PL201881B1

PL201881B1 - Izolowany polipeptyd składający się z immunogennej części natywnego WT1, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i szczepionka oraz polinukleotyd kodujący ten polipeptyd

Info

Publication number: PL201881B1
Application number: PL348595A
Authority: PL
Inventors: Martin Cheever; Alexander Gaiger
Original assignee: Corixa Corp; Alexander Gaiger
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2009-05-29
Also published as: AU6407899A; MXPA01003344A; NZ510600A; TWI285648B; JP4235984B2; CN100486995C; KR100752065B1; CA2349442C; WO2000018795A9; WO2000018795A3; JP4243792B2; CA2349442A1; MY139226A; NO20011613D0; NO20011613L; JP2002525099A; HK1039782A1; PL348595A1; DE69938970D1; BR9914116A

Abstract

Wynalazek dotyczy izolowanego polipeptydu, który sk lada si e z immunogennej cz esci natywne- go WT1, która sk lada si e z sekwencji wybranej z sekwencji Sekw. Id. Nr: 2 lub Sekw. Id. Nr: 144. Wy- nalazek obejmuje te z kompozycj e farmaceutyczn a, która zawiera polipeptyd wg wynalazku w kombi- nacji z dopuszczalnym fizjologicznie no snikiem albo zaróbk a oraz szczepionk e, która zawiera ten poli- peptyd w kombinacji z niespecyficznym wzmacniaczem odpowiedzi immunologicznej, a tak ze polinu- kleotyd koduj acy polipeptyd wed lug wynalazku. Polipeptyd mo ze by c zastosowany jako substancja aktywna terapeutycznie, a takze do wytwarzania leku do wzmacniania albo indukowania odpowiedzi immunologicznej u pacjenta. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowany polipeptyd składający się z immunogennej części natywnego WT1, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i szczepionka oraz polinukleotyd kodujący ten polipeptyd.

Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny immunoterapii chorób nowotworowych, takich jak białaczka i raki.

Rak i białaczka stanowią znaczący problem zdrowotny w Stanach Zjednoczonych i na całym świecie. Jakkolwiek nastąpił postęp w wykrywaniu i leczeniu takich chorób, żadne szczepionki ani inne uniwersalnie skuteczne sposoby zapobiegania albo leczenia raka i białaczki nie są obecnie dostępne. Leczenie takich chorób polega obecnie na połączeniu wczesnej diagnozy z agresywnym leczeniem, które może obejmować jeden albo więcej rozmaitych sposobów leczenia, takich jak chirurgia, radioterapia chemioterapia i terapia hormonalna. Sposób leczenia konkretnych nowotworów jest często wybierany w oparciu o rozmaite parametry prognostyczne, włączając w to analizę markerów specyficznych dla nowotworu. Jednakże zastosowanie ustalonych markerów często prowadzi do wyników, które są trudne do interpretacji i nadal obserwuje się wysoką śmiertelność wśród wielu pacjentów z nowotworami.

Immunoterapie dają potencjalną możliwość lepszego leczenia i zwiększenia szans na przeżycie w przypadkach raka i biał aczek. Ostatnie dane pokazują , ż e biał aczkę moż na leczyć przez immunoterapię w kontekście transplantacji szpiku kostnego (np. wlewu limfocytów dawcy). Takie terapie mogą obejmować wywoływanie albo wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej na antygen związany z nowotworem (TAA). Jednakże, jak dotychczas poznano stosunkowo niewiele TAA i nie wykazano, z nielicznymi wyją tkami, żeby wywoływanie odpowiedzi odpornościowej przeciw takim antygenom było leczniczo korzystne.

Zgodnie z powyższym istnieje potrzeba w tej dziedzinie ulepszonych metod zapobiegania i leczenia białaczki i raka. Niniejszy wynalazek spełnia te potrzeby i dostarcza dalszych związanych z tym korzyści.

Wynalazek dotyczy izolowanego polipeptydu, który składa się z immunogennej części natywnego WT1, która składa się z sekwencji wybranej z Sekw. Id. Nr: 2 lub Sekw. Id. Nr: 144.

Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej polipeptyd według wynalazku w kombinacji z dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem lub zaróbką. Ponadto wynalazek dotyczy szczepionki zawierającej polipeptyd według wynalazku w kombinacji z niespecyficznym wzmacniaczem odpowiedzi immunologicznej, którym korzystnie jest adiuwant, korzystnie wybrany z grupy składającej się z cytokin (np. GM-CSF, ligand Flat3), mikrosfer, adiuwantów opartych na bromku dimetylodioktadecyloamoniowym (DDA), AS-1, AS-2, QS21, adiuwantów opartych na saponinie, MV, ddMV, adiuwantów opartych na stymulującym kompleksie immunologicznym (iscom) i inaktywowanych toksyn.

Wynalazek dotyczy też polinukleotydu kodującego polipeptyd według wynalazku.

Ponadto wynalazek dotyczy polipeptydu według wynalazku do zastosowania jako substancja aktywna terapeutycznie.

Wynalazek dotyczy również polipeptydu według wynalazku do zastosowania w wytwarzaniu leku do wzmacniania albo indukowania odpowiedzi immunologicznej u pacjenta.

Immunogenna część, korzystnie wiąże się z cząsteczką MHC klasy I i/lub klasy II.

Kompozycje farmaceutyczne lub szczepionki według wynalazku, podane pacjentowi wzmagają lub indukują odpowiedź odpornościową i hamują rozwój choroby nowotworowej u pacjenta. Choroby nowotworowe obejmują między innymi białaczki (np. ostrą szpikową, ostrą limfocytową i przewlekłą szpikową) oraz raki (np. sutka, płuc, raka tarczycy i układu pokarmowego albo czerniaka). Pacjent może, ale nie musi być dotknięty chorobą nowotworową, a podawanie kompozycji farmaceutycznej i szczepionki może hamować wystąpienie takiej choroby albo może hamować rozwój i/lub przerzutowanie w przypadku zaistniałej choroby.

Polipeptyd według niniejszego wynalazku można też stosować do usuwania komórek wyrażających WT1 ze szpiku kostnego i/lub krwi obwodowej lub ich frakcji przez doprowadzenie do kontaktu ze szpikiem kostnym, krwią obwodową albo frakcjami szpiku kostnego lub krwi obwodowej z limfocytami T, które reagują specyficznie z polipeptydem WT1, przy czym etap doprowadzania do kontaktu następuje w warunkach i w czasie dostatecznym dla umożliwienia usunięcia komórek WT1 dodatnich do poziomu mniej niż 10%, korzystnie mniej niż 5% a jeszcze korzystniej mniej niż 1% liczby komórek mieloidalnych albo limfatycznych w szpiku kostnym, krwi obwodowej lub frakcjach. Szpik kostny, krew

PL 201 881 B1 obwodową i frakcje można otrzymać od pacjenta dotkniętego chorobą związaną z ekspresją WT1 albo można otrzymać od człowieka albo ssaka innego niż człowiek niedotkniętego taką chorobą.

Tak przygotowany szpik kostny, krew obwodową lub frakcję szpiku kostnego lub krwi obwodowej jak opisano powyżej można podać pacjentowi w celu hamowania rozwoju choroby nowotworowej. Taki szpik kostny, krew obwodowa lub frakcje mogą być autologiczne, albo mogą pochodzić ze spokrewnionych albo niespokrewnionych ludzi albo zwierząt innych niż człowiek (np. syngeniczne albo allogeniczne).

Polipeptyd według wynalazku można też wykorzystać do stymulowania (lub wzbudzania) i/lub namnażania limfocytów T przez doprowadzenie do kontaktu limfocytów T z polipeptydem WT1 w warunkach i w czasie dostatecznym dla stymulacji i/lub namnożenia limfocytów T. Takie limfocyty T mogą być autologicznymi, allogenicznymi, syngenicznymi albo niespokrewnionymi swoistymi wobec WT1 limfocytami T i mogą być stymulowane in vitro albo in vivo. Namnażające się limfocyty T mogą w niektórych przypadkach być obecne w szpiku kostnym, krwi obwodowej albo frakcjach szpiku kostnego lub krwi obwodowej i mogą (ale nie muszą) być klonalne. W niektórych wykonaniach, limfocyty T mogą być obecne u ssaków w czasie stymulacji i/lub namnażania się. Limfocyty T swoiste wobec WT1 można zastosować na przykład w infuzjach limfocytów dawcy.

Tak przygotowane komórki można podawać pacjentowi w celu hamowania rozwoju choroby nowotworowej u pacjenta.

Polipeptyd według wynalazku lub kodujący go polinukleotyd według wynalazku umożliwia także przeprowadzenie monitorowania odpowiedzi w postaci przeciwciała, limfocytów T CD4⁺ i/lub limfocytów T CD8⁺ u pacjenta. Sposób monitorowania może obejmować etapy: (a) inkubowania pierwszej próbki biologicznej z jednym lub więcej spośród: (i) polipeptydu WT1; (ii) polinukleotydu kodującego polipeptyd WT1; albo (iii) komórki prezentującej antygen, która wyraża polipeptyd WT1, przy czym pierwsza próbka biologiczna jest pobrana od pacjenta przed terapią albo immunizacją, a inkubację przeprowadza się w warunkach i w czasie dostatecznym dla umożliwienia utworzenia się kompleksów immunologicznych; (b) wykrywania kompleksów immunologicznych utworzonych pomiędzy polipeptydem WT1 a przeciwciałami w próbce biologicznej, które wiążą się swoiście z polipeptydem WT1; i (c) powtórzenia etapów (a) i (b) z użyciem drugiej próbki biologicznej pobranej od tego samego pacjenta po terapii albo immunizacji; i (d) porównania liczby kompleksów immunologicznych wykrytych w pierwszej i drugiej próbce biologicznej i monitorowania w ten sposób skutecznoś ci immunizacji albo terapii choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1 u pacjenta.

W niektórych wykonaniach powyż szych sposobów, etap wykrywania obejmuje (a) inkubowanie kompleksów immunologicznych z odczynnikiem do wykrywania, który ma zdolność wiązania się z kompleksami immunologicznymi i zawiera grupę wskaź nikową , (b) usunię cie niezwią zanego odczynnika do wykrywania, i (c) wykrywanie obecności albo nieobecności grupy wskaźnikowej. Odczynnik do wykrywania może obejmować, na przykład, drugorzędowe przeciwciało, albo jego fragment wiążący się z antygenem, zdolne do wiązania się z przeciwciałami, które swoiście wiążą się z polipeptydem WT1 albo cząsteczkę taką jak Białko A. W innych wykonaniach, grupa wskaźnikowa jest związana z polipeptydem WT1 i etap wykrywania obejmuje usunięcie niezwiązanego polipeptydu WT1, a następnie wykrywanie obecności albo nieobecności grupy wskaźnikowej.

Sposoby monitorowania skuteczności immunizacji albo terapii choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1 u pacjenta mogą obejmować etapy: (a) inkubowania pierwszej próbki biologicznej z jednym lub więcej spośród: (i) polipeptydu WT1; (ii) polinukleotydu WT1 kodującego polipeptyd WT1; albo (iii) komórki prezentującej antygen, która wyraża polipeptyd WT1, gdzie pierwsza próbka biologiczna zawiera limfocyty T CD4⁺ i/lub CD8⁺ i jest pobrana od pacjenta przed terapią albo immunizacją, i gdzie inkubację przeprowadza się w warunkach i w czasie dostatecznym dla umoż liwienia specyficznej aktywacji, proliferacji i/lub lizy limfocytów T; (b) wykrywania poziomu aktywacji, proliferacji i/lub lizy limfocytów T; (c) powtórzenia etapów (a) i (b) z użyciem drugiej próbki biologicznej zawierającej limfocyty T CD4⁺ i/lub CD8⁺, przy czym druga próbka biologiczna jest pobrana od tego samego pacjenta po leczeniu albo immunizacji; i (d) porównania poziomu aktywacji, proliferacji i/lub lizy limfocytów T w pierwszej i drugiej próbce biologicznej i monitorowania w ten sposób skuteczno ś ci terapii albo immunizacji u pacjenta.

Polipeptyd według wynalazku i kodujący go polinukleotyd są odpowiednie do hamowania rozwoju choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1 u pacjenta w sposobie obejmującym etapy: (a) inkubowania limfocytów T CD4⁺ i/lub CD8⁺ izolowanych od pacjenta z jednym lub więcej spośród: (i) polipeptydu WT1; (ii) polinukleotydu kodującego polipeptyd WT1; lub (iii) komórki prezentującej

PL 201 881 B1 antygen, która wyraża polipeptyd WT1, tak, że limfocyty T namnażają się; i (b) podawania pacjentowi skutecznej ilości namnożonych limfocytów T hamując w ten sposób rozwój choroby nowotworowej u pacjenta. W niektórych wykonaniach etap inkubowania limfocytów T moż e być powtarzany raz albo wielokrotnie.

Polipeptyd według wynalazku i kodujący go polinukleotyd są odpowiednie do hamowania rozwoju choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1 u pacjenta w sposobie obejmującym etapy: (a) inkubowania limfocytów T CD4⁺ i/lub CD8⁺ izolowanych od pacjenta z jednym lub więcej spośród: (i) polipeptydu WT1; (ii) polinukleotydu kodującego polipeptyd WT1; lub (iii) komórki prezentującej antygen, która wyraża polipeptyd WT1, tak, że limfocyty T namnażają się; (b) klonowania jednej lub większej liczby komórek, które namnożyły się i (c) podawania pacjentowi skutecznej ilości sklonowanych limfocytów T.

Polipeptyd według wynalazku i kodujący go polinukleotyd są odpowiednie do ustalania obecności lub nieobecności choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1 u pacjenta w sposobie obejmującym: (a) inkubowanie limfocytów T CD4⁺ i/lub CD8⁺ izolowanych od pacjenta z jednym lub więcej spośród: (i) polipeptydu WT1; (ii) polinukleotydu kodującego polipeptyd WT1; lub (iii) komórki prezentującej antygen, która wyraża polipeptyd WT1, i (b) wykrywanie obecności albo braku aktywacji limfocytów T i ustalenie na tej podstawie obecności albo nieobecności choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1. W niektórych wykonaniach etap wykrywania obejmuje wykrywanie obecnoś ci albo braku proliferacji limfocytów T.

Polipeptyd według wynalazku i kodujący go polinukleotyd są odpowiednie do ustalania obecności lub nieobecności choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1 u pacjenta w sposobie obejmującym: (a) inkubowanie próbki biologicznej pobranej od pacjenta z jednym lub więcej spośród: (i) polipeptydu WT1; (ii) polinukleotydu kodującego polipeptyd WT1; lub (iii) komórki prezentującej antygen, która wyraża polipeptyd WT1, gdzie inkubację przeprowadza się w warunkach i w czasie dostatecznym dla umożliwienia utworzenia się kompleksów immunologicznych; (b) wykrywanie kompleksów immunologicznych utworzonych pomiędzy polipeptydem WT1 a przeciwciałami w próbce biologicznej, które wiążą się swoiście z polipeptydem WT1 i ustalenie na tej podstawie obecności albo nieobecności choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1.

Te i inne aspekty niniejszego wynalazku staną się oczywiste po odniesieniu się do następującego dalej szczegółowego opisu i dołączonych rysunków.

Krótki opis rysunków

Na Fig. 1 przedstawiono porównanie sekwencji mysiego (MO) i ludzkiego (HU) białka WT1 (Id. Sekw. Nr: 320 i 319, odpowiednio).

Na Fig. 2 przedstawiono filtr z Western blot, ilustrujący wykrywanie przeciwciał swoistych wobec WT1 u pacjentów z nowotworami krwi (AML). Ścieżka 1 pokazuje wskaźniki masy cząsteczkowej; ścieżka 2 przedstawia kontrolę dodatnią (linia ludzkich komórek białaczkowych dodatnich względem WT1 po immunoprecypitacji przeciwciałem swoistym wobec WT1); ścieżka 3 przedstawia kontrolę ujemną (linia komórek WT1 dodatnich po immunoprecypitacji surowicą mysią); a ścieżka 4 przedstawia linię komórek WT1 dodatnich po immunoprecypitacji surowicą pacjenta z AML. W przypadku ścieżek 2-4 osad po immunoprecypitacji rozdzielano przez elektroforezę w żelu i jako sondę stosowano przeciwciało swoiste wobec WT1.

Na Fig. 3 przedstawiono filtr z Western blot, ilustrujący wykrywanie odpowiedzi w postaci przeciwciał swoistych wobec WT1 u myszy B6 immunizowanej TRAMP-C, nowotworową linią komórkową WT1 dodatnią. Ścieżki 1, 3 i 5 pokazują wskaźniki masy cząsteczkowej, a ścieżki 2, 4 i 6 pokazują WT1 swoiste kontrole dodatnie (N180, Santa Gruz Biotechnology, polipeptyd obejmujący 180 aminokwasów N-końcowego regionu białka WT1, migrujący na filtrze z Western blot na poziomie 52 u). Zastosowanym pierwszorzędowym przeciwciałem było WT180 w ścieżce 2, surowica nieimmunizowanej myszy B6 w ścieżce 4 i surowica immunizowanej myszy B6 w ścieżce 6.

Na Fig. 4 przedstawiono filtr z Western blot, ilustrujący wykrywanie przeciwciał swoistych wobec WT1 u myszy immunizowanej reprezentatywnymi peptydami WT1. Ścieżki 1, 3 i 5 pokazują wskaźniki masy cząsteczkowej, a ścieżki 2, 4 i 6 pokazują kontrole dodatnie swoiste wobec WT1 (N180, Santa Cruz Biotechnology, polipeptyd obejmujący 180 aminokwasów N-końcowego regionu białka WT1, migrujący na filtrze z Western blot na poziomie 52 u). Zastosowanym pierwszorzędowym przeciwciałem było WT180 w ścieżce 2, surowica nieimmunizowanej myszy B6 w ścieżce 4 i surowica immunizowanej myszy B6 w ścieżce 6.

PL 201 881 B1

Figury 5A do 5C są schematami ilustrującymi stymulację odpowiedzi proliferacyjnej limfocytów T u myszy immunizowanych reprezentatywnymi peptydami WT1. Testy z włączeniem tymidyny przeprowadzono przy zastosowaniu jednej linii T i dwóch różnych klonów, jak wskazano, a wyniki wyrażono w cpm. Na osi x wskazano badanie kontrolne bez antygenu (Bez Ag) i z B6/pożywką; zastosowanymi antygenami były ludzki p6-22 (p1), p117-139 (p2) albo ludzki p244-262 (p3).

Figury 6A i 6B są histogramami ilustrującymi stymulację odpowiedzi proliferacyjnych limfocytów T u myszy immunizowanych reprezentatywnymi peptydami WT1. Trzy tygodnie po trzeciej immunizacji, komórki śledziony myszy zaszczepionych szczepionką A albo szczepionką B hodowano w samej pożywce (pożywka) albo jako komórki i pożywka (B6/bez antygenu), komórki śledziony B6 traktowane pulsowo peptydami p6-22 (p6), p117-139 (p117), p244-262 (p244) (Szczepionka A; Fig. 6A) lub p287-301 (p287), p299-313 (p299), p421-435 (p421) (Szczepionka B; Fig. 6B), i komórki śledziony B6 traktowane pulsowo nierelewantnymi peptydem (peptyd nierelewantny) w stężeniu 25 μg/ml i były testowane po 96 godzinach pod kątem proliferacji przez włączenie tymidyny (³H). Słupki reprezentują współczynnik stymulacji (SI), który jest liczony jako średnia ze studzienek doświadczalnych podzielona przez średnią z kontroli (komórki śledziony B6 bez antygenu).

Figury 7A-7D są histogramami ilustrującymi wytwarzanie proliferujących linii i klonów limfocytów T swoistych wobec p117-139 i p6-22. Po immunizacji in vivo, trzy początkowe stymulacje in vitro (IVS) przeprowadzono stosując wszystkie trzy peptydy szczepionki A albo B, odpowiednio. Następne IVS przeprowadzono jako stymulacje pojedynczymi peptydami stosując jedynie dwa odpowiednie peptydy, p117-139 i p6-22. Klony pochodziły z linii T specyficznych zarówno dla p6-22, jak i p117-139, jak wskazano. Limfocyty T hodowano w samej pożywce (pożywka) albo jako komórki śledziony i pożywka (B6/bez antygenu), komórki śledziony B6 traktowane pulsowo peptydami p6-22 (p6), p117-139 (p117) albo nierelewantnym kontrolnym peptydem (peptyd nierelewantny) w stężeniu 25 μg/ml i testowano po 96 godzinach pod kątem proliferacji przez włączenie tymidyny (³H). Słupki reprezentują współczynnik stymulacji (SI), który jest liczony jako średnia ze studzienek doświadczalnych podzielona przez średnią z kontroli (komórki śledziony B6 bez antygenu).

Na Fig. 8A i 8B przedstawiono wyniki analizy TSITES ludzkiego WT1 (Id. Sekw. Nr: 319) dla peptydów, które mają zdolność wzbudzania odpowiedzi Th. Regiony zaznaczone jako „A” są środkami bloków AMPHI, „R” oznacza reszty pasujące do motywu Rothbard/Taylor, „D” oznacza reszty pasujące do motywu lAd, a „d” wskazuje na reszty pasujące do motywu lEd.

Figury 9A i 9B są schematami ilustrującymi wzbudzanie swoistej wobec peptydu WT1 odpowiedzi CTL u myszy immunizowanych peptydami WT1. Na Fig. 9A przedstawiono lizę komórek docelowych przez allogeniczne linie komórkowe, a na Fig. 9B przedstawiono lizę linii komórkowych opłaszczonych peptydem. W każdym przypadku, % lizy (określony w standardowym teście uwalniania chromu) jest pokazany przy trzech wskazanych stosunkach efektor:cel (E:T). Wyniki są przedstawione dla komórek chłoniaka (LSTRA i E10), jak również E10 + p235-243 (E10+P235). Komórki E10 są tu również określane jako komórki EL-4.

Figury 10A-10D przedstawiają schematy ilustrujące wzbudzanie swoistej wobec peptydu WT1 odpowiedzi CTL, która zabija WT1 dodatnie linie komórek nowotworowych, ale nie zabija WT1 ujemnych linii komórek po zaszczepieniu myszy B6 peptydem WT1 P117. Na Fig. 10A pokazano, że limfocyty T nieimmunizowanych myszy B6 nie zabijają dodatnich linii komórek nowotworowych. Na Fig. 10B pokazano lizę komórek docelowych przez allogeniczne linie komórkowe. Na Fig. 10C i 10D pokazano lizę WT1 dodatnich linii komórek nowotworowych w porównaniu z WT1 ujemnymi liniami komórkowymi w dwóch odrębnych doświadczeniach. Ponadto, na Fig. 10C i 10D przedstawiono lizę linii komórkowych opłaszczonych peptydem (WT1 ujemnej linii E10 opłaszczonej odpowiednim peptydem WT1, P117). W każdym przypadku, % lizy (określony w standardowym teście uwalniania chromu) jest pokazany przy trzech wskazanych stosunkach efektor:cel. Wyniki są przedstawione dla komórek chłoniaka (E10), komórek raka prostaty (TRAMP-C), transformowanej linii fibroblastów (BLK-SV40), jak również E10+p117.

Figury 11A i 11B przedstawiają histogramy ilustrujące zdolność CTL swoistych wobec reprezentatywnego peptydu P117-139 do lizy komórek nowotworowych WT1 dodatnich. Trzy tygodnie po trzeciej immunizacji, komórki śledziony myszy zaszczepionych peptydami p235-243 albo p117-139 stymulowano in vitro odpowiednim peptydem i testowano pod kątem zdolności do lizy komórek docelowych inkubowanych z peptydami WT1, jak również komórek nowotworowych WT1 dodatnich i ujemnych. Słupki reprezentują średni % swoistej lizy w teście uwalniania chromu przeprowadzonym trzykrotnie przy stosunku E:T wynoszącym 25:1. Na Fig. 11A przedstawiono aktywność cytotoksyczną linii

PL 201 881 B1 limfocytów T swoistych dla p235-243 wobec WT1 ujemnej linii EL-4 (EL-4, WT1 ujemna); EL-4 traktowanej pulsowo odpowiednim (stosowanym do immunizacji jak również restymulacji) peptydem p235-243 (EL-4+p235); EL-4 traktowanej pulsowo nierelewantnymi peptydami p117-139 (EL-4+p117), p126-134 (EL-4+p126) lub p130-138 (EL-4+p130) oraz wobec WT1 dodatnich komórek nowotworowych BLK-SV40 (BLK-SV40, WT1 dodatnie) i TRAMP-C (TRAMP-C, WT1 dodatnie), jak wskazano. Na Fig. 11B przedstawiono aktywność cytotoksyczną linii limfocytów T swoistych dla p117-139 wobec linii EL-4; EL-4 traktowanej pulsowo peptydem p117-139 (EL-4+p117) i EL-4 traktowanej pulsowo nierelewantnymi peptydami p123-131 (EL-4+p123), lub p128-136 (EL-4+p128); BLK-SV40 i TRAMPC, jak wskazano.

Figury 12A i 12B przedstawiają histogramy ilustrujące swoistość lizy komórek nowotworowych WT1 dodatnich, jak wykazano przez hamowanie nieznakowanymi (zimnymi) komórkami docelowymi. Słupki reprezentują średni % swoistej lizy w testach uwalniania chromu przeprowadzonych trzykrotnie przy stosunku E:T wynoszącym 25:1. Na Fig. 12A przedstawiono aktywność cytotoksyczną linii limfocytów T swoistych dla p117-139 wobec WT1 ujemnej linii komórkowej EL-4 (EL-4, WT1 ujemne); WT1 dodatniej linii nowotworowej TRAMP-C (TRAMP-C, WT1 dodatnia); komórek TRAMP-C inkubowanych z dziesię ciokrotnym nadmiarem (w porównaniu ze znakowanymi komórkami docelowymi (komórki gorące) komórek EL-4 traktowanych pulsowo relewantnym peptydem p117-139 (TRAMP-C + p117 zimne komórki docelowe) bez znakowania ⁵¹Cr i komórek TRAMP-C inkubowanych z EL-4 traktowanych pulsowo nierelewantnym peptydem bez znakowania ⁵¹Cr (TRAMP-C + nierelewantny zimny cel), jak wskazano. Na Fig. 12B przedstawiono aktywność cytotoksyczną linii limfocytów T swoistych dla p117-139 wobec WT1 ujemnej linii komórkowej EL-4 (EL-4, WT1 ujemne); WT1 dodatniej linii nowotworowej BLK-SV40 (BLK-SV40, WT1 dodatnia), komórek BLK-SV40 inkubowanych z relewantnym zimnym celem (BLK-SV40 + p117 zimny cel) i komórek BLK-SV40 inkubowanych z nierelewantnym zimnym celem (BLK-SV40 + nierelewantny zimny cel), jak wskazano.

Figury 13A-13C są to histogramy przedstawiające ocenę 9-merowego epitopu CTL w obrębie p117-139. Linię CTL swoistą wobec nowotworowego p117-139 testowano przeciw peptydom w obrębie aminokwasów 117-139 zawierających albo pozbawionych odpowiedniego motywu wiążącego H-2^bklasy I i po restymulacji przy zastosowaniu p126-134 lub p130-138. Słupki reprezentują średni % swoistej lizy w testach uwalniania chromu przeprowadzonych trzykrotnie przy stosunku E:T wynoszącym 25:1. Na Fig. 13A przedstawiono aktywność cytotoksyczną linii limfocytów T swoistych dla p117-139 wobec WT1 ujemnej linii EL-4 (EL-4, WT1 ujemna) i komórek EL-4 traktowanych pulsowo peptydami p117-139 (EL-4 + p117), p119-127 (EL-4 + p119), p120-128 (EL-4 + p120), p123-131 (EL-4 + p123), p126-134 (EL-4 + p126), p128-136 (EL-4 + p128), oraz p130-138 (EL-4 + p130). Na Fig. 13B przedstawiono aktywność cytotoksyczną linii CTL po restymulacji p126-134 wobec WT1 ujemnej linii komórkowej EL-4, komórek EL-4 traktowanych pulsowo peptydami p117-139 (EL-4 + p117), p126-134 (EL-4 + p126) oraz WT1 dodatniej linii komórek nowotworowych TRAMP-C. Na Fig. 13C przedstawiono aktywność cytotoksyczną linii CTL po restymulacji p130-138 wobec EL-4, komórek EL-4 traktowanych pulsowo peptydami p117-139 (EL-4 + p117), p130-138 (EL-4 + p130) oraz WT1 dodatniej linii komórek nowotworowych TRAMP-C.

Niniejszy wynalazek opiera się na stwierdzeniu, że odpowiedź immunologiczna wzbudzona przeciw produktowi genu guza Wilmsa (WT) (np. WT1) może przynieść profilaktyczne i/lub terapeutyczne korzyści pacjentom dotkniętym chorobami nowotworowymi charakteryzującymi się zwiększoną ekspresją genu WT1. Takie choroby obejmują między innymi białaczki (np. ostrą białaczkę szpikową (AML), przewlekłą białaczkę szpikową (CML), ostrą białaczkę limfocytową (ALL) i postać dziecięcą ALL), jak również wiele nowotworów, takich jak nowotwory płuc, sutka, tarczycy i układu pokarmowego oraz czerniaki. Gen WT1 został pierwotnie zidentyfikowany i wyizolowany na podstawie delecji cytogenetycznej w chromosomie 11p13 u pacjentów z guzem Wilmsa (patrz Call i wsp. patent USA 5,350,840). Gen składa się z 10 eksonów i koduje czynnik transkrypcyjny z palcem cynkowym, a sekwencje mysiego i ludzkiego białka WT1 są przedstawione na Fig. 1 i w Id. Sekw. Nr: 319 i 320.

Polipeptydy WT1

W kontekś cie niniejszego wynalazku, polipeptydem WT1 jest polipeptyd, który skł ada się z immunogennej części natywnego WT1 (tj. białka WT1 wyrażanego przez organizm, który nie jest zmodyfikowany genetycznie).

Stosowany tu termin „część immunogenna” oznacza część polipeptydu, która jest rozpoznawana (tj. wiązana swoiście) przez powierzchniowy receptor antygenu limfocytów B i/lub limfocytów T.

Niektóre korzystne części immunogenne wiążą się z cząsteczką MHC klasy I albo klasy II. W znaczeniu tu stosowanym mówi się, że część immunogenna „wiąże się” z cząsteczką MHC klasy I albo klasy II,

PL 201 881 B1 jeżeli takie wiązanie jest wykrywalne przy zastosowaniu testów znanych w tej dziedzinie. Przykładowo, zdolność polipeptydu do wiązania się z MHC klasy I można ocenić pośrednio przez monitorowanie zdolności do promowania włączenia wyznakowanej ¹²⁵I e2-mikroglobuliny (e2m) do heterotrimerowych kompleksów MHC klasy I/e2m/peptyd (patrz Parker i wsp., J Immunol. 152: 163, 1994). Alternatywnie, można zastosować testy współzawodnictwa z funkcjonalnym peptydem, które są znane w tej dziedzinie. Pewne części immunogenne mają jedną albo więcej sekwencji przedstawionych w Tabelach II - XIV. Reprezentatywne immunogenne części obejmują, ale nie wyłącznie RDLNALLPAVPSLGGGG (reszty

6-22 ludzkiego WT1; Id. Sekw. Nr: 1), PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (reszty 117-139 ludzkiego i mysiego WT1; Id. Sekw. Nr: 2 i 3, odpowiednio), GATLKGVAAGSSSSVKWTE (reszty 244-262 ludzkiego WT1; Id. Sekw. Nr: 4), GATLKGVAA (reszty 244-252 ludzkiego WT1; Id. Sekw. Nr: 88), CMTWNQMNL (reszty 235-243 ludzkiego i mysiego WT1; Id. Sekw. Nr: 49 i 258, odpowiednio), SCLESQPTI (reszty 136-144 mysiego WT1; Id. Sekw. Nr: 296), SCLESQPAI (reszty 136-144 ludzkiego WT1; Id. Sekw. Nr: 198), NLYQMTSQL (reszty 225-233 ludzkiego i mysiego WT1; Id. Sekw. Nr: 147 i 284 odpowiednio); ALLPAVSSL (reszty 10-18 mysiego WT1; Id. Sekw. Nr: 255); albo RMFPNAPYL (reszty 126-134 ludzkiego i mysiego WT1; Id. Sekw. Nr: 185 i 293, odpowiednio). Inne części immunogenne można na ogół zidentyfikować stosując dobrze znane techniki, takie jak te zebrane w publikacji Paul, Fundamental Immunology, 3 wyd., 243-247 (Raven Press, 1993) i zacytowanych tam odnośnikach. Reprezentatywne techniki do identyfikowania immunogennych części obejmują przeszukiwanie polipeptydów pod kątem zdolności do reagowania ze swoistymi wobec antygenu surowicami odpornościowymi i/lub liniami lub klonami limfocytów T. Część immunogenna natywnego polipeptydu WT1 jest częścią, która reaguje z taką surowicą odpornościową i/lub limfocytami T na poziomie, który nie jest zasadniczo mniejszy niż reaktywność pełnej długości WT1 (np. w teście ELISA i/lub teście reaktywności limfocytów T). Innymi słowy, część immunogenna może reagować w takich testach na poziomie, który jest podobny lub wyższy niż reaktywność polipeptydu pełnej długości. Takie przeszukiwania można na ogół przeprowadzić stosując metody dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie, takie jak opisane w Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Alternatywnie, immunogenne części można identyfikować przy zastosowaniu analizy komputerowej, takiej jak program TSites (patrz, Rothbard and Taylor. EMBO.J. 7:93-100,1988; Deavin i wsp., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996), który poszukuje motywów peptydowych, które mają potencjał wzbudzania odpowiedzi Th. Peptydy CTL z motywami odpowiednimi dla wiązania się z mysimi i ludzkimi MHC klasy I albo klasy II można identyfikować według BIMAS (Parker i wsp., J: Immunol. 152:163, 1994) i innych analiz przewidujących wiązanie się z innym peptydem HLA. W celu potwierdzenia immunogenności, peptyd można testować przy użyciu modelu myszy transgenicznych względem HLA A2 i/lub testów stymulacji in vitro stosując komórki dendrytyczne, fibroblasty albo komórki krwi obwodowej.

Polipeptydy WT1 można wytworzyć dowolną z rozmaitych dobrze znanych technik. Zrekombinowane polipeptydy kodowane przez polinukleotydy WT1, jak tu opisano, można łatwo otrzymać wychodząc z polinukleotydu. Na ogół do wyrażenia zrekombinowanych polipeptydów WT1 można zastosować dowolny spośród różnych wektorów ekspresyjnych znanych specjalistom w tej dziedzinie w dowolnej odpowiedniej komórce. Ekspresję można uzyskać w dowolnej odpowiedniej komórce gospodarza, która została stransformowana lub transfekowana wektorem ekspresyjnym zawierającym cząsteczkę DNA, która koduje zrekombinowany polipeptyd. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują prokarionty, drożdże i wyższe komórki eukariotyczne. Korzystnie stosowanymi komórkami gospodarza są E. coli, drożdże lub linie komórek ssaczych, takie jak COS i CHO. Supernatanty z odpowiednich układów gospodarz/wektor, które wydzielają zrekombinowane białko lub polipeptyd do pożywki hodowlanej, można najpierw zagęścić przy zastosowaniu dostępnych handlowo filtrów. Koncentrat można następnie nanieść na odpowiednie złoże do oczyszczania, takie jak złoże powinowactwa lub żywice jonowymienne. Wreszcie można zastosować jeden lub więcej etapów HPLC z odwróconymi fazami do dalszego oczyszczania zrekombinowanego polipeptydu. Takie techniki można zastosować do przygotowania natywnych polipeptydów.

Polipeptydy można zsyntetyzować przy zastosowaniu dowolnej z dostępnych handlowo technik w fazie stałej, takich jak metoda syntezy w fazie stałej Merrifielda, gdzie aminokwasy dodaje się kolejno do rosnącego łańcucha aminokwasowego. Patrz Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. Wyposażenie do automatycznej syntezy polipeptydów jest dostępne handlowo od dostawców, takich jak Applied BioSystems Inc. (Foster City, CA) i może być obsługiwane zgodnie z instrukcjami producenta.

PL 201 881 B1

Generalnie, opisane tu polipeptydy i polinukleotydy są wyizolowane. „Wyizolowanym” polipeptydem lub polinukleotydem jest taki, który jest przeniesiony ze swojego normalnego środowiska. Przykładowo, naturalnie występujące białko jest wyizolowane, jeżeli jest oddzielone od jakiejś części albo całego współwystępującego z nim materiału w układzie naturalnym. Korzystnie takie polipeptydy mają stopień czystości co najmniej około 90%, korzystniej co najmniej około 95%, a najkorzystniej co najmniej około 99%. Uważa się, że polinukleotyd jest wyizolowany, jeżeli, na przykład, jest sklonowany w wektorze, który nie jest częścią naturalnego środowiska.

Polinukleotydy WT1

Dowolny polinukleotyd, który koduje polipeptyd WT1 jak tu opisano, jest polinukleotydem WT1 objętym niniejszym wynalazkiem. Takie polinukleotydy mogą być jednoniciowe (kodujące albo antysensowne) lub dwuniciowe i mogą być cząsteczkami DNA (genomowe, cDNA lub syntetyczne) albo RNA. W obrębie polinukleotydu według niniejszego wynalazku mogą, ale nie muszą, być obecne dodatkowe sekwencje kodujące lub niekodujące, a polinukleotyd może, ale nie musi, być połączony z innymi czą steczkami i/lub materiał ami wspomagają cymi.

Specjalista w dziedzinie rozumie, że w wyniku degeneracji kodu genetycznego może być wiele sekwencji nukleotydowych, które kodują polipeptyd WT1. Niektóre z tych polinukleotydów wykazują minimalną homologię z sekwencją nukleotydową dowolnego natywnego genu. Polinukleotydy, które wykazują różnice na skutek różnic w stosowaniu kodonów, objęte są również niniejszym wynalazkiem.

Po zidentyfikowaniu immunogennej części polipeptydu WT1, jak opisano powyżej, polinukleotyd WT1 można otrzymać przy zastosowaniu różnorodnych technik. Na przykład, polinukleotyd WT1 może być amplifikowany z cDNA wytwarzanego z komórek, które wyrażają WT1. Takie polinukleotydy można amplifikować w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W tym podejściu, można zaprojektować startery specyficzne dla sekwencji w oparciu o dostarczone tu sekwencje części immunogennej i można je kupić albo zsyntetyzować. Przykładowo odpowiednie startery do amplifikacji w reakcji PCR ludzkiego genu WT1 obejmują: pierwszy etap - P118: 1434-1414: 5' GAG AGT GAG ACT TGA AAG CAGT 3'. (Id. Sekw. Nr: 5) i P135: 5' CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3' (Id. Sekw. Nr: 6); drugi etap - P136: 5' GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG 3' (Id. Sekw. Nr: 7) i P137: 5' GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3' (Id. Sekw. Nr: 8). Startery do amplifikacji w reakcji PCR mysiego genu WT1 obejmują: pierwszy etap - P138: 5' TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3'. (Id. Sekw. Nr: 9) i P139: 5' GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3' (Id. Sekw. Nr: 10), drugi etap - P140: 5' GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3' (Id. Sekw. Nr: 11) i P141: 5' GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3' (Id. Sekw. Nr: 12).

Powieloną część można zastosować do izolacji genu pełnej długości z biblioteki genomowej DNA lub odpowiedniej biblioteki cDNA przy zastosowaniu dobrze znanych technik. Alternatywnie, gen pełnej długości można skonstruować z wielu fragmentów PCR. Polinukleotydy WT1 można również otrzymać przez syntezę składników oligonukleotydowych i ligację składników razem w celu wytworzenia kompletnego polinukleotydu.

Polinukleotydy WT1 można również syntetyzować dowolną z metod znanych w tej dziedzinie, włączając w to syntezę chemiczną (np. syntezę chemiczną w fazie stałej z fosforamidytem). Modyfikacje sekwencji polinukleotydowej można również wprowadzać przy zastosowaniu standardowych technik mutagenezy, takich jak mutageneza ukierunkowana oligonukleotydem (patrz Adelman et al., DNA 2:183, 1983). Alternatywnie, cząsteczki RNA można wytworzyć przez transkrypcję in vivo albo in vitro sekwencji DNA kodujących polipeptyd WT1, pod warunkiem, że DNA jest włączony do wektora z odpowiednim promotorem polimerazy RNA (takim jak T7 lub SP6). Pewne części można stosować do wytworzenia kodowanego peptydu, jak tu opisano. Ponadto, lub alternatywnie, część można podać pacjentowi, tak że zakodowany polipeptyd jest wytwarzany in vivo (np. przez transfekowanie komórek prezentujących antygen, takich jak komórki dendrytyczne, konstruktem cDNA kodującym polipeptyd WT1 i podawanie transfekowanych komórek pacjentowi).

Polinukleotydy, które kodują polipeptyd WT1 można na ogół zastosować do wytwarzania polipeptydu in vitro albo in vivo. Polinukleotydy WT1, które są komplementarne do sekwencji kodującej (tj. polinukleotydy antysensowne), można również zastosować jako sondę lub do hamowania ekspresji WT1. Konstrukty cDNA, które mogą być transkrybowane do antysensownego RNA, można również wprowadzić do komórek tkanek w celu ułatwienia wytwarzania antysensownego RNA.

Dowolny polinukleotyd może być ponadto zmodyfikowany w celu zwiększenia stabilności in vivo. Możliwe modyfikacje obejmują, ale nie wyłącznie, dodawanie sekwencji flankujących na końcach 5' i 3'; zastosowanie raczej fosforotionianu albo 2' O-metylu zamiast wiązań fosfodiestarazowych

PL 201 881 B1 w szkielecie wę glowym; i/lub włączenie nietypowych zasad, takich jak inozyna, keozyna (ang. Queosine) i wybutozyna, jak również acetylo-, metylo-, tio- i innych zmodyfikowanych form adeniny, cytydyny, guaniny, tyminy i urydyny.

Opisane tu sekwencje nukleotydowe można łączyć z różnymi innymi sekwencjami nukleotydowymi stosując ustalone techniki rekombinowania DNA. Przykładowo, polinukleotyd można klonować w różnych wektorach do klonowania, w łączając w to plazmidy, fagmidy, pochodne faga lambda i kosmidy. Wektory będące przedmiotem szczególnego zainteresowania obejmują wektory ekspresyjne, wektory replikacyjne, wektory do wytwarzania sond i wektory do sekwencjonowania. Generalnie, wektory będą zawierały początek replikacji funkcjonalny w co najmniej jednym organizmie, dogodne miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne i jeden lub więcej markerów selekcyjnych. Inne elementy będą zależały od żądanego zastosowania i będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie.

W pewnych wykonaniach, polinukleotydy mogą być tak formuł owane, aby moż liwe był o wniknięcie do komórki ssaka i ekspresja wewnątrz niej. Takie formulacje mogą być szczególnie przydatne dla celów terapeutycznych, jak opisano poniżej. Specjalista w tej dziedzinie będzie zdawał sobie sprawę, że istnieje wiele sposobów uzyskania ekspresji polinukleotydu w komórce docelowej i można zastosować dowolną dogodną metodę. Przykładowo, polinukleotyd można wstawić do wektora wirusowego, takiego jak, ale nie ograniczonego do, adenowirusa, wirusa towarzyszącego adenowirusowi, retrowirusa, wirusa krowianki lub innych wirusów ospy (np. ptasi wirus ospy). Techniki wstawiania DNA do takich wektorów są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Wektory retrowirusowe mogą dodatkowo przenosić lub wstawiać gen dla markera selekcyjnego (aby pomóc w identyfikacji lub selekcji transdukowanych komórek) i/lub cząsteczkę kierującą, taką jak gen, który koduje ligand dla receptora na konkretnej komórce docelowej, aby nadać wektorowi specyficzność wobec celu. Kierowanie do celu można również uzyskać przy zastosowaniu przeciwciała, metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Można zastosować konstrukty cDNA w takich wektorach, na przykład do transfekowania ludzkich albo zwierzęcych linii komórkowych w celu ich zastosowania przy tworzeniu modeli nowotworów WT1 dodatnich, które można zastosować do przeprowadzenia doświadczeń z ochroną przed nowotworem i immunoterapią adaptywną w celu wykazania hamowania wzrostu nowotworu albo rozwoju białaczki albo lizy takich komórek.

Inne formulacje terapeutyczne polinukleotydów zawierają koloidalne układy dyspersyjne, takie jak kompleksy makrocząsteczkowe, nanokapsułki, mikrosfery, perełki i układy na bazie lipidów, obejmujące emulsje olej w wodzie, micele, micele mieszane i liposomy. Korzystnym układem koloidalnym do zastosowania jako cząsteczka transportowa in vitro i in vivo jest liposom (tj. sztuczny pęcherzyk błonowy). Przygotowanie i zastosowanie takich układów jest dobrze znane w tej dziedzinie.

Kompozycje immunoterapeutyczne mogą również lub alternatywnie zawierać limfocyty T swoiste wobec WT1. Takie komórki można generalnie uzyskać in vitro albo ex vivo przy zastosowaniu standardowych procedur. Przykładowo, limfocyty T mogą być obecne w (lub izolowane z) szpiku kostnym, krwi obwodowej albo frakcji szpiku kostnego lub krwi obwodowej ssaka, takiego jak pacjent, przy zastosowaniu dostępnego handlowo układu separacji, takiego jak układ CEPRATE™, dostępny z CellPro Inc., Bothell W A (patrz także patent USA nr 5,240,856; patent USA nr 5,215,926; WO 89/06280; WO 91/16116 i WO 92/07243). Alternatywnie, limfocyty T mogą pochodzić od spokrewnionych albo niespokrewnionych ludzi, ssaków innych niż ludzie, linii albo hodowli komórkowych.

Limfocyty T mogą być stymulowane polipeptydem WT1, polinukleotydem kodującym polipeptyd WT1 i/lub komórką prezentującą antygen (APC), która wyraża polipeptyd WT1. Takie stymulacje przeprowadza się w warunkach i przez czas wystarczający do umożliwienia wytwarzania limfocytów T, które są swoiste wobec polipeptydu WT1. Korzystnie polipeptyd albo polinukleotyd WT1 jest obecny wewnątrz dostarczającego go nośnika, takiego jak mikrosfery w celu ułatwienia wytworzenia swoistych wobec antygenu limfocytów T. Limfocyty T, które można izolować od pacjenta albo spokrewnionego lub niespokrewnionego dawcy przy zastosowaniu rutynowych technik (takich jak wirowanie limfocytów z krwi obwodowej w gradiencie gę stości Ficoll/Hypaque), inkubuje się z polipeptydem WT1. Przykł adowo, limfocyty T można inkubować in vitro przez 2-9 dni (typowo 4 dni) w 37°C z polipeptydem WT1 (np. 5 do 25 μg/ml) albo komórkami syntetyzującymi porównywalne ilości polipeptydu WT1. Może być konieczne inkubowanie oddzielnej porcji próbki limfocytów T w nieobecności polipeptydu WT1, która służy jako kontrola.

Uważa się, że limfocyty T są swoiste wobec polipeptydu WT1, jeżeli zabijają komórki docelowe opłaszczone polipeptydem WT1 albo wyrażające gen kodujący taki polipeptyd. Swoistość limfocytów T można ocenić stosując różne standardowe techniki. Przykładowo, w teście uwalniania chromu lub

PL 201 881 B1 teście proliferacji wskaźnik stymulacji dla więcej niż dwukrotnego wzrostu lizy i/lub proliferacji w porównaniu z kontrolami ujemnymi, wskazuje na swoistość limfocytów T. Takie testy można przeprowadzić, na przykład, jak opisano w Chen i wsp., Cancer Res. 54: 1065-1070, 1994. Alternatywnie, wykrywanie proliferacji limfocytów T można przeprowadzić przy zastosowaniu rozmaitych znanych technik. Przykładowo, proliferację limfocytów T można wykryć mierząc wzrost szybkości syntezy DNA (np. przez pulsowe znakowanie hodowli limfocytów T trytowaną tymidyną i mierzenie ilości trytowanej tymidyny włączonej do DNA). Inne sposoby wykrywania proliferacji obejmują mierzenie wzrostu wytwarzania interleukiny 2(IL-2), wypływu Ca²⁺, albo pobierania barwnika, takiego jak 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolium. Alternatywnie, można mierzyć syntezę limfokin (takich jak interferon gamma) albo można oznaczyć względną liczbę limfocytów T, które odpowiadają na polipeptyd WT1.

Kontakt z polipeptydem WT1 (200 ng/ml - 100 μg/ml, korzystnie 100 ng/ml - 25 μg/ml) przez 3-7 dni powinien dawać co najmniej dwukrotny wzrost proliferacji limfocytów T, i/lub kontakt jak opisano powyżej przez 2-3 godziny powinien prowadzić w rezultacie do aktywacji limfocytów T, zmierzonej standardowym testem na cytokiny, w którym dwukrotny wzrost poziomu uwolnienia cytokin (np. TNF lub IFN-γ) jest wskaźnikiem aktywacji limfocytów T (patrz Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)). Swoiste wobec WT1 limfocyty T można namnażać stosując standardowe techniki. Korzystnie, limfocyty T pochodzące bądź od pacjenta, bądź spokrewnionego albo niespokrewnionego dawcy są podawane pacjentowi po stymulacji i namnożeniu.

Limfocytami T, które zostają zaktywowane w odpowiedzi na polipeptyd WT1, polinukleotyd albo APC wyrażające WT1, mogą być CD4⁺ i/lub CD8⁺. Swoistą aktywację limfocytów T CD4⁺ lub CD8⁺można wykrywać różnymi sposobami, które obejmują wykrywanie proliferacji limfocytów T, wytwarzanie cytokin (np. limfokin) albo wytwarzanie aktywności cytolitycznej (tj. wytwarzanie cytotoksycznych limfocytów T swoistych wobec WT1). W przypadku limfocytów T CD4⁺ korzystnym sposobem wykrywania aktywacji swoistych limfocytów T jest wykrywanie proliferacji limfocytów T. W przypadku limfocytów T CD8⁺ korzystnym sposobem wykrywania aktywacji swoistych limfocytów T jest wykrywanie wytwarzania aktywności cytolitycznej.

Dla celów leczniczych, limfocyty T CD4⁺ lub CD8⁺, których proliferacja następuje w odpowiedzi na polipeptyd WT1, polinukleotyd albo APC, można namnażać zarówno in vitro, jak i in vivo. Proliferacji takich limfocytów T in vitro można dokonać różnymi sposobami. Przykładowo, limfocyty T można ponownie wystawić na działanie polipeptydu WT1 z albo bez dodatkowych czynników wzrostowych dla limfocytów T, takich jak interleukina-2 i/lub komórki stymulujące, które syntetyzują polipeptyd WT1. Dodawanie komórek stymulujących jest korzystne przy wytwarzaniu odpowiedzi limfocytów T CD8⁺. Limfocyty T można hodować do dużej ich liczby in vitro z zachowaniem swoistości odpowiedzi na nieciągłą restymulację polipeptydem WT1. Krótko mówiąc, w celu przeprowadzenia pierwotnej stymulacji in vitro (IVS), dużą liczbę limfocytów (np. więcej niż 4 x 10⁷) można umieścić w kolbkach z pożywką zawierającą ludzką surowicę. Polipeptyd WT1 (np. 10 μg/ml) może być dodawany bezpośrednio, łącznie z toksyną tężca (np. 5 μg/ml). Kolby można następnie inkubować (np. 37°C przez 7 dni). W celu przeprowadzenia drugiej IVS, limfocyty T zbiera się następnie i umieszcza w nowych kolbach z 2-3 x 10⁷ napromieniowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej. Polipeptyd WT1 (np. 10 μg/ml) jest dodawany bezpośrednio. Kolby inkubuje się następnie w 37°C przez 7 dni. Dnia 2 i 4 po drugiej IVS, można dodać 2-5 jednostek interleukiny-2 (IL-2). W celu przeprowadzenia trzeciej IVS, limfocyty T można umieścić w studzienkach i stymulować własnymi limfocytami opłaszczonymi peptydem transformowanymi EBV. IL-2 można dodać dnia 2 i 4 każdego cyklu. Wkrótce po wykazaniu, że komórki są swoistymi cytotoksycznymi limfocytami T, można je namnożyć stosując 10-dniowy cykl stymulacji wyższymi dawkami IL-2 (20 jednostek) dnia 2, 4 i 6.

Alternatywnie, jeden lub więcej limfocytów T, które proliferują w obecności polipeptydu WT1, można namnożyć przez klonowanie. Sposoby klonowania komórek są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują ograniczające rozcieńczenie. Odpowiadające limfocyty T można oczyszczać z krwi obwodowej uczulanych pacjentów przez wirowanie w gradiencie gęstości i tworzenie rozet czerwonych ciałek owcy i wyprowadzenie hodowli przez stymulowanie potencjalnym antygenem w obecności napromienionych autologicznych komórek wypełniających. W celu wytworzenia linii limfocytów T CD4⁺jako bodziec antygenowy stosuje się polipeptyd WT1, a autologiczne limfocyty krwi obwodowej (PBL) albo limfoblastoiodalne linie komórkowe (LCL) unieśmiertelnione przez infekcję wirusem Epstein Barr'a stosuje się jako komórki prezentujące antygen. W celu wytworzenia linii limfocytów T CD8⁺, autologiczne prezentujące antygen komórki transfekowane wektorem ekspresyjnym, które wytwarzają polipeptyd WT1 można stosować jako komórki stymulujące. Wyprowadzone linie limfocytów T można

PL 201 881 B1 klonować 2-4 dni po stymulacji antygenem przez wysianie stymulowanych limfocytów T przy gęstości 0,5 komórek na studzienkę w 96-studzienkowych płaskodennych płytkach z 1 x 10⁶ napromienionych komórek PBL lub LCL i zrekombinowanej interleukiny-2 (rIL-2) (50 jedn./ml). Studzienki z ustabilizowanym wzrostem klonalnym można zidentyfikować po około 2-3 tygodniach po wyjściowym wysianiu i restymulować odpowiednim antygenem w obecnoś ci autologicznych prezentuj ą cych antygen komórek, a następnie kolejno namnażać przez dodawanie niskich dawek rIL-2 (10 U/ml) 2-3 dni po stymulacji antygenem. Klony limfocytów T można utrzymywać w 24-studzienkowych płytkach przez okresową restymulację antygenem i rIL-2 raz na około dwa tygodnie.

W niektórych wykonaniach, allogeniczne limfocyty T moż na wzbudzać (tj. uczulać na WT1) in vitro i/lub in vivo. Takie wzbudzenie można uzyskać przez doprowadzenie do kontaktu limfocytów T z polipeptydem WT1, polinukleotydem kodującym taki polipeptyd, albo komórką wytwarzającą taki polipeptyd, w warunkach i w czasie dostatecznym dla wzbudzenia limfocytów T. Na ogół uważa się, że limfocyty T są wzbudzone jeżeli, na przykład, kontakt z polipeptydem WT1 prowadzi do proliferacji i/lub aktywacji limfocytów T, co mierzy się w standardowych opisanych tu testach proliferacji, uwolnienia chromu i/lub uwolnienia cytokin. Współczynnik stymulacji wykazujący ponad dwukrotne zwiększenie proliferacji albo lizy i ponad trzykrotny wzrost poziomu cytokin w porównaniu z kontrolami negatywnymi wskazuje na specyficzność limfocytów T. Komórki wzbudzane in vitro można zastosować, na przykład, w czasie transplantacji szpiku kostnego albo jako infuzję limfocytów dawcy.

W pewnych aspektach ujawnione tu polipeptydy, polinukleotydy, mogą wchodzić w skład kompozycji farmaceutycznych albo szczepionek. Kompozycje farmaceutyczne zawierają jeden lub więcej takich związków i dopuszczalny fizjologicznie nośnik albo zaróbkę. Szczepionki zawierają jeden lub więcej takich związków i niespecyficzny wzmacniacz odpowiedzi immunologicznej, taki jak adiuwant albo liposom (do którego związek jest włączony). Kompozycje farmaceutyczne i szczepionki mogą dodatkowo zawierać układ dostarczania, taki jak biodegradowalne mikrosfery, które są ujawnione, na przykład, w patentach USA nr 4,897,268 i 5,075,109.

Kompozycje farmaceutyczne i szczepionki mogą być przeznaczone do wywoływania odpowiedzi limfocytów T swoistych wobec polipeptydu WT1 u pacjenta, takiego jak człowiek. Szczepionka zawiera niespecyficzny wzmacniacz odpowiedzi immunologicznej, który korzystnie wzmacnia odpowiedź limfocytów T. Wzmacniacz odpowiedzi immunologicznej może zwiększać poziom odpowiedzi limfocytów T na polipeptyd WT1 o wartość, która jest proporcjonalnie większa niż wartość wzmocnienia odpowiedzi przeciwciał. Przykładowo, gdy porównuje się standardowy adiuwant na bazie oleju, taki jak CFA, wzmacniacz odpowiedzi immunologicznej, który preferencyjnie wzmacnia odpowiedź limfocytów T może zwiększać proliferacyjną odpowiedź limfocytów T co najmniej dwukrotnie, odpowiedź lityczną co najmniej o 10% i/lub aktywację limfocytów T co najmniej dwukrotnie w porównaniu z kontrolnymi liniami komórkowymi WT1 ujemnymi, nie wzmacniają c jednocześ nie w sposób wykrywalny odpowiedzi przeciwciał. Wartość wzmocnienia odpowiedzi limfocytów T, albo przeciwciał na polipeptyd WT1 może generalnie być określona przy użyciu dowolnej reprezentatywnej techniki znanej w tej dziedzinie, takiej jak techniki tu dostarczone.

Kompozycja farmaceutyczna lub szczepionka może zawierać DNA kodujący jeden albo więcej opisanych powyżej polipeptydów, takich jak polipeptyd wytworzony in situ. Jak zaznaczono powyżej, DNA może być obecny w dowolnym z różnorodnych układów dostarczania znanych specjalistom w tej dziedzinie, włączając w to układy ekspresji kwasów nukleinowych, bakterie, wirusowe układy ekspresji i ssacze układy ekspresji. Odpowiednie układy ekspresyjne kwasów nukleinowych zawierają sekwencje DNA odpowiednie dla ekspresji u pacjenta (takie jak odpowiedni promotor i sygnał terminacyjny). Bakteryjny układ dostarczania obejmuje podawanie bakterii, takiej jak Bacillus-Calmette-Guerrin), która wyraża immunogenną część polipeptydu na swojej powierzchni. W korzystnym wykonaniu, DNA można wprowadzać przy użyciu wirusowego układu dostarczania (np. wirus krowianki lub inny wirusy ospy, retrowirus lub adenowirus), który może obejmować zastosowanie niepatogennych (defektywnych), zdolnych do replikacji wirusów. Techniki włączania DNA do takich układów ekspresyjnych są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. DNA może być również „nagi” jak opisano przykładowo w Ulmer i wsp., Science 259:1745-1749, 1993 i artykule przeglądowym Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Pobieranie nagiego DNA można zwiększyć przez opłaszczenie DNA na biodegradowalnych kulkach, które są wydajnie transportowane do komórek.

Jak zaznaczono powyżej, kompozycja farmaceutyczna albo szczepionka może zawierać komórkę prezentującą antygen, która wyraża polipeptyd WT1. Dla celów terapeutycznych, jak tu opisano, korzystnie komórką prezentującą antygen jest autologiczna komórka dendrytyczna. Takie komórki

PL 201 881 B1 można otrzymać i transfekować przy użyciu standardowych technik, takich jak te opisane przez Reeves i wsp. Cancer Res. 56:5672-5677, 1996; Tuting i wsp. J. Immunol. 160:1139-1147, 1998 i Nair i wsp. Nature Biotechnol. 16:364-369, 1998. Ekspresja polipeptydu WT1 na powierzchni komórki prezentującej antygen musi być potwierdzona poprzez stymulację in vitro i standardową proliferację, jak również testy uwalniania chromu, jak tu opisano.

Jakkolwiek dowolny nośnik znany specjalistom w tej dziedzinie można zastosować w kompozycjach farmaceutycznych według tego wynalazku, typ nośnika będzie różnił się w zależności od sposobu podawania. Kompozycje według niniejszego wynalazku można sporządzić dla każdego dowolnego odpowiedniego sposobu podawania, włączając w to na przykład podawanie miejscowe, doustne, donosowe, dożylne, wewnątrzczaszkowe, dootrzewnowe, podskórne lub domięśniowe. Przy podawaniu pozajelitowym, takim jak iniekcje podskórne, nośnik korzystnie stanowi woda, sól fizjologiczna, alkohol, tłuszcz, wosk lub bufor. Do podawania doustnego można zastosować dowolny z powyższych nośników lub nośnik stały, taki jak mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sól sodowa sacharyny, talk, celuloza, glukoza, sacharoza i węglan magnezu. W kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku jako nośniki można również zastosować biodegradowalne mikrosfery (np. polimleczan, poliglikolan). Do zastosowań miejscowych korzystne są formulacje, takie jak kremy lub lotiony, w których stosuje się dobrze znane składniki.

Takie kompozycje mogą również zawierać bufory (np. obojętnie buforowaną sól fizjologiczną lub sól fizjologiczną buforowaną fosforanem), węglowodany (np. glukozę, mannozę, sacharozę i dekstrany), mannitol, białka, polipeptydy lub aminokwasy, takie jak glicyna, przeciwutleniacze, związki chelatujące, takie jak EDTA lub glutation, adiuwanty (np. wodorotlenek glinu) i/lub środki konserwujące. Alternatywnie kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być formułowane jako liofilizat. Związki mogą być również zamknięte w liposomach przy użyciu dobrze znanej technologii.

W szczepionkach według wynalazku stosuje się dowolne niespecyficzne wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej, takie jak adiuwanty. Większość adiuwantów zawiera substancję zaprojektowaną tak, aby chroniła antygen przed szybkim katabolizmem, taką jak wodorotlenek glinu albo olej mineralny i stymulatory odpowiedzi immunologicznej, takie jak lipid A, białka pochodzące z Bortadella pertussis lub Mycobacterium tuberculosis. Odpowiednie nieswoiste wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej obejmują adiuwanty oparte na wodorotlenku glinu (np. Alhydrogel, Rehydragel, fosforan glinu, Algammulin, wodorotlenek glinu); adiuwanty oparte na oleju (adiuwant Freunda (FA), Specol, RIBI, TiterMax, Montanide ISA50 lub Seppic MONTANIDE ISA 720; cytokiny (np. GM-CSF albo Iigand-Flat3); mikrosfery; adiuwanty oparte na niejonowych kopolimerach blokowych; adiuwanty oparte na bromku dimetylodioktadecyloamoniowym (DDA) AS-1, AS-2 (Smith Kline Beecham); adiuwanty oparte na systemie adiuwantowym Adjuvant Ribi; QS21 (Aąuila); adiuwanty oparte na saponinie (nieoczyszczona saponina, saponina Quil A); adiuwanty oparte na dipeptydzie muramylowym (MDP), takie jak SAF (adiuwant Syntex w postaci mikrofluidyzowanej (SAF-m); bromek dimetylodioktadecyloamoniowy (DDA); adiuwanty oparte na ludzkim dopełniaczu m vaccae i pochodne, adiuwanty oparte na stymulującym kompleksie immunologicznym (iscom), inaktywowane toksyny i atenuowane czynniki infekcyjne (takie jak M. tuberculosis).

Jak zaznaczono powyżej, w niektórych wykonaniach, wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej są wybrane pod kątem ich zdolności do preferencyjnego wzbudzania albo wzmacniania odpowiedzi limfocytów T (np. CD4⁺ i/lub CD8⁺) na polipeptyd WT1. Takie wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują między innymi Montanide ISA50, Seppic MONTANIDE ISA 720, cytokiny (np. GM-CSF albo Iigand-Flat3), mikrosfery, adiuwanty oparte na bromku dimetylodioktadecyloamoniowym (DDA), AS-1 (Smith Kline Beecham), AS-2 (Smith Kline Beecham); adiuwanty oparte na systemie adiuwantowym Adjuvant Ribi; QS21 (Aquila); adiuwanty oparte na saponinie (nieoczyszczona saponina, saponina Quil A); adiuwant Syntex w postaci mikrofluidyzowanej (SAF-m); MV, ddMV (Genesis), adiuwanty oparte na stymulującym kompleksie immunologicznym (iscom) i inaktywowane toksyny.

Opisane tu kompozycje i szczepionki można podawać jako część preparatu o przedłużonym uwalnianiu (tj. preparatu, takiego jak kapsułka lub gąbka, która powoduje spowolnione uwalnianie składnika po podaniu). Takie preparaty ogólnie można przygotować stosując dobrze znaną technologię i podawać np. przez implantację doustną, doodbytniczą lub podskórną albo przez implantację w żądanym miejscu docelowym. Preparaty o przedł u ż onym uwalnianiu mogą zawierać polipeptyd lub polinukleotyd zawieszone w substancji nośnikowej i/lub zawarte w zbiorniczku otoczonym błoną kontrolującą tempo uwalniania. Nośniki do stosowania w takich formulacjach są akceptowalne biologicznie

PL 201 881 B1 i mogą także być biodegradowalne; korzystnie formulacje zapewniają względnie stałe uwalnianie składnika aktywnego. Ilość składnika aktywnego zawarta w formulacji o przedłużonym uwalnianiu zależy od miejsca implantacji, poziomu i oczekiwanego czasu uwalniania i natury stanu chorobowego, który ma być leczony, lub któremu ma zapobiegać.

Terapia chorób nowotworowych

Kompozycje i szczepionki według wynalazku można stosować do hamowania rozwoju chorób nowotworowych (np. chorób postępujących lub przerzutujących albo chorób charakteryzujących się niewielkim obciążeniem nowotworem, takich jak minimalna choroba szczątkowa). Ogólnie, metody takie można zastosować do zapobiegania, opóźniania lub leczenia choroby związanej z ekspresją WT1. Innymi słowy, dostarczonych sposobów terapeutycznych można użyć do leczenia istniejącej, związanej z WT1 choroby, lub do zapobiegania lub opóźniania pojawienia się takiej choroby u pacjenta, który jest wolny od choroby lub dotkniętego chorobą jeszcze niezwiązaną z ekspresją WT1.

Stosowane tu określenie, że choroba jest „związana z ekpresją WT1” oznacza, że chore komórki (np. komórki nowotworu) w pewnym momencie przebiegu choroby wykazują wykrywalnie wyższe niż normalne komórki tej samej tkanki, poziomy polipeptydu WT1. Związek ekspresji WT1 z chorobami złośliwymi nie wymaga, by WT1 było obecne w nowotworze. Na przykład, nadekspresja WT1 może być włączona w zapoczątkowanie nowotworu, lecz następnie może zostać utracona. Alternatywnie, choroba złośliwa, która nie charakteryzuje się wzrostem ekspresji WT1, może w późniejszym czasie, zmienić się w chorobę charakteryzującą się podwyższoną ekspresją WT1. Zgodnie z tym, chorobę złośliwą, w której chore komórki poprzednio wyrażały, obecnie wyrażają lub oczekuje się, że będą wyrażać podwyższone poziomy WT1, traktuje się jako „związaną z ekspresją WT1”.

Immunoterapię można przeprowadzać stosując każdą z różnorodnych technik, w których niniejszym dostarczone związki działają w celu usunięcia komórek wyrażających WT1 z ciała pacjenta. Usunięcie takie może zajść w wyniku wzmocnienia lub indukcji odpowiedzi immunologicznej u pacjenta, specyficznej dla WT1 lub komórek wyrażających WT1. Alternatywnie, komórki wyrażające WT1 można usunąć ex vivo (np. przez działanie na autologiczny szpik kostny, krew obwodową lub frakcję szpiku kostnego albo krwi obwodowej). Frakcje szpiku kostnego lub krwi obwodowej można otrzymać stosując którąkolwiek ze standardowych technik z dziedziny.

W takich metodach kompozycje farmaceutyczne i szczepionki można podawać pacjentowi. Stosowany tu termin „pacjent” odnosi się do dowolnego zwierzęcia ciepłokrwistego, korzystnie człowieka. Pacjent może lub nie, być dotknięty złośliwą chorobą. A zatem, powyższe kompozycje farmaceutyczne i szczepionki można wykorzystać do zapobiegania zachorowaniu (tj. profilaktycznie) lub do leczenia pacjenta dotkniętego chorobą (np. do zapobiegania lub opóźniania postępu i/lub przerzutowania istniejącej choroby). Pacjent dotknięty chorobą może mieć minimalną chorobę szczątkową (np. niskie obciążenie nowotworem u pacjentów białaczkowych w stanie całkowitej lub częściowej remisji albo pacjentów z rakiem po zmniejszeniu obciążenia nowotworem po zabiegu chirurgicznym, radioterapii i/lub chemioterapii). Takiego pacjenta można immunizować, by zahamować nawrót (tj. zapobiec lub opóźnić nawrót lub obniżyć ostrość nawrotu). W pewnych korzystnych wykonaniach, leczy się pacjenta cierpiącego na białaczkę (np. AML, CML, ALL lub dziecięcą ALL), zespół mielodysplastyczny (MDS) lub nowotwór (np. żołądkowojelitowy, płuc, tarczycy, rak sutka lub czerniak), gdy nowotwór i białaczka są WT1 dodatnie (tj. wykrywalnie reagują z przeciwciałem przeciw WT1 lub wyrażają mRNA WT1 na poziomie wykrywalnym przez RT-PCR, jak niniejszym opisano) lub cierpiącego na chorobę autoimmunologiczną skierowaną przeciw komórkom wyrażającym WT1.

Kompozycje według wynalazku można stosować same lub w kombinacji z konwencjonalnymi trybami postępowania terapeutycznego, takimi jak zabieg chirurgiczny, naświetlania, chemioterapia i/lub przeszczep szpiku kostnego (autologiczny, syngeniczny, allogeniczny lub niespokrewniony). Jak poniżej szczegółowo omówiono, czynniki wiążące i limfocyty T, przygotowane jak tu opisano, można wykorzystać do oczyszczenia autologicznych komórek macierzystych. Oczyszczanie takie może być korzystne przed, na przykład, transplantacją szpiku kostnego lub transfuzją krwi albo jej składników. Czynniki wiążące, limfocyty T, komórki prezentujące antygen (APC, ang. antigen presenting cells) i kompozycje niniejszym dostarczone można następnie wykorzystać do namnożenia i stymulacji (lub wzbudzenia) autologicznych, allogenicznych, syngenicznych lub niezwiązanych limfocytów T WT1-specyficznych in vitro i/lub in vivo. Takie limfocyty T WT1-specyficzne można wykorzystać, na przykład w infuzji limfocytów dawców.

Drogi i częstość podawania ujawnionych tu kompozycji terapeutycznych, jak też dawkowanie będą różnić się w zależności od osobnika i można je bez trudu ustalić stosując standardowe techniki.

PL 201 881 B1

Ogólnie, kompozycje farmaceutyczne i szczepionki można podawać przez iniekcję (np. śródskórną, domięśniową, dożylną lub podskórną), donosowo (np. przez aspirację) lub doustnie. W niektórych nowotworach, kompozycje farmaceutyczne można podawać miejscowo (przez, na przykład, rektokolonoskopię, gastroskopię, wideoendoskopię, angiografię lub innymi metodami znanymi w tej dziedzinie). Korzystnie, 1 do 10 dawek można podać w okresie 52 tygodni. Korzystnie 6 dawek podaje się w odstępach 1 miesiąca, a szczepienia przypominające można podawać okresowo póź niej. Dla pojedynczych pacjentów mogą być odpowiednie odmienne protokoły. Odpowiednią dawką jest ilość składnika, która, gdy jest podawana jak opisano wyżej, ma zdolność wzmacniania odpowiedzi immunologicznej przeciw guzowi, która jest przynajmniej 10-50% powyżej poziomu podstawowego (tj. przy braku leczenia). Taką odpowiedź można monitorować przez pomiar przeciwciał przeciw nowotworowi u pacjenta lub przez zależne od szczepionki powstawanie cytolitycznych komórek efektorowych zdolnych do zabijania komórek nowotworu pacjenta in vitro. Takie szczepionki powinny także mieć zdolność wywoływania odpowiedzi odpornościowej prowadzącej do poprawy rezultatu klinicznego (np. częstszych pełnych lub częściowych remisji, dłuższego przeżycia bez choroby i/lub całkowitego przeżycia) u pacjentów szczepionych w porównaniu do pacjentów nieszczepionych. Ogólnie, dla kompozycji farmaceutycznych i szczepionek zawierających jeden lub więcej polipeptydów, ilość każdego polipeptydu obecna w dawce zmienia się od około 100 μg do 5 mg. Odpowiednie wielkości dawki będą zmieniać się w zależności od wagi pacjenta lecz typowo będą w zakresie od około 0,1 ml do około 5 ml.

Ogólnie odpowiedni tryb dawkowania i leczenie dostarcza aktywnego składnika(ów) w ilości wystarczającej do wywołania korzyści terapeutycznej i/lub profilaktycznej. Taką odpowiedź można śledzić przez ustalenie polepszania się rezultatu klinicznego (np. częstszych pełnych lub częściowych remisji, dłuższego przeżycia bez choroby i/lub całkowitego przeżycia) u pacjentów leczonych w porównaniu do pacjentów nieleczonych. Wzrost wcześniej istniejącej odpowiedzi immunologicznej na WT1 generalnie koreluje z poprawianiem się rezultatów klinicznych. Takie odpowiedzi immunologiczne można na ogół ocenić stosując standardowe oznaczenia proliferacji, cytotoksyczności lub cytokin, które można przeprowadzić z próbkami otrzymanymi od pacjentów przed i po leczeniu.

Metody hamowania rozwoju choroby złośliwej związanej z ekspresją WT1 obejmują też podawanie autologicznych limfocytów T aktywowanych tak, by odpowiadały na polipeptyd WT1 lub wyrażające WT1 komórki APC, jak opisano wyżej. Takie limfocyty T mogą być CD4⁺ i/lub CD8⁺ i można je namnażać jak opisano powyżej. Limfocyty T można podawać pojedynczemu pacjentowi w ilości skutecznie hamującej rozwój choroby złośliwej. Typowo, około 1 x 10⁹ do 1 x 10¹¹ limfocytów T/m² podaje się dożylnie, dojamowo albo do łożyska wyciętego guza. Oczywistym będzie dla specjalistów w dziedzinie, że liczba komórek i częstość podawania zależeć będą od odpowiedzi pacjenta.

Według pewnych wykonań, limfocyty T można stymulować przed autologiczną transplantacją szpiku kostnego. Taka stymulacja może zachodzić in vivo lub in vitro. Do stymulacji in vitro, szpik kostny i/lub krew obwodową (albo frakcje szpiku kostnego lub krwi obwodowej) otrzymane od pacjenta można kontaktować z polipeptydem WT1, polinukleotydem kodującym polipeptyd WT1 i/lub komórkami APC wyrażającymi polipeptyd WT1 w warunkach i przez czas wystarczający do umożliwienia stymulacji limfocytów T jak opisano wyżej. Szpik kostny, komórki macierzyste krwi obwodowej i/lub limfocyty T WT1-swoiste można następnie podawać pacjentowi stosując standardowe techniki.

Według pokrewnych wykonań, limfocyty T od spokrewniownego lub niespokrewnionego dawcy można stymulować syngenicznym lub allogenicznym (spokrewnionym lub niespokrewnionym) przeszczepem szpiku kostnego. Taka stymulacja może zachodzić in vivo lub in vitro. Do stymulacji in vitro, szpik kostny i/lub krew obwodową (albo frakcje szpiku kostnego lub krwi obwodowej) otrzymane od pacjenta można kontaktować z polipeptydem WT1, polinukleotydem kodującym polipeptyd WT1 i/lub komórkami APC wyrażającymi polipeptyd WT1 w warunkach i przez czas wystarczający do umożliwienia stymulacji limfocytów T jak opisano wyżej. Szpik kostny, komórki macierzyste krwi obwodowej i/lub limfocyty T WT1-swoiste można następnie podawać pacjentowi stosując standardowe techniki.

W innych wykonaniach, limfocyty T WT1-swoiste, jak niniejszym opisano, można wykorzystać do usunięcia komórek wyrażających WT1 z autologicznego szpiku kostnego, krwi obwodowej lub frakcji szpiku kostnego lub krwi obwodowej (np. wzbogaconej przed podaniem pacjentowi w CD34⁺ krwi obwodowej (PB, peripheral blood). Metody takie można przeprowadzać przez kontaktowanie szpiku kostnego lub PB, z takimi limfocytami T w warunkach i przez czas wystarczający do umożliwienia obniżenia komórek wyrażających WT1 do mniej niż 10%, korzystnie mniej niż 5% i bardziej korzystnie do mniej niż 1% całkowitej liczby komórek mieloidalnych lub limfatycznych w szpiku kostnym lub krwi obwodowej. Granicę, do której udało się usunąć takie komórki, można łatwo ustalić standardowymi

PL 201 881 B1 metodami, takimi jak na przykład, jakościowa i ilościowa analiza PCR, morfologia, immunohistochemia i analiza FACS. Szpik kostny lub PB (albo ich frakcje) można następnie podać pacjentowi stosując standardowe metody.

Metody diagnostyczne

Niniejszym opisano metody wykrywania złośliwej choroby związanej z ekspresją WT1 i monitorowania skuteczności immunizacji lub leczenia takiej choroby. Metody takie oparto na stwierdzeniu że odpowiedź odpornościową swoistą dla białka WT1 można wykryć u pacjentów cierpiących na takie choroby i że metody wzmacniające takie odpowiedzi odpornościowe mogą zapewnić korzyści zapobiegawcze lub lecznicze.

W celu ustalenia obecności lub braku choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1, pacjenta można przebadać pod kątem limfocytów T swoistych dla WT1. W pewnych metodach próbkę biologiczną zawierającą limfocyty T CD4⁺ i/lub CD8⁺ izolowane od pacjenta inkubuje się z polipeptydem WT1, polinukleotydem kodującym polipeptyd WT1 i/lub komórkami APC wyrażającymi polipeptyd WT1 i wykrywa się obecność lub brak specyficznej aktywacji limfocytów T jak niniejszym opisano. Odpowiednie próbki biologiczne obejmują, ale nie są ograniczone do wyizolowanych limfocytów T. Na przykład limfocyty T można izolować od pacjenta rutynowymi technikami (takimi jak wirowanie limfocytów z krwi obwodowej w gradiencie gęstości Ficoll/Hypaque). Limfocyty T można inkubować in vitro przez 2-9 dni (typowo 4 dni) w 37°C z polipeptydem WT1 (np. 5-25 μg/ml). Może być konieczne inkubowanie następnej objętości próbki limfocytów T bez polipeptydu WT1 jako kontroli. Dla limfocytów T CD4⁺ aktywację korzystnie wykrywa się przez ocenę proliferacji limfocytów T. Dla komórek CD8⁺, aktywację korzystnie wykrywa się przez ocenę aktywności cytolitycznej. Poziom proliferacji przynajmniej dwa razy większy i/lub poziom aktywności cytolitycznej przynajmniej o 20% większy niż u zdrowych pacjentów wskazuje na obecność choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1. Następnie można dokonać korelacji stosując metody dobrze znane w dziedzinie, pomiędzy poziomem proliferacji i/lub aktywnością cytolityczną i przewidywaną odpowiedzią na terapię. W szczególności, można oczekiwać, że pacjenci przejawiający wyższą odpowiedź przeciwciał, proliferacyjną i/lub lityczną wykażą większą odpowiedź na terapię.

Według innych metod, w próbce biologicznej otrzymanej od pacjenta oznacza się poziom przeciwciał specyficznych dla WT1. Próbkę biologiczną inkubuje się z polipeptydem WT1, polinukleotydem kodującym polipeptyd WT1 i/lub komórkami APC wyrażającymi polipeptyd WT1 w warunkach i przez czas odpowiedni dla utworzenia kompleksów immunologicznych. Kompleksy immunologiczne utworzone między polipeptydem WT1 i przeciwciałami w próbce biologicznej swoiście wiążą polipeptyd WT1 i są następnie wykrywane. Próbką biologiczną do wykorzystania w obrębie takich metod może być jakakolwiek próbka uzyskana od pacjenta, o której sądzi się, że zawiera przeciwciała. Odpowiednie próbki biologiczne obejmują krew, surowice, płyn z puchliny brzusznej, szpik kostny, wysięk opłucnowy i płyn mózgowo-rdzeniowy.

Próbkę biologiczną inkubuje się z polipeptydem WT1 w mieszaninie reakcyjnej w warunkach i przez czas wystarczający dla utworzenia kompleksów immunologicznych między polipeptydem a przeciwciałami swoistymi dla WT1. Na przykład, próbkę biologiczną i polipeptyd WT1 można inkubować w 4°C przez 24-48 godzin.

Po inkubacji mieszaninę reakcyjną bada się na obecność kompleksów immunologicznych. Wykrywanie kompleksów immunologicznych utworzonych między polipeptydem WT1 i przeciwciałami obecnymi w próbce biologicznej można przeprowadzić różnymi znanymi technikami, takimi jak radioimmuno-oznaczenie (RIA, ang. radioimmunoassay) i ELISA (ang. enzyme linked immunosorbent assay). Odpowiednie oznaczenia są dobrze znane i wyczerpująco opisane w literaturze naukowej i patentowej (np. Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Oznaczenia, które można zastosować, obejmują, lecz nie wyłącznie, immunotest, taki jak test kanapkowy z dwoma monoklonalnymi przeciwciałami David i wsp. (patent USA 4,376,110); test kanapkowy z przeciwciałem monoklonalnym-poliklonalnym (Wide i wsp. w Kirkham i Hunter, wyd., Radioimmunoassay Methods, E. i S. Livingstone, Edinburgh, 1970); metodę „western blot” według Gordon i wsp. (Patent USA 4.452.901) immunoprecypitację znakowanym ligandem (Brown i wsp., J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980); test ELISA jak opisano, na przykład, w Raines i Ross (J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982); techniki immunocytochemiczne obejmujące wykorzystanie fluorochromów (Brooks i wsp., Clin. Exp. Immunol. 39:477, 1980) i neutralizacji aktywności (Bowen-Pope i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400, 1984). Inne oznaczenia immunologiczne obejmują między innymi

PL 201 881 B1 opisane w patentach USA nr: 3,817,827, 3,850,752, 3,901,654, 3,935,074, 3,984,533, 3,996,345, 4,034,074 i 4,098,876.

W celu wykrywania polipeptyd WT1 moż e być znakowany lub nieznakowany. Nieznakowany polipeptyd WT1 można zastosować w oznaczeniach aglutynacji lub w połączeniu ze znakowanymi odczynnikami do wykrywania, które wiążą się z kompleksem immunologicznym (np. anty-immunoglobina, białko G, białko A lub lektyna i przeciwciała drugorzędowe albo ich fragmenty wiążące antygen, zdolne do wiązania się z przeciwciałami swoiście wiążącymi się z polipeptydem WT1). Jeśli polipeptyd WT1 jest znakowany, grupą wskaźnikową może być każda odpowiednia grupa wskaźnikowa znana w dziedzinie, obejmująca izotopy radioaktywne, grupy fluorescencyjne, grupy luminescencyjne, enzymy, biotynę i cząstki barwnika.

W pewnych oznaczeniach, nieznakowany polipeptyd WT1 unieruchamia się na podł o ż u stał ym. Podłożem stałym może być dowolny materiał znany specjalistom w dziedzinie, do którego można przyczepić polipeptyd. Na przykład, stałym podłożem może być studzienka w płytce mikrotitracyjnej lub nitroceluloza albo inna odpowiednia błona. Alternatywnie, podłożem może być kulka lub krążek, z takiego materiału jak szkło, włókno szklane, lateks lub tworzywo sztuczne, takie jak polistyren lub polichlorek winylu. Podłożem może także być cząstka magnetyczna lub sensorowe włókno optyczne, takie jak ujawnione np. w patencie USA Nr 5,359,681. Polipeptyd można unieruchamiać na podłożu stałym stosując liczne techniki znane specjalistom w tej dziedzinie, obszernie opisane w literaturze patentowej i naukowej. W kontekście niniejszego wynalazku termin „unieruchomienie” odnosi się zarówno do wiązania niekonwalencyjnego, takiego jak adsorpcja, jak i wiązania kowalencyjnego (które może być bezpośrednim połączeniem między antygenem i grupami funkcjonalnymi na podłożu lub połączeniem za pomocą czynnika sieciującego). Korzystne jest unieruchomienie przez adsorpcję do studzienki na płytce mikrotitracyjnej lub do błony. W takich przypadkach adsorpcję można osiągnąć przez kontaktowanie polipeptydu WT1, w odpowiednim buforze, z podłożem stałym przez odpowiedni czas. Czas kontaktu zmienia się z temperaturą lecz typowo wynosi około 1 godzinę do około 1 dnia. Na ogół kontakt studzienki w płytce mikrotitracyjnej (takiej jak polistyrenowa lub z polichlorku winylu) z iloś cią polipeptydu w zakresie od okoł o 10 ng do okoł o 10 μ g i korzystnie okoł o 100 ng do okoł o 1 μg, jest wystarczający do unieruchomienia odpowiedniej ilości polipeptydu.

Po unieruchomieniu pozostałe miejsca wiązania białka na podłożu są typowo blokowane. Można zastosować dowolny czynnik blokujący znany specjalistom w tej dziedzinie, taki jak albumina surowicy bydlęcej czy Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), inaktywowana termicznie normalna surowica kozia (NGS, ang. normal goat serum) lub BLOTTO (buforowany roztwór odtłuszczonego mleka zawierający również konserwant, sole i czynniki przeciwpieniące). Podłoże następnie inkubuje się z próbką biologiczną podejrzewaną o obecność specyficznego przeciwciała. Próbkę można stosować jako taką, lub częściej rozcieńczoną, zwykle w roztworze buforowanym zawierającym niewielką ilość (0,1% - 0,5% wagi) białka, takiego jak BSA, NGS lub BLOTTO. Ogólnie odpowiedni czas kontaktu (tj. czas inkubacji) jest czasem wystarczającym do wykrycia obecności przeciwciała specyficznie wiążącego WT1 w próbce zawierającej takie przeciwciało. Korzystnie, czas kontaktu jest wystarczający do osiągnięcia poziomu wiązania wynoszącego przynajmniej około 95% osiąganego przy równowadze między związanym i niezwiązanym przeciwciałem. Specjaliści w dziedzinie zorientują się, że czas niezbędny do osiągnięcia równowagi można łatwo ustalić przez oznaczenie poziomu wiązania osiąganego w pewnym czasie. W temperaturze pokojowej czas inkubacji około 30 minut jest zwykle wystarczający.

Niezwiązaną próbkę można następnie usunąć przez przepłukanie podłoża stałego odpowiednim buforem, takim jak PBS, zawierający 0,1% Tween 20™. Można następnie dodać reagent wykrywający wiążący się z kompleksem immunologicznym, który zawiera grupę wskaźnikową. Reagent wykrywający inkubuje się z kompleksem immunologicznym przez czas wystarczający do wykrycia związanego polipeptydu. Potrzebny czas można ogólnie ustalić przez oznaczenie poziomu wiązania osiąganego w pewnym czasie. Niezwiązany reagent wykrywający usuwa się następnie, a związany reagent wykrywający wykrywa się przy użyciu grupy wskaźnikowej. Metoda wykorzystana do wykrycia grupy wskaźnikowej zależy od natury tej grupy. Dla grup radioaktywnych, na ogół odpowiednie jest zliczanie scyntylacyjne lub metody autoradiograficzne. Metod spektroskopowych można użyć do wykrycia barwników, grup luminescencyjnych i fluorescencyjnych. Biotynę można wykryć przy użyciu awidyny sprzężonej z inną grupą wskaźnikową (zwykle grupą radioaktywną lub fluorescencyjną albo enzymem). Enzymatyczne grupy wskaźnikowe (np. peroksydaza z chrzanu, beta-galaktozydaza, alkaliczna fosfataza i oksydaza glukozowa) można zazwyczaj wykrywać przez dodanie substratu (na ogół

PL 201 881 B1 przez określony czas), po którym przeprowadza się spektroskopową lub inną analizę produktów reakcji. Niezależnie od zastosowanej metody, poziom związanego reagenta wykrywającego, który jest przynajmniej dwukrotnie wyższy niż tło (tj. poziom obserwowany dla próbki biologicznej otrzymanej od wolnego od choroby osobnika) wskazuje na obecność choroby nowotworowej związanej z ekspresją WT1.

Ogólnie, metody monitorowania skuteczności immunizacji lub leczenia obejmują monitorowanie u pacjenta zmian w poziomie przeciwciał lub limfocytów T swoistych dla WT1. Metody, w których poziomy przeciwciał są monitorowane, mogą obejmować etapy: (a) inkubacji pierwszej próbki biologicznej otrzymanej od pacjenta przed leczeniem lub immunizacją polipeptydem WT1, przeprowadzonej w warunkach i przez czas wystarczający do utworzenia się kompleksu immunologicznego; (b) wykrywania kompleksów immunologicznych utworzonych między polipeptydem WT1 i przeciwciałami w próbce biologicznej specyficznie wiążącej się z polipeptydem WT1; (c) powtarzania etapów (a) i (b) z drugą próbką biologiczną pobraną od pacjenta po leczeniu lub immunizacji; i (d) porównania liczby kompleksów immunologicznych wykrywanych w pierwszej i drugiej próbce biologicznej. Alternatywnie, zamiast polipeptydu WT1 można wykorzystać polinukleotyd kodujący polipeptyd WT1, albo komórkę APC wyrażającą polipeptyd WT1. W takich metodach, w próbce biologicznej wykrywa się kompleksy immunologiczne między polipeptydem WT1 kodowanym przez polinukleotyd lub wyrażanym przez komórki APC i przeciwciałami.

Metody, w których aktywacja limfocytów T i/lub liczba prekursorów swoistych dla WT1 są monitorowane, mogą obejmować etapy: (a) inkubacji pierwszej próbki biologicznej zawierającej limfocyty CD4⁺ i/lub CD8⁺ (np. szpik kostny, krew obwodowa lub ich frakcje), otrzymanej od pacjenta przed leczeniem lub immunizacją polipeptydem WT1, przeprowadzonej w warunkach i przez czas wystarczający do specyficznej aktywacji, proliferacji i/lub lizy limfocytów T; (b) wykrywania poziomu aktywacji, proliferacji i/lub lizy limfocytów T; (c) powtarzania etapów (a) i (b) z drugą próbką biologiczną zawierającą limfocyty T CD4⁺ i/lub CD8⁺ i pobraną od tego samego pacjenta po leczeniu lub immunizacji; oraz (d) porównania poziomu aktywacji, proliferacji i/lub lizy limfocytów T w pierwszej i drugiej próbce biologicznej. Alternatywnie, zamiast polipeptydu WT1 można wykorzystać polinukleotyd kodujący polipeptyd WT1, albo komórkę APC wyrażającą polipeptyd WT1.

Próbką biologiczną do wykorzystania w takich metodach może być każda próbka otrzymana od pacjenta, o której sądzi się, że zawiera przeciwciała, limfocyty T CD4⁺ i/lub limfocyty T CD8⁺. Odpowiednie próbki biologiczne obejmują krew, surowice, płyn z puchliny brzusznej, szpik kostny, wysięk opłucnowy i płyn mózgowo-rdzeniowy. Pierwszą próbkę biologiczną można otrzymać przed rozpoczęciem leczenia lub immunizacji albo w czasie leczenia lub trybu szczepień. Drugą próbkę biologiczną powinno się otrzymać w podobny sposób, ale w czasie następującym po dodatkowym leczeniu lub immunizacji. Drugą próbkę biologiczną można otrzymać po zakończeniu lub w czasie leczenia lub immunizacji, pod warunkiem, że przynajmniej część leczenia lub immunizacji zachodzi między izolacją pierwszej i drugiej próbki biologicznej.

Etapy inkubacji i wykrywania dla obu próbek można ogólnie przeprowadzić jak opisano powyżej. Statystycznie istotny wzrost liczby kompleksów immunologicznych w próbce drugiej względem próbki pierwszej odzwierciedla skuteczne leczenie lub immunizację.

Następujące przykłady podane są w celu ilustracji a nie ograniczenia.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Wykrywanie odpowiedzi odpornościowej na WT1 u pacjentów z nowotworami złośliwymi krwi

Przykład ten ilustruje wykrywanie istniejącej odpowiedzi odpornościowej u pacjentów z nowotworami złośliwymi krwi.

W celu wykrycia obecności istniejącej wcześniej swoistej odpowiedzi przeciwciał WT1, surowice pacjentów z AML, ALL, CML oraz anemiami aplastycznymi analizowano stosując technikę Western blot. Surowice analizowano również pod względem zdolności do immunoprecypitacji WT1 z ludzkiej linii komórek białaczki K562 (American Type Culture Collection, Manassas, VA). W każdym z przypadków, immunoprecypitaty rozdzielano elektroforezą w żelu, przenoszono na błonę i inkubowano z przeciwciałem anty WT 1, WT180 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Ta analiza Western blot, pozwoliła na identyfikację potencjalnych przeciwciał skierowanych przeciwko WT1 u pacjentów z nowotworami złośliwymi krwi. Reprezentatywny Western blot, pokazujący wyniki dla pacjenta z AML, przedstawiono na Fig. 2. Wykryte białko o masie 52 u w immunoprecypitacie, wytworzonym przy użyciu surowicy pacjenta, było rozpoznane przez przeciwciało specyficzne dla WT1. Białko o masie 52 u, migrowało tak samo jak kontrola dodatnia.

PL 201 881 B1

P r z y k ł a d 2

Indukcja wytwarzania przeciwciał anty WT1 u myszy intmunizowanych liniami komórkowymi wyrażającymi WT1

Przykład przedstawia zastosowanie komórek wyrażających WT1 do indukowania swoistej odpowiedzi przeciwciał wobec WT1 in vivo.

Wykrycie istniejących przeciwciał wobec WT1 u pacjentów chorych na białaczkę, silnie sugerowało możliwość immunizacji w stosunku do białka WT1, w celu wywołania odporności na WT1. W celu sprawdzenia, czy odporność na WT1 może być wywołana przez szczepienie, myszy szczepiono komórkami TRAMP-C, które są nowotworową linią komórkową pochodzącą od B6, wyrażającą WT1. Samce myszy B6 szczepiono podskórnie 5 x 10⁶ komórek TRAMP-C, po czym przypominano dwukrotnie dawką po 5 x 10⁶ komórek w odstępach 3-tygodniowych. Trzy tygodnie po ostatniej immunizacji, otrzymano surowicę zawiesiny pojedynczych komórek śledziony przygotowano w pożywce RPMI 1640 (Gibco) z 25 μM β-2-merkaptoetanolem, 200 jednostkami penicyliny na ml, 10 mM L-glutaminy i 10% płodową surowicą bydlęcą.

Po immunizacji komórkami TRAMP-C, u immunizowanych zwierząt wykrywano odpowiedź przeciwciał swoistych wobec WT1. Reprezentatywny filtr z Western blot, przedstawiono na Fig. 3. Wyniki te pokazują, że immunizacja wobec białka WT1, może doprowadzić do wywołania odpowiedzi odpornościowej na białko WT1.

P r z y k ł a d 3

Wywołanie odpowiedzi limfocytów Th i przeciwciał u myszy immunizowanych peptydami WT1

Przykład przedstawia możliwość wywołania swoistej odpowiedzi przeciw WT1 przez immunizację peptydami WT1.

Peptydy odpowiednie do wywołania odpowiedzi, polegającej na wzmożonej proliferacji limfocytów T oraz odpowiedzi przeciwciał, zidentyfikowano w oparciu o program TSites (Rothbard i Taylor, EMBO J., 7:93-100, 1988; Deavin i wsp., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996). Program TSites wyszukuje motywy peptydowe, mające zdolność do wywoływania odpowiedzi limfocytów Th. Peptydy, pokazane w Tabeli 1, zsyntetyzowano i poddano sekwencjonowaniu.

T a b e l a 1 Peptydy WT1

Peptyd	Sekwencja	Uwagi
Mysz: p6-22	RDLNALLPAVSSLGGGG (Id. Sekw. Nr: 13)	1 różnica w stosunku do ludzkiej sekwencji WT1
Człowiek: p6-22	RDLNALLPAVPSLGGGG (Id. Sekw. Nr: 1)
Człowiek/mysz: p117-139	PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (Id. Sekw. Nr: 2 i 3)
Mysz: p244-262	GATLKGMAAGSSSSVKWTE (Id. Sekw. Nr: 14)	1 różnica w stosunku do ludzkiej sekwencji WT1
Człowiek: p244-262	GATLKGVAAGSSSSVKWTE (Id. Sekw. Nr: 4)
Człowiek/mysz: p287-301	RIHTHGVFRGIQDVR (Id. Sekw. Nr: 15 i 16)
Mysz: p299-313	VRRVSGVAPTLVRS (Id. Sekw. Nr: 17)	1 różnica w stosunku do ludzkiej sekwencji WT1
Człowiek/mysz: p421-435	CQKKFARSDELVRHH (Id. Sekw. Nr: 19 i 20)

Przy immunizacji peptydy grupowano w następujący sposób:

Grupa A

Grupa B

Grupa kontrolna Grupa kontrolna

6-22 człowiek: 10,9 mg w 1 ml (10 μl = 100 pg) p117-139 człowiek/mysz: 7,6 mg w 1 ml (14 μl = 100 pg) p244-262 człowiek: 4,6 mg w 1 ml (22 μl = 100 pg) p287-301 człowiek/mysz: 7,2 mg w 1 ml (14 μl = 100 pg) mysz p299-313: 6,6 mg w 1 ml (15 μl = 100 pg) p421-435 człowiek/mysz: 3,3 mg w 1 ml (30 μl = 100 pg) (peptyd FBL 100 pg) + CFA/IFA (peptyd CD45 100 pg) + CFA/IFA

PL 201 881 B1

Grupa A zawierała peptydy obecne w aminokońcowej części białka WT1 (ekson 1), grupa B natomiast zawierała peptydy z końca karboksy białka, który zawierał region z czterema palcami cynkowymi o sekwencji holomolgicznej do innych białek wiążących DNA. W grupie B, p287-301 i p299-313 pochodziło z eksonu 7 (motyw palca cynkowego 1) i p421-435 pochodziło z eksonu 10 (motyw palca IV).

Myszy B6 immunizowano grupami peptydów WT1 lub peptydami kontrolnymi. Przed wstrzyknięciem peptydy rozpuszczano w 1 ml sterylnej wody, myszy B6 immunizowano trzykrotnie z 3-tygodniowymi odstępami. Używano następujących adiuwantów: CFA/IFA, GM-CSF i Montinide. Obecność przeciwciał swoistych wobec WT1 wykrywano zgodnie z opisami z przykładów 1 i 2. Odpowiedź limfocytów T badano standardowym testem z wykorzystaniem inkorporacji tymidyny. Komórki hodowano w obecności antygenu, mierząc ich proliferację na podstawie ilości włączonej radioaktywnej tymidyny (Chen i wsp., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994). Konkretnie, limfocyty hodowano na 96-studzienkowej płytce w gęstości 2 x 10⁵ komórek na studzienkę z 4x10⁵ napromienionych (3000 radów) komórek śledziony i odpowiednim peptydem.

Immunizacja myszy peptydami grupy oznaczonej jako Grupa A wywołała odpowiedź przeciwciał wobec WT1 (Fig. 4). Nie wykryto przeciwciał po immunizacji szczepionką B, co pozostaje w zgodzie z brakiem odpowiedzi pomocniczych limfocytów T na immunizację tą samą szczepionką. P117-139 wywołał odpowiedzi limfocytów T (Fig. 5A-5C). Wskaźniki stymulacji (SI) były w zakresie 8-72. Inne peptydy (P6-22 i P299-313) również wywołały odpowiedzi proliferacyjne limfocytów T. Przy immunizacji peptydem P6-22 wskaźnik stymulacji wynosił 2,3, zaś przy immunizacji peptydem P299-313 SI wynosił 3,3. Jako kontrole dodatnie stosowano stymulowanie limfocytów T ConA, jak również dobrze znanymi antygenami (np. CD45 i FBL) oraz allogenicznymi limfocytami T (DeBruijn i wsp., Eur. J. Immunol. 21:2963-2970, 1991).

Na Fig. 6A i 6B przedstawiono proliferacyjną odpowiedź limfocytów T zaobserwowaną dla każdego z trzech peptydów w szczepionce A (Fig. 6A) i w szczepionce B (Fig. 6B). Szczepionka A wywołała proliferacyjną odpowiedź limfocytów T na immunizację peptydami p6-22 i p117-139, gdzie wskaźniki stymulacji (SI) wahały się pomiędzy 3 i 8. Nie wykryto odpowiedzi proliferacyjnej w przypadku peptydu p244-262 (Fig. 6A).

Kolejne stymulacje in vitro przeprowadzono jako stymulacje dla pojedynczych peptydów, używając tylko p6-22 i p117-139. Stymulacja swoistej linii limfocytów T szczepionką A z p117-139 wywołała proliferację, podczas gdy nie zaobserwowano odpowiedzi na p6-22 (Fig. 7A). Klony otrzymane z wyżej wymienionej linii były swoiste dla p117-139 (Fig. 7B). W przeciwieństwie, stymulacja swoistej linii limfocytów T szczepionką A z p6-22 wywołała proliferację, podczas gdy nie zaobserwowano odpowiedzi na p117-139 (Fig. 7C). Klony otrzymane z wyżej wymienionej linii były swoiste dla p6-22 (Fig. 7D).

Powyższe wyniki świadczą, że szczepienie peptydami WT1 może wywołać odpowiedź przeciwciał na białko WT1 oraz proliferacyjną odpowiedź limfocytów T na immunizowanie peptydami.

P r z y k ł a d 4

Wywołanie odpowiedzi CTL u myszy immunizowanych peptydami WT1

Przykład przedstawia zdolność peptydów WT1 do wywoływania odpowiedzi CTL.

Peptydy (złożone z 9 aminokwasów) z odpowiednimi motywami wiążącymi MHC klasy I, zidentyfikowano przy wykorzystaniu analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA (Parker i ws., J. Immunol. 152:163, 1994). Peptydy zidentyfikowane taką analizą przedstawiono w Tabelach II - XLIV. W każdej z tabel, wynik określa teoretyczne powinowactwo wiązania (czas połowicznej dysocjacji) peptydu do cząsteczek MHC.

Peptydy zidentyfikowano przy użyciu programu TSites (Rothbard i Taylor, EMBO J., 7:93-100, 1988; Deavin i wsp., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996), który wyszukuje motywy peptydowe, mające zdolność do wywoływania odpowiedzi limfocytów pomocniczych Th. Peptydy pokazano na Fig. 8A i 8B i w Tabeli XLV.

PL 201 881 B1

T a b e l a II

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA A1

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	137	CLESQPAIR (Id. Sekw. Nr: 47)	18,000
2	80	GAEPHEEQC (Id. Sekw. Nr: 87)	9,000
3	40	FAPPGASAY (Id. Sekw. Nr: 74)	5,000
4	354	QCDFKDCER (Id. Sekw. Nr: 162)	5,000
5	2	GSDVRDLNA (Id. Sekw. Nr: 101)	3,750
6	152	VTFDGTPSY (Id. Sekw. Nr: 244)	2,500
7	260	WTEGQSNHS (Id. Sekw. Nr: 247)	2,250
8	409	TSEKPFSCR (Id. Sekw. Nr: 232)	1,350
9	73	KQEPSWGGA (Id. Sekw. Nr: 125)	1,350
10	386	KTCQRKFSR (Id. Sekw. Nr: 128)	1,250
11	37	VLDFAPPGA (Id. Sekw. Nr: 241)	1,000
12	325	CAYPGCNKR (Id. Sekw. Nr: 44)	1,000
13	232	QLECMTWNQ (Id. Sekw. Nr: 167)	0,900
14	272	ESDNHTTPI (Id. Sekw. Nr: 71)	0,750
15	366	RSDQLKRHQ (Id. Sekw. Nr: 193)	0,750
16	222	SSDNLYQMT (Id. Sekw. Nr: 217)	0,750
17	427	RSDELVRHH (Id. Sekw. Nr: 191)	0,750
18	394	RSDHLKTHT (Id. Sekw. Nr: 192)	0,750
19	317	TSEKRPFMC (Id. Sekw. Nr: 233)	0,675
20	213	QALLLRTPY (Id. Sekw. Nr: 160)	0,500

T a b e l a III

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA A 0201

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	313,968
2	187	SLGEQQYSV (Id. Sekw. Nr: 214)	285,163
3	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	181,794
4	242	NLGATLKGV (Id. Sekw. Nr: 146)	159,970
5	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	68,360
6	292	GVFRGIQDV (Id. Sekw. Nr: 103)	51,790
7	191	QQYSVPPPV (Id. Sekw. Nr: 171)	22,566
8	280	ILCGAQYRI (Id. Sekw. Nr: 116)	17,736
9	235	CMTWNQMNL (Id. Sekw. Nr: 49)	15,428
10	441	NMTKLQLAL (Id. Sekw. Nr: 149)	15,428

PL 201 881 B1

c.d. tabeli III

1	2	3	4
11	7	DLNALLPAV (Id. Sekw. Nr: 58)	11,998
12	227	YQMTSQLEC (Id. Sekw. Nr: 251)	8,573
13	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	8,014
14	309	TLVRSASET (Id. Sekw. Nr: 226)	7,452
15	408	KTSEKPFSC (Id. Sekw. Nr: 129)	5,743
16	340	LQMHSRKHT (Id. Sekw. Nr: 139)	4,752
17	228	QMTSQLECM (Id. Sekw. Nr: 169)	4,044
18	93	TVHFSGQFT (Id. Sekw. Nr: 235)	3,586
19	37	VLDFAPPGA (Id. Sekw. Nr: 241 )	3,378
20	86	EQCLSAFTV (Id. Sekw. Nr: 69)	3,068

T a b e l a IV

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA A 0205

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	42,000
2	292	GVFRGIQDV (Id. Sekw. Nr: 103)	24,000
3	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	21,000
4	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	21,000
5	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	16,800
6	302	RVPGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 195)	14,000
7	441	NMTKLQLAL (Id. Sekw. Nr: 149)	7,000
8	235	CMTWNQMNL (Id. Sekw. Nr: 49)	7,000
9	187	SLGEQQYSV (Id. Sekw. Nr: 214)	6,000
10	191	QQYSVPPPV (Id. Sekw. Nr: 171)	4,800
11	340	LQMHSRKHT (Id. Sekw. Nr: 139)	4,080
12	242	NLGATLKGV (Id. Sekw. Nr: 146)	4,000
13	227	YQMTSQLEC (Id. Sekw. Nr: 251)	3,600
14	194	SVPPPVYGC (Id. Sekw. Nr: 218)	2,000
15	93	TVHFSGQFT (Id. Sekw. Nr: 235)	2,000
16	280	ILCGAQYRI (Id. Sekw. Nr: 116)	1,700
17	98	GQFTGTAGA (Id. Sekw. Nr: 99)	1,200
18	309	TLVRSASET (Id. Sekw. Nr: 226)	1,000
19	81	AEPHEEQCL (Id. Sekw. Nr: 30)	0,980
20	73	KQEPSWGGA (Id. Sekw. Nr: 125)	0,960

PL 201 881 B1

T a b e l a V

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA A24

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	302	RVPGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 195)	16,800
2	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 194)	12,000
3	356	DFKDCERRF (Id. Sekw. Nr: 55)	12,000
4	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	9,600
5	326	AYPGCNKRY (Id. Sekw. Nr: 42)	7,500
6	270	GYESDNHT (Id. Sekw. Nr: 106)	7,500
7	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	7,200
8	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	7,200
9	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	7,200
10	329	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 90)	6,600
11	417	RWPSCQKKF (Id. Sekw. Nr: 196)	6,600
12	47	AYGSLGGPA (Id. Sekw. Nr: 41)	6,000
13	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	6,000
14	4	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 62)	5,760
15	285	QYRIHTHGV (Id. Sekw. Nr: 175)	5,000
16	192	QYSVPPPVV (Id. Sekw. Nr: 176)	5,000
17	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	4,800
18	441	NMTKLQLAL (Id. Sekw. Nr: 149)	4,800
19	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	4,000
20	235	CMTWNQMNL (Id. Sekw. Nr: 49)	4,000

T a b e l a VI

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA A3

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	436	NMHQRNMTK (Id. Sekw. Nr: 148)	40,000
2	240	QMNLGATLK (Id. Sekw. Nr: 168)	20,000
3	88	CLSAFTVHF (Id. Sekw. Nr: 48)	6,000
4	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	4,500
5	169	AQFPNHSFK (Id. Sekw. Nr: 36)	4,500
6	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	4,050
7	137	CLESQPAIR (Id. Sekw. Nr: 47)	4,000
8	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	3,000
9	32	AQWAPVLDF (Id. Sekw. Nr: 37)	2,700
10	280	ILCGAQYRI (Id. Sekw. Nr: 116)	2,700

PL 201 881 B1

c.d. tabeli VI

1	2	3	4
11	386	KTCQRKFSR (Id. Sekw. Nr: 128)	1,800
12	235	CMTWNQMNL (Id. Sekw. Nr: 49)	1,200
13	441	NMTKLQLAL (Id. Sekw. Nr: 149)	1,200
14	152	VTFDGTPSY (Id. Sekw. Nr: 244)	1,000
15	187	SLGEQQYSV (Id. Sekw. Nr: 214)	0,900
16	383	FQCKTCQRK (Id. Sekw. Nr: 80)	0,600
17	292	GVFRGIQDV (Id. Sekw. Nr: 103)	0,450
18	194	SVPPPVYGC (Id. Sekw. Nr: 218)	0,405
19	287	RIHTHGVFR (Id. Sekw. Nr: 182)	0,400
20	263	GQSNHSTGY (Id. Sekw. Nr: 100)	0,360

T a b e l a VII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA A68.1

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	100	FTGTAGACR (Id. Sekw. Nr: 84)	100,000
2	386	KTCQRKFSR (Id. Sekw. Nr: 128)	50,000
3	368	DQLKRHQRR (Id. Sekw. Nr: 60)	30,000
4	312	RSASETSEK (Id. Sekw. Nr: 190)	18,000
5	337	LSHLQMHSR (Id. Sekw. Nr: 141)	15,000
6	364	FSRSDQLKR (Id. Sekw. Nr: 83)	15,000
7	409	TSEKPFSCR (Id. Sekw. Nr: 232)	15,000
8	299	DVRRVPGVA (Id. Sekw. Nr: 63)	12,000
9	4	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 62)	12,000
10	118	SQASSGQAR (Id. Sekw. Nr: 216)	10,000
11	343	HSRKHTGEK (Id. Sekw. Nr: 111)	9,000
12	169	AQFPNHSFK (Id. Sekw. Nr: 36)	9,000
13	292	GVFRGIQDV (Id. Sekw. Nr: 103)	8,000
14	325	CAYPGCNKR (Id. Sekw. Nr: 44)	7,500
15	425	FARSDELVR (Id. Sekw. Nr: 75)	7,500
16	354	QCDFKDCER (Id. Sekw. Nr: 162)	7,500
17	324	MCAYPGCNK (Id. Sekw. Nr: 142)	6,000
18	251	AAGSSSSVK (Id. Sekw. Nr: 28)	6,000
19	379	GVKPFQCKT (Id. Sekw. Nr: 104)	6,000
20	137	CLESQPAIR (Id. Sekw. Nr: 47)	5,000

PL 201 881 B1

T a b e l a VIII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA A 1101

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	386	KTCQRKFSR (Id. Sekw. Nr: 128)	1,800
2	169	AQFPNHSFK (Id. Sekw. Nr: 36)	1,200
3	436	NMHQRNMTK (Id. Sekw. Nr: 148)	0,800
4	391	KFSRSDHLK (Id. Sekw. Nr: 120)	0,600
5	373	HQRRHTGVK (Id. Sekw. Nr: 109)	0,600
6	383	FQCKTCQRK (Id. Sekw. Nr: 80)	0,600
7	363	RFSRSDQLK (Id. Sekw. Nr: 178)	0,600
8	240	QMNLGATLK (Id. Sekw. Nr: 168)	0,400
9	287	RIHTHGVFR (Id. Sekw. Nr: 182)	0,240
10	100	FTGTAGACR (Id. Sekw. Nr: 84)	0,200
11	324	MCAYPGCNK (Id. Sekw. Nr: 142)	0,200
12	251	AAGSSSSVK (Id. Sekw. Nr: 28)	0,200
13	415	SCRWPSCQK (Id. Sekw. Nr: 201)	0,200
14	118	SQASSGQAR (Id. Sekw. Nr: 216)	0,120
15	292	GVFRGIQDV (Id. Sekw. Nr: 103)	0,120
16	137	CLESOPAIR (Id. Sekw. Nr: 47)	0,080
17	425	FARSDELVR (Id. Sekw. Nr: 75)	0,080
18	325	CAYPGCNKR (Id. Sekw. Nr: 44)	0,080
19	312	RSASETSEK (Id. Sekw. Nr: 190)	0,060
20	65	PPPPHSFI (Id. Sekw. Nr: 156)	0,060

T a b e l a IX

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA A 3101

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	386	KTCQRKFSR (Id. Sekw. Nr: 128)	9,000
2	287	RIHTHGVFR (Id. Sekw. Nr: 182)	6,000
3	137	CLESQPAIR (Id. Sekw. Nr: 47)	2,000
4	118	SQASSGQAR (Id. Sekw. Nr: 216)	2,000
5	368	DQLKRHQRR (Id. Sekw. Nr: 60)	1,200
6	100	FTGTAGACR (Id. Sekw. Nr: 84)	1,000
7	293	VFRGIQDVR (Id. Sekw. Nr: 238)	0,600
8	325	CAYPGCNKR (Id. Sekw. Nr: 44)	0,600
9	169	AQFPNHSFK (Id. Sekw. Nr: 36)	0,600
10	279	PILCGAQYR (Id. Sekw. Nr: 155)	0,400

PL 201 881 B1

c.d. tabeli IX

1	2	3	4
11	436	NMHQRNMTK (Id. Sekw. Nr: 148)	0,400
12	425	FARSDELYR (Id. Sekw. Nr: 75)	0,400
13	32	AQWAPVLDF (Id. Sekw. Nr: 37)	0,240
14	240	QMNLGATLK (Id. Sekw. Nr: 168)	0,200
15	354	QCDFKDCER (Id. Sekw. Nr: 162)	0,200
16	373	HQRRHTGVK (Id. Sekw. Nr: 109)	0,200
17	383	FQCKTCQRK (Id. Sekw. Nr: 80)	0,200
18	313	SASETSEKR (Id. Sekw. Nr: 197)	0,200
19	358	KDCERRFSR (Id. Sekw. Nr: 118)	0,180
20	391	KFSRSDHLK (Id. Sekw. Nr: 120)	0,180

T a b e l a X

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA 3302

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	337	LSHLQMHSR (Id. Sekw. Nr: 141)	15,000
2	409	TSEKPFSCR (Id. Sekw. Nr: 232)	15,000
3	364	FSRSDQLKR (Id. Sekw. Nr: 83)	15,000
4	137	CLESQPAIR (Id. Sekw. Nr: 47)	9,000
5	368	DQLKRHQRR (Id. Sekw. Nr: 60)	9,000
6	287	RIHTHGVFR (Id. Sekw. Nr: 182)	4,500
7	210	TGSQALLLR (Id. Sekw. Nr: 223)	3,000
8	425	FARSDELVR (Id. Sekw. Nr: 75)	3,000
9	313	SASETSEKR (Id. Sekw. Nr: 197)	3,000
10	293	VFRGIQDVR (Id. Sekw. Nr: 238)	3,000
11	354	OCDFKDCER (id. Sekw. Nr: 162)	3,000
12	100	FTGTAGACR (Id. Sekw. Nr: 84)	3,000
13	118	SQASSGQAR (Id. Sekw. Nr: 216)	3,000
14	325	CAYPGCNKR (Id. Sekw. Nr: 44)	3,000
15	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	1,500
16	139	ESQPAIRNQ (Id. Sekw. Nr: 72)	1,500
17	299	DVRRVPGVA (Id. Sekw. Nr: 63)	1,500
18	419	PSCQKKFAR (Id. Sekw. Nr: 159)	1,500
19	272	ESDNHTTPI (Id. Sekw. Nr: 71)	1,500
20	4	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 62)	1,500

PL 201 881 B1

T a b e l a XI

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B14

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	362	RRFSRSDQL (Id. Sekw. Nr: 187)	1000,000
2	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 127)	300,000
3	423	KKFARSDEL (Id. Sekw. Nr: 122)	150,000
4	390	RKFSRSDHL (Id. Sekw. Nr: 183)	150,000
5	439	QRNMTKLQL (Id. Sekw. Nr: 173)	20,000
6	329	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 90)	10,000
7	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	10,000
8	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	9,000
9	301	RRVPGVAPT (Id. Sekw. Nr: 189)	6,000
10	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	5,000
11	371	KRHQRRHTG (Id. Sekw. Nr: 126)	5,000
12	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	5,000
13	144	IRNQGYSTV (Id. Sekw. Nr: 117)	4,000
14	429	DELVRHHNM (Id. Sekw. Nr: 53)	3,000
15	437	MHQRNMTKL (Id. Sekw. Nr: 143)	3,000
16	125	ARMFPNAPY (Id. Sekw. Nr: 38)	3,000
17	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	3,000
18	286	YRIHTHGVF (Id. Sekw. Nr: 252)	3,000
19	174	HSFKHEDPM (Id. Sekw. Nr: 110)	3,000
20	372	RHQRRHTGV (Id. Sekw. Nr: 181)	3,000

T a b e l a XII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B40

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencje)
1	2	3	4
1	81	AEPHEEQCL (Id. Sekw. Nr: 30)	40,000
2	429	DELVRHHNM (Id. Sekw. Nr: 53)	24,000
3	410	SEKPFSCRW (Id. Sekw. Nr: 207)	20,000
4	318	SEKRPFMCA (Id. Sekw. Nr: 208)	15,000
5	233	LECMTWNQM (Id. Sekw. Nr: 131)	12,000
6	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 206)	10,000
7	349	GEKPYQCDF (Id. Sekw. Nr: 91)	8,000
8	6	RDLNALLPA (Id. Sekw. Nr: 177)	5,000
9	85	EEQCLSAFT (Id. Sekw. Nr: 65)	4,000
10	315	SETSEKRPF (Id. Sekw. Nr: 209)	4,000

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XII

1	2	3	4
11	261	TEGQSNHST (Id. Sekw. Nr: 221)	4,000
12	23	GCALPYSGA (Id. Sekw. Nr: 89)	3,000
13	38	LDFAPPGAS (Id. Sekw. Nr: 130)	3,000
14	273	SDNHTTPIL, (Id. Sekw. Nr: 204)	2,500
15	206	TDSCTGSQA (Id. Sekw. Nr: 220)	2,500
16	24	CALPVSGAA (Id. Sekw. Nr: 43)	2,000
17	98	GQFTGTAGA (Id. Sekw. Nr: 99)	2,000
18	30	GAAQWAPVL (Id. Sekw. Nr: 86)	2,000
19	84	HEEQCLSAF (Id. Sekw. Nr: 107)	2,000
20	26	LPVSGAAQW (Id. Sekw. Nr: 138)	2,000

T a b e l a XIII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B60

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	81	AEPHEEQCL (Id. Sekw. Nr: 30)	160,000
2	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 206)	40,000
3	429	DELVRHHNM (Id. Sekw. Nr: 53)	40,000
4	233	LECMTWNQM (Id. Sekw. Nr: 131)	22,000
5	273	SDNHTTPIL (Id. Sekw. Nr: 204)	20,000
6	209	CTGSQALLL (Id. Sekw. Nr: 52)	8,000
7	30	GAAQWAPVL (Id. Sekw. Nr: 86)	8,000
8	318	SEKRPFMCA (Id. Sekw. Nr: 208)	8,000
9	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	8,000
10	138	LESQPAIRN (Id. Sekw. Nr: 132)	5,280
11	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	4,400
12	329	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 90)	4,400
13	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	4,400
14	85	EEQCLSAFT (Id. Sekw. Nr: 65)	4,400
15	208	SCTGSQALL (Id. Sekw. Nr: 202)	4,000
16	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	4,000
17	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 194)	4,000
18	261	TEGQSNHST (Id. Sekw. Nr: 221)	4,000
19	18	LGGGGGCAL (Id. Sekw. Nr: 134)	4,000
20	221	YSSDNLYQM (Id. Sekw. Nr: 253)	2,200

PL 201 881 B1

T a b e l a XIV

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B61

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	318	SEKRPFMCA (Id. Sekw. Nr: 208)	20,000
2	429	DELVRHHNM (Id. Sekw. Nr: 53)	16,000
3	298	QDVRRVPGV (Id. Sekw. Nr: 164)	10,000
4	81	AEPHEEQCL (Id. Sekw. Nr: 30)	8,000
5	233	LECMTWNQM (Id. Sekw. Nr: 131)	8,000
6	6	RDLNALLPA (Id. Sekw. Nr: 177)	5,500
7	85	EEQCLSAFT (Id. Sekw. Nr: 65)	4,000
8	261	TEGQSNHST (Id. Sekw. Nr: 221)	4,000
9	206	TDSCTGSQA (Id. Sekw. Nr: 220)	2,500
10	295	RGIQDVRRV (Id. Sekw. Nr: 179)	2,200
11	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 206)	2,000
12	250	VAAGSSSSV (Id. Sekw. Nr: 236)	2,000
13	29	SGAAQWAPV (Id. Sekw. Nr: 211)	2,000
14	315	SETSEKRPF (Id. Sekw. Nr: 209)	1,600
15	138	LESQPAIRN (Id. Sekw. Nr: 132)	1,200
16	244	GATLKGVAA (Id. Sekw. Nr: 88)	1,100
17	20	GGGGCALPV (Id. Sekw. Nr: 92)	1,100
18	440	RNMTKLQLA (Id. Sekw. Nr: 186)	1,100
19	23	GCALPVSGA (Id. Sekw. Nr: 89)	1,100
20	191	QQYSVPPPV (Id. Sekw. Nr: 171)	1,000

T a b e l a XV

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B62

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	146	NQGYSTVTF (Id. Sekw. Nr: 150)	211,200
2	32	AQWAPVLDF (Id. Sekw. Nr: 37)	96,000
3	263	GQSNHSTGY (Id. Sekw. Nr: 100)	96,000
4	88	CLSAFTVHF (Id. Sekw. Nr: 48)	96,000
5	17	SLGGGGGCA (Id. Sekw. Nr: 215)	9,600
6	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	8,800
7	191	QQYSVPPPV (Id. Sekw. Nr: 171)	8,000
8	98	GQFTGTAGA (Id. Sekw. Nr: 99)	8,000
9	384	QCKTCQRKF (Id. Sekw. Nr: 163)	6,000
10	40	FAPPGASAY (Id. Sekw. Nr: 74)	4,800

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XV

1	2	3	4
11	227	YQMTSQLEC (Id. Sekw. Nr: 251)	4,800
12	187	SLGEQQYSV (Id. Sekw. Nr: 214)	4,400
13	86	EQCLSAFTV (Id. Sekw. Nr: 69)	4,400
14	152	VTFDGTPSY (Id. Sekw. Nr: 244)	4,400
15	101	TGTAGACRY (Id. Sekw. Nr: 224)	4,000
16	242	NLGATLKGV (Id. Sekw. Nr: 146)	4,000
17	92	FTVHFSGQF (Id. Sekw. Nr: 85)	4,000
18	7	DLNALLPAV (Id. Sekw. Nr: 58)	4,000
19	123	GQARMFPNA (Id. Sekw. Nr: 98)	4,000
20	280	ILCGAQYRI (Id. Sekw. Nr: 116)	3,120

T a b e l a XVI

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B7

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	240,000
2	4	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 62)	200,000
3	302	RVPGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 195)	20,000
4	30	GAAQWAPVL (Id. Sekw. Nr: 86)	12,000
5	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	12,000
6	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	12,000
7	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	12,000
8	299	DVRRVPGVA (Id. Sekw. Nr: 63)	5,000
9	208	SCTGSQALL (Id. Sekw. Nr: 202)	4,000
10	303	VPGVAPTLV (Id. Sekw. Nr: 242)	4,000
11	18	LGGGGGCAL (Id. Sekw. Nr: 134)	4,000
12	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 194)	4,000
13	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	4,000
14	209	CTGSQALLL (Id. Sekw. Nr: 52)	4,000
15	329	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 90)	4,000
16	235	CMTWNQMNL (Id. Sekw. Nr: 49)	4,000
17	441	NMTKLQLAL (Id. Sekw. Nr: 149)	4,000
18	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	4,000
19	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	4,000
20	143	AIRNOGYST (Id. Sekw. Nr: 33)	3,000

PL 201 881 B1

T a b e l a XVII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B8

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	329	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 90)	16,000
2	4	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 62)	12,000
3	316	ETSEKRPFM (Id. Sekw. Nr: 73)	3,000
4	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	1,600
5	208	SCTGSQALL (Id. Sekw. Nr: 202)	0,800
6	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	0,800
7	244	GATLKGVAA (Id. Sekw. Nr: 88)	0,800
8	30	GAAQWAPVL (Id. Sekw. Nr: 86)	0,800
9	299	DVRRVPGVA (Id. Sekw. Nr: 63)	0,400
10	420	SCQKKFARS (Id. Sekw. Nr: 200)	0,400
11	387	TCQRKFSRS (Id. Sekw. Nr: 219)	0,400
12	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	0,400
13	141	QPAIRNQGY (Id. Sekw. Nr: 170)	0,400
14	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	0,400
15	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	0,400
16	384	QCKTCQRKF (Id. Sekw. Nr: 163)	0,400
17	136	SCLESQPAI (Id. Sekw. Nr: 198)	0,300
18	347	HTGEKPYQC (Id. Sekw. Nr: 112)	0,300
19	401	HTRTHTGKT (Id. Sekw. Nr: 114)	0,200
20	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 127)	0,200

T a b e l a XVIII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 2702

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 127)	900,000
2	362	RRFSRSDQL (Id. Sekw. Nr: 187)	900,000
3	286	YRIHTHGVF (Id. Sekw. Nr: 252)	200,000
4	125	ARMFPNAPY (Id. Sekw. Nr: 38)	200,000
5	375	RRHTGVKPF (Id. Sekw. Nr: 188)	180,000
6	32	AQWAPVLDF (Id. Sekw. Nr: 37)	100,000
7	301	RRVPGVAPT (Id. Sekw. Nr: 189)	60,000
8	439	QRNMTKLQL (Id. Sekw. Nr: 173)	60,000
9	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	22,500
10	426	ARSDELVRH (Id. Sekw. Nr: 39)	20,000

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XVIII

1	2	3	4
11	146	NQGYSTVTF (Id. Sekw. Nr: 150)	20,000
12	144	IRNQGYSTV (Id. Sekw. Nr: 117)	20,000
13	389	QRKFSRSDH (Id. Sekw. Nr: 172)	20,000
14	263	GQSNHSTGY (Id. Sekw. Nr: 100)	20,000
15	416	CRWPSCQKK (Id. Sekw. Nr: 50)	20,000
16	191	QQYSVPPPV (Id. Sekw. Nr: 171)	10,000
17	217	LRTPYSSDN (Id. Sekw. Nr: 140)	10,000
18	107	CRYGPFGPP (Id. Sekw. Nr: 51)	10,000
19	98	GQFTGTAGA (Id. Sekw. Nr: 99)	10,000
20	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	6,000

T a b e l a XIX

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 2705

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 127)	30000,000
2	362	RRFSRSDQL (Id. Sekw. Nr: 187)	30000,000
3	416	CRWPSCQKK (Id. Sekw. Nr: 50)	10000,000
4	439	QRNMTKLQL (Id. Sekw. Nr: 173)	2000,000
5	286	YRIHTHGVF (Id. Sekw. Nr: 252)	1000,000
6	125	ARMFPNAPY (Id. Sekw. Nr: 38)	1000,000
7	294	FRGIQDVRR (Id. Sekw. Nr: 81)	1000,000
8	432	VRHHNMHQR (Id. Sekw. Nr: 243)	1000,000
9	169	AQFPNHSFK (Id. Sekw. Nr: 36)	1000,000
10	375	RRHTGVKPF (Id. Sekw. Nr: 188)	900,000
11	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	750,000
12	144	IRNQGYSTV (Id. Sekw. Nr: 117)	600,000
13	301	RRVPGVAPT (Id. Sekw. Nr: 189)	600,000
14	32	AQWAPVLDF (Id. Sekw. Nr: 37)	500,000
15	191	QQYSVPPPV (Id. Sekw. Nr: 171)	300,000
16	373	HQRRHTGVK (Id. Sekw. Nr: 109)	200,000
17	426	ARSDELVRH (Id. Sekw. Nr: 39)	200,000
18	383	FQCKTCQRK (Id. Sekw. Nr: 80)	200,000
19	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	200,000
20	389	QRKFSRSDH (Id. Sekw. Nr: 172)	200,000

PL 201 881 B1

T a b e l a XX

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 3501

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	278	TPILCGAQY (Id. Sekw. Nr: 227)	40,000
2	141	QPAIRNQGY (Id. Sekw. Nr: 170)	40,000
3	219	TPYSSDNLY (Id. Sekw. Nr: 231)	40,000
4	327	YPGCNKRYF (Id. Sekw. Nr: 250)	20,000
5	163	TPSHHAAQF (Id. Sekw. Nr: 228)	20,000
6	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	20,000
7	221	YSSDNLYQM (Id. Sekw. Nr: 253)	20,000
8	26	LPVSGAAQW (Id. Sekw. Nr: 138)	10,000
9	174	HSFKHEDPM (Id. Sekw. Nr: 110)	10,000
10	82	EPHEEQCLS (Id. Sekw. Nr: 68)	6,000
11	213	QALLLRTPY (Id. Sekw. Nr: 160)	6,000
12	119	QASSGQARM (Id. Sekw. Nr: 161)	6,000
13	4	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 62)	6,000
14	40	FAPPGASAY (Id. Sekw. Nr: 74)	6,000
15	120	ASSGQARMF (Id. Sekw. Nr: 40)	5,000
16	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	5,000
17	303	VPGVAPTLV (Id. Sekw. Nr: 242)	4,000
18	316	ETSEKRPFM (Id. Sekw. Nr: 73)	4,000
19	152	VTFDGTPSY (Id. Sekw. Nr: 244)	4,000
20	412	KPFSCRWPS (Id. Sekw. Nr: 123)	4,000

T a b e l a XXI

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 3701

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 206)	40,000
2	273	SDNHTTPIL (Id. Sekw. Nr: 204)	40,000
3	81	AEPHEEQCL (Id. Sekw. Nr: 30)	10,000
4	298	QDVRRVPGV (Id. Sekw. Nr: 164)	8,000
5	428	SDELVRHHN (Id. Sekw. Nr: 203)	6,000
6	85	EEQCLSAFT (Id. Sekw. Nr: 65)	5,000
7	208	SCTGSQALL (Id. Sekw. Nr: 202)	5,000
8	4	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 62)	5,000
9	209	CTGSQALLL (Id. Sekw. Nr: 52)	5,000
10	38	LDFAPPGAS (Id. Sekw. Nr: 130)	4,000

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XXI

1	2	3	4
11	223	SDNLYQMTS (Id. Sekw. Nr: 205)	4,000
12	179	EDPMGQQGS (Id. Sekw. Nr: 64)	4,000
13	206	TDSCTGSQA (Id. Sekw. Nr: 220)	4,000
14	6	RDLNALLPA (Id. Sekw. Nr: 177)	4,000
15	84	HEEQCLSAF (Id. Sekw. Nr: 107)	2,000
16	233	LECMTWNQM (Id. Sekw. Nr: 131)	2,000
17	429	DELVRHHNM (Id. Sekw. Nr: 53)	2,000
18	315	SETSEKRPF (Id. Sekw. Nr: 209)	2,000
19	349	GEKPYQCDF (Id. Sekw. Nr: 91)	2,000
20	302	RVPGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 195)	1,500

T a b e l a XXII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 3801

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	437	MHQRNMTKL (Id. Sekw. Nr: 143)	36,000
2	434	HHNMHQRNM (Id. Sekw. Nr: 108)	6,000
3	372	RHQRRHTGV (Id. Sekw. Nr: 181)	6,000
4	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	4,000
5	433	RHHNMHQRN (Id. Sekw. Nr: 180)	3,900
6	165	SHHAAQFPN (Id. Sekw. Nr: 213)	3,900
7	202	CHTPTDSCT (Id. Sekw. Nr: 45)	3,000
8	396	DHLKTHTRT (Id. Sekw. Nr: 57)	3,000
9	161	GHTPSHHAA (Id. Sekw. Nr: 94)	3,000
10	302	RVPGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 195)	2,600
11	417	RWPSCQKKF (Id. Sekw. Nr: 196)	2,400
12	327	YPGCNKRYF (Id. Sekw. Nr: 250)	2,400
13	208	SCTGSQALL (Id. Sekw. Nr: 202)	2,000
14	163	TPSHHAAQF (Id. Sekw. Nr: 228)	2,000
15	120	ASSGQARMF (Id. Sekw. Nr: 40)	2,000
16	18	LGGGGGCAL (Id. Sekw. Nr: 134)	2,000
17	177	KHEDPMGQQ (Id. Sekw. Nr: 121)	1,800
18	83	PHEEQCLSA (Id. Sekw. Nr: 154)	1,800
19	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	1,300
20	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	1,300

PL 201 881 B1

T a b e l a XXIII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 3901

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	437	MHQRNMTKL (Id. Sekw. Nr: 143)	135,000
2	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 127)	45,000
3	434	HHNMHQRNM (Id. Sekw. Nr: 108)	30,000
4	362	RRFSRSDQL (Id. Sekw. Nr: 187)	30,000
5	372	RHQRRHTGV (Id. Sekw. Nr: 181)	30,000
6	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	9,000
7	439	QRNMTKLQL (Id. Sekw. Nr: 173)	7,500
8	390	RKFSRSDHL (Id. Sekw. Nr: 183)	6,000
9	396	DHLKTHTRT (Id. Sekw. Nr: 57)	6,000
10	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	6,000
11	423	KKFARSDEL (Id. Sekw. Nr: 122)	6,000
12	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	6,000
13	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	6,000
14	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	6,000
15	144	IRNQGYSTV (Id. Sekw. Nr: 117)	5,000
16	136	SCLESQPAI (Id. Sekw. Nr: 198)	4,000
17	292	GVFRGIQDV (Id. Sekw. Nr: 103)	3,000
18	302	RVPGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 195)	3,000
19	208	SCTGSQALL (Id. Sekw. Nr: 202)	3,000
20	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	3,000

T a b e l a XXIV

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 3902

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	24,000
2	390	RKFSRSDHL (Id. Sekw. Nr: 183)	20,000
3	423	KKFARSDEL (Id. Sekw. Nr: 122)	20,000
4	32	AQWAPVLDF (Id. Sekw. Nr: 37)	5,000
5	146	NQGYSTVTF (Id. Sekw. Nr: 150)	5,000
6	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	2,400
7	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	2,400
8	30	GAAQWAPVL (Id. Sekw. Nr: 86)	2,400
9	441	NMTKLQLAL (Id. Sekw. Nr: 149)	2,400
10	302	RVPGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 195)	2,400

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XXIV

1	2	3	4
11	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	2,000
12	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 194)	2,000
13	209	CTGSQALLL (Id. Sekw. Nr: 52)	2,000
14	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 127)	2,000
15	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	2,000
16	437	MHQRNMTKL (Id. Sekw. Nr: 143)	2,000
17	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	2,000
18	208	SCTGSQALL (Id. Sekw. Nr: 202)	2,000
19	329	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 90)	2,000
20	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	2,000

T a b e l a XXV

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 4403

Bank	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	315	SETSEKRPF (Id. Sekw. Nr: 209)	80,000
2	349	GEKPYQCDF (Id. Sekw. Nr: 91)	80,000
3	84	HEEQCLSAF (Id. Sekw. Nr: 107)	60,000
4	410	SEKPFSCRW (Id. Sekw. Nr: 207)	48,000
5	429	DELVRHHNM (Id. Sekw. Nr: 53)	24,000
6	278	TPILCGAQY (Id. Sekw. Nr: 227)	15,000
7	141	QPAIRNQGY (Id. Sekw. Nr: 170)	9,000
8	40	FAPPGASAY (Id. Sekw. Nr: 74)	9,000
9	213	QALLLRTPY (Id. Sekw. Nr: 160)	9,000
10	318	SEKRPFMCA (Id. Sekw. Nr: 208)	8,000
11	81	AEPHEEQCL (Id. Sekw. Nr: 30)	8,000
12	152	VTFDGTPSY (Id. Sekw. Nr: 244)	4,500
13	101	TGTAGACRY (Id. Sekw. Nr: 224)	4,500
14	120	ASSGQARMF (Id. Sekw. Nr: 40)	4,500
15	261	TEGQSNHST (Id. Sekw. Nr: 221)	4,000
16	85	EEQCLSAFT (Id. Sekw. Nr: 65)	4,000
17	233	LECMTWNQM (Id. Sekw. Nr: 131)	4,000
18	104	AGACRYGPF (Id. Sekw. Nr: 31)	4,000
19	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 206)	3,000
20	185	QGSLGEQQY (Id. Sekw. Nr: 166)	3,000

PL 201 881 B1

T a b e l a XXVI

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 5101

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	303	VPGVAPTLV (Id. Sekw. Nr: 242)	314,600
2	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	242,000
3	250	VAAGSSSSV (Id. Sekw. Nr: 236)	157,300
4	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	50,000
5	30	GAAQWAPVL (Id. Sekw. Nr: 86)	50,000
6	20	GGGGCALPV (Id. Sekw. Nr: 92)	44,000
7	64	PPPPPHSFI (Id. Sekw. Nr: 157)	40,000
8	29	SGAAQWAPV (Id. Sekw. Nr: 211)	40,000
9	18	LGGGGGCAL (Id. Sekw. Nr: 134)	31,460
10	295	RGIQDVRRV (Id. Sekw. Nr: 179)	22,000
11	119	QASSGQARM (Id. Sekw. Nr: 161)	18,150
12	418	WPSCQKKFA (Id. Sekw. Nr: 246)	12,100
13	82	EPHEEQCLS (Id. Sekw. Nr: 68)	12,100
14	110	GPFGPPPPS (Id. Sekw. Nr: 96)	11,000
15	272	ESDNHTTPI (Id. Sekw. Nr: 71)	8,000
16	306	VAPTLVRSA (Id. Sekw. Nr: 237)	7,150
17	280	ILCGAQYRI (Id. Sekw. Nr: 116)	6,921
18	219	TPYSSDNLY (Id. Sekw. Nr: 231)	6,600
19	128	FPNAPYLPS (Id. Sekw. Nr: 79)	6,500
20	204	TPTDSCTGS (Id. Sekw. Nr: 230)	6,050

T a b e l a XXVII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 5102

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	295	RGIQDVRRV (Id. Sekw. Nr: 179)	290,400
2	303	VPGVAPTLV (Id. Sekw. Nr: 242)	200,000
3	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	133,100
4	250	VAAGSSSSV (Id. Sekw. Nr: 236)	110,000
5	30	GAAQWAPVL (Id. Sekw. Nr: 86)	55,000
6	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	50,000
7	20	GGGGCALPV (Id. Sekw. Nr: 92)	44,000
8	29	SGAAQWAPV (Id. Sekw. Nr: 211)	44,000
9	64	PPPPPHSFI (Id. Sekw. Nr: 157)	40,000
10	119	QASSGQARM (Id. Sekw. Nr: 161)	36,300

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XXVII

1	2	3	4
11	110	GPFGPPPPS (Id. Sekw. Nr: 96)	27,500
12	412	KPFSCRWPS (Id. Sekw. Nr: 123)	25,000
13	18	LGGGGGCAL (Id. Sekw. Nr: 134)	24,200
14	24	CALPVSGAA (Id. Sekw. Nr: 43)	16,500
15	219	TPYSSDNLY (Id. Sekw. Nr: 231)	15,000
16	292	GVFRGIQDV (Id. Sekw. Nr: 103)	14,641
17	136	SCLESQPAI (Id. Sekw. Nr: 198)	14,520
18	418	WPSCQKKFA (Id. Sekw. Nr: 246)	12,100
19	269	TGYESDNHT (Id. Sekw. Nr: 225)	11,000
20	351	KPYQCDFKD (Id. Sekw. Nr: 124)	11,000

T a b e l a XXVIII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 5201

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	191	QQYSVPPPV (Id. Sekw. Nr: 171)	100,000
2	32	AQWAPVLDF (Id. Sekw. Nr: 37)	30,000
3	243	LGATLKGVA (Id. Sekw. Nr: 133)	16,500
4	303	VPGVAPTLV (Id. Sekw. Nr: 242)	13,500
5	86	EQCLSAFTV (Id. Sekw. Nr: 69)	12,000
6	295	RGIQDVRRV (Id. Sekw. Nr: 179)	10,000
7	98	GQFTGTAGA (Id. Sekw. Nr: 99)	8,250
8	292	GVFRGIQDV (Id. Sekw. Nr: 103)	8,250
9	29	SGAAQWAPV (Id. Sekw. Nr: 211)	6,000
10	146	NQGYSTVTF (Id. Sekw. Nr: 150)	5,500
11	20	GGGGCALPV (Id. Sekw. Nr: 92)	5,000
12	239	NQMNLGATL (id. sekw. Nr: 151)	4,000
13	64	PPPPPHSFI (Id. Sekw. Nr: 157)	3,600
14	273	SDNHTTPIL (Id. Sekw. Nr: 204)	3,300
15	286	YRIHTHGVF(Id. Sekw. Nr: 252)	3,000
16	269	TGYESDNHT (Id. Sekw. Nr: 225)	3,000
17	406	TGKTSEKPF (Id. Sekw. Nr: 222)	2,750
18	327	YPGCNKRYF (Id. Sekw. Nr: 250)	2,750
19	7	DLNALLPAV (Id. Sekw. Nr: 58)	2,640
20	104	AGACRYGPF (Id. Sekw. Nr: 31)	2,500

PL 201 881 B1

T a b e l a XXIX

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA B 5801

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	230	TSQLECMTW (Id. Sekw. Nr: 234)	96,800
2	92	FTVHFSGQF (Id. Sekw. Nr: 85)	60,000
3	120	ASSGQARMF (Id. Sekw. Nr: 40)	40,000
4	168	AAQFPNHSF (Id. Sekw. Nr: 29)	20,000
5	408	KTSEKPFSC (Id. Sekw. Nr: 129)	12,000
6	394	RSDHLKTHT (Id. Sekw. Nr: 192)	9,900
7	276	HTTPILCGA (Id. Sekw. Nr: 115)	7,200
8	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 194)	6,600
9	152	VTFDGTPSY (Id. Sekw. Nr: 244)	6,000
10	40	FAPPGASAY (Id. Sekw. Nr: 74)	6,000
11	213	QALLLRTPY (Id. Sekw. Nr: 160)	4,500
12	347	HTGEKPYQC (Id. Sekw. Nr: 112)	4,400
13	252	AGSSSSVKW (Id. Sekw. Nr: 32)	4,400
14	211	GSQALLLRT (Id. Sekw. Nr: 102)	4,356
15	174	HSFKHEDPM (Id. Sekw. Nr: 110)	4,000
16	317	TSEKRPFMC (Id. Sekw. Nr: 233)	4,000
17	26	LPVSGAAQW (Id. Sekw. Nr: 138)	4,000
18	289	HTHGVFRGI (Id. Sekw. Nr: 113)	3,600
19	222	SSDNLYQMT (Id. Sekw. Nr: 217)	3,300
20	96	FSGQFTGTA (Id. Sekw. Nr: 82)	3,300

T a b e l a XXX

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA CW0301

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	100,000
2	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 127)	48,000
3	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	36,000
4	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 206)	30,000
5	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	24,000
6	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	24,000
7	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	20,000
8	362	RRFSRSDQL (Id. Sekw. Nr: 187)	12,000
9	329	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 90)	10,000
10	286	YRIHTHGVF (Id. Sekw. Nr: 252)	10,000

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XXX

1	2	3	4
11	301	RRVPGVAPT (Id. Sekw. Nr: 189)	10,000
12	24	CALPVSGAA (Id. Sekw. Nr: 43)	10,000
13	136	SCLESQPAI (Id. Sekw. Nr: 198)	7,500
14	437	MHQRNMTKL (Id. Sekw. Nr: 143)	7,200
15	390	RKFSRSDHL (Id. Sekw. Nr: 183)	6,000
16	423	KKFARSDEL (Id. Sekw. Nr: 122)	6,000
17	92	FTVHFSGQF (Id. Sekw. Nr: 85)	5,000
18	429	DELVRHHNM (Id. Sekw. Nr: 53)	5,000
19	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	4,800
20	30	GAAQWAPVL (Id. Sekw. Nr: 86)	4,000

T a b e l a XXXI

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA CW0401

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	356	DFKDCERRF (Id. Sekw. Nr: 55)	120,000
2	334	YFKLSHLQM (Id. Sekw. Nr: 248)	100,000
3	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	88,000
4	163	TPSHHAAQF (Id. Sekw. Nr: 228)	52,800
5	327	YPGCNKRYF (Id. Sekw. Nr: 250)	40,000
6	285	QYRIHTHGV (Id. Sekw. Nr: 175)	27,500
7	424	KFARSDELV (Id. Sekw. Nr: 119)	25,000
8	326	AYPGCNKRY (Id. Sekw. Nr: 42)	25,000
9	192	QYSVPPPVY (Id. Sekw. Nr: 176)	25,000
10	417	RWPSCQKKF (Id. Sekw. Nr: 196)	22,000
11	278	TPILCGAQY (Id. Sekw. Nr: 227)	12,000
12	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	11,616
13	141	QPAIRNQGY (Id. Sekw. Nr: 170)	11,000
14	303	VPGVAPTLV (Id. Sekw. Nr: 242)	11,000
15	219	TPYSSDNLY (Id. Sekw. Nr: 231)	10,000
16	39	DFAPPGASA (Id. Sekw. Nr: 54)	7,920
17	99	OFTGTAGAC (Id. Sekw. Nr: 165)	6,000
18	4	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 62)	5,760
19	70	SFIKQEPSW (Id. Sekw. Nr: 210)	5,500
20	63	PPPPPPHSF (Id. Sekw. Nr: 158)	5,280

PL 201 881 B1

T a b e l a XXXII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA CW0602

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 127)	9,680
2	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	6,600
3	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	6,600
4	7	DLNALLPAV (Id. Sekw. Nr: 58)	6,000
5	441	NMTKLQLAL (Id. Sekw. Nr: 149)	6,000
6	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	6,000
7	4	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 62)	6,000
8	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 206)	4,400
9	10	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	4,000
10	213	QALLLRTPY (Id. Sekw. Nr: 160)	3,300
11	319	EKRPFMCAY (Id. Sekw. Nr: 67)	3,000
12	30	GAAQWAPVL (Id. Sekw. Nr: 86)	2,200
13	242	NLGATLKGV (Id. Sekw. Nr: 146)	2,200
14	292	GVFRGIQDV (Id. Sekw. Nr: 103)	2,200
15	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	2,200
16	362	RRFSRSDQL (Id. Sekw. Nr: 187)	2,200
17	439	QRNMTKLQL (Id. Sekw. Nr: 173)	2,200
18	295	RGIQDVRRV (Id. Sekw. Nr: 179)	2,200
19	423	KKFARSDEL (Id. Sekw. Nr: 122)	2,200
20	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	2,200

T a b e l a XXXIII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z ludzkim HLA CW0702

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	319	EKRPFMCAY (Id. Sekw. Nr: 67)	26,880
2	326	AYPGCNKRY (Id. Sekw. Nr: 42)	24,000
3	40	FAPPGASAY (Id. Sekw. Nr: 74)	14,784
4	192	QYSVPPPVY (Id. Sekw. Nr: 176)	12,000
5	278	TPILCGAQY (Id. Sekw. Nr: 227)	12,000
6	219	TPYSSDNLY (Id. Sekw. Nr: 231)	12,000
7	213	QALLLRTPY (Id. Sekw. Nr: 160)	8,800
8	125	ARMFPNAPY (Id. Sekw. Nr: 38)	8,000
9	327	YPGCNKRYF (Id. Sekw. Nr: 250)	6,600
10	152	VTFDGTPSY (Id. Sekw. Nr: 244)	5,600

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XXXIII

1	2	3	4
11	141	QPAIRNQGY (Id. Sekw. Nr: 170)	4,800
12	345	RKHTGEKPY (Id. Sekw. Nr: 184)	4,000
13	185	QGSLGEQQY (Id. Sekw. Nr: 166)	4,000
14	101	TGTAGACRY (Id. Sekw. Nr: 224)	4,000
15	375	RRHTGVKPF (Id. Sekw. Nr: 188)	4,000
16	263	GQSNHSTGY (Id. Sekw. Nr: 100)	4,000
17	163	TPSHHAAQF (Id. Sekw. Nr: 228)	3,000
18	33	QWAPVLDFA (Id. Sekw. Nr: 174)	2,688
19	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	2,640
20	84	HEEQCLSAF (Id. Sekw. Nr: 107)	2,400

T a b e l a XXXIV

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z mysim MHC klasy I Db

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	235	CMTWNQMNL (Id. Sekw. Nr: 49)	5255,712
2	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	1990,800
3	221	YSSDNLYQM (Id. Sekw. Nr: 253)	930,000
4	228	QMTSQLECM (Id. Sekw. Nr: 169)	33,701
5	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	21,470
6	441	NMTKLQLAL (Id. Sekw. Nr: 149)	19,908
7	437	MHQRNMTKL (Id. Sekw. Nr: 143)	19,837
8	136	SCLESQPAI (Id. Sekw. Nr: 198)	11,177
9	174	HSFKHEDPM (Id. Sekw. Nr: 110)	10,800
10	302	RVPGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 195)	10,088
11	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	8,400
12	10	ALLPAYPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	5,988
13	208	SCTGSQALL (Id. Sekw. Nr: 202)	4,435
14	209	CTGSQALLL (Id. Sekw. Nr: 52)	3,548
15	238	WNQMNLGAT (Id. Sekw. Nr: 245)	3,300
16	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 194)	3,185
17	24	CALPVSGAA (Id. Sekw. Nr: 43)	2,851
18	18	LGGGGGCAL (Id. Sekw. Nr: 134)	2,177
19	142	PAIRNQGYS (Id. Sekw. Nr: 152)	2,160
20	30	GAAQWAPVL (Id. Sekw. Nr: 86)	1,680

PL 201 881 B1

T a b e l a XXXV

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z mysim MHC klasy I Dd

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	112	FGPPPPSQA (Id. Sekw. Nr: 76)	48,000
2	122	SGQARMFPN (Id. Sekw. Nr: 212)	36,000
3	104	AGACRYGPF (Id. Sekw. Nr: 31)	30,000
4	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 194)	28,800
5	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	20,000
6	302	RVPGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 195)	20,000
7	18	LGGGGGCAL (Id. Sekw. Nr: 134)	20,000
8	81	AEPHEEQCL (Id. Sekw. Nr: 30)	10,000
9	29	SGAAQWAPV (Id. Sekw. Nr: 211)	7,200
10	423	KKFARSDEL (Id. Sekw. Nr: 122)	7,200
11	295	RGIQDVRRV (Id. Sekw. Nr: 179)	7,200
12	390	RKFSRSDHL (Id. Sekw. Nr: 183)	6,000
13	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 127)	6,000
14	362	RRFSRSDQL (Id. Sekw. Nr: 187)	6,000
15	417	RWPSCQKKF (Id. Sekw. Nr: 196)	6,000
16	160	YGHTPSHHA (Id. Sekw. Nr: 249)	6,000
17	20	GGGGCALPV (Id. Sekw. Nr: 92)	6,000
18	329	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 90)	5,000
19	372	RHQRRHTGV (Id. Sekw. Nr: 181)	4,500
20	52	GGPAPPPAP (Id. Sekw. Nr: 93)	4,000

T a b e l a XXXVI

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z mysim MHC klasy I Kb

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	329	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 90)	24,000
2	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147)	10,000
3	420	SCQKKFARS (Id. Sekw. Nr: 200)	3,960
4	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 194)	3,630
5	437	MHQRNMTKL (Id. Sekw. Nr: 143)	3,600
6	387	TCQRKFSRS (Id. Sekw. Nr: 219)	3,600
7	302	RVPGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 195)	3,300
8	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	3,000
9	289	HTHGVFRGI (Id. Sekw. Nr: 113)	3,000
10	43	PGASAVGSL (Id. Sekw. Nr: 153)	2,400

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XXXVI

1	2	3	4
11	155	DGTPSYGHT (Id. Sekw. Nr: 56)	2,400
12	273	SDNHTTPIL (Id. Sekw. Nr: 204)	2,200
13	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185)	2,200
14	128	FPNAPYLPS (Id. Sekw. Nr: 79)	2,000
15	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 206)	1,584
16	207	DSCTGSCAL (Id. Sekw. Nr: 61)	1,584
17	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 127)	1,500
18	18	LGGGGGCAL (Id. Sekw. Nr: 134)	1,324
19	233	LECMTWNQM (Id. Sekw. Nr: 131)	1,320
20	441	NMTKLQLAL (Id. Sekw. Nr: 149)	1,200

T a b e l a XXXVII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z mysim MHC klasy I Kd

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	285	QYRIHTHGV (Id. Sekw. Nr: 175)	600,000
2	424	KFARSDELV (Id. Sekw. Nr: 119)	288,000
3	334	YFKLSHLQM (Id. Sekw. Nr: 248)	120,000
4	136	SCLESQPTI (Id. Sekw. Nr: 199)	115,200
5	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151)	115,200
6	10	ALLPAVSSL (Id. Sekw. Nr: 35)	115,200
7	47	AYGSLGGPA (Id. Sekw. Nr: 41)	86,400
8	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	80,000
9	270	GYESDNHTA (Id. Sekw. Nr: 105)	72,000
10	326	AYPGCNKRY (Id. Sekw. Nr: 42)	60,000
11	192	QYSVPPPVY (Id. Sekw. Nr: 176)	60,000
12	272	ESDNHTAPI (Id. Sekw. Nr: 70)	57,600
13	289	HTHGVFRGI (Id. Sekw. Nr: 113)	57,600
14	126	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 62)	57,600
15	4	CTGSQALLL (Id. Sekw. Nr: 52)	57,600
16	208	SCTGSQALL (Id. Sekw. Nr: 202)	48,000
17	441	NMTKLQLAL (Id. Sekw. Nr: 149)	48,000
18	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	48,000
19	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144)	48,000
20	235	CMTWNQMNL (Id. Sekw. Nr: 49)	48,000

PL 201 881 B1

T a b e l a XXXVIII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z mysim MHC klasy I Kk

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	81	AEPHEEQCL (Id. Sekw. Nr: 30)	40,000
2	85	EEQCLSAFT (Id. Sekw. Nr: 65)	40,000
3	429	DELVRHHNM (Id. Sekw. Nr: 53)	20,000
4	315	SETSEKRPF (Id. Sekw. Nr: 209)	20,000
5	261	TEGQSNHST (Id. Sekw. Nr: 221)	20,000
6	410	SEKPFSCRW (Id. Sekw. Nr: 207)	10,000
7	272	ESDNHTTPI (Id. Sekw. Nr: 71)	10,000
8	318	SEKRPFMCA (Id. Sekw. Nr: 208)	10,000
9	138	LESOPAIRN (Id. Sekw. Nr: 132)	10,000
10	233	LECMTWNQM (Id. Sekw. Nr: 131)	10,000
11	298	QDVRRVPGV (Id. Sekw. Nr: 164)	10,000
12	84	HEEQCLSAF (Id. Sekw. Nr: 107)	10,000
13	349	GEKPYQCDF (Id. Sekw. Nr: 91)	10,000
14	289	HTHGVFRGI (Id. Sekw. Nr: 113)	10,000
15	179	EDPMGQQGS (Id. Sekw. Nr: 64)	8,000
16	136	SCLESQPAI (Id. Sekw. Nr: 198)	5,000
17	280	ILCGAQYRI (Id. Sekw. Nr: 116)	5,000
18	273	SDNHTTPIL (Id. Sekw. Nr: 204)	4,000
19	428	SDELVRHHN (Id. Sekw. Nr: 203)	4,000
20	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 206)	4,000

T a b e l a XXXIX

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z mysim MHC klasy I Ld

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	163	TPSHHAAQF (Id. Sekw. Nr: 228)	360,000
2	327	YPGCNKRYF (Id. Sekw. Nr: 250)	300,000
3	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 59)	150,000
4	26	LPVSGAAQW (Id. Sekw. Nr: 138)	93,600
5	278	TPILCGAQY (Id. Sekw. Nr: 227)	72,000
6	141	QPAIRNQGY (Id. Sekw. Nr: 170)	60,000
7	219	TPYSSDNLY (Id. Sekw. Nr: 231)	60,000
8	303	VPGVAPTLV (Id. Sekw. Nr: 242)	60,000
9	120	ASSGQARMF (Id. Sekw. Nr: 40)	50,000
10	63	PPPPPPHSF (Id. Sekw. Nr: 158)	45,000

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XXXIX

1	2	3	4
11	113	GPPPPSQAS (Id. Sekw. Nr: 97)	45,000
12	157	TPSYGHTPS (Id. Sekw. Nr: 229)	39,000
13	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 61)	32,500
14	110	GPFGPPPPS (Id. Sekw. Nr: 96)	30,000
15	82	EPHEEQCLS (Id. Sekw. Nr: 68)	30,000
16	412	KPFSCRWPS (Id. Sekw. Nr: 123)	30,000
17	418	WPSCQKKFA (Id. Sekw. Nr: 246)	30,000
18	221	YSSDNLYQM (Id. Sekw. Nr: 253)	30,000
19	204	TPTDSCTGS (Id. Sekw. Nr: 230)	30,000
20	128	FPNAPYLPS (Id. Sekw. Nr: 79)	30,000

T a b e l a XL

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z bydlęcym HLA A20

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	350	EKPYQCDFK (Id. Sekw. Nr: 66)	1000,000
2	319	EKRPFMCAY (Id. Sekw. Nr: 67)	500,000
3	423	KKFARSDEL (Id. Sekw. Nr: 122)	500,000
4	345	RKHTGEKPY (Id. Sekw. Nr: 184)	500,000
5	390	RKFSRSDHL (Id. Sekw. Nr: 183)	500,000
6	137	CLESQPAIR (Id. Sekw. Nr: 47)	120,000
7	380	VKPFQCKTC (Id. Sekw. Nr: 239)	100,000
8	407	GKTSEKPFS (Id. Sekw. Nr: 95)	100,000
9	335	FKLSHLQMH (Id. Sekw. Nr: 78)	100,000
10	247	LKGVAAGSS (Id. Sekw. Nr: 135)	100,000
11	370	LKRHQRRHT (Id. Sekw. Nr: 136)	100,000
12	258	VKWTEGQSN (Id. Sekw. Nr: 240)	100,000
13	398	LKTHTRTHT (Id. Sekw. Nr: 137)	100,000
14	331	NKRYFKLSH (Id. Sekw. Nr: 145)	100,000
15	357	FKDCERRFS (Id. Sekw. Nr: 77)	100,000
16	385	CKTCQRKFS (Id. Sekw. Nr: 46)	100,000
17	294	FRGIQDVRR (Id. Sekw. Nr: 81)	80,000
18	368	DQLKRHQRR (Id. Sekw. Nr: 60)	80,000
19	432	VRHHNMHQR (Id. Sekw. Nr: 243)	80,000
20	118	SQASSGQAR (Id. Sekw. Nr: 216)	80,000

PL 201 881 B1

T a b e l a XLI

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z mysim MHC klasy I A 0201

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 293)	313,968
2	187	SLGEQQYSV (Id. Sekw. Nr: 299)	285,163
3	10	ALLPAVSSL (Id. Sekw. Nr: 255)	181,794
4	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 284)	68,360
5	292	GVFRGIQDV (Id. Sekw. Nr: 270)	51,790
6	93	TLHFSGQFT (Id. Sekw. Nr: 302)	40,986
7	191	QQYSVPPPV (Id. Sekw. Nr: 290)	22,566
8	280	ILCGAQYRI (Id. Sekw. Nr: 274)	17,736
9	441	NMTKLHYAL (Id. Sekw. Nr: 285)	15,428
10	235	CMTWNQMNL (Id. Sekw. Nr: 258)	15,428
11	7	DLNALLPAV (Id. Sekw. Nr: 261)	11,998
12	242	NLGATLKGM (Id. Sekw. Nr: 283)	11,426
13	227	YQMTSQLEC (Id. Sekw. Nr: 307)	8,573
14	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 286)	8,014
15	309	TLVRSASET (Id. Sekw. Nr: 303)	7,452
16	408	KTSEKPFSC (Id. Sekw. Nr: 277)	5,743
17	340	LQMHSRKHT (Id. Sekw. Nr: 280)	4,752
18	228	QMTSQLECM (Id. Sekw. Nr: 289)	4,044
19	37	VLDFAPPGA (Id. Sekw. Nr: 304)	3,378
20	302	RVSGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 295)	1,869

T a b e l a XLII

Wyniki analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA dla wiązania się ludzkich peptydów WT1 z mysim MHC klasy MHC Class I Db

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	2	3	4
1	221	YSSDNLYQM (Id. Sekw. Nr: 308)	312,000
2	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 293)	260,000
3	235	CMTWNQMNL (Id. Sekw. Nr: 258)	260,000
4	437	MHQRNMTKL (Id. Sekw. Nr: 281)	200,000
5	238	WNQMNLGAT (Id. Sekw. Nr: 305)	12,000
6	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 282)	8,580
7	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 298)	7,920
8	136	SCLESQPTI (Id. Sekw. Nr: 296)	7,920
9	81	AEPHEEQCL (Id. Sekw. Nr: 254)	6,600
10	10	ALLPAVSSL (Id. Sekw. Nr: 255)	6,600

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XLII

1	2	3	4
11	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 294)	6,000
12	441	NMTKLHVAL (Id. Sekw. Nr: 285)	3,432
13	228	QMTSQLECM (Id. Sekw. Nr: 289)	3,120
14	174	HSFKHEDPM (Id. Sekw. Nr: 272)	3,120
15	242	NLGATLKGM (Id. Sekw. Nr: 283)	2,640
16	261	TEGQSNHGI (Id. Sekw. Nr: 301)	2,640
17	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 284)	2,640
18	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 263)	2,600
19	119	QASSGQARM (Id. Sekw. Nr: 288)	2,600
20	18	LGGGGGCGL (Id. Sekw. Nr: 279)	2,600

T a b e l a XLIII

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	329	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 268)	24,000
2	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 284)	10,000
3	420	SCQKKFARS (Id. Sekw. Nr: 297)	3,960
4	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 294)	3,630
5	437	MHQRNMTKL (Id. Sekw. Nr: 281)	3,600
6	387	TCQRKFSRS (Id. Sekw. Nr: 300)	3,600
7	289	HTHGVFRGI (Id. Sekw. Nr: 273)	3,000
8	130	NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 282)	3,400
9	43	PGASAYGSL (Id. Sekw. Nr: 287)	2,400
10	155	DGAPSYGHT (Id. Sekw. Nr: 260)	2,400
11	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 293)	2,200
12	128	FPNAPYLPS (Id. Sekw. Nr: 267)	2,000
13	207	DSCTGSQAL (Id. Sekw. Nr: 263)	1,584
14	3	SDVRDLNAL (Id. Sekw. Nr: 298)	1,584
15	332	KRYFKLSHL (Id. Sekw. Nr: 276)	1,500
16	233	LECMTWNQM (Id. Sekw. Nr: 278)	1,320
17	18	LGGGGGCGL (Id. Sekw. Nr: 279)	1,320
18	242	NLGATLKGM (Id. Sekw. Nr: 283)	1,200
19	123	GQARMFPN (Id. Sekw. Nr: 269)	1,200
20	441	NMTKLHVAL (Id. Sekw. Nr: 285)	1,200

PL 201 881 B1

T a b e l a XLIV

Lp	Początek	Lista podsekwencji	Wynik (Szacunkowy czas połowicznej dysocjacji cząsteczki zawierającej taką podsekwencję)
1	285	QYRIHTHGV (Id. Sekw. Nr: 291)	600,000
2	424	KFARSDELV Id. Sekw. Nr: 275)	288,000
3	334	YFKLSHLQM (Id. Sekw. Nr: 306)	120,000
4	136	SCLESQPTI (Id. Sekw. Nr: 296)	115,200
5	239	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 286)	115,200
6	10	ALLPAVSSL (Id. Sekw. Nr: 255)	115,200
7	47	AYGSLGGPA (Id. Sekw. Nr: 256)	86,400
8	180	DPMGQQGSL (Id. Sekw. Nr: 262)	80,000
9	270	GYESDNHTA (Id. Sekw. Nr: 271)	72,000
10	192	QYSVPPPVY (Id. Sekw. Nr: 292)	60,000
11	326	AYPGCNKRY (Id. Sekw. Nr: 257)	60,000
12	289	HTHGVFRGI (Id. Sekw. Nr: 273)	57,600
13	4	DVRDLNALL (Id. Sekw. Nr: 264)	57,600
14	126	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 293)	57,600
15	209	CTGSQALLL (Id. Sekw. Nr: 259)	48,000
16	86	EQCLSAFTL (Id. Sekw. Nr: 265)	48,000
17	302	RVSGVAPTL (Id. Sekw. Nr: 295)	48,000
18	218	RTPYSSDNL (Id. Sekw. Nr: 294)	48,000
19	272	ESDNHTAPI (Id. Sekw. Nr: 266)	48,000
20	225	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 284)	48,000

T a b e l a XLV

Wyniki analizy TSites przewidywanych miejsc wiązania peptydów dla ludzkich peptydów WT1 zdolnych do wzbudzania odpowiedzi pomocniczych limfocytów T

Peptyd	Sekwencja
1	2
p6-23	RDLNALLPAVPSLGGGG (Id. Sekw. Nr: 1)
p30-35	GAAQWA (Id. Sekw. Nr: 309)
p45-56	ASAYGSLGGPAP (Id. Sekw. Nr: 310)
p91-10S	AFTVHFSGQFTGTAG (Id. Sekw. Nr: 311)
p117-139	PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (Id. Sekw. Nr: 2)
p167-171	HAAQF (Id. Sekw. Nr: 312)
P202-233	CHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 313)
P244-262	GATLKGVAAGSSSSVKWTE (Id. Sekw. Nr: 4)

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XLV

1	2
p287-318	RIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETS (Id. Sekw. Nr: 314)
p333-336	RYFK (Id. Sekw. Nr: 315)
p361-374	ERRFSRSDQLKRHQ (Id. Sekw. Nr: 316)
p389-410	QRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTS (Id. Sekw. Nr: 317)
p421-441	CQKKFARSDELVRHHNMHQRN (Id. Sekw. Nr: 318)

Niektóre peptydy CTL (pokazane w Tabeli XLVI) zostały wybrane do dalszych badań. Dla każdego peptydu z Tabeli XLVI, przedstawiono wyniki otrzymane przy zastosowaniu analizy BIMAS przewidywanego wiązania peptydu HLA.

T a b e l a XLVI

Sekwencje peptydu WT1 i przewidywane wiązanie peptydu z HLA

Peptyd	Sekwencja	Komentarz
p329-337	GCNKRYFKL (Id. Sekw. Nr: 90 i 268)	wynik 24000
p225-233	NLYQMTSQL (Id. Sekw. Nr: 147 i 284)	wiąże się również z HLA klasy II i HLA A2, Kd, wynik 10000
p23S-243	CMTWNQMNL (Id. Sekw. Nr: 49 i 258)	wiąże się również z HLA A2, wynik S,2SS,712
p126-134	RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185 i 293)	wiąże się również z Kd, HLA klasy II i HLA A2, wynik 1990800
p221-229	YSSDNLYQM (Id. Sekw. Nr: 253 i 308)	wiąże się również z Ld, wynik 312000
p228-236	QMTSQLECM (Id. Sekw. Nr: 169 i 289)	wynik 3120
p239-247	NQMNLGATL (Id. Sekw. Nr: 151 i 286)	wiąże się również z HLA A 0201, Kd, wynik 8015
mysia p136-144	SCLESQPTI (Id. Sekw. Nr: 296)	wiąże się również z Kd, 1 różnica w stosunku do ludzkiej
ludzka p136-144	SCLESQPAI (Id. Sekw. Nr: 198)	wynik 7920
mysia p10-18	ALLPAVSSL ( Id. Sekw. Nr: 225)	wiąże się również z Kd, 1 różnica w stosunku do ludzkiej
ludzka p10-18	ALLPAVPSL (Id. Sekw. Nr: 34)	wynik 6600

Wiązanie peptydu do C57B1/6 mysiego MHC potwierdzano wykorzystując linie komórek białaczki RMA-S, jak opisano w Ljunggren et al., Nature 346:476-480, 1990. W skrócie, komórki RMA-S hodowano przez 7 godzin w 26°C w pożywce pełnej uzupełnionej 1% FCS. 10⁶ komórek RMA-S dodawano do każdej studzienki 24-studzienkowej płytki i inkubowano w obecności lub przy braku odpowiedniego peptydu (25 μg/ml) przez 16 godzin w 26°C, a później przez 3 godziny w 37°C w pożywce pełnej. Następnie komórki przepłukiwano trzykrotnie i barwiono przeciwciałami anty D^b lub anty K^b, połączonymi z izotiocyjanianem fluoresceiny (PharMingen, San Diego, CA). Znakowane komórki przemywano dwukrotnie, zawieszano, utrwalano w 500 μl buforu PBS, zawierającego 1% paraformaldehyd i analizowano pod kątem intensywności fluorescencji w cytometrze przepływowym (Becton-Dickinson FACSCalibur®). Procent zwiększenia ilości cząsteczek D^b lub K^b na powierzchni komórek RMA-S mierzono jako wzrost średniej intensywności fluorescencji komórek inkubowanych z peptydem w stosunku do komórek inkubowanych wyłącznie w pożywce.

Myszy immunizowano peptydami zdolnymi do wiązania mysich MHC klasy I. Po immunizacji, komórki śledziony stymulowano in vitro i testowano pod kątem zdolności do lizy komórek docelowych inkubowanych z peptydem WT1. Odpowiedź CTL analizowano w teście wykorzystującym uwalnianie chromu (Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994). 10⁶ komórek docelowych inkubowano w 37°C z 150 μφ chromianu sodu (⁵¹Cr) przez 90 minut, w obecności lub przy braku odpowiedniego peptydu. Komórki przepłukiwano trzykrotnie i zawieszano w pożywce RPMI z 5% płodową surowicą bydlęcą.

PL 201 881 B1

W teście, 10⁴ wyznakowanych ⁵¹Cr komórek docelowych inkubowano z komórkami efektorowymi w różnych gęstościach w objętości końcowej 200 μl na 96-studzienkowej płytce (dno studzienek w kształcie litery „U”). Supernatanty usuwano po 4 do 7 godzinach inkubacji w 37°C i procent specyficznej lizy komórek wyznaczano wg następującego wzoru:

% specyficznej lizy = 100 x (uwalnianie eksperymentalne - uwalnianie spontaniczne)/(uwalnianie maksymalne - uwalnianie spontaniczne).

Wyniki przedstawione w Tabeli XLVII pokazują, że niektóre peptydy WT1 mają zdolność wiązania cząstek MHC klasy I, co jest niezbędne do wywołania odpowiedzi CTL. Dodatkowo, niektóre z peptydów wykazały zdolność do wywoływania CTL (Fig. 9A i 9B), co wykazano za pomocą testów, wykorzystujących uwalnianie chromu. Po immunizacji peptydami p10-18 człowiek, p136-144 człowiek, p136-144 mysz i p235-243, otrzymano specyficzne linie i klony CTL. Powyższe wyniki dowodzą, że odpowiedź CTL specyficzna dla peptydów może zabić komórki nowotworowe wyrażające WT1.

T a b e l a XLVII

Wiązanie peptydów WT1 do antygenów klasy I myszy B6

Peptyd	Powinowactwo do mysich MHC klasy I
Kontrola pozytywna	91%
Kontrola negatywna	0,5-1,3%
p235-243	33,6%
p136-144 mysz	27,9%
p136-144 człowiek	52%
p10-18 człowiek	2,2%
p225-233	5,8%
p329-337	1,2%
p126-134	0,9%
p221-229	0,8%
p228-236	1,2%
p239-247	1%

P r z y k ł a d 5

Wykorzystanie polipeptydu WT1 do wywołania swoistej dla WT1 odpowiedzi CTL u myszy

Poniższy przykład przedstawia zdolność reprezentatywnego polipeptydu WT1 do wywołania odpowiedzi CTL, zdolnej do zabicia komórek nowotworowych, pozytywnych pod względem WT1.

P117-139, peptyd z motywami odpowiadającymi za wiązanie MHC klasy I i MHC klasy II, zidentyfikowano zgodnie z opisem z powyższych przykładów, stosując analizę potencjalnych peptydów wiążących HLA w programach TSites i BIMAS. Myszy immunizowano zgodnie z opisem z przykładu 3. Po immunizacji, komórki śledziony stymulowano in vitro i testowano pod kątem zdolności do lizy komórek docelowych inkubowanych z peptydem WT1, oraz komórek nowotworowych WT1 dodatnich i ujemnych. Odpowiedź CTL analizowano w teście wykorzystującym uwalnianie chromu. Wyniki przedstawione na Fig. 10A-10D, dowodzą, że peptyd p117 może wywołać odpowiedź CTL specyficzna dla WT1, zdolną do zabicia komórek nowotworowych, dodatnich pod względem WT1, przy jednoczesnym braku odpowiedzi w stosunku do komórek ujemnych pod względem WT1. Przytoczone wyniki pokazują, że odpowiedź CTL specyficzna dla peptydów w rzeczywistości może zabić komórki nowotworowe wyrażające WT1 oraz, że terapia oparta na szczepionce i terapia z wykorzystaniem limfocytów T jest skuteczna w stosunku do WT1 dodatnich nowotworów złośliwych.

Podobną immunizację przeprowadzono dla 9-aminokwasowych peptydów wiążących MHC klasy I tj. p136-144, p225-233, p235-243 oraz dla 23-aminokwasowego peptydu p117-139. Po immunizacji, komórki śledziony stymulowano in vitro z każdym z 4 peptydów, a następnie testowano pod kątem zdolności do lizy komórek docelowych inkubowanych z peptydem WT1. Odpowiedzi CTL były

PL 201 881 B1 wywoływane specyficznie w przypadku p136-144, p235-243 i dla p117-139, ale nie dla p225-233. Wyniki CTL dla p235-243 i p117-139 pokazano na Fig. 11A i 11B. Nie przedstawiono wyników dla p136-144 i p225-233.

Analiza lizy komórek przy udziale CTL wykazała, że peptydy docelowe WT1 są obrabiane endogennie i występują w połączeniu z cząsteczkami MHC klasy I komórek nowotworowych. Wspomnianą odpowiedź CTL specyficzną dla peptydu WT1 testowano pod kątem zdolności do lizy, zarówno komórek nowotworowych ujemnych, jak i dodatnich pod względem WT. Odpowiedź specyficzna dla p235-243, powodowała lizę komórek docelowych, inkubowanych z peptydami p235-243, nie powodując lizy komórek linii wyrażających białka WT1 (Fig. 11A). Natomiast odpowiedź specyficzna dla p117-139, powodowała lizę komórek docelowych, inkubowanych z peptydami p235-243, jednocześnie powodując lizę komórek linii wyrażających białka WT1 (Fig. 11B). Jako kontrolę negatywną stosowano odpowiedź CTL, specyficzną dla p117-139, która nie powodowała lizy komórek EL-4 (tu również występujących jako E10), ujemnych pod względem WT1.

Specyficzność lizy komórek swoistych dla WT1 potwierdzano w teście opartym na nie wyznakowanych komórkach docelowych (Fig. 12A i 12B). Komórki efektorowe wysiewano w różnych stosunkach komórek efektorowych do docelowych na 96-studzienkowej płytce (dno studzienek w kształcie litery „U”). Dodawano 10-krotnie większą liczbę komórek docelowych na studzienkę, pokrytych peptydami i nie wyznakowanych ⁵¹Cr, w porównaniu z komórkami wyznakowanymi na studzienkę. Ostatecznie, dodawano 10⁴ wyznakowanych ⁵¹Cr komórek docelowych na studzienkę i inkubowano przez 4 godziny w 37°C w objętości końcowej 200 μl na studzienkę.

Liza komórek TRAMP-C pod wpływem odpowiedzi CTL, specyficznej dla p117-139 była blokowana od 58% do 36% przez EL-4 inkubowanymi z peptydem p117-139, ale nie przez EL-4 inkubowanymi z innym peptydem (Fig. 12A). Podobnie, liza komórek BLK-SV40 była blokowana od 18% do 0% przez EL-4 inkubowanymi z p117-139 (Fig. 12B). Wyniki potwierdzają, że odpowiedź CTL, specyficzna dla peptydu WT1, jest zdolna do zabijania komórek nowotworu złośliwego przez rozpoznawanie poddawanego obróbce WT1.

Kilka segmentów z potencjalnymi motywami CTL jest zawartych w peptydzie p117-139. W celu ustalenia dokładnej sekwencji epitopu CTL, zsyntetyzowano wszystkie możliwe peptydy o długości 9 aminokwasów w oparciu o p117-139 (Tabela XLVIII). Dwa z tych peptydów (p126-134 oraz p130-138) wiązały cząsteczki H-2^b klasy I (Tabela XLVIII). Odpowiedź CTL wywołana immunizacją peptydem p117-139, powodowała lizę komórek docelowych inkubowanych z p126-134 i p130-138, ale nie obserwowano lizy komórek dla innych 9-merowych peptydów zsyntetyzowanych w oparciu o p117-139 (Fig. 13A).

Linię CTL specyficzną dla p117-139, stymulowano ponownie p126-134 albo p130-138. Po ponownej stymulacji obie linie limfocytów T wykazywały zdolność do lizy komórek, ale tylko CTL specyficzne dla p130-138 powodowały lizę komórek nowotworowych dodatnich pod względem WT1 (Fig. 13B oraz 13C). Wyniki te pokazują, że p130-138 jest naturalnym epitopem.

T a b e l a XLVIII

Wiązanie peptydów WT1, o długości 9 aminokwasów, zsyntetyzowanych w oparciu o p117-139 z antygenami klasy I pochodzącymi z myszy B6

Peptyd	Powinowactwo wiązania do mysiego MHC Klasy I
1	2
P117-125 PSQASSGQA (Id. Sekw. Nr: 221)	2%
P118-126 SQASSGQAR (Id. Sekw. Nr: 216)	2%
P119-127 QASSGQARM (Id. Sekw. Nr: 161 i 288)	2%
P120-128 ASSGQARMF (Id. Sekw. Nr: 40)	1%
P121-129 SSGQARMFP (Id. Sekw. Nr: 222)	1%
P122-130 SGQARMFPN (Id. Sekw. Nr: 212)	1%
P123-131 GQARMFPNA (Id. Sekw. Nr: 98 i 269)	1%
P124-132 QARMFPNAP (Id. Sekw. Nr: 223)	1%

PL 201 881 B1

c.d. tabeli XLVIII

1	2
P125-133 ARMFPNAPY (Id. Sekw. Nr: 38)	1%
P126-134 RMFPNAPYL (Id. Sekw. Nr: 185 i 293)	79%
P127-135 MFPNAPYLP (Id. Sekw. Nr: 224)	2%
P128-136 FPNAPYLPS (Id. Sekw. Nr: 79 i 267)	1%
P129-137 PNAPYLPSC (Id. Sekw. Nr: 225)	1%
P130-138 NAPYLPSCL (Id. Sekw. Nr: 144 i 282)	79%
P131-139 APYLPSCLE (Id. Sekw. Nr: 226)	1%

P r z y k ł a d 6

Wykrywanie mRNA specyficznych dla WT1 w mysich liniach komórek nowotworowych

Poniższy przykład przedstawia zastosowanie RT-PCR do wykrywania mRNA, specyficznych dla WT1 w komórkach i liniach komórkowych.

Jednojądrzaste komórki wyizolowano z wykorzystaniem techniki wirowania w gradiencie gęstości, po izolacji natychmiastowo zamrożono i trzymano w -80°C, aż do momentu analizy metodą RT-PCR pod kątem obecności mRNA specyficznych dla WT1. RT-PCR przeprowadzano zgodnie z opisem z Fraizer et al. Blood 86:4704-4706, 1995. Całkowite RNA izolowano z 10⁷ komórek, zgodnie ze standardowymi procedurami. Osady RNA zawieszano w 25 μl wody traktowanej pirowęglanem dietylu i używano w reakcji odwrotnej transkrypcji. Region kodujący motywy palców cynkowych (eksony 7-10) amplifikowano metodą PCR w postaci fragmentu mysiego cDNA o długości 330 pz. Amplifikację przeprowadzono w maszynie do PCR przez jedną, a w razie konieczności, przez dwie rundy PCR. W reakcji używano polimerazy DNA AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 2,5 mM MgCl2 i 20 pmol każdego ze starterów w całkowitej objętości 50 pl. 20 μl porcje z każdej reakcji PCR poddawano elekroforezie w 2% żelu agarozowym i barwiono bromkiem etydyny. Żele dokumentowano na filmie Polaroid (Polaroid 667, Polaroid Ltd., Hertfordshire, England). Aby zabezpieczyć się przed zanieczyszczeniem podjęto środki ostrożności polecane przez Kwok i Higuchi, Nature 339:237-238, 1989. W każdym eksperymencie stosowano kontrole ujemne zawierające cDNA i bufory do PCR z wodą zamiast cDNA. Aby uniknąć fałszywych wyników ujemnych, obecność nienaruszonego RNA i odpowiedniego cDNA sprawdzano w każdej próbce poprzez kontrolną reakcję PCR ze starterami do β-aktyny. Próbki, w których nie amplifikowała się β-aktyna, wykluczono z dalszej analizy.

Startery do amplifikacji WT1 w mysich liniach komórkowych to: P115: 1458-1478: CCC AGG CTG CAA TAA GAG ATA 3' (starter lewy; Id. Sekw. Nr: 21) i P116: 1767-1787: 5' ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3' (starter prawy; Id. Sekw. Nr: 22) (patrz Inoue et al. Blood 88:2267-2278, 1996; Fraizer et al., Blood 86: 4704-4706, 1995).

Startery do beta aktyny, używane w reakcjach kontrolnych, to: 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3' (starter lewy; Id. Sekw. Nr: 23) i 5' GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3' (starter prawy; Id. Sekw. Nr: 24).

Startery używane do amplifikacji ludzkiego WT1: P117: 954-974: 5' GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3' (Id. Sekw. Nr: 25) i P118: 1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3' (Id. Sekw. Nr: 5). W gniazdowym RT-PCR, starterami mogą być: P119: 1023-1043: 5' GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3' (Id. Sekw. Nr: 26) I P120: 1345-1365: 5' TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3' (Id. Sekw. Nr: 27).

Tabela XLVIII przedstawia wyniki analizy PCR dla WT1 w mysich liniach komórek nowotworowych. W Tabeli, (+++) oznacza silną amplifikację WT1 w pierwszej rundzie RT-PCR, (++) oznacza amplifikację WT1 w pierwszej rundzie RT-PCR, (+) oznacza, że produkt amplifikacji wykrywano tylko w drugiej rundzie RT-PCR, a (-) oznacza brak amplifikacji WT1.

PL 201 881 B1

T a b e l a XLIX

Wykrywanie mRNA WT1 w mysich liniach komórek nowotworowych

Linia komórkowa	mRNA WT1
K562 (ludzka białaczka; ATCC): kontrola dodatnia; (Lozzio i Lozzio, Blood 45:321-334,1975)	+++
TRAMPC (prostata transformowana SV40, B6); Foster et al., Cancer Res. 57:3325-3330,1997	+++
BLK-SV40 HD2 (fibroplasty transformowane SV40, B6; ATCC); Nature 276:510-511,1978	++
CTLL (limfocyty T, B6; ATCC); Gillis, Nature 268:154-156,1977	+
FM (podlinia FBL-3, białaczka, B6); Glynn i Ferer, Cancer Res. 28:434-439,1968	+
BALB 3T3 (ATCC); Aaroston i Todaro, J. Cell. Physiol. 72:141-148,1968	+
S49.1 (chłoniak, limfocyt T, B/C; ATCC); Horibata i Harris, Exp. Cell. Res. 60:61,1970	+
BNL CL. 2 (wątroba embrionalna, B/C, ATCC); Nature 276:510-511, 1978	+
MethA (mięsak, B/C); Old et al., Ann. NY Acad. Sci. 101:80-106,1962	-
P3.6.2.8.1 (szpiczak, B/C; ATCC); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66:344, 1970	-
P2N (białaczka, DBA/2; ATCC); Melling et al., J. Immunol. 117:1267-1274,1976	-
BCL1 (chłoniak, B/C; ATCC); Slavin i Strober, Nature 272:624-626,1977	-
LSTRA (chłoniak, B/C); Glynn et al., Cancer Res. 28:434-439,1968	-
E10/EL-4 (chłoniak, B6); Glynn et al., Cancer Res. 28:434-439,1968	-

Będzie oczywiste na podstawie powyższego, że jakkolwiek konkretne wykonania wynalazku zostały tu opisane w celu ilustracji, można dokonać różnych modyfikacji nie odbiegając od ducha i zakresu wynalazku. A zatem niniejszy wynalazek ma być ograniczony jedynie przez załączone zastrzeżenia.

PL 201 881 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Gaiger, Alexander Cheever, Martin A.

<120

Gly

<130>	210121.465C1
<140>	US
<141>	1999-03-25
<160>	326
<170>	FastSEQ for Windows
<210>	1
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Homo sapieni
<400>	1
Asp Leu	Asn Ala Leu Leu Pro

	<210>	2
	<211>	23
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapiens
	<400>	2
Pro	Ser Gin	Ala	Ser Ser
1			5
Tyr	Leu Pro	Ser	Cys Leu
		20

	<210>	3
	<211>	23
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	3
Pro	Ser Gin	Ala	Ser	Ser	Gly
1			5
Tyr	Leu Pro	Ser	Cys	Leu	Glu

	<210>	4
	<211>	19
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapienS
	<400>	4
Gly	Ala Thr	Leu	Lys Gly Val
1			5
Trp	Thr Glu
	<210>	5

PL 201 881 B1 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gagagtcaga cttgaaagca gt

<210>	6
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	6

ctgagcctca gcaaatgggc

<210>	7
<211>	27
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	7

gagcatgcat gggctccgac gtgcggg

<210>	8
<211>	25
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	8

ggggtaccca ctgaacggtc cccga

<210>	9
<211>	18
<212>	DNA
<213>	Mus musculus
<400>	9

tccgagccgc acctcatg

<210>	10
<211>	18
<212>	DNA
<213>	Mus musculus
<400>	10

gcctgggatg ctggactg

<210>	11
<211>	27
<212>	DNA
<213>	Mus musculus
<400>	11

gagcatgcga tgggttccga cgtgcgg

<210>	12
<211>	29
<212>	DNA
<213>	Mus musculus
<400>	12

ggggtacctc aaagcgccac gtggagttt

PL 201 881 B1 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13

Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly 15 10 15

Gly <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14

Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys 15 10 15

Trp Thr Glu <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapier©

Arg 1	<400> Ile His	15 Thr	His Gly Val 5	Phe	Arg	Gly 10	Ile	Gin	Asp	Val	Arg 15
	<210>	16
	<211>	15
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	16
Arg	Ile His	Thr	His Gly Val	Phe	Arg	Gly	Ile	Gin	Asp	Val	Arg
1			5			10					15
	<210>	17
	<211>	14
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	17
Val	Arg Arg	Val	Ser Gly Val	Ala	Pro	Thr	Leu	Val	Arg	Ser
1			5			10
	<210>	18
	<211>	14

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser 15 10 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 201 881 B1 <400> 19

Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His 15 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20

Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His 15 10 15 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 cccaggctgc aataagagat a

<210>	22
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Mus musculus
<400>	22

atgttgtgat ggcggaccaa t

<210>	23
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	23

gtggggcgcc ccaggcacca

<210>	24
<211>	24
<212>	DNA
<213>	Homo sapieni
<400>	24

gtccttaatg ctacgcacga tttc

<210>	25
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	25

ggcatctgag accagtgaga a

<210>	26
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	26

gctgtcccac ttacagatgc a

PL 201 881 B1

<210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 27

tcaaagcgcc agctggagtt t <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29

Ala Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe

5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30

Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Ala Ile Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr 1 5

PL 201 881 B1 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34

Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35

Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu 1 5 <210> 36 <211> 9 o i ''Ί ν. rinm rrw <213> Homo sapiens <400> 36

Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe Lys 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37

Ala Gin Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38

Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39

Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 1 5

PL 201 881 B1 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41

Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42

Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43

Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44

Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45

Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47

Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala Ile Arg

PL 201 881 B1

5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48

Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49

Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50

Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51

Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52

Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53

Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54

PL 201 881 B1

Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj>

<400> 55

Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien) <400> 56

Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien5 <400> 57

Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien) <400> 58

Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 59

Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 60

Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^

PL 201 881 B1 <400> 61

Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62

Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienS <400> 63

Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 64

Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 65

Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj) <400> 66

Glu Lys Pro Tyr Gin Cys Asp Phe Lys <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapierć>

<400> 67

Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tvr 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj

PL 201 881 B1 <400> 68

Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj <400> 69

Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 70

Glu Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien<, <400> 71

Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 72

Glu Ser Gin Pro Ala Ile Arg Asn Gin 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 73

Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400>. 74

Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT

PL 201 881 B1 <213> Homo sapienę <400> 75

Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Ara 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienf <400> 76

Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj <400> 77

Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj» <400> 78

Phe Lys Leu Ser His Leu Gin Met His 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 79

Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 80

Phe Gin Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys ¹ 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien_5 <400> 81

Phe Arg Gly Ile Gin Asp Val Arg Arg 1 5 <210> 82 <211> 9

PL 201 881 B1

	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien£
	<400>	82
Phe	Ser Gly	Gin	Phe Thr Gly
1			5
	<210>	83
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapieri?
	<400>	83
Phe	Ser Arg	Ser	Asp Gin Leu

<210>

<211>

<212>

<213>

<400> Phe Thr Gly

PRT

Homo sapien^

Thr Ala Gly Ala Cys Arg 5 <210>

<211>

<212>

<213>

<400> Phe Thr Val

PRT

Homo sapiens

His Phe Ser Gly Gin Phe 5 <210>

<211>

<212>

<213>

<400> Gly Ala Ala

PRT

Homo sapien£

Gin Trp Ala Pro Val Leu 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiepi <400> 87

Ala Glu	Pro	His Glu Glu 5	Gin	Cys
<210>	88
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapier/>
<400>	88
Ala Thr	Leu	Lys Gly Val	Ala	Ala
		5
<210>	89

PL 201 881 B1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienę <400> 89

Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 90

Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu 1 5 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 91

Gly Glu Lys Pro Tyr Gin Cys Asp Phe

5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj <400> 92

Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapierjS <400> 93

Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj>

<400> 94

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj?

<400> 95

Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser 1 5

PL 201 881 B1 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien£ <400> 96

Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 97

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser 1 5 <210> 98 <211> 9 <213> Homo sapien^ <400> 98

Gly Gin Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienC, <400> 99

Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens, <400> 100

Gly Gin Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 101

Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala ¹ 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien)>

<400> 102

Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr ¹ 5

PL 201 881 B1 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienS, <400> 103

Gly Val Phe Arg Gly Ile Gin Asp Val 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 104

Gly Val Lys Pro Phe Gin Cys Lys Thr 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 105

Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Ala 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien5 <400> 106

Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienś, <400> 107

His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien,$>

<400> 108

His His Asn Met His Gin Arg Asn Met 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapieni’ <400> 109

His Gin Arg Arg His Thr Gly Val Lys

PL 201 881 B1

<210>	110
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapien^
<400>	110
Ser Phe	Lys	His Glu Asp

<210> 111 .

<211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj <400> 111

His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 112

His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gin Cys 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien<;

<400> 113

His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienc, <400> 114

His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien$ <400> 115

Thr Thr	Pro	Ile Leu Cys 5
<210>	116
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapien }
<400>	116

PL 201 881 B1

Ile Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Ara Ile 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien( <400> 117

Ile Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapierj <400> 118

Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiet£>

<400> 119

Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 1 5 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 120

Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 121

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin 1 5 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien$ <400> 122

Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu 1 . 5 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^

PL 201 881 B1

<400>	123
Pro Phe	Ser	Cys Arg Trp
		5
<210>	124
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapien£

<400> 124

Lys Pro Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj <400> 125

Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiei^ <400> 126

Lys 1	Arg His	Gin	Arg 5	Arg	His
	<210>	127
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Home	> sapien£
	<400>	127
Lys	Arg Tyr	Phe	Lys	Leu	Ser

<210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj <400> 128

Lys	Thr Cys	Gin	Arg Lys Phe
1			5
	<210>	129
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapiens,
	<400>	129
Lys	Thr Ser	Glu	Lys Pro Phe
1			5
	<210>	130
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^

PL 201 881 B1

<400> Asp Phe	130 Ala	Pro Pro Gly Ala 5	Ser
<210>	131
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapienc;
<400>	131
Glu Cys	Met	Thr Trp Asn Gin	Met

<210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 132

Glu Ser	Gin	Pro Ala Ile 5	Arg	Asn
<210>	133
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapien^
<400>	133
Gly Ala	Thr	Leu Lys Gly	Val	Ala

<210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 134

Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 135

Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser ¹ 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 136

Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr 1 5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT

PL 201 881 B1 <213> Homo sapiens, <400> 137

Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr 1 5 .

<210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj <400> 138

Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gin Trp 1 5 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens, <400> 139

Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr 1 5 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj, <400> 140

Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn 1 5 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 141

Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arq 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^>

<400> 142

Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys 1 5 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 143

Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu 1 5 <210> 144 <211> 9

PL 201 881 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens, <400> 144

Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu 1 5 <210 145 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien>

<400> 145

Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Homo śapienj <400 146

Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj) <400 147

Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu 1 5 <210 148 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien£ <400> 148

Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys 1 5 <210 149 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 149

Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala Leu 1 5 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400 150

Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe 1 5 <210> 151

PL 201 881 B1

	<211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj
	<400>	151
Asn	Gin Met	Asn	Leu Gly	Ala
1	<210>	152	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Home	i sapien^
	<400>	152
Pro	Ala Ile	Arg	Asn Gin	Gly
1	<210>	153	5

	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapienj
	<400>	153
Pro	Gly Ala	Ser	Ala Tyr	Gly
1	<210>	154	5

	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	154
Pro	His Glu	Glu	Gin Cys	Leu
1	<210>	155	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapierKj
	<400>	155
Pro	Ile Leu	Cys	Gly Ala	Gin
1	<210>	156	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	156
Pro	Pro Pro	Pro	His Ser	Phe
1	<210>	157	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	157
Pro	Pro Pro	Pro	Pro His	Ser
1			5

Thr Leu

Tyr Ser

Ser Ala

Tyr Arg

Ile Lys

Phe Ile

Ser Leu

PL 201 881 B1 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^' <400> 158

Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe 1 5 <210> 159 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien/ <400> 159

Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien£ <400> 160

Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr 1 5 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapieiy <400> 161

Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met ¹ 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienę <400> 162

Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg ¹ 5 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien/ <400> 163

Gin Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe 1 5 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 164

Gin Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val 1 5

PL 201 881 B1 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien£ <400> 165

Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys 1 5 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien<J <400> 166

Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr 1 5 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapier^ <400> 167

Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 1 5 <210> 168 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj, <400> 168

Gin Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys 1 5 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 169

Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met 1 5 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj>

<400> 170

Gin Pro Ala Ile Arg Asn Gin Gly Tyr 1 5 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapier/>

<400> 171

Gin Gin Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val

PL 201 881 B1 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien) <400> 172

Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His 1 5 <210> 173 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 173

Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu 1 5 <210> 174 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapieny <400> 174

Gin Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala 1 5 <210> 175 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj <400> 175

Gin Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val 1 5 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 176

Gin Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tvr 1 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^j <400> 177

Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala 1 5 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien/> <400> 178

PL 201 881 B1

Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu Lys 1 5 <210> 179 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 179

Arg Gly Ile Gin Asp Val Arg Arg Val 1 5 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapier^ <400> 180

Arg His His Asn Met His Gin Arg Asn 1 5 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien$ <400> 181

Arg 1	His Gin	Arg	Arg His Thr 5
	<210>	182
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	182
Arg	Ile His	Thr	His Gly Val
1			5
	<210>	183
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^

<400> 183

Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 <210> 184 <211> 9 <212> PRT

	<213>	Homo	sapien^
	<400>	184
Arg	Lys His	Thr	Gly Glu Lys
1			5
	<210>	185
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^

PL 201 881 B1

<400> 185	Pro
Arg 1	Met Phe	Pro	Asn Ala 5
	<210>	186
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	186
Arg	Asn Met	Thr	Lys Leu	Gin
1			5
	<210>	187
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	187
Arg	Arg Phe	Ser	Arg Ser	Asp
1			5
	<210>	188
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien£
	<400>	188
Arg	Arg His	Thr	Gly Val	Lys
1			5
	<210>	189
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapienS
	<400>	189
Arg	Arg Val	Pro	Gly Val	Ala
1			5
	<210>	190
	ζϋτ 1 s	n
	' Ł- X X
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	190
Arg	Ser Ala	Ser	Glu Thr	Ser
1			5
	<210>	191
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapier£>
	<400>	191
Arg	Ser Asp	Glu	Leu Val	Arg
1			5
	<210>	192
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien<>

Tyr Leu

Leu Ala

Gin Leu

Pro Phe

Pro Thr

Glu Lys

His His

PL 201 881 B1

	<400>	192
Arg	Ser Asp	His	Leu Lys Thr
1			5
	<210>	193
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien$
	<400>	193
Arg	Ser Asp	Gin	Leu Lys Arg
1			5
	<210>	194
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	194
Arg	Thr Pro	Tyr	Ser Ser Asp
1			5
	<210>	195
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	195
Arg	Val Pro	Gly	Val Ala Pro
1			5
	<210>	196
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien5
	<400>	196
Arg	Trp Pro	Ser	Cys Gin Lys
1			5
	<210>	197
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien<,
	<400>	197
Ser	Ala Ser	Glu	Thr Ser Glu
1			5
	<210>	198
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	198
Ser	Cys Leu	Glu	Ser Gin Pro
1			5
	<210>	199
	<211>	9
	<212>	PRT

His Thr

His Gin

Thr Leu

Lys Phe

Lys Arg

Ala Ile

Asn Leu

PL 201 881 B1

	<213>	Homo	sapien
	<400>	199
Ser	Cys Leu	Glu	Ser Gin	Pro
1			5
	<210>	200
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien$
	<400>	200
Ser	Cys Gin	Lys	Lys Phe	Ala
1			5
	<210>	201
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapienf
	<400>	201
Ser	Cys Arg	Trp	Pro Ser	Cys
1			5
	<210>	202
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	202
Ser	Cys Thr	Gly	Ser Gin	Ala
1			5
	<210>	203
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien<
	<400>	203
Ser	Asp Glu	Leu	Val Arg	His
1			5
	<210>	204
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien/;
	<400>	204
Ser	Asp Asn	His	Thr Thr	Pro
1			5
	<210>	205
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien*?
	<400>	205
Ser	Asp Asn	Leu	Tyr Gin	Met
1			5
	<210>	206
	<211>	9

Thr Ile

Arg Ser

Gin Lys

Leu Leu

His Asn

Ile Leu

Thr Ser

PL 201 881 B1

	<212> <213>	PRT Homo	sapien^
	<400>	206
Ser	Asp Val	Arg	Asp Leu	Asn
1			5
	<210>	207
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapierf,
	<400>	207
Ser	Glu Lys	Pro	Phe Ser	Cys

<210> 208 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 208

Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala 1 5 <210> 209 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapier^ <400> 209

Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe 1 5 <210> 210 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien£ <400> 210

Ser Phe Ile Lys Gin Glu Pro Ser Trp 1 5 <210> 211 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 211

Ser Gly Ala Ala Gin Trp Ala Pro Val 1 5 <210> 212 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 212

Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe Pro Asn 1 5 <210> 213

PL 201 881 B1

<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapien^
<400>	213
His His	Ala Ala Gin Phe
		5
<210>	214
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Homo	sapien^

<400> 214

Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val 1 5 <210> 215 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienjj <400> 215

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala

5 <210> 216 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 216

Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg 1 5 <21O> 217 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien$ <400> 217

Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gin Met Thr 1 5 <210> 218 <211> 9 <212> PRT <213> Homo s apient, <400> 218

Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys 1 5 <210> 219 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^.

<400> 219

Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser 1 5

PL 201 881 B1 <210>

<211>

<212>

<213>

<400> Thr Asp Ser

220

PRT

Homo sapien^¹

220

Cys Thr Gly Ser Gin Ala 5 <210> 221 <211> 9 <212> PRT

	<213>	Homo	sapien^
	<400>	221
Thr	Glu Gly	Gin	Ser Asn His	Ser	Thr
1			5
	<210>	222
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapienc,
	<400>	222
Thr	Gly Lys	Thr	Ser Glu Lys	Pro	Phe

<210>

<211>

<212>

<213>

<400> Thr Gly Ser <210>

<211>

<212>

<213>

<400> Thr Gly Thr <210>

<211>

<212>

<213>

<400> Thr Gly Tyr <210>

<211>

<212>

<213>

<400> Thr Leu Val

223 9

PRT Homo sapie

223

Gin Ala Leu Leu Leu Arg 5

224

PRT

Homo sapierA,

224

Ala Gly Ala Cys Arg Tyr 5

225

PRT

Homo sapien^

225

Glu Ser Asp Asn His Thr 5

226 9

PRT Homo sap ien^

226

Arg Ser Ala Ser Glu Thr 5

PL 201 881 B1

	<210> 227
<211> <212> <213>	9 PRT Homo	sapien£
	<400>	227
Thr	Pro Ile	Leu	Cys Gly Ala
1			5
	<210>	228
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapienj>
	<400>	228
Thr	Pro Ser	His	His Ala Ala
1			5
	<210>	229
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	229
Thr	Pro Ser	Tyr	Gly His Thr
1			5
	<210>	230
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	230
Thr	Pro Thr	Asp	Ser Cys Thr
1			5
	<210>	231
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien
	<400>	231
Thr	Pro Tyr	Ser	Ser Asp Asn
1			5
	<210>	232
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapienj^
	<400>	232
Thr	Ser Glu	Lys	Pro Phe Ser
1			5
	<210>	233
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapienM
	<400>	233
Thr	Ser Glu	Lys .	Arg Pro Phe

Gin Tyr

Gin Phe

Pro Ser

Gly Ser

Leu Tyr

Cys Arg

Met Cys

PL 201 881 B1

5 <210> 234 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj <400> 234

Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp 1 5 <210> 235 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiegi <400> 235

Thr Val His Phe Ser Gly Gin Phe Thr 1 5 <210> 236 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj <400> 236

Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val 1 5 <210> 237 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 237

Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala 1 5 <210> 238 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienS <400> 238

Val Phe Arg Gly Ile Gin Asp Val Arg 1 5 <210> 239 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienj>

<400> 239

Val Lys Pro Phe Gin Cys Lys Thr Cys 1 5 <210> 240 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^S <400> 240

PL 201 881 B1

Val	Lys Trp	Thr	Glu Gly	Gin
1			5
	<210>	241
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	• sapienj
	<400>	241
Val	Leu Asp	Phe	Ala Pro	Pro
1			5
	<210>	242
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapier^
	<400>	242
Val	Pro Gly	Val	Ala Pro	Thr
1			5
	<210>	243
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapienę

<400> 243

Val Arg His His Asn Met His Gin Ara 1 5 <210> 244 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 244

Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 1 5 <210> 245 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien^ <400> 245

Trp Asn Gin Met Asn Leu Gly Ala Thr ¹ 5 <210> 246 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapien5 <400> 246

Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ale ¹ 5 <210> 247 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapienjś

PL 201 881 B1

<400> 247 Trp Thr Glu Gly Gin Ser	Asn
1	5
	<210>	248
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	> sapien^
	<400>	248
Tyr	Phe Lys	Leu	Ser His	Leu
1			5
	<210>	249
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	249
Tyr	Gly His	Thr	Pro Ser	His
1			c
			u
	<210>	250
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien/
			/
	<400>	250
Tyr	Pro Gly	Cys	Asn Lys	Arg
1			5
	<210>	251
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien(
	<400>	251
Tyr	Gin Met	Thr	Ser Gin	Leu
1			5
	<210>	252
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
			/
	<400>	252
Tyr	Arg Ile	His	Thr His	Gly
1			5
	<210>	253
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapien^
	<400>	253
Tyr	Ser Ser	Asp	Asn Leu	Tyr
1			5
	<210>	254
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus

His Ser

Gin Met

His Ala

Tyr Phe

Glu Cys

Val Phe

Gin Met

PL 201 881 B1

	<400>	254
Ala	Glu Pro	His	Glu Glu Gin	Cys	Leu
1			5
	<210>	255
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	255
Ala	Leu Leu	Pro	Ala Val Ser	Ser	Leu
1			5
	<210>	256
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	256
Ala	Tyr Gly	Ser	Leu Gly Gly	Pro	Ala
1			5
	<210>	257
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	257
Ala	Tyr Pro	Gly	Cys Asn Lys	Arg	Tyr
1			5
	<210>	258
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	258
Cys	Met Thr	Trp	Asn Gin Met	Asn	Leu
1			5
	<210>	259
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	259
Cys	Thr Gly	Ser	Gin Ala Leu	Leu	Leu
1			5
	<210>	260
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	260
Asp	Gly Ala	Pro	Ser Tyr Gly	His	Thr
1			5
	<210>	261
	<211>	9
	<212>	PRT

PL 201 881 B1

	<213>	Mus	musculus
	<400>	261
Asp	Leu Asn	Ala	Leu Leu Pro	Ala	Val
1			5
	<210>	262
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	262
Asp	Pro Met	Gly	Gin Gin Gly	Ser	Leu
1			5
	<210>	263
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	263
Asp	Ser Cys	Thr	Gly Ser Gin	Ala	Leu
1			5
	<210>	264
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	264
Asp	Val Arg	Asp	Leu Asn Ala	Leu	Leu
1			5
	<210>	265
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	265
Glu	Gin Cys	Leu	Ser Ala Phe	Thr	Leu
1			5
	<210>	266
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	266
Glu	Ser Asp	Asn	His Thr Ala	Pro	Ile
1			5
	<210>	267
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	267
Phe	Pro Asn	Ala	Pro Tyr Leu	Pro	Ser
1			5
	<210>	268
	<211>	9

PL 201 881 B1

	<212> PRT <213> Mus	musculus
	<400>	268
Gly	Cys Asn	Lys	Arg Tyr Phe	Lys	Leu
1			5
	<210>	269
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	269
Gly	Gin Ala	Arg	Met Phe Pro	Asn	Ala
1			5
	<210>	270
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	270
Gly	Val Phe	Arg	Gly Ile Gin	Asp	Val
1			5
	<210>	271
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	271
Gly	Tyr Glu	Ser	Asp Asn His	Thr	Ala
1			5
	<210>	272
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	272
His	Ser Phe	Lys	His Glu Asp	Pro	Met
1			5
	<210>	273
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	273
His	Thr His	Gly	Val Phe Arg	Gly	Ile
1			5
	<210>	274
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	274
Ile	Leu Cys	Gly	Ala Gin Tyr	Arg	Ile
1			5
	<210>	275

PL 201 881 B1 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 275

Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 1 5 <210> 276 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 276

Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu 1 5 <210> 277 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 277

Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 1 5 <210> 278 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 278

Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin Met 1 5 <210> 279 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 279

Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu 1 5 <210> 280 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 280

Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr 1 5 <210> 281 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 281

Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu 1 5

PL 201 881 B1

	<210>	282
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	282
Asn	Ala Pro	Tyr	Leu Pro Ser Cys	Leu
1			5
	<210>	283
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	283
Asn	Leu Gly	Ala	Thr Leu Lys Gly	Met
1			5
	<210>	284
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	284
Asn	Leu Tyr	Gin	Met Thr Ser Gin	Leu
1			5
	<210>	285
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	285
Asn	Met Thr	Lys	Leu His Val Ala	Leu
1			5
	<210>	286
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	286
Asn	Gin Met	Asn	Leu Gly Ala Thr	Leu
1			5
	<210>	287
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	287
Pro	Gly Ala	Ser	Ala Tyr Gly Ser	Leu
1			5
	<210>	288
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	288
Gin	Ala Ser	Ser	Gly Gin Ala Arg	Met
1			5

PL 201 881 B1 <210> 289 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 289

Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met 1 5 <210> 290 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 290

Gin Gin Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val 1 5 <210> 291 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 291

Gin Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val 1 5 <210> 292 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 292

Gin Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr 1 5 <210> 293 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 293

Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 294 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 294

Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu 1 5 <210> 295 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 295

Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu

PL 201 881 B1

<210>	296
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Mus	musculus
<400>	296
Cys Leu	Glu	Ser Gin Pro	Thr	Ile
		5
<210>	297
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Mus	musculus
<400>	297
Cys Gin	Lys	Lys Phe Ala	Arg	Ser

<211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 298

Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu 1 5 <210> 299 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 299

Ser Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Val 1 5 <210> 300 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 300

Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser 1 5 <210> 301 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 301

Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Gly Ile 1 5 <210> 302 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 302

PL 201 881 B1

Thr 1	Leu His	Phe	Ser 5	Gly	Gin	Phe	Thr
	<210>	303
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	303
Thr	Leu Val	Arg	Ser	Ala	Ser	Glu	Thr
1	<210>	304	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	304
Val	Leu Asp	Phe	Ala	Pro	Pro	Gly	Ala
1	<210>	305	5

	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	305
Trp	Asn Gin	Met	Asn	Leu	Gly	Ala	Thr
1	<210>	306	5

	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	306
Tyr	Phe Lys	Leu	Ser	His	Leu	Gin	Met
1	<210>	307	5
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Mus	musculus
	<400>	307
Tyr	Gin Met	Thr	Ser	Gin	Leu	Glu	Cys
1			5

Tyr

PL 201 881 B1

	<400>	309
Gly	Ala Ala	Gin	Trp Ala
1	<210>	310	5
	<211>	12
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapiens
	<400>	310
Ala	Ser Ala	Tyr	Gly Ser	Leu	Gly	Gly
1	<210>	311	5

	<211>	15
	<212>	PRT
	<213>	Home	' sapiens
	<400>	311
Ala	Phe Thr	Val	His Phe	Ser	Gly	Gin
1	<210>	312	5

	<211>	5
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapiens
	<400>	312
His	Ala Ala	Gin	Phe
1	<210>	313	5
	<211>	32
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapiens
	<400>	313
Cys	His Thr	Pro	Thr Asp	Ser	Cys	Thr
1			5
Arg	Thr Pro	Tyr	Ser Ser	Asp	Asn	Leu
		20				25
	<210>	314
	<211>	32
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapiens
	<400>	314
Arg	Ile His	Thr	His Gly	Val	Phe	Arg
1			5
Val	Pro Gly	Val	Ala Pro	Thr	Leu	Val
		20				25
	<210>	315
	<211>	4
	<212>.	PRT
	<213>	Homo	sapiens
	<400>	315
Arg	Tyr Phe	Lys
1

Pro Ala Pro 10

Phe Thr Gly Thr Ala Gly 10 15

Gly	Ser	Gin	Ala	Leu	Leu	Leu
10					15
Tyr	Gin	Met	Thr	Ser 30	Gin	Leu

Gly 10	Ile	Gin	Asp	Val	Arg 15	Arg
Arg	Ser	Ala	Ser	Glu 30	Thr	Ser

100

PL 201 881 B1

	<210> 316 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens
	<400>	316
Glu	Arg Arg	Phe	Ser	Arg	Ser	Asp
1	<210>	317	5

	<211>	22
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapiens
	<400>	317
Gin	Arg Lys	Phe	Ser	Arg	Ser	Asp
1			5
His	Thr Gly	Lys	Thr	Ser
		20
	<210>	318
	<211>	21
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapiens
	<400>	318
Cys	Gin Lys	Lys	Phe	Ala	Arg	Ser
1			5
Met	His Gin	Arg	Asn
		20
	<210>	319
	<211>	449
	<212>	PRT
	<213>	Homo sapiens
	<400>	319
Met	Gly Ser	Asp	Val	Arg	Asp	Leu
1			5
Ser	Leu Gly	Gly	Gly	Gly	Gly	Cys
		20
Gin	Trp Ala	Pro	Val	Leu	Asp	Phe
	35				40
Gly	Ser Leu	Gly	Gly	Pro	Ala	Pro
	50			55
Pro	Pro Pro	Pro	His	Ser	Phe	Ile
65				70
Ala	Glu Pro	His	Glu	Glu	Gin	Cys
			85
Ser	Gly Gin	Phe	Thr	Gly	Thr	Ala
		100
Gly	Pro Pro	Pro	Pro	Ser	Gin	Ala
	115					120
Pro	Asn Ala	Pro	Tyr	Leu	Pro	Ser
	130			135
Arg	Asn Gin	Gly	Tyr	Ser	Thr	Val
145			150
Gly	His Thr	Pro	Ser	His	His	Ala
			165
Lys	His Glu	Asp	Pro	Met	Gly	Gin
		180
Tyr	Ser Val	Pro	Pro	Pro	Val	Tyr

Gin Leu Lys Arg His Gin 10

His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr 10 15

Asp Glu Leu Val Arg His His Asn 10 15

Asn	Ala 10	Leu	Leu	Pro	Ala	Val 15	Pro
Ala 25	Leu	Pro	Val	Ser	Gly 30	Ala	Ala
Ala	Pro	Pro	Gly	Ala 45	Ser	Ala	Tyr
Pro	Pro	Ala	Pro 60	Pro	Pro	Pro	Pro
Lys	Gin	Glu 75	Pro	Ser	Trp	Gly	Gly 80
Leu	Ser 90	Ala	Phe	Thr	Val	His 95	Phe
Gly 105	Ala	Cys	Arg	Tyr	Gly 110	Pro	Phe
Ser	Ser	Gly	Gin	Ala 125	Arg	Met	Phe
Cys	Leu	Glu	Ser 140	Gin	Pro	Ala	Ile
Thr	Phe	Asp 155	Gly	Thr	Pro	Ser	Tyr 160
Ala	Gin 170	Phe	Pro	Asn	His	Ser 175	Phe
Gin 185	Gly	Ser	Leu	Gly	Glu 190	Gin	Gin
Gly	Cys	His	Thr	Pro	Thr	Asp	Ser

PL 201 881 B1

101

Cys

195

200

205

Thr 210

Gly

Ser

Gin

Ala

Leu 215

Leu

Arg

Thr

Pro 220

Tyr

Ser

Asp

Asn 225

Leu

Tyr

Gin

Met

Thr 230

Ser

Gin

Leu

Glu

Cys 235

Met

Thr

Trp

Asn

Gin 240

Met

Asn

Leu

Gly

Ala

Thr

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gly

Ser

Val

245

250

255

Lys

Trp

Thr

Glu

Gly

Gin

Ser

Asn

His

Ser

Thr

Gly

Tyr

Glu

Ser

260

265

270

Asp

Asn

His

Thr

Pro

Ile

Leu

Cys

Gly

Ala

Gin

Tyr

Arg

Ile

His

275

280

285

Thr

His

Gly

Val

Phe

Arg

Gly

Ile

Gin

Asp

Val

Arg

Val

Pro

290

295

300

Gly

Val

Ala

Pro

Thr

Leu

Val

Arg

Ser

Ala

Ser

Glu

Thr

Ser

Glu

Lys

305

310

315

320

Arg

Pro

Phe

Met

Cys

Ala

Tyr

Pro

Gly

Cys

Asn

Lys

Arg

Tyr

Phe

Lys

Leu

325

330

335

Ser

His

Leu

Gin

Met

His

Ser

Arg

Lys

His

Thr

Gly

Glu

Lys

Pro

Tyr

340

345

350

Gin

Cys

Asp

Phe

Lys

Asp

Cys

Glu

Arg

Phe

Ser

Arg

Ser

Asp

Gin

355

360

365

Leu

Lys

Arg

His

Gin

Arg

His

Thr

Gly

Val

Lys

Pro

Phe

Gin

370

375

380

Cys

Lys

Thr

Cys

Gin

Arg

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Asp

His

Leu

Lys

Thr

385

390

395

400

His

Thr

Arg

Thr

His

Thr

Gly

Lys

Thr

Ser

Glu

Lys

Pro

Phe

Ser

Cys

Arg

405

410

415

Trp

Pro

Ser

Cys

Gin

Lys

Phe

Ala

Arg

Ser

Asp

Glu

Leu

Val

420

425

430

Arg

His

Asn

Met

His

Gin

Arg

Asn

Met

Thr

Lys

Leu

Gin

Leu

Ala

435

440

445

Leu

<210> <211> <212> <213>

320 449 PRT Mus

musc

:ulus

<400>

320

Met

Gly

Ser

Asp

Val

Arg

Asp

Leu

Asn

Ala

Leu

Pro

Ala

Val

Ser

1

5

10

15

Ser

Leu

Gly

Cys

Gly

Leu

Pro

Val

Ser

Gly

Ala

Gin

20

25

30

Trp

Ala

Pro

Val

Leu

Asp

Phe

Ala

Pro

Gly

Ala

Ser

Ala

Tyr

Gly

35

40

45

Ser

Leu

Gly

Pro

Ala

Pro

Ala

Pro

50

55

60

Pro

His

Ser

Phe

Ile

Lys

Gin

Glu

Pro

Ser

Trp

Gly

65

70

75

80

Ala

Glu

Pro

His

Glu

Gin

Cys

Leu

Ser

Ala

Phe

Thr

Leu

His

Phe

Ser

Gly

85

90

95

Gin

Phe

Thr

Gly

Thr

Ala

Gly

Ala

Cys

Arg

Tyr

Gly

Pro

Phe

Gly

100

105

110

Pro

Ser

Gin

Ala

Ser

Gly

Gin

Ala

Arg

Met

Phe

115

120

125

Pro

Asn

Ala

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Cys

Leu

Glu

Ser

Gin

Pro

Thr

Ile

130

135

140

Arg

Asn

Gin

Gly

Tyr

Ser

Thr

Val

Thr

Phe

Asp

Gly

Ala

Pro

Ser

Tyr

145

150

155

160

Gly

His

Thr

Pro

Ser

His

Ala

Gin

Phe

Pro

Asn

His

Ser

Phe

165

170

175

102

PL 201 881 B1

Lys	His	Glu	Asp 180	Pro	Met	Gly	Gin
Tyr	Ser	Val 195	Pro	Pro	Pro	Val	Tyr 200
Cys	Thr 210	Gly	Ser	Gin	Ala	Leu 215	Leu
Asn 225	Leu	Tyr	Gin	Met	Thr 230	Ser	Gin
Met	Asn	Leu	Gly	Ala 245	Thr	Leu	Lys
Ser	Val	Lys	Trp 260	Thr	Glu	Gly	Gin
Ser	Asp	Asn 275	His	Thr	Ala	Pro	Ile 280
His	Thr 290	His	Gly	Val	Phe	Arg 295	Gly
Gly 305	Val	Ala	Pro	Thr	Leu 310	Val	Arg
Arg	Pro	Phe	Met	Cys 325	Ala	Tyr	Pro
Leu	Ser	His	Leu 340	Gin	Met	His	Ser
Tyr	Gin	Cys 355	Asp	Phe	Lys	Asp	Cys 360
Gin	Leu 370	Lys	Arg	His	Gin	Arg 375	Arg
Cys 385	Lys	Thr	Cys	Gin	Arg 390	Lys	Phe
His	Thr	Arg	Thr	His 405	Thr	Gly	Lys
Arg	Trp	His	Ser 420	Cys	Gin	Lys	Lys
Arg Leu	His	His 435	Asn	Met	His	Gin	Arg 440

Gin 185	Gly	Ser	Leu	Gly	Glu 190	Gin	Gin
Gly	Cys	His	Thr	Pro 205	Thr	Asp	Ser
Leu	Arg	Thr	Pro 220 Met	Tyr	Ser	Ser	Asp
Leu	Glu	Cys 235	Thr	Trp	Asn	Gin 240
Gly	Met 250	Ala	Ala	Gly	Ser	Ser 255	Ser
Ser 265	Asn	His	Gly	Ile	Gly 270	Tyr	Glu
Leu	Cys	Gly	Ala	Gin 285	Tyr	Arg	Ile
Ile	Gin	Asp	Val 300	Arg	Arg	Val	Ser
Ser	Ala	Ser 315	Glu	Thr	Ser	Glu	Lys 320
Gly	Cys 330	Asn	Lys	Arg	Tyr	Phe 335	Lys
Arg 345	Lys	His	Thr	Gly	Glu 350	Lys	Pro
Glu	Arg	Arg	Phe	Ser 365	Arg	Ser	Asp
His	Thr	Gly	Val 380	Lys	Pro	Phe	Gin
Ser	Arg	Ser 395	Asp	His	Leu	Lys	Thr 400
Thr	Ser 410	Glu	Lys	Pro	Phe	Ser 415	Cys
Phe 425	Ala	Arg	Ser	Asp	Glu 430	Leu	Val
Asn	Met	Thr	Lys	Leu 445	His	Val	Ala

	<210> 321 <211> 9
<212> <213>	PRT Homo sapiens and	Mus
	<400>	321
Pro 1	Ser Gin	Ala	Ser Ser Gly 5	Gin
	<210>	322
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapiens and	Mus
	<400>	322
Ser 1	Ser Gly	Gin	Ala Arg Met 5	Phe
	<210>	323
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapiens and	Mus
	<400>	323
Gin	Ala Arg	Met	Phe Pro Asn	Ala

musculus

Ala musculus

Pro musculus

Pro

PL 201 881 B1

103

1	5
	<210> 324 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens and Mus musculus

<400> 324

Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro 1 5 <210> 325 <211> 9 <212> PRT

	<213>	Homo	sapiens and	Mus	musculus
	<400>	325
Pro	Asn Ala	Pro	Tyr Leu Pro	Ser	Cys
1			5
	<210>	326
	<211>	9
	<212>	PRT
	<213>	Homo	sapiens and	Mus	musculus
	<400>	326
Ala	Pro Tyr	Leu	Pro Ser Cys	Leu	Glu
1			5

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że składa się z immunogennej części natywnego WT1, która składa się z sekwencji wybranej z Sekw. Id. Nr: 2 lub Sekw. Id. Nr: 144.
2. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w zastrz. 1 w kombinacji z dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem albo zaróbką.
3. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera polipeptyd określony w zastrz. 1 w kombinacji z niespecyficznym wzmacniaczem odpowiedzi immunologicznej.
4. Szczepionka według zastrz. 3, znamienna tym, że wzmacniaczem odpowiedzi immunologicznej jest adiuwant.
5. Szczepionka według zastrz. 4, znamienna tym, że wzmacniacz odpowiedzi immunologicznej jest wybrany z grupy składającej się z cytokin (np. GM-CSF, ligand Flat3), mikrosfer, adiuwantów opartych na bromku dimetylodioktadecyloamoniowym (DDA), AS-1, AS-2, QS21, adiuwantów opartych na saponinie, MV, ddMV, adiuwantów opartych na stymulującym kompleksie immunologicznym (iscom) i inaktywowanych toksyn.
6. Polinukleotyd kodujący polipeptyd określony w zastrz. 1
7. Polipeptyd jak określono w zastrz. 1 do zastosowania jako substancja aktywna terapeutycznie.
8. Polipeptyd jak określono w zastrz. 1 do zastosowania w wytwarzaniu leku do wzmacniania albo indukowania odpowiedzi immunologicznej u pacjenta.