPF (SEQ IDNO:188) 180.000 6 32 AQWAPVLDF (SEQ IDN〇:37) 100.000 7 301 RRVPGVAPT (SEQ ID NO: 189) 60.000 8 439 QRNMTKLQL (SEQ IDNO:173) 60.000 9 126 RiMFPNAPYL (SEQ IDNO:185) 22.500 10 426 ARSDELVRH (SEQ IDN〇:39) 20.000 11 146 NQGYSTVTF (SEQ ID NO: 150) 20.000 12 144 IRNQGYSTV (SEQ ID NO: 117) 20.000 13 389 QRJCFSRSDH (SEQ ID NO: 172) 20.000 14 263 GQSNHSTGY (SEQ ID NO: 100) 20.000 15 416 CRWPSCQKK(SEQ 20.000 103376.doc 77 1285648 1DNO:50) 16 191 QQYSVPPPV(SiiQ 1DN〇:171) .10.000 17 217 LRTPYSSDN (SEQ ID NO: 140) 10.000 18 107 CRYGPFGPP(SEQID NO:51) 10.000 19 98 GQFTGTAGA (SEQ IDN〇:99) 10.000 20 239 NQMNLGATL (SEQ IDNO:151) 6.000

表XIX 人類WT1肽與人類HLA B2705結合作用之 B1 MAS HLA月大結合作用預估分析法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時問） 1 332 KRYFKLSHL(SEQ IDNO-.127) 30000.000 2 362 RRFSRSDQL(SEQ1D NO: 187) 30000.000 3 416 CRWPSCQKK(SEQ IDNO:50) 10000.000 4 439 QRNMTKLQL (SEQ ID NO: 173) 2000.000 5 286 YRIHTHGVF(SEQID NO:252) 1000.000 6 125 ARjMFPNAPY (SliQ IDNO:3S) 1000.000 7 294 FRGIQDVRR(SEQID NO:81) 1000.000 8 432 VRHHNMHQR (SEQ IDN〇:243) 1000.000 9 169 AQFPNHSFK (SEQ IDN〇:36) 1000.000 10 375 RRHTGVKPF (SEQ IDNO:188) 900.000 11 126 RiMFPNAPYL (SEQ IDN〇:185) 750.000 12 144 IRNQGYSTV (SEQ ID NO: 117) 600.000 13 · 301 RRVPGVAPT(SEQ 600.000 103376.doc 78-

1285648 ID NO: 189) 14 32 AQWAPVLDF (SEQ IDN〇:37) 500.000 15 191 QQYSVPPPV(SEQ IDNO:171) 300.000 16 373 HQRRHTGVK (SEQ ID NO: 109) 200.000 17 426 ARSDELVRH (SEQ IDNO:39) 200.000 18 383 FQCKTCQRK (SEQ IDNO:SO) 200.000 19 239 NQMNLGATL (SEQ IDN〇:151) 200.000 20 389 QRKFSRSDH (SEQ IDNO:172) 200.000

表XX 人類WT1肽與人類HLA B3 501結合作用之 BIMAS HLA肽結合1乍用預估分析法結装分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 278 TPILCGAQY (SEQ ID N〇:227) 40.000 2 141 QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170) 40.000 n 219 丁PYSSDNLY (SEQ ID NO:231) 40.000 4 327 YPGCNKRYF (SEQ IDNO;250) 20.000 5. 163 TPSHHAAQF (SEQ IDNO:228) 20.000 6· 180 DPMGQQGSL (SEQ ID NO:59) 20.000 7 221 YSSDNLYQM(SEQ IDNO:253) 20.000 8 26 LPVSGAAQW (SEQ IDN〇:138) 10.000 9 174 HSFKHEDPM (SEQ IDNO:110) 10.000 10 82 EPHEEQCLS (SEQ ID NO:68) 6.000 11 213 QALLLRTPY (SEQ ID 6.000 103376.doc 79- 1285648 NO: 160) 12 119 QASSGQARM (SEQ IDNO:161) ^ 6.000 13 4 DVRDLNALL(SEQ IDNO:62) 6.000 14 40 FAPPGASAY (SEQ IDNO:74) 6.000 15 120 ASSGQARMF(SEQ IDNO:40) 5.000 16 207 DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61) 5.000 17 303 VPGVAPTLV (SEQ ID NO:242) 4.000 18 316 ETSEKRPFM (SEQ ID NO:73) 4.000 19 152 VTFD.GTPSY (SEQ ID NO:244) 4.000 20 412 KPFSCRWPS (SEQ ID NO:123) 4.000

：表 XXI 人類WT1肽與人類HLA B3701結合作用之 BIMAS HLA肽結合1乍用預估分析法結冢

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半袞期估算時間） 1 3 SDVRDLNAL(SEQ ID NO:206) 40.000 2 273 SDNHTTPIL (SEQ ID NO:204) 40.000 3 81 AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30) 10.000 4 298 QDVRRVPGV (SEQ IDNO:164) 8.000 5 428 SDELVRHHN(SEQ IDNO:203) 6.000 6 85 EEQCLSAFT (SEQ ID N〇:65) 5.000 7 208 SCTGSQALL (SEQ ID NO:202) 5.000 8 4 DVRDLNALL (SEQ IDN〇:62) 5.000 9 209 CTGSQALLL (SEQ ID 5.000 103376.doc 80- 1285648 NO:52) 10 38 LDFAPPGAS (SEQ ID NO: 130) .4.000 11 223 SDNLYQMTS (SEQ IDN〇:205) 4.000 12 179 EDPMGQQGS (SEQ ID NO:64) 4.000 13 206 TDSCTGSQA (SEQ IDNO:220) 4.000 14 6 RDLNALLPA (SEQ ID NO: 177) 4.000 15 84 HEEQCLSAF (SEQ ID NO:107) 2.000 16 233 LECMTWNQM (SEQ IDNO:131) 2.000 17 429 DELVRHHNM (SEQ IDNO:53) 2.000 18 315 SETSEKRPF (SEQ ID NO:209) ’ 2.000 19 349 4 GEKPYQCDF (SEQ IDNO:9I) 2.000 20 302 RVPGVAPTL (SEQ IDN〇:195) 1.500

表 XXII 人類WT1肽與人類HLA B3 801結合作用之 BIMAS HLA刀大結合作用預估分折法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半袞期估算時間） 1 437 MHQRNMTKL (SEQ IDNO:143) 36.000 2 434 HHNMHQRNM (SEQ ID NO: 108) 6.000 3 372 RHQRRHTGV (SEQ ID NO: 181.) 6.000 4 180 DPMGQQGSL (SEQ IDNO.-59) 4.000 5 433 RHHNMHQRN (SEQ IDNO:180)' 3.900 6 165 SHHAAQFPN (SEQ IDNO:213) 3.900 7 202 CHTPTDSCT (SEQ ID 3.000 103376.doc -81 - 1285648 NO:45) 8 396 οπυαΉτκ 丁（SHQ 1DN0:57) 3.000 9 161 GHTPSHHAA (SEQ 10N〇:94) 3.000 10 302 RVPGVAPTL (SEQ IDN〇:195) 2.600 11 417 RWPSCQKKF (SEQ ID NO: 196) 2.400 12 327 YPGCNKRYF (SEQ IDNO:250) 2.400 13 208 SCTGSQALL (SEQ ID N〇:202) 2.000 14 163 TPSHHAAQF(SEQ IDNO:228) 2.000 15 120 ASSGQARMF (SEQ IDNO.-40) 2.000 16 18 LGGGGGCAL(SEQ IDNO:134) 2.000 17 177 KHEDPMGQQ (SEQ IDNO.-121) 1.800 18 .83 PHEEQCLSA (SEQ ID NO: 154) 1.S00 19 10 ALLPAVPSL(SEQID NO:34) 1.300 20 225 NLYQMTSQL (SEQ IDNO:147) 1.300 表xxm

人類WT1壯、與人類丨1 LA 133901結合作川之 BIMAS HLA肽結合作用預估分祈法結裝分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 437 MHQRNMTKL (SEQ IDN〇:143) 135.000 2 332 KRYFKLSHL (SEQ IDNO:127) 45.000 j 434 HHNMHQRNM (SEQ IDNO:108) 30.000 4 362 RRFSRSDQL (SEQ ID NO:187) 30.000 5 372 RHQRRHTGV (SEQ 30.000 103376.doc 82- 1285648

1DNO-.181) | 6 10 ALU)AVPSL(SEQ1D N〇:34) .9.000 7 439 QRNMTKLQL (SEQ IDNO:173) 7.500 8 390 RKFSRSDHL (SEQ ID NO: 183) 6.000 9 396 DHLKTHTRT (SEQ IDN〇:57) 6.000 10 239 NQMNLGATL (SEQ IDNO:151) 6.000 11 423 KKFARSDEL (SEQ ID NO: 122) 6.000 12 126 RMFPNAPYL (SEQ IDNO:185) 6.000 13 225 NLYQMTSQL (SEQ IDNO:147) 6.000 14 ISO DPMGQQGSL(SEQ IDNO:59) 6.000 15. 144 IRNQGYSTV (SEQ ID NO: 117) 5.000 16 .136 SCLESQPAI (SEQ ID NO: 198) 4.000 17 292 GVFRGIQDV (SEQ IDNO:103) 3.000 18 302 RVPGVAPTL (SEQ IDNO:195) 3.000 19 208 SCTGSQALL (SEQ ID NO:202) 3.000 20 207 DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61) 3.000

表 XXIV 人類WT1肽與人類HLA B3902結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 239 • NQMNLGATL (SEQ IDNO:151) 24.000 2 390 RKFSRSDHL (SEQ ID NO:183) 20.000 «.· 423 KKFARSDEL (SEQ .20.000 103376.doc 83- 1285648

1[)Ν〇:122) 4 32 AQWAPVLDI;(Si：Q IDNO:37； 5.ϋϋϋ 5 146 NQGYSTVTF (SIZQ IDNO:150) 5.000 6 130 NAPYLPSCL(SEQID N〇:144) 2.400 7 225 NLYQMTSQL (SEQ ID NO: 147) 2.400 8 30 GAAQWAPVL(SEQ IDKO:86) 2.400 9 441 NMTKLQLAL (SEQ IDNO:149) 2.400 10 302 RVPGVAPTL (SI{Q IDNO:195) 2.400 11 126 RMI:PNAPYL(SI：Q IDNO:185) 2.000 12 218 RTPYSSDNL(SEQID NO: 194) 2.000 13 209 CTGSQALLL(SEQID NO:52) 2.000 14 .332 KRYFKLSHL (SHQ 1DN〇:127) 2.000 15 180 DPMGQQGSL(SEQ IDN〇:59) 2.000 16 437 MHQRNMTKL (SEQ IDNO:143) 2.000 17 207 DSCTGSQAL(SEQ IDNO:61) 2.000 18 208 SCTGSQALL (SEQ ID N〇:202) 2.000 19 329 GCNKRYFKL (SEQ IDN〇:90) 2.000 20 10 ALLPAVPSL (SEQ ID N〇:34) 2.000 表XXV 人類WT1肽與人類HLA B4403結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結装分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半褒期估郛時間） 1 315 SETSEKRPF (SEQID 80.000 103376.doc 84- ,π、 1285648

N〇:209) 1 2 349 GEKPYQCDF(SEQ IDNO:91) S0.000 3 84 HEEQCLSAF(SEQID NO: 107) 60.000 4 410 SEKPFSCRW (SEQ ID NO:207) 48.000 5 429 DELVRHHNM (SEQ IDNO:53) 24,000 6 278 TPILCGAQY (SEQ ID NO:227) 15.000 7 141 QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170) 9.0.00 8 40 FAPPGASAY(SEQ IDNO:74) 9.000 9 213 QALLLRTPY(SEQID NO: 160) 9.000 10 318 SEKRPFMCA (SEQ IDNO:208) 8.000 11 81 AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30) 8.000 12 152 VTFDGTPSY (SEQ ID NO:244) 4.500 13 101 TGTAGACRY (SEQ IDN〇:224) 4.500 14 120 ASSGQARMF (SEQ ID NO:40) 4.500 15 261 TEGQSNHST (SEQ ID N〇:221) 4.000 16 85 EEQCLSAFT (SEQ ID NO:65) 4.000 17 233 LECMTWNQM (SEQ IDN〇:131) 4.000 18 104 AGACRYGPF.(SEQ IDNO:31) 4.000 19 3 SDVRDLNAL (SEQ IDN〇:206) 3.000 20 185 QGSLGEQQY (SEQ ID NO: 166) 3.000 103376.doc 85- 1285648

表 XXVI 人類WT1肽與人類HLA B5 101結合作用之 BIMAS HLA^;結合作用預估分析法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） ] 303 VPGVAPTLV (SEQ 1DN〇:242) 314.600 2 ISO DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59) 242.000 3 250 VAAGSSSSV(SEQ IDNO:236) 157,300 4 130 NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144) 50.000 5 30 GAAQWAPVL (SEQ ID N〇:86) 50.000 6 20 GGGGCALPV (SEQ ID NO:92) 44.000 7 64 PPPPPHSFI (SEQ ID NO: 157) 40.000 8 •29 SGAAQWAPV (SEQ IDNO:211) 40.000 9 18 LGGGGGCAL(SEQ IDNO:134) 31.460 ]0 295 RGIQDVRRV (SEQ ID NO: 179) 22.000 11 119 QASSGQARM (SEQ IDNO:161) 18.150 12 418 WPSCQKKFA (SEQ IDNO:246) 12.100 13 82 EPHEEQCLS (SEQ ID N〇:68) 12.100 14 110 GPFGPPPPS (SEQ ID NO:96) 11.000 15 272 ESDNHTTPI (SEQ ID N〇:71) 8.000 16 306 VAPTLVRSA (SEQ IDNO:237) 7.150 17 280 ILCGAQYRI (SEQ ID NO: 116) 6.921 18 219 TPYSSDNLY (SEQ ID NO:231) 6.600 19 128 FPNAPYLPS (SEQ ID 6.500 - 103376.doc 86- 1285648 N〇:79) 20 204 TPTDSCTGS(SEQID N〇:230) .6.050 表 XXVll 人類WT1肽與人類HLA B5 102結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） I 295 RGIQDVRRV(SEQ ID NO: 179) 290.400 2 303 VPGVAPTLV (SEQ IDNO:242) 200.000 λ j 180 DPMGQQGSL (SEQ IDN〇:59) 133.100 /1 250 VAAGSSSSV (SEQ IDNO:236) 110.000 5 30 GAAQWAPVL (SEQ IDN〇:86) 55.000 6 130 NAPYLPSCL(SEQID NO: 144) 50.000 7 20 GGGGCALPV(SEQ IDN〇:92) 44,000 8 29 SGAAQWAPV (SEQ IDNO:211) 44.000 9 64 PPPPPHSFI (SEQ ID NO:157) 40.000 10 119 QASSGQARiM (SEQ IDNO:161) 36.300 11 110 GPFGPPPPS (SEQ ID NO:96) 27.500 12 412 KPFSCRWPS (SEQ ID NO:123) 25.000 13 18 LGGGGGCAL (SEQ ID NO: 134) 24.200 14 24 CALPVSGAA (SEQ ID NO:43) 16.500 15 219 TPYSSDNLY (SEQ ID NO:231) 15.000 16 292 GVFRGIQDV (SEQ IDNO:103) 14.641 17 136 SCLESQPAI (SEQ ID 14.520 103376.doc 87- 1285648 NO:198) | 18 418 WPSCQKKFA(SCQ IDNO:246) 12.100 19 269 TGYESDNH 丁（SIZQ 1DN〇:225) 11.000 20 351 KPYQCDFKD (SEQ ID NO: 124) 11.000

表 XXVIII 人類WT1肽土人類HLA B5201結合作用之百I MAS HL A肽結合作用預估分析法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半袞期估算時問） 1 191 QQYSVPPPV (SEQ IDNO:171) 100.000 2 32 AQWAPVLDF (SEQ IDNO:37) 30.000 3 243 LGATLKGVA(SEQ IDN〇:133) 16.500 4 303 VPGVAPTLV (SEQ IDNO:242) 13.500 5 86 EQCLSAFTV (SEQ ID NO:69) 12.000 6 295 RGIQDVRRV (SEQ ID NO: 179) 10.000 7 98 GQFTGTAGA (SEQ IDNO:99) S.250 8 292 GVFRGIQDV (SEQ IDNO:103) 8.250 9 29 SGAAQWAPV (SEQ IDNO:211) 6.000 10 146 NQGYSTVTF (SEQ IDNO:150) 5.500 11 20 GGGGCALPV (SEQ ID NO:92) 5.000 12 239 NQMNLGATL (SEQ IDNO:151) 4.000 13 64 PPPPPHSFI (SEQ ID NO:157) 3.600 14 273 SDNHTTPIL (SEQ ID NO:204) 3.300 15 286 YRJHTHGVF(SEQID 3.000 103376.doc 88- 1285648 NO:252) 16 269 TGYESDNHT(SEQ IDNO:225) 3.000 17 406 TGKTSEKPF (SEQ ID NO:222) 2.750 18 327 YPGCNKRYF(SEQ ID N〇:250) 2.750 19 7 DLNALLPAV (SEQ ID NO:58) 2.640 20 104 AGACRYGPF (SEQ IDNO:31) 2.500

表 XXIX

人類WT1肽與人類HLA B5801結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 230 TSQLECMTW (SEQ ID NO:234) 96.S00 2 92 FTVHFSGQF(SEQID NO:85) 60.000 3 120 ASSGQARMF(SEQ ID NO:40) 40.000 4 168 AAQFPNHSF (SEQ ID NO:29) 20.000 5 408 KTSEKPFSC (SEQ ID NO:129) 12.000 6 394 RSDHLKTHT (SEQ ID NO: 192) 9.900 7 276 HTTPILCGA (SEQ ID N〇:115) 7.200 8 218 RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194) 6.600 9 152 VTFDGTPSY(SEQID NO:244) 6.000 10 40 FAPPGASAY (SEQ IDNO:74) 6.000 11 213 QALLLRTPY(SEQID NO: 160) 4.500 12 347 HTGEKPYQC (SEQ IDNO:112) 4.400 13 252 AGSSSSVKW (SEQ 4.400 103376.doc 89- 1285648

1 1DN0:32) 14 211 GSQALLLRT (SEQ ID NO: 102) 4.356 15 174 HSFKHEDPM (SEQ IDNO:110) 4.000 16 317 TSEKRPFMC (SEQ IDN〇:233) 4.000 17 26 LPVSGAAQW(SEQ ID NO: 138) 4.000 18 289 HTHGVFRGI (SEQ ID N〇:113) 3.600 19 222 SSDNLYQiMT(SEQ IDN〇:217) 3.300 20 96 FSGQFTGTA (SEQ ID N〇:82) .3.300

表XXX 人類WTUU與人類1-1LA CW0301結合作⑴之 B1N4AS HLA肽結合作用預估分析法結果~

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 10 ALLPAVPSL(SEQID NO:34) 100.000 2 332 KRYFKLSHL (SEQ IDNO:i27) 48.000 j 126 RMFPNAPYL (SEQ IDNO:185) 36.000 4 3 SDVRDLNAL (SEQ ID N〇:206) 30.000 5 239 NQMNLGATL (SEQ ID NO:151) 24.000 6 225 NLYQMTSQL (SEQ IDN〇:147) 24.000 7 180 DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59) 20.000 8 362 RRf SRSDQL (SEQ ID NO: 187) 12.000 9 329 GCNKRYFKL (SEQ IDN〇:90) 10.000 10 286 YRJHTHGVF(SEQID N〇:252) 10.000 11 301 RRVPGVAPT (SEQ 10.000 103376.doc 90-

1285648 IDN0:1S9) 12 24 CALPVSGAA (SCQ IDNO.-43) 10.000 13 136 SCLESQPAI (SEQ ID NO: 198) 7.500 14 437 MHQRNMTia (SEQ IDNO:143) 7.200 15 390 RKFSRSDHL(SEQID NO:183) 6.000 16 423 KKFARSDEL(SEQ IDNO:I22) 6.000 17 92 FTVHFSGQF (SEQ ID NO:85) 5.000 18 429 DELVRHHNM (SEQ IDNO.-53) 5.000 19 130 NAPYLPSCL(SIIQID NO: 144) 4.800 20 30 GAAQWAPVL(SI£Q IDNO:86) 4.000

表 XXXI 人類WT1壯、與人類HLA CW0401結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果+ 分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 356· · DFKDCERRF (SEQ IDNO:55) 120.000 2 334 YFKLSHLQM(SEQ ID NO:248) 100.000 3 180 DPMGQQGSL (SEQ IDN〇:59) S8.000 4 163 TPSHHAAQF (SEQ ID NO:228) 52.800 5 327 YPGCNKRYF (SEQ ID NO:250) 40.000 6 285 QYRIHTHGV (SEQ IDNO:175) 27.500 7 424 KFARSDELV (SEQ IDNO:119) 25.000 8 326 AYPGCNKRY (SEQ IDNO:42) 25.000 9 192 QYSVPPPVY(SEQ 25.000 103376.doc -91 - 1285648 1DN0:176) 10 417 RWi>SCQKKF(SEQ IDNO:196) • 22.000 11 278 TP1LCGAQY(SEQID N〇:227) 12.000 12 10 ALLPAVPSL(SEQID NO:34) 11.616 13 141 QPAIRNQGY(SEQ ID NO: 170) 11.000 ]4 303 VPGVAPTLV (SEQ IDNO:242) 11.000 15 219 TPYSSDNLY(SEQ1D N〇:231) 10,000 16 39 DFAPPGASA (SEQ IDNO:54) 7.920 17 99 QFTGTAGAC (SEQ ID NO: 165) 6.000 18 4 DVRDLNALL (SEQ IDNO:62) 5.760 19 70 SFIKQEPSW(SEQID NO:2iO) 5.500 20 .63 PPPPPPHSF(SEQID N〇:158) 5.2S0

表 XXXII

人類WT1肽與人類HLA CW0602結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果~ 分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時問） 1 332 KRYFKLSHL(SEQ IDNO:127) 9.680 2 239 NQMNLGATL (SEQ IDNO:151) 6.600 j 130 NAPYLPSCL (SEQ ID NO: 144) 6.600 4 7 DLNALLPAV (SEQ IDNO:58) 6.000 5 441 NMTKLQLAL (SEQ IDNO:149) 6.000 6 225 . NLYQMTSQL (SEQ IDNO:147) 6.000 # ·· 7 4 DVRDLNALL (SEQ 6.000 103376.doc 92- 1285648 IDNO.-62) 8 3 SDVRDLNAL (SEQ ID NO:206) 4.400 9 10 ALLPAVPSL(SEQ1D NO:34) 4.000 10 213 QALLLRTPY(SEQID NO: 160) 3.300 11 319 EKRPFMCAY (SEQ IDN〇:67) 3.000 12 30 GAAQWAPVL (SEQ IDNO:86) 2.200 13 242 NLGATLKGV (SEQ IDNO:146) 2.200 14 292 GVFRGIQDV (SEQ IDNO:103) 2.200 15 207 DSCTGSQAL (SEQ IDN〇:61) 2.200 16 362 RRFSRSDQL (SEQ ID N〇:187) 2.200 17 439 QRNMTKLQL (SEQ IDNO:173) 2.200 18 295 * RGIQDVRRV (SEQ IDNO:179) 2.200 19 423 KKFARSDEL (SEQ IDNO:122) 2.200 20 180 DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59) 2.200

表 XXXIII

人類WT1肽與人類HLA CW0702結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離丰衰期估算時間） 1 319 EKRPFMCAY (SEQ IDNO:67) 26.8S0 2 326 AYPGCNKRY (SEQ IDN〇:42) 24.000 n j 40 FAPPGASAY (SEQ IDNO:74) 14.784 4 192 QYSVPPPVY (SEQ IDN〇:176) 12.000 5 278 TPILCGAQY (SEQ ID .12.000 103376.doc -93- 1285648 N〇:227) 6 219 TPYSSDNLY(SEQID NO:231) .12.000 7 213 QALLLRTPY(SEQ1D NO: 160) S.SOO 8 125 AI<M[rPNAPY(SI:Q IDNO:38) S.000 9 327 YPGCNKRYF(SEQ ID NO:250) 6.600 10 152 VTFDGTPSY(SEQID NO:244) 5.600 11 141 QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170) 4.800 12 345 RKHTGEKPY (SEQ 1DN0:184) 4.000 13 185 QGSLGEQQY (SEQ IDN0:I66) 4.000 14 101 TGTAGACRY (SEQ IDNO:224) • 4.000 15 375 RRHTGVKPF (SEQ IDN〇:188) 4.000 16 263 GQSNHSTGY (SEQ ID NO: 100) 4.000 17 163 TPSHHAAQF (SEQ IDN〇:228) 3.000 18 33 QWAPVLDFA (SEQ IDN〇:174) 2.688 •19 130 NAPYLPSCL(SEQID NO: 144) 2.640 20 84 HHEQCLSAF (SEQ ID NO: 107) 2.400

表 XXXIV 人類WT1肽與小白鼠MHC I級Db結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時問） 1 235 CMTWNQMNL (SEQ IDNO:49) 5255.712 2 126 RiMFPNAPYL (SEQ IDNO:185) 1990.S00 •’ 103376.doc 94- 1285648

3 221 YSSDNLYQM (SEQ IDNO:253) 930.000 4 228 QMTSQLECM (SEQ ID NO: 169) 33.701 5 239 NQMNLGATL (SEQ IDNO:151) 21.470 6 441 NMTKLQLAL (SEQ IDNO:149) ,19.908 7 437 MHQRNMTKL (SEQ IDNO:143) 19.S37 8 136 SCLESQPAI (SEQ ID NO: 198) 11.177 9 174 HSFKHEDPM (SEQ IDNO:110) 10.S00 10 302 RVPGVAPTL (SEQ IDNO:195) 10.0SS 11 130 NAPYLPSCL (SEQ ID N〇:144) 8.400 12. 10 ALLPAVPSL (SEQ ID NO:34) 5.9SS 13 208 · SCTGSQALL (SEQ ID NO:202) 4.435 14 209 CTGSQALLL (SEQ ID NO:52) 3.548 15 238 WNQMNLGAT (SEQ ID NO:245) 3.300 16 218 RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194) 3.1S5 17 24 CALPVSGAA (SEQ IDN〇:43) 2.851 18 18 LGGGGGCAL (SEQ IDNO:134) 2.177 19 142 PAIRjNQGYS (SEQ ID NO: 152) 2.160 20 30 GAAQWAPVL (SEQ ID NO:86) 1.680 103376.doc 95- ’G、\

1285648

表 XXXV

人颓WTHU;與小白鼠MIIC 1級Dd結合作用之 BIMAS ΠΙ=Λ肽結合作用預括分析法1F1T 分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 112 FGPPPPSQA (SEQID ΝΟ:76) ^ 4S.000 2 122 SGQARMFPN (SEQ IDNO.-212) 36.000 3 104 AGACRYGPF (SEQ IDNO:31) 30.000 4 218 RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194) 2S.S00 5 130 NAPYLPSCL (SEQID N〇:144) 20.000 6 302 RVPGVAPTL (SEQ IDNO:195) 20.000 7 18 LGGGGGCAL (SEQ IDNO:134) 20.000 8 81 AEPHEEQCL (SEQ ID N〇:30) 10.000 9 29 SGAAQWAPV (SEQ IDNO:211) 7.200 10 423 KKFARSDEL (SEQ ID NO: 122) 7.200 11 295 RGIQDVRRV (SEQ ID NO: 179) 7.200 12 390 RKFSRSDHL(SEQ1D NO: 183) 6.000 13 332 KRYFKLSHL (SEQ ID NO: 127) 6.000 14 362 RRFSRSDQL (SEQ ID NO: 187) 6.000 15 417 RWPSCQKKF (SEQ ID NO: 196) 6.000 16 160 YGHTPSHHA (SEQ ID N〇:249) 6.000 17 20 GGGGCALPV.(SEQ ID N〇:92) 6.000 18 329 GCNKRYFKL (SEQ ID NO:90) 5.000 19 372 RHQRRHTGV (SEQ 4.500 103376.doc 96- 1285648 IDN0:1SI) 20 52 GGPAPPPAP (SCQID NO:93) .4.000

表 XXXVI 人類WT1肽與小白鼠MHC I級Kb結合作用之 B1MAS HLA肽結合作用預估分析法結果~

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 329 GCNKRYFKL (SEQ ID NO:90) 24.,000 2 225 NLYQMTSQL (SEQ IDNO:147) 10.000 3 420 SCQKKFARS (SEQ IDNO:200) 3.960 4 218 RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 194) 3.630 5 437 MHQRNMTKL (SEQ IDNO:143) 3.600 6 387 TCQRKFSRS (SEQ ID N0:2I9) 3.600 7 302 RVPGVAPTL (SEQ ID NO: 195) 3.300 8 130 NAPYLPSCL (SEQ ID NO:144) 3.000 9 289 HTHGVFRGI (SEQ ID NO: 113) 3.000 10 43 PGASAYGSL (SEQ IDN〇:153) 2.400 11 155 DGTPSYGHT (SEQ IDNO:56) 2.400 12 273 SDNHTTPIL (SEQ ID N〇:204) 2.200 13 126 —RMFPNAPYL (SEQ IDNO:185) 2.200 14 128 FPNAPYLPS (SEQ ID N〇:79) 2.000 15 3 SDVRDLNAL (SEQ ID NO:206) 1.584 16 207 DSCTGSQAL (SEQ IDNO:61) 1.5S4 17 332 KRYFKLSHL (SEQ 1.500 103376.doc 97- 1285648

1DNOM27) 18 18 LGGGGGCAL(SEQ IDN〇:134) 1.320 19 233 LECMTWNQM (SEQ IDNO:131) 1.320 20 441 NMTKLQLAL (SEQ IDNO:149) 1.200 103376.doc 98- 1285648 表 XXXVll 人類WT1肽與小白鼠MHC 1級Kd結合作用之 BIM A S H L A肽結合作用預估分析法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 285 QYRIHTHGV (SEQ ID NO: 175) 600.000 2 424 KFARSDELV (SEQ ID NO: 119) 288.000 3 334 YFKLSHLQM (SEQ ID NO:248) 120.000 4 136 SCLESQPTI (SEQ ID NO:.199) 115.200 5 239 NQMNLGATL (SIZQ IDNO.-151) • 115.200 6 10 ALLPAVSSL(SEQID NO:35) 1 15.200 7 47 AYGSLGGPA (SEQ IDNO:41) 86.400 8 .180 DPMGQQGSL(SEQ IDNO:59) 80.000 9 270 GYESDNHTA (SEQ IDNO:105) 72.000 10 326 AYPGCNKRY (SEQ IDNO:42) 60.000 11 192 QYSVPPPVY (SEQ IDNO:176) 60.000 12 272 ESDNHTAP1 (SEQ ID NO:70) 57.600 13 289 HTHGVFRGI (SEQ ID NO:113) 57.600 14 126 DVRDLNALL (SEQ ID NO:62) 57.600 15 4 CTGSQALLL (SEQ ID NO:52) 57.600 16 208 SCTGSQALL (SEQ ID N〇:202) 4S.000 17 441 NMTKLQLAL (SEQ ID NO: 149) 48.000 18 207 DSCTGSQAL (SEQ IDN〇:61) 48.000 19 130 NAPYLPSCL (SEQ ID 48.000 103376.doc 99- 1285648 NO:i44) 20 235 CMTWNQMNL (SEQ IDNO:49) .4S.000 表 XXXVIIi 人類ντπ肽與小白鼠MHC I級Kk結合作用之 ΒΊMAS HLA肽結合作用預估分折法結果~

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 81 AEPHEEQCL (SEQ ID NO:30) 40.000 2 85 EEQCLSAFT (SEQ ID NO:65) 40.000 3 429 DELVRHHNM (SEQ IDNO:53) 20.000 4 315 SETSEKRPF (SEQ ID NO:209) 20.000 5 261 TEGQSNHST (SEQ ID NO:221) 20.000 6 •410 SEKPFSCRW (SEQ ID N〇:207) 10.000 7 272 ESDNHTTPI (SEQ ID N〇:71) 10.000 8 318 SEKRPFMCA (SEQ IDNO.-208) 10.000 9 138 LESQPAIRN (SEQ ID NO: 132) 10.000 10 233 LECMTV/NQM (SEQ IDNO:131) 10.000 11 298 QDVRRVPGV (SEQ IDNO:164) 10.000 12 84 HEEQCLSAF (SEQ ID NO: 107) · 10.000 13 349 GEKPYQCDF (SEQ IDNO:91) 10.000 14 289 HTHGVFRGI (SEQ ID NO:113) 10.000 15 179 EDPMGQQGS (SEQ IDNO:64) S.000 16 136 SCLESQPAI (SEQ ID NO:198) 5.000 17 280 ILCGAQYRJ (SEQ ID 5.000 103376.doc 100- 1285648 NO: 116) 18 273 SDNHTTPIL(SEQ ID NO:204) • 4.000 19 . 428 SDELVRHHN (SEQ ID NO:203) 4.000 20 3 SDVRDLNAL (SEQ ID NO:206) 4.000

表 XXXIX 人類WT1肽也小白鼠MHC I級Ld結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 163 TPSHHAAQF (SEQ ID NO:228) 360.000 2 327 YPGCNKRYF (SEQ ID NO:250) 300.000 3 180 DPMGQQGSL (SEQ IDNO:59) 150.000 4 26 LPVSGAAQW (SEQ IDNO:138) 93.600 5 278 TPILCGAQY (SEQ ID NO:227) 72.000 6 141 QPAIRNQGY (SEQ ID NO: 170) 60.000 7 219 TPYSSDNLY (SEQ ID N〇:231) 60.000 8 303 VPGVAPTLV (SEQ ID NO:242) 60.000 9 120 ASSGQARMF (SEQ ID NO:40) 50.000 10 63 PPPPPPHSF (SEQ ID NO: 158) 45.000 11 113 GPPPPSQAS (SEQ ID NO:97) 45.000 12 157 TPSYGHTPS (SEQ ID NO:229) 39.000 13 207 DSCTGSQAL (SEQ ID NO:61) 32.500 14 110 GPFGPPPPS (SEQ ID NO:96) 30.000 15 82 EPHEEQCLS (SEQ ID 30.000 103376.doc 101 - 1285648 NO:68) 16 412 KPFSCRWPS (SEQID NO:123) .30.000 17 418 WPSCQKKFA (SEQ ID NO:246) 30.000 18 221 YSSDNLYQM (SEQ IDN〇:253) 30.000 19 204 TPTDSCTGS (SEQ ID N〇:230) * 30.000 20 128 FPNAPYLPS (SEQ ID N〇:79) 30.000

表XL 人類WT1肽與牛HLA A20結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分挤"7去結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 350 EKPYQCDFK (SEQ IDNO:66) 1000.00 2 319 EKRPFMCAY (SEQ IDN〇:67) 500.000 .Λ J 423 KKFARSDEL (SEQ ID NO: 122) 500.000 4 345 RKHTGEKPY (SEQ ID NO: 184) 500.000 5 390 RKFSRSDHL (SEQ ID NO: 183) 500.000 6 137 CLESQPAIR (SEQ ID N〇:47) 120.000 7 380 VKPFQCKTC (SEQ IDN〇:239) 100.000 8 407 GKTSEKPFS (SEQ ID NO:95) 100.000 9 335 FKLSHLQMH (SEQ ID NO:78) 100.000 10 247 LKGVAAGSS (SEQ IDNO:135) 100.000 11 370 LKRHQRRHT (SEQ ID NO: 136) 100.000 12 258 VKWTEGQSN (SEQ ID NO:240) 100.000 ··· 13 398 LKTHTRTHT (SEQ 100.000 103376.doc 102- 1285648 IDNO:137) 14 331 NKRYFKLSH(SEQ IDNO:145) 100.000 15 357 FKDCERRFS (SEQ ID NO:77) 100.000 16 385 CKTCQRKFS (SEQ IDNO:46) 100.000 17 294 FRGIQDVRR(SEQID N〇:81) 80.000 18 368 DQLKRHQRR (SEQ ID NO:60) 80.000 19 432 VRHHNMHQR(SEQ IDN〇:243) 80.000 20 118 SQASSGQAR(SEQ IDNO:216) 80.000 # 表 XLl 小白鼠WT1肽與小白鼠MHC I級A0201結合作用 ^OlMAS HLA肽結合作用預估分析法結果》

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 126 RMFPNAPYL (SEQ ID NO:293) 313.96S 2 187 SLGEQQYSV (SEQ ID N〇:299) 285.163 3 10 ALLPAVSSL (SEQ ID NO:255) 181.794 4 225 NLYQMTSQL (SEQ IDNO:284) 68.360 5 292 GVFRGIQDV (SEQ ID NO:270) 51.790 6 93 TLHFSGQFT (SEQ ID N〇:302) 40.9S6 7 191 QQYSVPPPV (SEQ ID NO:290) 22.566 8 280 ILCGAQYRJ (SEQ ID NO:274) 17.736 9 441 NMTKLHVAL (SEQ IDNO:285) 15.42S 10 235 CMTWNQMNL (SEQ IDN〇:258) 15.42S 1! 7 DLNALLPAV (SEQ 11.998 103376.doc 103- 1285648 IDN〇:261) 12 242 NLGATLKGM (SEQ IDNO:283) 11.426 13 227 YQMTSQLEC (SEQ IDNO:307) 8.573 14 239 NQMNLGATL (SEQ ID N〇:286) S.014 15 309 TLVRSASET (SEQ ID NO:303) 7,452 16 408 KTSEKPFSC (SEQ ID NO:277) 5.743 17 340 LQMHSRKHT (SEQ IDNO:280) 4.752 18 228 QMTSQLECM (SEQ IDNO:289) 4.044 19 37 VLDFAPPGA (SEQ IDNO:304) 3.37S 20 302 RVSGVAPTL (SEQ IDNO:295) 1.869

·. 表 XUI 小白鼠WT1肽與小白鼠MHC I級Db結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果

分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 221 YSSDNLYQM (SEQ IDNO:308) 312.000 2 126 RMFPNAPYL (SEQ IDNO:293) 260.000 3 235 CMTWNQMNL (SEQ IDN〇:258) 260.000 4 437 MHQRNMTKL (SEQ IDNO:281) 200.000 5 238 W^NQiViNLGAT (SEQ IDNO:305) 12.000 6 130 NAPYLPSCL(SEQID NO:282) 8.5S0 7 3 SDVRDLNAL (SEQ IDN〇:298) 7.920 8 136 SCLESQPTI (SEQ ID NO:296) 7.920 . 103376.doc -104- 1285648 9 81 AEPHEEQCL (SEQ ID NO:254) 6.600 10 10 ALLPAVSSL(SEQID NO:255) 6.600 11 218 RTPYSSDNL (SEQ ID NO:294) 6.000 12 441 NMTKLHVAL (SEQ IDN〇:285) 3.432 13 228 QMTSQLECM (SEQ .IDNO:289) •3.120 14 174 HSFKHEDPM (SEQ ID NO:272) 3.120 15 242 NLGATLKGM (SEQ ID NO:283) 2.640 16 261 TEGQSNHGI (SEQ ID N〇:301) 2.640 17 225 NLYQMTSQL (SEQ ID NO:284) 2.640 18 207 DSCTGSQAL (SEQ ID NO:263) 2.600 19 119 QASSGQARiVl (SEQ ID NO:288) 2.600 20 18 LGGGGGCGL (SEQ ID NO:279) 2.600

表 XLIII 小白鼠WT1肽與小白鼠MHC I級Kb結合作用之 BIMAS HLA月大結合作用預估分析法結果一分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半衰期估算時間） 1 329 GCNKRYFKL (SEQ ID NO:268) 24.000 2 225 NLYQMTSQL (SEQ IDN〇:284) 10.000 3 420 SCQKKFARS (SEQ IDNO-.297) 3.960 4 218 RTPYSSDNL (SEQ ID NO:294) 3.630 5 437 MHQRNMTKL (SEQ • IDN〇:281). 3.600 ··_ 6 387 TCQRKFSRS (SEQ ID 3.600 - 103376.doc 105- 1285648 ΝΌ:300) 7 289 HTHGVFRGI(SEQID N〇:273) .3.000 8 130 NAPYLPSCL(SEQ ID NO:282) 3.000 9 43 PGASAYGSL(SEQ ID N〇:287) 2.400 10 155 DGAPSYGHT(SEQ IDNO:260) .2.400 11 126 RiMFPNAPYL (SEQ ID*NO:293) 2.200 12 128 FPNAPYLPS (SEQ ID NO:267) 2.000 13 207 DSC1，GSQAL(SIZQ IDNO:263) 1.584 14 3 SDVRDLNAL(SHQ ID NO:298) 1.5S4 15 332 KRYFKLSHL (SEQ IDN〇:276) 1.500 16 233 LECMTWNQM (SEQ IDNO:278) 1.320 17 18 < LGGGGGCGL (SEQ IDNO:279) 1.320 18 242 NLGATLKGM (SEQ IDNO.-283) 1.200 19 123 GQARMFPN (SEQ ID NO:269)A 1.200 20 441 NiMTKLHVAL (SEQ IDNO:285) 1.200

表 XLIV 小白鼠WT1肽與小白鼠MHC I級ICd結合作用之 BIMAS HLA肽結合作用預估分析法結果~^ 分級起點位置副序列殘基列表分數(含此副序列之分子之解離半袞期估算時叫） 1 285 QYRJHTHGV (SEQ IDNO:291) 600.000 2 424 KFARSDELV (SEQ IDN〇:275) 2SS.000 • 3 334 YFKLSHLQM (SEQ 1DNO:306) 120.000 .. 103376.doc 106- 1285648

4 136 SCLESQPTI (SEQ ID NO:296) 115.200 5 239 NQMNLGATL (SEQ IDNO:286) 115.200 · 6 10 ALLPAVSSL(SEQID NO:255) 115.200 7 47 AYGSLGGPA (SHQ IDNO:256) 86.400 8 180 DPMGQQGSL (SEQ ID N〇:262) 8Q.000 9 270 GYESDNHTA (SEQ IDNO:271) 72.000 10 192 QYSVPPPVY(SEQ IDNO:292) 60.000 11 326 AYPGCNKRY(SEQ IDNO:257) 60.000 12 289 HTHGVFRGI (SEQ ID NO:273) 57.600 13 4 DVRJDLNALL(SEQ ID N〇:264) 57.600 14 126、 RMFPNAPYL (SEQ ID NO:293) 57.600 15 209 CTGSQALLL (SEQ ID N〇:259) 48.000 16 86 EQCLSAFTL (SEQ ID N〇:265) 48.000 17 302 RVSGVAPTL (SEQ IDNO:295) 48.000 18 218 RTPYSSDNL (SEQ ID NO:294) 48.000 19 272 ESDNHTAPI (SEQ ID N〇:266) 48.000 20 225 NLYQMTSQL (SEQ ID NO:284) 48.000 •表 XL V 可誘發助手T細胞反應之人類WT丨肽之TS i tes 月大結合作用預估分析法in 月太序列 p6-23 RDLNALLPAVPSLGGGG (SEQ ID NO: 1) p30-35 GAAQWA (SEQ ID NO:309) p45-56 ASAYGSLGGPAP (SEQ ID NO:310) 103376.doc 107- 1285648 p9M05 AFTVHFSGQFTGTAG (SEQ ID NO:311) P117-139 PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (SEQ 1DN0:2) pl67-17l HAAQF (SEQIDNO:312) p202-233 CHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQL (SEQ ID NO:313) p244-262 GATLKGVAAGSSSSVKWTE (SEQ ID NO:4) ρ287·318 RIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETS (SEQ ID N〇:314) p333-336 RYFK (SEQIDNO:315) p361-374 ERRFSRSDQLKRHQ (SEQ ID NO:316) ρ389·410 QRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTS (SEQ ID NO:317) p421-441 CQKKFARSDELVRHHNMHQRN (SEQ ID N〇:318) 選出幾種CTL肽（示於表XLVI)進行進一步分析。表XLVI 中提出各肽使用BIMAS HLA肽結合作用預估分析法得到之分數。

103376.doc -108 - 1285648

表 XLVI WT1肽序列輿HLA肽結合作用干舊仕法肽序列註解 P329-337 GCNKRYFKL (SEQD3Nos:90 與268) 分數24,000 P225-233 NLYQMTSQL (SEQ ID Nos: 147與284) 亦結合II級與HLA A2, Kd ’ 分數l〇,〇〇〇 P235-243 CMTWNQMNL (SEQ ID Nos: 49與258) 亦結合HLAA2，分數 5,255,712 P126-134 RMFPNAPYL (SEQ ID Nos: 185與293) 亦結合Kd，II級及HLA A2，分數 1，990,880 p221-229 YSSDNLYQM (SEQ ID Nos: 253與308) 亦結合Ld，分數 312,000 p228-236 QMTSQLECM (SEQ ID Nos: 169與289) 分數3，120 p239-247 NQMNLGATL (SEQ ID Nos: 151 與286) 亦結合HLA A 0201， Kd，分數8,015 小白鼠 P136-144 ^CLESQPTI (SEQ ID Nos: 296) 亦結合Kd，1處與人類不符合人類 P136-144 SCLESQPAI (SEQ ID Nos: 198) 分數7,920 小白鼠plO-18 ALLPAVSSL (SEQ ID Nos: 255) 亦結合Kd，HLA A2，1 處與人類不符合人類plO-18 ALLPAVPSL (SEQ ID Nos: 34) 分數6,600 依林葛倫（Ljunggren)等人，Nature 346:476-480，1990所述，採用白血病細胞株RMA-S確認與C57B1/6鼠MHC之肽。簡言之，由RMA-S細胞於26°C下，在補充1% FCS之完全培養基中培養7小時。在24孔板中各孔内添加共106個 RMA_S細胞，單獨或與指定肽（25微克/毫升）於完全培養基中於26°C下培養16小時，再於3 7°C下培養3小時。然後洗滌細胞3次，以與螢光素異硫氰酸酯共輛之抗Db或抗Kb抗體 (法明藥廠（PharMingen，San Diego，CA))染色。有標記之細 103376.doc -109- 1285648 胞洗滌2次，於500微升含1%多聚曱醛之PBS中再懸浮及固定，並於流動細胞計數器（Becton-DickinsonFACSCalibur⑧) 中分析螢光素強度。RMA-S細胞表面上增加之Db4Kb分子百分比係由細胞與肽培養後相對於細胞於培養基中單獨培養時之平均螢光強度增加百分比決定。接種肽之小白鼠可與鼠I級MHC結合。接種免疫後，於試管内刺激脾細胞，並測試其對與WT1肽培養之目標物之溶解能力。以標準鉻釋出分析法分析CTL(陳等人，Cancer Res. 54:1065-1070，1994)。取 1〇6個目標細胞於37°C 下，與 150 微居禮鈉51Cr，於含或不含特異性肽下培養90分鐘。洗條細胞3次，再懸浮於含5%胎牛血清之RPMI中。分析時，由104 個標記51Cr之目標細胞與不同濃度效應物細胞，於終體積 200微升，於U-型底96孔板中培養。於37°C下4至7小時後，排除上澄液’以下列公式測定特異性溶胞作用百分比：特異性溶胞作用％=100 χ(實驗性釋出量-自發性釋出量）/(最大釋出量-自發性釋出量）表XLVII所示結果顯示某些WT1肽可結合I級MHC分子，其係產生CTL之必要條件。此外，有數種肽可誘發肽特異性CTL(圖9Α與9Β)，此可採用鉻釋出分析法測定。接種肽pl(M8人類、pi36_144人類、ρι36_144小白鼠&p235_243 後產生肤特異性CTL株’並確立純系。這些結果顯示肽特異性CTL可殺死表現WT1之惡性細胞。 103376.doc -110- 1285648

表 XLVII WT1 CTL肽輿小白鼠B6 I級抗原之結合作用肽對小白鼠MHC I級之結合親和力陽性對照組 91% 陰性對照組 0.5-1.3% P235-243 33.6% pl36-144小白鼠 27.9% pl36_144 人類 52% plO-18:人類 2.2% P225-233 5.8% P329-337 1.2% P126-134 0.9% P221-229 0.8% P228-236 1.2% P239-247 1% 實例5 WT1多肽於誘發小白鼠WT1特異性CTL之用途本實例說明代表性WT1多肽於誘發可殺死WT1陽性腫瘤細胞株之CTL免疫性之能力上之用途。 • 依上述，採用TSITES與BIMAS HLA肽結合作用預估分析法鑑定具有適合結合I級與II級MHC之特點之肽。依實例3 所述，為小白鼠免疫接種。免疫接種後，於試管内刺激脾細胞，並測試其對與WT1肽培養之目標物，及WT1陽性與陰性腫瘤細胞之溶胞能力。以標準鉻釋出分析法分析 CTL。示於圖10A-10D之結果顯示，？117可誘發可殺死\¥丁1 陽性腫瘤細胞之WT1特異性CTL，但未觀察到殺死WT1陰性細胞之現象。這些結果證明肽特異性CTL的確可殺死表現 WT1之惡性細胞，且該疫苗與T細胞療法可有效對抗表現 103376.doc -111 - 1285648 WT1之惡性病。採用9聚體1級]^11(：結合肽卩136-144，卩225-233，卩23 5-243 及23聚體肽pli7-139進行類似免疫接種。接種後，以4種肽分別於試管内刺激脾細胞，並測試其對與WT1肽培養之目標物之溶胞能力。針對卩136-144，卩235-243及卩117-139會產生 CTL，但 ρ225·233則不會。p235-243 及 pll7-139 之 CTL 數據示於圖11A與11B。肽pl36_144及p225-233之數據則未說明。 CTL溶胞作用要求目標WT1多肽為内因性處理，且與腫瘤細胞I級MHC分子結合。測試上述WT1肽特異性CTL溶解 WT1陽性細胞之能力，並與陰性腫瘤細胞株結果比較。 P23 5-243之特異性CTL可溶解與p235-243肽培養之目標細胞，但無法溶解表現WT1蛋白質之細胞株（圖11 A)。反之， pi 17-139之特異性CTL可溶解與pi 17-139肽培養之目標細胞，而且亦溶解表現WT1之惡性細胞（圖11B)。陰性對照組為不溶解WTl陰性EL-4(本文中亦稱為E10)之pll7-13 9之特異性CTL。利用冷目標抑制法確認WT1特異性溶胞作用之特異性 (圖12A-12B)。依多種不同效應物：目標比例，將效應物細胞塗佈在U-型96孔板中。添加過量1〇倍（相對於熱目標物）之包覆指定肽但未標記51Cr之目標物。最後，每孔添加1 〇4 個標記51Cr之目標細胞，板子於37°C下培養4小時。每孔總體積為200微升。

與相關肤pi 17-139培養之EL-4可使pi 17-139特異性CTL 103376.doc -112- 1285648 溶解TRAMP-C之作用程度由58%阻斷為36%，但與不相關肽培養之EL-4則無此現象（圖12A)。同樣地，由EL-4與相關肽pll7-139培養，使溶解BLK-SV40之作用程度由18%阻斷為0°/。（圖12B)。其結果證實WT1肽特異性CTL藉由辨識經處理之WT1而特定殺死惡性細胞。 pll7-139中含有具有推斷之ctl要素之數個片段。為了決定CTL表面決定基之正確序列，合成…丨厂丨39中所有可能之 9聚體肽（表XLVIII)。其中二個肽（pi26-134及pl30-138)經證實可結合H-2b I級分子（表XLVIII)。接種pll7-139後產生之 (：1^可溶解與口126-134及913 0-13 8培養之目標物，但不溶解與P117-139中其他9聚體肽培養之目標物。以pl26_134或pl30-138再刺激ρ117·139特異性CTL株。以 Ρ126-134或ρ130-138再刺激後，這二株Τ細胞均證明肽特異性溶胞作用，但僅pi 30-13 8特異性CTL顯示可溶解WT1陽性腫瘤細胞株（圖13B與13C)。因此，pl30-138似乎為天然處理之表面決定基。 103376.doc -113- 1285648 表 xlviii 口117-139中^¥丁1(：1^9聚體肽輿小白鼠86 1級抗原之結合作用

刀太與小白鼠MHC I級之結合親和力 P117-125 PSQASSGQA (SEQ ID NO:221) 2% PI 18-126 SQASSGQAR (SEQ ID NO:216) 2% PI 19-127 QASSGQARM (SEQ ID N〇s: 161 與 288) 2% P120-128 ASSGQARMF (SEQ ID N〇:40 ]% P121-129 SSGQARMFP (SEQ ID N〇:222) 1% P122-130 SGQARMFPN (SEQ ID NO:212) * 1% P123-131 GQARMFPNA (SEQ ID N〇s: 98 與 269) 1% P124-132 QARMFPNAP (SEQ ID NO:223) 1% P125-133 ARMFPNAPY (SEQ ID N〇:38) 1% P126-134 RMFPNAPYL (SEQ ID N〇s: 185 與 293) 79% P127-135 MFPNAPYLP (SEQ ID N〇:224) 2% P128-136 FPNAPYLPS (SEQ ID N〇s: 79 與 267) 1% P129-137 PNAPYLPSC (SEQ .ID NO:225) 1% PI 30-138 NAPYLPSCL (SEQ ID N〇s: 144 與 282) 79% P13M39 APYLPSCLE (SEQ ID N〇:226) 1% 103376.doc 114· 1285648 實例6 於小白鼠腫瘤細胞株中德为丨WT 1

JtmRNA 本實例說明RT-PCR於細胞及細胞株中扒、ηί ^ τ杈測WT1特異性 mRNA之用途。利用密度梯度離心法單離單核細胞，龙> & i立即冷凍，存放在-80°C下，直到RT-PCR分析WT1特異怕 ^ 饤，、改mRisJA之存在為止。通常依弗萊茲（Fraizer)等人，Blood 86·47〇4 470ό 1995 所述進行RT-PCR。根據標準方法，自1()7彻α ’ U個細胞中萃取總 RNA。RNA沉澱塊再懸浮於25微升經焦破缺人‘二乙酯處理之水中，直接用於逆轉錄作用。利用PCR擴增辞指_區 ^ 序列7至10)，作為330 bp小白鼠cDNA。於為μ 於熱循環機中，在一個或若必要時，在二個連續PCR循環φ/ τ運行擴增。採用

AmpliTaq DNA聚合酶（柏金艾瑪公司（perk· ln Elmer Cetus5

Norwalk, CT))，2.5 mM MgCl2及各20微微莫耳之各引子總反應體積50微升。取20微升PCR產物於细^ 、‘凑化3,8-二氮基 -5 -乙基-6-苯基菲咬錄（ethidium bromide、仇△ ;本色之2%瓊脂糖凝膠上電泳。使用拍立得底片（拍立得667 & (Polaroid 667,

Polaroid Ltd·，Hertfordshire，England)為凝膠拍照。依克夭克（Kwok)與希古奇（Higuchi)，Nature 339:237-238，1989)之建議，小心防止交叉污染。陰性對照組包括每個實驗使用 cDNA-及PCR-試劑改與水而非cDNA之混合物。為了避免偽陰性，利用/3 -肌動蛋白引子進行對照組PCR，為各樣本分析完整RNA及適當cDNA之產生。未經此等引子擴增之樣本則排除在分析之外。 103376.doc -115- 1285648 用於小白鼠細胞株中擴WT1之引子為：卩1 15:1458-1478·· 5’ CCC AGG CTG CAA TAA GAG ΑΤΑ 3’（前向引子；SEQ ID N0:21);與 P116: 1767-1787: 5, ATG TTG TGA TGG CGG ACCAAT3 乂反向引子；SEQIDNO:22)(參見英諾（Inoue)等人，Blood，88: 2267-2278, 1996;弗萊茲（Fraizer)，Blood 86: 4704-4706, 1995) 〇對照組反應採用之yS -肌動蛋白引子為5’ GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3f(有意義引子；SEQ ID NO:23);及 5, GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3,（反義引子；SEQ ID NO:24)。用於擴增人類WT1之引子包括：PI 17:954-974:5* GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3’（SEQ ID NO:25);與 PI 18:1434-1414: 5? GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3f (SEQ ID NO:5)。用於集合RT-PCR，之引子可為：P119: 1023-1043: 5丨 GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3,（SEQ ID NO: 26);與P120: 1345-1365: 5’ TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3’（SEQ ID NO:27)。表XLVIII出示小白鼠腫瘤細胞株之WT1 PCR分析結果。表IV中，（+++)表示第一個RT PCR步驟中有強烈WT1 PCR 擴增產物，（++)表示第一個WT1 RT PCR步驟可檢測到WT1 擴增產物，（+)表示僅在第一個WT1 RT PCR步驟可檢測到產物，且（-)表示無WT1 PCR。 103376.doc -116· 1285648

表 XLIX

乾小白鼠腫瘤細胞蚨中檢測WT1 mRNA 細胞株 WTlmRNA K562(人類白血病；ATCC):陽性對照組；（L〇zzi〇與 Lozzio, Blood 45:321-334, 1975) +++ TRAMPC (SV40轉形之前列腺細胞，B6); Foster et al.， Cancer Res. 57:3325-3330, 1997 +++ BLK-SV40 HD2 (SV40-轉形之纖維母細胞，B6; ATCC); Nature 276:510-511，1978 ++ CTLL(T-細胞，B6;ATCC);Gillis，Nature 268:154-156, 1977) + FM (FBL-3亞株，白血病，B6); Glynn與Fefer，Cancer Rds. 28:434-439, 1968 + BALB 3T3 (ATC); Aaroston與Todaro, J. Cell. Physiol· 72:141-148, 1968 + S49.1(淋巴瘤，似T-細胞，B/C; ATCC); Horibata與 Harris，Exp. Cell. Res· 60:61，1970 + BNL CL.2(胚胎肝，B/C; ATCC); Nature 276:510-511， 1978 + MethA(肉瘤 B/C); Old et al·，Ann. NY Acad. Sci_ 101:80-106, 1962 师 Ρ3·6.2·8·1(骨髓瘤，B/C; ATCC); Proc· Natl· Acad· Sci· USA 66:344, 1970 酿 P2N(白血病，08八/2;八丁(：(：)；]^以11叩61&1·，】· Immunol· 117:1267-1274, 1976 — BCL1(淋巴瘤，B/C; ATCC); Slavin與Strober，Nature 272:624-626, 1977 LSTRA(淋巴瘤，B/C); Glynn et al·，Cancer Res. 28:434-439, 1968 E10/EL-4(淋巴瘤，B6); Glynn et al·，Cancer Res· 28:434-439, 1968

由上文可見，雖然為了說明已敘述了本發明明確具體實施例，但仍可在不偏離本發明内涵及範圍内進行各種不同修飾。因此本發明除了附錄之申請專利範圍外，並不受限制0 103376.doc -117· 1285648 序列表 <πο>佳格，亞歷山大 (Gaiger, Alexander) 曲摩，馬丁 A. (Cheever, Martin A) <120〉用於WT1特異性免疫治療之組合物及方法 <130> 210121.465C1

<140> US

<141> 1999-03-25 <160> 326

<170〉3.0視窗版 FastSEQ <210> 1 <211〉 17 <212> PRT <213〉人類 <400> 1

Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly

<210〉 2 <211> 23 <212> PRT <213> 人類 <400> 2 103376.doc 1285648

Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro 15 10 15

Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu 20 <210〉 3

<211> 23 <212> PRT <213〉鼷鼠 <400> 3 Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro 15 10 15 Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu 20 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213〉人類 <400> 4 Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys 15 10 15 Trp Thr Glu <210〉 5 <211> 22 <212> DNA <213〉人類 <400> 5 gagagtcaga cttgaaagca gt 22 <210〉 6 103376.doc 1285648 <211〉 20 <212> DNA <213> 人類 <400> 6 ctgagcctca gcaaatgggc <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> 人類 <400> 7

gagcatgcat gggctccgac gtgcggg <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> 人類 <400> 8 ggggtaccca ctgaacggtc cccga <210> 9 <211〉 18 <212> DNA <213> 鼷鼠 <400〉 9 tccgagccgc acctcatg <210> 10 103376.doc 1285648 <211〉 18 <212> DNA <213〉鼷鼠

<400> 10 gcctgggatg ctggactg 18 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> 鼷鼠 <400> 11 gagcatgcga tgggttccga cgtgcgg 27 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> 鼷鼠 <400> 12 ggggtacctc aaagcgccac gtggagttt 29 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 13 Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly 15 10 15

Gly 103376.doc -4- 1285648 <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213〉鼷鼠 <400> 14

Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys 15 10 15

Trp Thr Glu <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> 人類 <400> 15

Arg lie His Thr His Gly Val Phe Arg Gly lie Gin Asp Val Arg 15 10 15 <210〉 16 <211> 15 <212> PRT <213〉鼷鼠 <400> 16

Arg lie His Thr His Gly Val Phe Arg Gly lie Gin Asp Val Arg 15 10 15 <210> 17 <211〉 14 <212> PRT <213> 鼷鼠 103376.doc 1285648 <400> 17

Val Arg Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213〉人類 <400> 18

Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser 1 5 10 <210〉 19 <211> 15 <212> PRT <213> 人類 <400> 19

Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His 15 10 15 <210> 20 <211〉 15 <212> PRT <213〉鼷鼠 <400> 20

Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His 1 5 10 15 <210> 21 <211> 21 103376.doc -6- 211285648

<212> DNA <213> 縫鼠 <400> 21 cccaggctgc aataagagat a <210> 22 <211〉 21 <212> DNA <213> 鼷鼠 <400> 22 atgttgtgat ggcggaccaa t <210> 23 <211〉 20 <212> DNA <213> 人類 <400> 23 gtggggcgcc ccaggcacca <210〉 24 <211> 24 <212> DNA <213> 人類 <400> 24 gtccttaatg ctacgcacga tttc <210> 25 <211〉 21 21 20 24 103376.doc

21 1285648 <212> DNA <213> 人類 <400> 25 ggcatctgag accagtgaga a <210〉 26 <211> 21 <212〉DNA <213〉人類 • <400〉 26 21 gctgtcccac ttacagatgc a <210〉 27 <211〉 21 <212> DNA <213> 人類 <400> 27 21 tcaaagcgcc agctggagtt t <210〉 28 φ <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 28

Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys 1 5 <210> 29 103376.doc 1285648 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 29

Ala Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 30

Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu 1 5 <210〉 31 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 31

Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 32 103376.doc 1285648

Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp 1 5 <210〉 33 <211> 9 <212〉 PRT <213> 人類 <400> 33 Ala lie Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 34 Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210〉 35 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 35 Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu 1 5

<210> 36 <211> 9 <212> PRT -10- 103376.doc 1285648

<213> 人類 <400> 36 Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe Lys 1 5 <210> 37 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 37 Ala Gin Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe 1 5 <210> 38 <211〉 9 <212〉 PRT <213> 人類 <400〉 38 Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr 1 5 <210〉 39 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 39 Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His 1 5 <210> 40 103376.doc -11 - 1285648 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 40

Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 41

Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala 5 <210> 42 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 42

Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 43 -12- 103376.doc 1285648

Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 44 Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 45 Cys His Thr ： 1 Pro Thr Asp Ser Cys Thr 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 46 Cys 1 Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser 5 <210〉 47 <211> 9 <212> PRT -13- 103376.doc 1285648

<213> 人類 <400> 47 Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala lie Arg 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 48 Cys Leu Ser Ala Pha Thr Val His Phe 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 49 Cys 1 Met Thr Trp Asn Gin Met Ans Leu 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 50 Cys Arg Trp 1 Pro Ser Cys Gin Lys Lys 5 <210> 51 103376.doc -14- 1285648 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 51

Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro 1 5 <210> 52 <211> <212> 9 PRT <213> 人類 <400> 52

Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu 1 5 <210〉 53 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 53

Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met 1 5 <210> 54 <211> 9 <212〉 PRT <213> 人類 <400> 54 •15- 103376.doc 1285648

Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala 1 5 <210〉 55 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 55 Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe 1 5 <210> 56 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 56 Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 57 Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr 1 5 <210> 58 <211〉 9 <212> PRT 103376.doc -16- 1285648

<213> 人類 <400> 58 Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 59 Asp 1 Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu 5 <210> 60 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 60 Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg 1 5 <210〉 61 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 61 Asp 1 Ser Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu 5 <210〉 62 103376.doc -17- 1285648 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 62

Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 63

Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 64

Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 65 -18- 103376.doc 1285648

Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr 1 5 <210〉 66 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 66 Glu 1 Lys Pro Tyr Gin Cys Asp Phe Lys 5 <210> 67 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 67 Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr 1 5 <210> 68 <211〉 9 <212〉 PRT <213> 人類 <400> 68 Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Ley Ser 1 5 <210> 69 <211〉 9 <212> PRT 103376.doc -19- 1285648

<213> 人類 <400> 69 Glu Gin Cys 1 Leu Ser Ala Phe Thr Val 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 70 Glu Ser Asp Asn His Thr Ala Pro lie 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 71 Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro lie 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 72 Glu Ser Gin Pro Ala lie Arg Asn Gin 1 5 <210> 73 103376.doc -20- 1285648 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 73

Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 74

Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 1 5 <210〉 75 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 75

Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg 1 5 <210> 76 <211> 9

<212> PRT <213〉人類 <400〉 76 -21 - 103376.doc 1285648

Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala 1 5 <210> 77 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 77 Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 78 Phe Lys Leu 1 Ser His Leu Gin Met His 5 <210〉 79 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 79 Phe 1 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser 5 <210〉 80 <211> 9 <212> PRT 103376.doc -22- 1285648

<213> 人類 <400> 80 Phe Gin Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys 1 5 <210> 81 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 81 Phe Arg Gly lie Gin Asp Val Arg Arg 1 5 <210> 82 <211> 9 <212〉 PRT <213> 人類 <400> 82 Phe 1 Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 83 Phe 1 Ser Arg Ser Asp Gin Leu Lys Arg 5 <210> 84 103376.doc -23- 1285648 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 84

Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 85

Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gin Phe <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 86

Gly Ala Ala Gin Trp Ala Pro Val Leu 1 5 <210> 87 <211> 9

<212> PRT <213〉人類 <400> 87 -24- 103376.doc 1285648

Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 88 Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala 1 5 <210> 89 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 89 Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 90 Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu 1 5 <210〉 91 <211〉 9 <212> PRT 103376.doc -25- 1285648

<213> 人類 <400> 91 Gly Glu Lys Pro Tyr Gin Cys Asp Phe 1 5 <210> 92 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 92 Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 93 Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro 1 5 <210〉 94 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 94 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala 1 5 <210> 95 103376.doc -26 - 1285648 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 95

Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser 1 5 <210> 96 <211〉 9

<212> PRT • <213>人類 <400> 96

Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser

5 <210> 97 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 97

Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser 5 <210〉98 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 98 -27- 103376.doc 1285648

Gly Gin Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala 1 5 <210〉 99 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 99 Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala 1 5 <210> 100 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 100 Gly 1 Gin Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr 5 <210> 101 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 101 Gly 1 Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala 5 <210> 102 <211> 9 <212〉 PRT 103376.doc -28- 1285648 <213〉人類 <400> 102

Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr 1 5 <210> <211> 103 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 103

Gly Val Phe Arg Gly lie Gin Asp Val 1 5 <210〉 104 <211> 9 <212〉 PRT <213> 人類 <400> 104

Gly Val Lys Pro Phe Gin Cys Lys Thr 1 5 <210> 105 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 105

Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Ala 1 5 <210> 106 -29- 103376.doc 1285648 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 106

Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 107

His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 108 • His His Asn Met His Gin Arg Asn Met 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 109 -30- 103376.doc 1285648

His Gin Arg Arg His Thr Gly Val Lys 1 5 <210〉 110 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 110

His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met

5 <210〉 111 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 111

His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 112 • His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gin Cys 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 -31 - 103376.doc 1285648

<400> 113 His Thr His Gly Val Phe Arg Gly lie 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 114 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 115 His Thr Thr Pro lie Leu Cys Gly Ala 1 5 <210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 116 lie Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg lie 1 5 <210> 117 <211> 9 103376.doc -32- 1285648 <212> PRT <213> 人類 <400> 117 lie Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val 1 5 <210> 118 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 118

Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg 1 5 <210〉 119 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 119

Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 1 5 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 120

Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys 1 5 -33- 103376.doc 1285648 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 121

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin 1 5 <210> 122 <211〉 9

# <212> PRT <213〉人類 <400> 122

Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu

5 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 123

Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser 1 5 <210> 124 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 -34- 103376.doc 1285648

<400> 124 Lys Pro Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp 1 5 <210〉 125 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 125 Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400〉 126 Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly 1 5 <210> 127 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 <400〉 127 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu 1 5 <210> 128 <211> 9 103376.doc -35-

1285648

<212> PRT <213> 人類 <400> 128 Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 129 Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 1 5 <210> 130 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 130 Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser 1 5 <210〉 131 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 131 Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin Met 1 5 103376.doc -36- 1285648 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 132

Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala 1 5 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 134

Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 135 -37- 103376.doc

Leu Glu Ser Gin Pro Ala lie Arg Asn

5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 133 1285648

Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 136 Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr 1 5 <210> 137 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 137 Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 138 Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gin Trp 1 5 <210> 139 <211〉 9 <212> PRT 103376.doc -38- 1285648

<213〉人類 <400> 139 Leu Gin Met 1 His Ser Arg Lys His Thr 5 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 140 Leu Arg Thr 1 Pro Tyr Ser Ser Asp Asn 5 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 141 Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 142 Met Cys Ala Thr Pro Gly Cys Asn Lys 1 5 <210> 143 -39- 103376.doc 1285648 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 143

Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu <210〉 144 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 144

Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu 1 5 <210> 145 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 145

Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 146 -40- 103376.doc 1285648

Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 147 Asn Leu Tyr 1 Gin Met Thr Ser Gin Leu 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 148 Asn Met His 1 Gin Arg Asn Met Thr Lys 5 <210> 149 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 149 Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala Leu 1 5 <210> 150 <211> 9 <212> PRT 103376.doc -41 - 1285648

<213> 人類 <400> 150 Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe 1 5 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 151 Asn Gin Met 1 Asn Leu Gly Ala Thr Leu 5 <210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 152 Pro Ala lie Arg Asn Gin Gly Tyr Ser 1 5 <210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 153 Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu 1 5 <210> 154 103376.doc -42- 1285648 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 154

Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala 1 5 <210> 155 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 155

Pro lie Le Cys Gly Ala Gin Tyr Arg 1 5 <210> 156 <211> 9

<212> PRT <213> 人類 <400> 156

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe lie Lys 1 5 <210> 157 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 157 -43- 103376.doc 1285648

Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe lie 1 5 <210〉 158 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 158

Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe 1 5 <210〉 159 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 159

Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg 1 5 <210> 160 <211> 9

<212> PRT <213〉人類 <400> 160

Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr 1 5 <210> 161 <211> 9

<212> PRT -44- 103376.doc 1285648

<213> 人類 <400> 161 Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met 1 5 <210〉 162 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 162 Gin Cys Asp 1 Phe Lys Asp Cys Glu Arg 5 <210> 163 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 163 Gin Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe 1 5 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 164 Gin Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val 1 5 <210> 165 103376.doc -45- 1285648 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 165

Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys <210> 166 <211> 9 <212> PRT ® <213〉人類 <400> 166

Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr 1 5 <210〉167 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 167

Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 1 5 <210> 168 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 168 -46- 103376.doc Ί285648

Gin Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys 1 5 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 169 Gin Met Thr 1 Ser Gin Leu Glu Cys Met 5 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 170 Gin 1 Pro Ala lie Arg Asn Gin Gly Tyr 5 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 171 Gin 1 Gin Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val 5 <210> 172 <211> 9 <212> PRT 103376.doc -47- 1285648

<213> 人類 <400> 172 Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His 1 5 <210> 173 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 173 Gin Arg Asn 1 Met Thr Lys Leu Gin Leu 5 <210> 174 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 174 Gin Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala 1 5 <210〉 175 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 175 Gin Tyr Arg lie His Thr His Gly Val 1 5 <210> 176 103376.doc -48- <211> 1285648 <212> PRT <213> 人類 <400> 176

Gin Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr 1 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 177

Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala 1 5 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 178

Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu Lys 1 5 <210> 179 <211> <212> 9 PRT <213> 人類 <400〉 179 -49- 103376.doc 1285648

Arg Gly lie Gin Asp Val Arg Arg Val 1 5 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 180 Arg His His Asn Met His Gin Arg Asn 1 5 <210〉 181 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 181 Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Val 1 5 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 182 Arg lie His Thr His Gly Val Phe Arg 1 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT 103376.doc -50- 1285648

<213> 人類 <400> 183 Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 <210> 184 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 184 Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr 1 5 <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 185 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 186 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 186 Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala 1 5 <210〉 187 103376.doc -51 -

1285648 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 187

Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu 5 <210> 188 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 188

Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe 1 5 <210> 189 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 189

Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr 1 5 <210> 190 <211〉 9

<212> PRT <213〉人類 <400> 190 -52- 103376.doc 1285648

Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 1 5 <210> 191 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 191 Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His 1 5 <210> 192 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 192 Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr 1 5 <210> 193 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 193 Arg Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin 1 5 <210> 194 <211> 9 <212> PRT 103376.doc -53- 1285648

<213> 人類 <400> 194 Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu 1 5 <210〉 195 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 195 Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 196 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 196 Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe 1 5 <210> 197 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 197 Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg 1 5 <210> 198 103376.doc -54- 1285648 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 198

Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala lie 1 5 <210> 199 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 199

Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Thr lie <210> 200 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 200

Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser 1 5 <210〉201 <211> 9

<212> PRT <213〉人類 <400> 201 -55- 103376.doc 1285648

Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys 1 5 <210> 202 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 202 Ser Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu 1 5 <210> 203 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 203 Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn 1 5 <210> 204 <211> 9 <212〉 PRT <213> 人類 <400> 204 Ser Asp Asn His Thr Thr Pro lie Leu 1 5 <210〉 205 <211> 9 <212> PRT 103376.doc -56- 1285648

<213> 人類 <400> 205 Ser Asp Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser 1 5 <210> 206 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 206 Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu 1 5 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 207 Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp 1 5 <210> 208 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 208 Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala 1 5 <210〉 209 103376.doc -57- 1285648 <211〉 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 209

Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe 1 5 <210> 210 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 210

Ser Phe lie Lys Gin Glu Pro Ser Trp 1 5 <210> 211 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 211

Ser Gly Ala Ala Gin Trp Ala Pro Val 1 5 <210> 212 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 212 -58- 103376.doc 1285648

Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe Pro Asn 1 5 <210> 213 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 213 Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Asn 1 5 <210> 214 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 214 Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val 1 5 <210> 215 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400〉 215 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala 1 5 <210> 216 <211> 9 <212> PRT 103376.doc -59- 1285648

<213> 人類 <400> 216 Ser 1 Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg 5 <210> 217 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 217 Ser 1 Ser Asp Asn Leu Tyr Gin Met Thr 5 <210> 218 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 218 Ser 1 Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys 5 <210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 219 Thr 1 Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser 5 <210> 220 103376.doc •60- 1285648 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 220

Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gin Ala 1 5 <210> 221 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 221

Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser Thr 1 5 <210> 222 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 222

Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe 1 5 <210> 223 <211> 9

<212> PRT <213> 人類 <400> 223 -61 - 103376.doc 1285648

Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg 1 5 <210> 224 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 224 Thr 1 Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr 5 <210> 225 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 225 Thr 1 Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr 5 <210> 226 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 226 Thr 1 Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr 5 <210> 227 <211> 9 <212> PRT 103376.doc -62- 1285648

<213> 人類 <400> 227 Thr Pro lie Leu Cys Gly Ala Gin Tyr 1 5 <210> 228 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 228 Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe 1 5 <210> 229 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 229 Thr Pro Ser Tyr Gly His thr Pro Ser 1 5 <210> 230 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 230 Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser 1 5 <210> 231 103376.doc -63- 1285648 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 231

Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr 5 <210〉 232 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 232

Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg 5 <210〉 233 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 233

Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys 5 <210〉 234 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 234 -64- 103376.doc 1285648

Thr Ser Gin ： 1 Leu Glu Cys Met Thr Trp 5 <210> 235 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 235 Thr Val His Phe Ser Gly Gin Phe Thr 1 5 <210> 236 <211> 9 <212> PRT <213〉人類 <400> 236 Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val 1 5 <210> 237 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 237 Val 1 Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala 5 <210> 238 <211> 9 <212> PRT 103376.doc -65- 1285648

<213> 人類 <400> 238 Val Phe Arg Gly lie Gin Asp Val Arg 1 5 <210> 239 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 239 Val Lys Pro Phe Gin Cys Lys Thr Cys 1 5 <210> 240 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 240 Val Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn 1 5 <210> 241 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 241 Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala 1 5 <210> 242 103376.doc -66- 1285648 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 242

Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val 5 <210> 243 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 243

Val Arg His His Asn Met His Gin Arg 5 <210> 244 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 244 • Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 5 <210> 245 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 245 103376.doc -67- 1285648

Trp Asn Gin 1 Met Asn Leu Gly Ala Thr 5 <210〉 246 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 246 Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala 1 5 <210> 247 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 247 Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser 1 5 <210> 248 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 248 Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met 1 5 <210> 249 <211> 9 <212> PRT 103376.doc -68 - 1285648

<213> 人類 <400〉 249 Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala 1 5 <210> 250 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 250 Tyr 1 Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe 5 <210> 251 <211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 251 Tyr 1 Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys 5 <210> 252 <211> 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 252 Tyr Arg lie His Thr His Gly Val Phe 1 5 <210> 253 103376.doc -69- 1285648

Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gin Met 1 5 <210> 254 <211〉 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 254

Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu 1 5 <210> 255 <211> 9 <212> PRT <213> 縫鼠 <400> 255

<211〉 9 <212> PRT <213> 人類 <400> 253

Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu 1 5 <210〉256 <211〉 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 256 -70- 103376.doc 1285648

Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala 1 5 <210> 257 <211> 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 257 Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr 1 5

<210> 258 <211〉 9 <212> PRT <213〉鼷鼠

<400〉258 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu 5 259 9 PRT 鼷鼠 259 Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu 1 5 <210> <211> <212> <213> <400>

<210〉 260 <211〉 9 <212> PRT 103376.doc •71 - 1285648 <213〉鼷鼠 <400> 260

Asp Gly Ala Pro Ser Tyr Gly His Thr 1 5 <210〉 261 <211> 9 <212> PRT <213> 縫氣 <400> 261

Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val 1 5 <210> 262 <211〉 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 262

Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu 1 5 <210> 263 <211> 9 <212〉 PRT <213> 鼷鼠 <400> 263

Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu 1 5 <210〉 264 -72- 103376.doc <211〉 1285648 <212> PRT <213> 縫氣 <400> 264

Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu 1 5 <210〉 265 <211> 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 265

Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu 1 5 <210> 266 <211〉 9 <212> PRT <213> 縫鼠 <400> 266

Glu Ser Asp Asn His Thr Ala Pro lie 1 5 <210〉 267 <211〉 9 <212> PRT <213〉隱鼠 <400> 267 -73- 103376.doc 1285648

Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser 1 5 <210> 268 <211〉 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 268

Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu 1 5

<210〉269 <211〉 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 269

Gly Gin Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala 1 5 <210> 270 <211> 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 270

Gly Val Phe Arg Gly lie Gin Asp Val 1 5

<210〉 271 <211> 9 <212> PRT -74- 103376.doc 1285648 <213> 鼷鼠 <400> 271

Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Ala 1 5 <210> 272 <211〉 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 272

His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met 1 5 <210> 273 <211〉 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 273

His Thr His Gly Val Phe Arg Gly lie 1 5 <210> 274 <211> 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400〉274 lie Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg lie 1 5 <210〉 275 -75- 103376.doc 1285648 <211〉 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 275

Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 1 5 <210> 276 <211> 9 <212> PRT <213> 縫鼠 <400> 276

Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu 1 5 <210> 277 <211> 9 <212> PRT <213> 縫鼠 <400> 277

Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 1 5 <210> 278 <211> 9 <212> PRT <213> 縫鼠 <400> 278 -76- 103376.doc 1285648

Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin Met 1 5 <210> 279 <211> <212> 9 PRT <213> 鼷鼠 <400> 279

Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu 1 5 <210> 280 <211> 9 <212> PRT <213> ss鼠 <400> 280

Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr 1 5 <210> 281 <211> 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 281

Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu 1 5

<210〉 282 <211〉 9 <212> PRT •77- 103376.doc 1285648 <213〉鼷鼠 <400〉282

Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu 1 5 <210> 283 <211> 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 283

Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met <210> 284 <211〉 9 <212> PRT <213〉鼷鼠 <400> 284

Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu 1 5 <210〉285 <211> 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 285

Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala Leu 1 5 <210> 286 -78- 103376.doc <211> 1285648 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 286

Asn Gin Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu 1 5 <210> 287 <211〉 9 <212> PRT <213> 縫鼠 <400> 287

Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu 1 5 <210> 288 <211> 9 <212> PRT <213〉鼷鼠 <400> 288

Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met 1 5 <210〉 289 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉縫鼠 <400> 289 -79- 103376.doc 1285648

Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met 1 5 <210〉290 <211〉 9 <212〉PRT <213〉鼷鼠 <400> 290 Gin Gin Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val 1 5

<210> 291 <211> 9 <212> PRT <213> 鼷鼠

<400〉291 Gin Tyr Arg lie His Thr His Gly Val 5 292 9 PRT 総鼠 292 Gin Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr 1 5 <210> <211> <212> <213> <400>

<210> 293 <211〉 9 <212> PRT 103376.doc -80- 1285648 <213〉鼷鼠 <400> 293

Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210〉294 <211> 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 294

Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu 1 5 <210> 295 <211> 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 295

Arg Val Ser Gly Yal Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 296 <211〉 9

<212> PRT <213〉鼷鼠 <400> 296

Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Thr lie 1 5 <210> 297 -81 - 103376.doc <211> 1285648 <212> PRT <213> 縫鼠 <400> 297

Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser 1 5 <210> 298 <211> 9 <212> PRT <213> 緣鼠 <400> 298

Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu <210> 299 <211> 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 299

Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val 1 5 <210> 300 <211> 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 300 -82 - 103376.doc 1285648

Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser 1 5 <210〉301 <211〉 9

<212> PRT <213〉鼷鼠 <400> 301

Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Gly lie 1 5

<210> 302 <211〉 9 <212> PRT <213〉鼷鼠 <400> 302

Thr Leu His Phe Ser Gly Gin Phe Thr 1 5 <210> 303 <211〉 9 <212> PRT <213〉鼷鼠 <400〉303

Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr 1 5

<210> 304 <211> 9 <212> PRT -83- 103376.doc 1285648 <213〉鼷鼠 <400〉304

Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala 1 5 <210〉305 <211> 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400〉305

Trp Asn Gin Met Asn Leu Gly Ala Thr 1 5 <210> 306 <211> 9 <212> PRT <213> 鼷鼠 <400〉306

Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met 1 5

<210〉307 <211> 9

<212> PRT <213> 鼷鼠 <400> 307

Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys 1 5 <210> 308 -84- 103376.doc <211> 1285648 <212> PRT <213> 縫鼠 <400〉 308

Thr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gin Met 1 5 <210> 309 <211〉 <212> 6 PRT <213〉人類 <400> 309

Gly Ala Ala Gin Trp Ala 1 5 <210> 310 <211> 12 <212> PRT <213> 人類 <400> 310

Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro 1 5 10 <210〉 311 <211> 15 <212> PRT <213> 人類 <400> 311 -85- 103376.doc 1285648

Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly 1 5 <210〉 312 <211> 5 <212> PRT <213> 人類 <400> 312 His Ala Ala Gin Phe 10 15 <210> 313 <211> 32 <212> PRT <213> 人類 <400> 313

Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu 15 10 15

Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu 20 25 30 <210> 314 <211> 32 <212> PRT <213> 人類 <400〉 314

Arg lie His Thr His Gly Val Phe Arg Gly lie Gin Asp Val Arg Arg 15 10 15

Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser 20 25 30 】03376.doc 86- 1285648 <210> 315 <211> 4 <212> PRT <213> 人類 <400> 315

Arg Tyr Phe Lys 1 <210> 316 <211〉 14 <212> PRT <213> 人類 <400> 316

Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin 1 5 10 <210> 317 <211〉 22 <212> PRT <213> 人類 <400> 317

Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr 15 10 10

His Thr Gly Lys Thr Ser 20

<210> 318 <211〉 21 <212> PRT 103376.doc -87- 1285648 <213> 人類 <400> 318

Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn 15 10 15

Met His Gin Arg Asn 20 <210〉319 <211> 449 <212> PRT <213> 人類

<400> 319

Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1.5 10 15

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30

Gin Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe lie Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser* Ala Thr Val His Phe 85 90 95

Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 " 110

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Glv Gin Ala Arg Met Phe 115 120 * 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala lie 130 135 , 140

Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 ^ 160

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175

Lys His Glu Asd Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190

Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 88- 103376.doc 1285648 195 200 205

Cys Thr Giy Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220

Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cvs Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255

Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270

Ser Asp Asn His Thr Thr Pro lie Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg lie 275 ， 280 285

His Thr His Gly Val Phe Arg Gly lie Gin Aso Val Aro Arg Val Pro 290 295 300 .一

Gly Val Ala Pro Thr： Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320

Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tvr Phe Lys 325 330 - 335

Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350

Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365

Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Giv Val Lys Pro Phe Gin 370 375 * 380

Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 * 400

His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Giu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415

Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430

Arg His His Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala 435 440 445

Leu <210> 320 <211> 449 <212> PRT <213>鼸鼠 <400> 320

Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser 15 10 15

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30

Gin Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ale Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe lie Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe 85 90 95

Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Hez Phe 115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Thr lie 130 135 140

Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr 145 150 155 160

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Asn His. Ser Phe ' 165 170 175 89- 103376.doc 1285648

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190

Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205

Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Aso 210 215 220 ^

Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255

Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Gly lie Glv Tyr Glu 260 265 270

Ser Asp Asn His Thr Ala Pro lie Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg lie 275 280 285

His Thr His Gly Val Phe Arg Gly lie Gin Asp Val Arg Arg Val Ser 290 295 300

Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 . 320 •Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335

Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350

Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365

Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gin 370 375 380

Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400

His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415

Arg Trp His Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430

Arg His His Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala 435 440 445

Leu . <210> 321 <211〉 9

<212> PRT <213> 人類與鼷鼠 <400> 321

Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala 1 5 <210〉 322 90- 103376.doc 1285648 <211> 9 <212> PRT <213> 人類與鼷鼠 <400> 322

Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe Pro 1 5 <210> 323 <211> 9 <212> PRT <213> 人類與鼷鼠 <400> 323

Gin Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro 1 5 <210> 324 <211> 9 <212> PRT <213> 人類與鼷鼠 <400> 324

Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro 1 5 <210〉 325 <211> 9 <212> PRT <213> 人類與鼷鼠 <400> 325 -91 · 103376.doc 1285648

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys 1 5 <210〉326 <211> 9 <212> PRT <213> 人類與鼷鼠 <400〉326

Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu 1 5

92- 103376.doc

Claims

1285648 第094123744號專利申請案 f——η 中文申請專利範圍替換本(95年5月）j 4 月日修(更)正本十、申請專利範圍： ^ --—--- 1. 一種多肽，其係由如SEQ ID NO:319所示WT1序列之少 I 於23個連續胺基酸殘基所組成，其中該多肽包含天然 WT1之免疫原部分，其中該免疫原部分包含SEQ ID NO:144。眷 103376-950525.doc