TWI504407B - 癌疫苗組合物 - Google Patents

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TWI504407B TW102139047A TW102139047A TWI504407B TW I504407 B TWI504407 B TW I504407B TW 102139047 A TW102139047 A TW 102139047A TW 102139047 A TW102139047 A TW 102139047A TW I504407 B TWI504407 B TW I504407B
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Description

癌疫苗組合物
本發明為關於一種人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者用癌疫苗組成物，係含有病毒腫瘤的癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質(以下有時略稱為WT1蛋白質)或其部分胜肽(以下有時略稱為WT1胜肽)。本發明又有關於HLA-A＊ 0206陽性者用癌疫苗組成物、WT1特異性CTLs的誘導方法、呈現(presenting)癌抗原的樹狀細胞的誘導方法、HLA-A＊ 0206陽性者用的癌診斷方法、及癌治療或預防方法，係含有編碼上述WT1蛋白質或WT1胜肽的DNA或RNA。
本發明還關於一種HLA-A＊ 0206陽性者用癌疫苗組成物，係含有WT1胜肽的修飾胜肽。
病毒腫瘤基因WT1被認為是與兒童腎臟腫瘤的病毒腫瘤的腫瘤形成有關的基因而單離出來(請參照非專利文獻1)。此基因是編碼鋅指(zinc finger)轉錄因子(transcription factor)的基因，該鋅指轉錄因子係關連於細胞增殖及細胞分化的調節機制，以及細胞凋亡(apoptosis)及組織發育。
WT1基因起初被分類為腫瘤抑制基因。但近年來由於以下(i)至(iii)的證據： (i)於包含如白血病及骨髓發育不良症候群(MDS)等造血性惡性腫瘤之各種的人類惡性腫瘤及實體癌中，野生型WT1基因的高表現(high expression)，(ii)以WT1抗反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide)處理的人類白血病細胞及實體癌細胞的增殖阻礙，(iii)由野生型WT1基因的組成性表現(constitutive expression)引起的小鼠骨髓性前驅細胞的增殖促進與分化抑制，暗示野生型WT1基因在各種類型的惡性疾患中，與其謂之為腫瘤抑制作用不如為進行發癌作用(參照專利文獻1)。
並且，已知WT1基因在胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列線癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等實體癌中也有高表現(參照專利文獻2)。
用於排除異物的免疫機制中，一般而言有關於辨認抗原而作用為抗原呈現細胞的巨噬細胞、辨認該巨噬細胞的抗原呈現而使產生各種淋巴介質(lymphokine)的其他T細胞等活化的輔助T細胞(helper T cell)、由該淋巴介質的作用而分化為抗體產生細胞的B淋巴球等的體液免疫(humoral immunity)；及接受抗原的呈現而分化的細胞毒性(cytotoxic)T淋巴球(CTLs)攻擊破壞目標細胞之細胞性免疫。
目前，癌的免疫被認為主要是CTLs參與的細胞性免疫。在CTLs參與的癌免疫中，辨認以第一型主要組織相容複合物(Major Histocompatibility Complex Class I；MHC Class I)與癌抗原的複合體形態所呈現(presentation)的癌抗原的前驅體T細胞，經分化增殖所生成的CTLs攻擊破壞癌細胞。此際，癌細胞將MHC class I抗原與癌抗原的複合體在其細胞表面呈現，成為CTLs的目標(參照非專利文獻2至5)。人的MHC則被稱為人類白血球型抗原(HLA)。
在目標細胞的癌細胞上由MHC class I抗原所呈現的 前述癌抗原，被認為是在癌細胞內合成的抗原蛋白質藉由細胞內蛋白分解酶之處理所生成之由約8至12個胺基酸所成的胜肽(參照非專利文獻2至5)。目前，對各種癌的抗原蛋白質正進行檢索，但被證明為癌特異性抗原者不多。
在WT1基因表現產物的胺基酸序列中，與 HLA-A＊ 2402或與HLA-A＊ 0201的結合上，確認有合成含有至少一個胺基酸作用為錨定胺基酸的連續7至30胺基酸所成的多胜肽，以及該等胜肽與HLA-A＊ 2402或與HLA-A＊ 0201的結合(HLA-A＊ 2402限制性或HLA-A＊ 0201限制性)；同時，在與HLA-A＊ 2402或與HLA-A＊ 0201結合的情況，顯示誘導CTLs且對目標細胞有殺細胞效果(以下簡稱為CTL反應)。並由此鑑定此等胜肽為源自WT1基因表現產物蛋白質的CTL抗原抗原決定基(CTL epitope)。
目前，WT1特異性的CTLs抗原決定基只對於 HLA-A＊ 2402或HLA-A＊ 0201(參照專利文獻3)、HLA-A＊ 3303(參照專利文獻4)以及HLA-A＊ 1101(專利文獻5)有鑑定，確認基於前述胜肽的CTL反應是只有由HLA-A＊ 2402限制性、HLA-A＊ 0201限制性、HLA-A＊ 3303限制性及HLA-A＊ 1101限制性所引發的特異性反應。
此事帶來癌抑制基因WT1的基因產物之蛋白質為有 希望的腫瘤排斥抗原(tumor rejection antigen)(也稱為腫瘤相關抗 原(tumor associated antigen,TAA))的可能性。事實上，高頻率的WT1特異性CTLs或高抗體力價的抗WT1抗體，並不在健康供血者的末梢血中，而是在癌患者的末梢血中檢測的。
然而，由於HLA也是規定個人的標誌(marker)，而 為多樣的。HLA的情況，MHC class I抗原有HLA-A、HLA-B及HLA-C，class II抗原有HLA-DP、HLA-DQ及HLA-DR之各有複數者存在。又HLA的各個抗原結合部位富有多類型，例如已知HLA-A有27種以上，HLA-B有59種以上，HLA-C有10種以上的多類型(對偶基因(allele))。
因此，希望藉由結合於HLA-A＊ 2402、HLA-A＊ 0201、 HLA-A＊ 3303或HLA-A＊ 1101以外的類型的HLA且誘導CTL反應的特定癌抗原，擴大能適用免疫療法的對象。
另一方面，WT1胜肽的修飾胜肽中，有2件文獻報 告下列3種胜肽：WT1187 P1Y胜肽(YLGEQQYSV；序列編號12)及WT1126 P1Y胜肽(YMFPNAPYL；序列編號35)(均參照專利文獻6)，以及WT1126 P9M胜肽(RMFPNAPYM；序列編號52)(參照專利文獻7)。
更有在歐洲專利1127068的審查意見書上，有下列2 種胜肽的報告：WT1126 P2L胜肽(RLFPNAPYL；序列編號39)WT1126 P2L&P9V胜肽(RLFPNAPYV；序列編號75)(參照非專利文獻7)。
但是，這些WT1修飾胜肽與HLA-A＊ 2402、HLA- A＊ 0201、HLA-A＊ 3303或HLA-A＊ 1101以外的類型的HLA結合且誘導CTL反應而為癌抗原，則完全沒有報告。
[專利文獻1]日本特開平9-104629號公報
[專利文獻2]日本特開平11-035484號公報
[專利文獻3]國際公開第WO00/06602號小冊
[專利文獻4]日本特願2006-045287號
[專利文獻5]日本特願2006-355356號
[專利文獻6]國際公開第WO2005/053618號小冊
[專利文獻7]國際公開第WO2007/016466號小冊
[非專利文獻1]Gessler,M.等，Nature，第343卷，774-778頁，1990年
[非專利文獻2]Cur. Opin. Immunol.，第5卷，709頁，1993年
[非專利文獻3]Cur. Opin. Immunol.，第5卷，719頁，1993年
[非專利文獻4]Cell，第82卷，13頁，1995年
[非專利文獻5]Immunol.Rev.，第146卷，167頁，1995年
[非專利文獻6]Mol. Cell. Biol.，第11卷，1707頁，1991年
[非專利文獻7]歐洲專利1127068的審查意見書
本發明是將一種癌的治療法及/或預防法的適用範圍擴大於HLA-A＊ 0206陽性者為目的，該治療法是對含白血病在內的惡性腫瘤患者以癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質(WT1蛋白質)或其部分胜肽(WT1胜肽)為基礎。
為了解決上述課題，本研究者進行精心研究。其結果發現：有關源自人類WT1蛋白質的WT1187 胜肽(SLGEQQYSV)及WT1126 胜肽(RMFPNAPYL)，以往只知道誘導HLA-A＊ 0201限制性的CTLs，而驚奇地發現該胜肽也誘導HLA-A＊ 0206限制性的CTLs。又，誘導HLA-A＊ 0201限制性CTLs的WT1胜肽，只知道國際公開第WO00/06602號小冊所記載的胜肽而已，但也發現WT1187 胜肽的修飾胜肽(又稱為WT1187 修飾胜肽)及WT1126 的修飾胜肽(又稱為WT1126 修飾胜肽)，也與HLA-A＊ 0201分子結合。本發明者基於這些知識再精心研究，而完成本發明。
即，本發明與下列(1)至(17)有關。
(1)一種人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者用癌疫苗組成物，係含有癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽為特徵。
(2)上述(1)記載的組成物，其癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質係為以下之(a)或(b)中之一種蛋白質。
(a)序列編號1的胺基酸序列
(b)胺基酸序列(a)中，有1個或數個胺基酸欠缺、取代或附加的胺基酸序列所成，並對HLA-A＊ 0206陽性者具有免疫原性的蛋白質。
(3)上述(1)所記載的組成物，其部分胜肽為WT1187 胜肽：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號2)，WT1126 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)，WT1187 P1F胜肽：Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號 11)，WT1187 P2M胜肽：Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號16)，WT1187 P3M胜肽：Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號20)，WT1126 P1F胜肽：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號34)，WT1126 P2L胜肽：Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號39)，WT1126 P3M胜肽：Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號46)，或WT1126 P9V胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(序列編號49)。
(4)上述(1)至(3)項任一項所記載的組成物，復含有佐劑(adjuvant)。
(5)一種人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者用癌疫苗組成物，係以含有編碼癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的DNA為特徵。
(6)一種人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者用癌疫苗組成物，係以含有編碼癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的RNA為特徵。
(7)一種WT1特異性CTLs的誘導方法，係含有下述步驟為其特徵：將源自人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者的週邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell)，在癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的存在下培養，由該週邊血液 單核球誘導WT1特異性CTLs。
(8)一種呈現癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的樹狀細胞的誘導方法，係含有下述步驟為其特徵：將源自人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者未成熟樹狀細胞(dendritic cells)，在癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的存在下培養，由該未成熟樹狀細胞誘導呈現該蛋白質或其部分胜肽的樹狀細胞。
(9)一種人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者用的癌的診斷方法，係含有下述步驟為其特徵：檢測或定量源自人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者的試樣中的癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽、其抗體或WT1特異性CTLs的步驟以及其次之將該蛋白質或其部分胜肽、其抗體或WT1特異性CTLs之量，與癌未發症的情況比較的步驟；或者，將上述(7)記載的方法所誘導的WT1特異性CTLs或上述(8)記載的方法所誘導的樹狀細胞投藥於(HLA)-A＊ 0206陽性對象以及其次之在(HLA)-A＊ 0206陽性對象決定該CTLs或樹狀細胞的位置或部位的步驟。
(10)一種人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者用癌疫苗組成物，係含有下述胜肽為其特徵：癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質的部分胜肽WT1187 胜肽：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號2)或WT1126 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A＊ 0206陽性者有免疫原性的胜肽
(11)上述(10)項所記載的組成物，該胜肽為下述者： WT1187 P1F胜肽：Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號11)、WT1187 P2M胜肽：Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號16)、WT1187 P3M胜肽：Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號20)、WT1126 P1F胜肽：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號34)、WT1126 P2L胜肽：Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號39)、WT1126 P3M胜肽：Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號46)或WT1126 P9V胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(序列編號49)。
(12)一種癌的治療或預防方法，係將含有癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的組成物，給藥至(HLA)-A＊ 0206陽性者。
(13)癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽之用途，係用於人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者的癌之治療或預防。
(14)一種癌的治療或預防方法，係將含有下述胜肽的組成物，投藥至人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0201陽性者：癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的WT1187 胜肽：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號2) 或WT1126 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的胜肽。
(15)下述胜肽之用途，係用於人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0201陽性者的癌的治療或預防：癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的WT1187 胜肽：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號2)或WT1126 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的胜肽。
(16)一種癌的治療或預防方法，係將編碼癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的RNA，導入至人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者的樹狀細胞。
(17)一種編碼癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的RNA之用途，係用於人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者的癌的治療或預防。
本發明又關於癌抑制基因WT1的基因產物之蛋白質或其部分胜肽的使用，係用於製造HLA-A＊ 0206陽性者的癌的治療或預防用的癌疫苗組成物。
本發明又關於下述胜肽的使用，係用於製造HLA-A＊ 0201陽性者的癌的治療或預防用的癌疫苗組成物：癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質或其部分胜肽的WT1187 胜肽：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號2)或WT1126 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的胜肽。
又在本發明中所稱「癌疫苗組成物」，係指接種或投 藥至包含人類的動物，而用於癌的治療或預防用的醫藥而言。「治療」是指完全治療病理狀態之外，雖不完全治癒但抑制症狀的進展及/或惡化，阻止病理狀態的進行，或改善病理狀態的一部分或全部而導向治癒；「預防」是指防止、抑制或延遲病理狀態之發症。
又例如，源自HLA-A＊ 0206陽性者或HLA-A＊ 0201陽 性者的週邊血液單核球、未成熟樹狀細胞、WT1特異性CTLs及樣品等，係分別指由HLA-A＊ 0206陽性者或HLA-A＊ 0201陽性者所分離或採取的週邊血液單核球，未成熟樹狀細胞，WT1特異性CTLs及血液等生體樣品等。又，源自HLA-A＊ 0206陽性者或HLA-A＊ 0201陽性者的WT1特異性CTLs，也包含由HLA-A＊ 0206陽性者或HLA-A＊ 0201陽性者所分離或採取的週邊血液單核球、未成熟樹狀細胞，或血液等生體樣品等所誘導的CTLs。
由本發明可以在HLA-A＊ 0206陽性者體內及體外誘導WT1特異性CTLs。以往，使用包含WT1蛋白質或WT1胜肽之疫苗的免疫療法的適用，只限定於HLA-A＊ 0201陽性患者或HLA-A＊ 2402陽性患者，但由於本發明，其對象可以擴大到HLA-A＊ 0206陽性患者。HLA-A2為在白種人頻率最高的HLA class I的血清型(約50%)，其大多數為HLA-A＊ 0201，但約4%的白種人有HLA-A＊ 0206。又在日本人中，HLA-A24(其大多數為HLA-A＊ 2402)為頻率最高的血清型(約58%)，HLA-A2在日本人顯示約42%。但有HLA-A2的日本人，只有約43%有HLA-A＊ 0201，其餘有HLA-A＊ 0206或HLA-A＊ 0207。換言之，約18%的日本人有 HLA-A＊ 0201，約17%的日本人有HLA-A＊ 0206。因此，與HLA-A＊ 0201陽性限制性CTL抗原決定基同樣地，至少在日本人也發現HLA-A＊ 0206陽性限制性CTL抗原決定基的情況，可以將癌免疫療法的適用擴及HLA-A＊ 0206陽性者，因而非常有用。並且，這個對偶基因(allele)可見於14%的中國人、9%的韓國人，所以可以擴大本發明的癌疫苗組成物的適用範圍。
本發明的癌疫苗組成物，是在HLA-A＊ 0206陽性者表現WT1的癌，例如造血器官腫瘤、實體癌等的治療上有用。又，本發明的癌疫苗組成物，對於HLA-A＊ 0206陽性者的癌發病預防有用。
第1圖表示由HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的PBMCs所得WT1187 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性圖。a表示對經51 Cr標識的B-LCLs的細胞傷害活性圖。b表示與脈衝至PBMCs的WT1187 胜肽的濃度平行而對經51 Cr標識的自體B-LCLs的細胞傷害活性增加的圖。
第2圖表示由HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的PBMCs所得WT1187 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性圖。a及b是由與第1圖a表示的供血者以外的二位不同健康供血者所得CTLs對經51 Cr標識的B-LCLs的細胞傷害活性圖。
第3圖之a表示對於以WT1基因形質轉換的B-LCLs或以空載體(vector)形質轉換的B-LCLs的WT1187 胜肽特異性CTLs的細胞傷害性圖。b表示對於0206K562細胞、K562細胞、KH88細胞及 JY細胞的WT1187 胜肽特異性CTLs的細胞傷害性圖。
第4圖表示由HLA class I抗體及HLA class II抗體引起的WT1187 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性的抑制圖。
第5圖表示由HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的PBMCs的WT1126 胜肽特異性CTLs之對經51 Cr標識的B-LCLs的細胞傷害活性圖。
第6圖之a及b表示對於0206K562細胞、K562細胞、KH88細胞及JY細胞的由不同提供者誘導的WT1126 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性圖。
第7圖a至e表示以修飾胜肽刺激HLA-A＊ 0201陽性的提供者1的PBMCs所誘導的CTLs，以WT1126 胜肽的四聚體及抗CD8抗體染色之使用流動細胞儀解析的結果圖。
第8圖表示以WT1126 P1F胜肽刺激HLA-A＊ 0201陽性的提供者1的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。
第9圖a及b表示以WT1126 P2L胜肽刺激HLA-A＊ 0201陽性的提供者1的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。
第10圖表示以WT1126 P2L胜肽刺激HLA-A＊ 0201陽性的提供者2的PBMCs所誘導的CTLs，以WT1126 胜肽的四聚體及抗CD8抗體染色之使用流動細胞儀解析的結果圖。
第11圖a及b表示以WT1126 P2L胜肽刺激提供者2的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。
第12圖a至c表示以WT1126 修飾胜肽刺激提供者3的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。
第13圖表示以WT1126 P9V胜肽刺激HLA-A＊ 0206陽性的提供 者3的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。
第14圖a至c表示以WT1126 修飾胜肽刺激HLA-A＊ 0206陽性的提供者4的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。
第15圖a至c表示以WT1126 修飾胜肽刺激HLA-A＊ 0206陽性的提供者4的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。
第16圖a及b表示以WT1187 修飾胜肽刺激HLA-A＊ 0201陽性的提供者的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。
第17圖a及b表示以WT1187 P1F修飾胜肽刺激HLA-A＊ 0206陽性的提供者的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。
第18圖a及b表示以WT1187 P2M修飾胜肽刺激HLA-A＊ 0206陽性的提供者的PBMCs所誘導的CTLs的細胞傷害活性的測定結果圖。
第19圖a至f表示WT1187 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第20圖a至f表示WT1187 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第21圖a至f表示WT1187 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第22圖a至e表示WT1187 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第23圖a至f表示WT1126 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫 誘導活性的評估結果圖。
第24圖a至f表示WT1126 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第25圖a至f表示WT1126 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第26圖a至f表示WT1126 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第27圖表示WT1126 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第28圖a至d表示WT1187 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第29圖a至e表示WT1187 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第30圖a至f表示WT1126 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第31圖a至f表示WT1126 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
第32圖表示WT1126 胜肽的修飾胜肽之特異性細胞免疫誘導活性的評估結果圖。
 [實施發明的最佳形態]
以下說明本發明。
本說明書及圖式中，以縮寫表示胺基酸殘基時，以下列編寫表示。
Ala或A：丙胺酸殘基
Arg或R：精胺酸殘基
Asn或N：天門冬醯胺酸殘基
Asp或D：天門冬胺酸殘基
Cys或C：半胱胺酸殘基
Gln或Q：麩醯胺酸殘基
Glu或E：麩胺酸殘基
Gly或G：甘胺酸殘基
His或H：組胺酸殘基
Ile或I：異白胺酸殘基
Leu或L：白胺酸殘基
Lys或K：離胺酸殘基
Met或M：甲硫胺酸殘基
Phe或F：苯丙胺酸殘基
Pro或P：脯胺酸殘基
Ser或S：絲胺酸殘基
Thr或T：羥丁胺酸殘基
Trp或W：色胺酸殘基
Tyr或Y：酪胺酸殘基
Val或V：纈胺酸殘基
本發明中的WT1蛋白質是以作為病毒腫瘤的致病基因(responsible gene)所單離的鋅指型轉錄因子的基因產物，並可舉與HLA-A＊ 0206分子結合而成為惡性腫瘤的目標抗原者。本發明中的WT1蛋白質，具體地可舉由449個胺基酸所成的人類WT1 蛋白質(序列表：序列編號1)，或在此胺基酸序列中，有1個或數個(約2至6個為佳)的胺基酸為欠缺、取代或附加的胺基酸序列所成，且對HLA-A＊ 0206陽性者有免疫原性的蛋白質為佳。插入的胺基酸或取代的胺基酸，也可以是由基因所編碼的20種胺基酸以外的非天然胺基酸。
WT1蛋白質的部分胜肽(WT1胜肽)是指構成WT1蛋 白質的胺基酸序列之一部分所成的胜肽。WT1胜肽，可舉與HLA-A＊ 0206分子結合而誘導細胞傷害性T細胞的源自WT1蛋白質為8至12個胺基酸所成的胜肽，而可舉較佳為8至9個胺基酸所成的胜肽。又，特別佳的是國際公開第WO00/06602號小冊記載的WT1187 胜肽(Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val；序列編號2)或WT1126 胜肽(Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu；序列編號3)。
又，只要是對於HLA-A＊ 0206陽性者有免疫原性的 胜肽即可，在WT1胜肽中有1個或數個胺基酸為欠缺、取代或附加的修飾胜肽，也可以使用做為本發明的WT1胜肽。這種修飾胜肽可舉WT1187 胜肽的修飾胜肽及WT1126 胜肽的修飾胜肽。
WT1187 胜肽的修飾胜肽，可舉合適為其由N末端起 第4至第8個胺基酸殘基，與WT1187 胜肽的由N末端起第4至第8個胺基酸殘基(EQQYS)相同的胜肽；較合適為其由N末端起第4至第9個胺基酸殘基，與WT1187 胜肽的由N末端起第4至第9個胺基酸殘基(EQQYSV)相同的胜肽。這種WT1187 胜肽的修飾胜肽，以有下列序列編號4至26及54至62之任一者所記載的胺基酸序列所成的胜肽為佳。
WT1187 P1G胜肽(GLGEQQYSV；序列編號4)
WT1187 P1A胜肽(ALGEQQYSV；序列編號5)
WT1187 P1V胜肽(VLGEQQYSV；序列編號6)
WT1187 P1L胜肽(LLGEQQYSV；序列編號7)
WT1187 P1I胜肽(ILGEQQYSV；序列編號8)
WT1187 P1M胜肽(MLGEQQYSV；序列編號9)
WT1187 P1W胜肽(WLGEQQYSV；序列編號10)
WT1187 P1F胜肽(FLGEQQYSV；序列編號11)
WT1187 P1Y胜肽(YLGEQQYSV；序列編號12)
WT1187 P2V胜肽(SVGEQQYSV；序列編號13)
WT1187 P2Q胜肽(SQGEQQYSV；序列編號14)
WT1187 P2I胜肽(SIGEQQYSV；序列編號15)
WT1187 P2M胜肽(SMGEQQYSV；序列編號16)
WT1187 P3L胜肽(SLLEQQYSV；序列編號17)
WT1187 P3A胜肽(SLAEQQYSV；序列編號18)
WT1187 P3V胜肽(SLVEQQYSV；序列編號19)
WT1187 P3M胜肽(SLMEQQYSV；序列編號20)
WT1187 P3P胜肽(SLPEQQYSV；序列編號21)
WT1187 P3W胜肽(SLWEQQYSV；序列編號22)
WT1187 P3F胜肽(SLFEQQYSV；序列編號23)
WT1187 P3Y胜肽(SLYEQQYSV；序列編號24)
WT1187 P3S胜肽(SLSEQQYSV；序列編號25)
WT1187 P3I胜肽(SLIEQQYSV；序列編號26)
WT1187 P9L胜肽(SLGEQQYSL；序列編號53)
WT1187 P1D胜肽(DLGEQQYSV；序列編號54)
WT1187 P1E胜肽(ELGEQQYSV；序列編號55)
WT1187 P1H胜肽(HLGEQQYSV；序列編號56)
WT1187 P1K胜肽(KLGEQQYSV；序列編號57)
WT1187 P1N胜肽(NLGEQQYSV；序列編號58)
WT1187 P1P胜肽(PLGEQQYSV；序列編號59)
WT1187 P1Q胜肽(QLGEQQYSV；序列編號60)
WT1187 P1R胜肽(RLGEQQYSV；序列編號61)
WT1187 P1T胜肽(TLGEQQYSV；序列編號62)
WT1126 胜肽的修飾胜肽，可舉合適為其由N末端第4至第8個胺基酸殘基，與WT1126 胜肽的由N末端起第4至第8個胺基酸殘基(PNAPY)相同的胜肽。這種WT1126 胜肽的修飾胜肽，有下列序列編號27至52及63至75之任一者所記載的胺基酸序列所成的胜肽為佳。
WT1126 P1G胜肽(GMFPNAPYL；序列編號27)
WT1126 P1A胜肽(AMFPNAPYL；序列編號28)
WT1126 P1V胜肽(VMFPNAPYL；序列編號29)
WT1126 P1L胜肽(LMFPNAPYL；序列編號30)
WT1126 P1I胜肽(IMFPNAPYL；序列編號31)
WT1126 P1M胜肽(MMFPNAPYL；序列編號32)
WT1126 P1W胜肽(WMFPNAPYL；序列編號33)
WT1126 P1F胜肽(FMFPNAPYL；序列編號34)
WT1126 P1Y胜肽(YMFPNAPYL；序列編號35)
WT1126 P2V胜肽(RVFPNAPYL；序列編號36)
WT1126 P2Q胜肽(RQFPNAPYL；序列編號37)
WT1126 P2A胜肽(RAFPNAPYL；序列編號38)
WT1126 P2L胜肽(RLFPNAPYL；序列編號39)
WT1126 P2I胜肽(RIFPNAPYL；序列編號40)
WT1126 P3I胜肽(RMIPNAPYL；序列編號41)
WT1126 P3L胜肽(RMLPNAPYL；序列編號42)
WT1126 P3G胜肽(RMGPNAPYL；序列編號43)
WT1126 P3A胜肽(RMAPNAPYL；序列編號44)
WT1126 P3V胜肽(RMVPNAPYL；序列編號45)
WT1126 P3M胜肽(RMMPNAPYL；序列編號46)
WT1126 P3P胜肽(RMPPNAPYL；序列編號47)
WT1126 P3W胜肽(RMWPNAPYL；序列編號48)
WT1126 P9V胜肽(RMFPNAPYV；序列編號49)
WT1126 P9A胜肽(RMFPNAPYA；序列編號50)
WT1126 P9I胜肽(RMFPNAPYI；序列編號51)
WT1126 P9M胜肽(RMFPNAPYM；序列編號52)
WT1126 P1D胜肽(DMFPNAPYL；序列編號63)
WT1126 P1E胜肽(EMFPNAPYL；序列編號64)
WT1126 P1H胜肽(HMFPNAPYL；序列編號65)
WT1126 P1K胜肽(KMFPNAPYL；序列編號66)
WT1126 P1N胜肽(NMFPNAPYL；序列編號67)
WT1126 P1P胜肽(PMFPNAPYL；序列編號68)
WT1126 P1Q胜肽(QMFPNAPYL；序列編號69)
WT1126 P1S胜肽(SMFPNAPYL；序列編號70)
WT1126 P1T胜肽(TMFPNAPYL；序列編號71)
WT1126 P2I&P9I胜肽(RIFPNAPYI；序列編號72)
WT1126 P2I&P9V胜肽(RIFPNAPYV；序列編號73)
WT1126 P2L&P9I胜肽(RLFPNAPYI；序列編號74)
WT1126 P2L&P9V胜肽(RLFPNAPYV；序列編號75)
其中，WT1187 胜肽的修飾胜肽，以WT1187 P1F胜肽(序列編號11)、WT1187 P2M胜肽(序列編號16)或WT1187 P3M胜肽(序列編號20)為佳；以WT1187 P1F胜肽或WT1187 P2M胜肽為較佳；WT1187 P2M胜肽再較佳。WT1126 胜肽的修飾胜肽則以WT1126 PIF胜肽(序列編號34)、WT1126 P2L胜肽(序列編號39)、WT1126 P3M胜肽(序列編號46)或WT1126 P9V胜肽(序列編號49)為佳；以WT1126 P2L胜肽、WT1126 P3M胜肽或WT1126 P9V胜肽較佳；WT1126 P9V胜肽再較佳。
本發明的癌疫苗組成物的WT1胜肽，以WT1187 胜肽、WT1126 胜肽、WT1187 P1F胜肽、WT1187 P2M胜肽、WT1187 P3M胜肽、WT1126 P1F胜肽、WT1126 P2L胜肽、WT1126 P3M胜肽或WT1126 P9V胜肽為佳。較佳的是WT1187 胜肽、WT1126 胜肽、WT1187 P1F胜肽、WT1187 P2M胜肽、WT1126 P2L胜肽、WT1126 P3M胜肽或WT1126 P9V胜肽；再較佳的是WT1187 胜肽、WT1126 胜肽、WT1187 P2M胜肽或WT1126 P9V胜肽；特別佳的是WT1187 胜肽或WT1126 胜肽。
又，WT1胜肽的衍生物也可使用做為WT1胜肽。例如WT1187 胜肽及WT1126 胜肽的衍生物，可舉在上述由9個連續胺基酸所成的胺基酸序列的N末端及/或C末端，有種種物質結合者。例如有胺基酸、胜肽、及其類似物(analogue)等結合也可以。WT1187 胜肽或WT1126 胜肽，或其修飾胜肽有該等物質結合時，該 等物質經例如生體內的酵素等，或細胞內處理等過程而被處理，最終生成由上述由9個胺基酸所成的胜肽，成為HLA-A＊ 0206分子的複合體而呈現於細胞表面，而在有HLA-A＊ 0206的患者中可以引發WT1特異性CTL反應。
WT1胜肽，可藉由在該技術領域中通常使用的方法 製造。例如可藉由Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；The Proteins,Vol.2,Academic Press Inc.,New York,1976； 合成，丸善(股)，1975；合成基礎実驗，丸善(股)，1985；医薬品開発続 第14巻、合成、広川書店，1991等所記載的胜肽合成方法而合成。
WT1胜肽及修飾胜肽的篩選方法，例如使用有 HLA-A＊ 0206的患者幾人的PBMCs(週邊血液單核球)只以1次的胜肽刺激而進行1FN γ分析，而選擇有良好反應的胜肽的方法，因簡便而為佳。
在本發明中，編碼上述對HLA-A＊ 0206陽性者有免 疫原性的WT1蛋白質或WT1胜肽的DNA等多核苷酸，也可使用做為癌疫苗組成物的有效成分。亦即，將編碼WT1蛋白質或WT1胜肽的多核苷酸，插入至適當的載體(較佳為表現載體)後，經由投藥至包含人類的動物，而可在生體內產生癌免疫。多核苷酸可舉DNA、RNA等，DNA或RNA為佳。多核苷酸的鹼基序列可根據對HLA-A＊ 0206陽性者有免疫原性的WT1蛋白質或WT1胜肽的胺基酸序列而決定。該多核苷酸可以例如公知的DNA或RNA合成法、PCR法等而製造。此方式之含有編碼WT1蛋白質或WT1胜肽的DNA之HLA-A＊ 0206陽性者用癌疫苗組成物，也是本發明 之一。WT1蛋白質與WT1胜肽，是以WT1胜肽為佳；WT1187 胜肽或WT1126 胜肽或其修飾胜肽為較佳；而以WT1187 胜肽或WT1126 胜肽為最佳。上述要將DNA插入的表現載體則沒有特別的限制。 又，RNA則不需插入於載體，可將其直接做為組成物的有效成分使用。
本發明的癌疫苗組成物可含有佐劑。作為佐劑，在 將成為抗原的WT1蛋白質或WT1胜肽給藥時，與其一起，或與WT1蛋白質或WT1胜肽分開另行給藥，只要為能非特異性地提高對該抗原的免疫應答的物質，則無限定。佐劑可舉例如沉降性佐劑或油性佐劑。沉降性佐劑可舉例如氫氧化鈉、氫氧化鋁、磷酸鈣、磷酸鋁、明礬(alum)、HEPES或羧乙烯聚合物等。油性佐劑以油會將抗原水溶液包起來形成微胞(micelle)者為佳，例如具體而言有液態石臘(liquid paraffin)、羊毛脂、弗氏佐劑(Freund’s adjuvant)、montanide ISA763AVG、montanide ISA51、不完全弗氏佐劑或完全弗氏佐劑等。佐劑可混合2種以上使用。以油性佐劑為佳。
本發明的癌疫苗組成物的佐劑調配量，只要能非特 異性地提高對抗原的免疫應答的量即可，並無特別限制，依佐劑的種類等而適宜選擇即可。
本發明的癌疫苗組成物可以經口給藥、或非經口給 藥例如腹腔內給藥、皮下給藥、皮內給藥、肌肉內給藥、靜脈內給藥、鼻腔內給藥等而給藥。又，非經口給藥也可舉將疫苗組成物塗敷於皮膚，或將含有疫苗組成物之貼附劑貼附於皮膚，使有效成分的WT1蛋白質或WT1胜肽經皮吸收的給藥方法。又，本 發明的疫苗組成物也可經由吸入等給藥。以非經口給藥為佳。較佳的是經由皮內給藥，或以皮下給藥而給藥。皮內給藥、皮下給藥的身體部位，則例如以上腕等為佳。
本發明的癌疫苗組成物根據給藥路徑而可有種種的 製劑形態，例如可成為固形製劑、液狀製劑等。例如可製成用於經口給藥的內服用固形劑或內服用液劑，或用於非經口给藥的注射劑等。
用於經口給藥的內服用固形劑，可舉錠劑、丸劑、 膠囊劑、散劑、顆粒劑等。內服用固形劑中，WT1蛋白質或WT1胜肽可以其原狀，或與添加劑混合或造粒(例如攪拌造粒法、流動層造粒法、乾式造粒法、轉動攪拌流動層造粒法等)，以常法製造。 例如膠囊劑，則以膠囊填充等；錠劑，則以打錠劑等而可製造。 添加劑可適宜調配1種或2種以上。添加劑可舉例如乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、微結晶纖維素、玉米澱粉等賦形劑；羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯酮、偏矽酸鋁鎂等結合劑；玉米澱粉等分散劑；纖維素二乙醇酸鈣等崩壞劑；硬脂酸鎂等潤滑劑；麩胺酸、天冬門酸等溶解輔助劑；安定劑；羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素等纖維素類；聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、聚乙烯醇等合成高分子類等水溶性高分子；白糖、粉糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖、還原麥芽糖飴、粉末還原麥芽糖飴、葡萄糖果糖液糖、果糖葡萄糖液糖、蜂蜜、山梨醇、麥芽糖醇、甘露醇、木糖醇、丁四醇、阿斯巴甜(aspartame)、糖精、糖精鈉等甘味劑等。
顆粒劑或錠劑，視需要也可以包裹劑包裹，又該包裹劑也可以是2層以上。包裹劑有例如白糖、明膠、羥丙基纖維、 羥丙基甲基纖維素酞二甲酸酯等。製造膠囊劑時，則適宜選擇上述賦形劑，與普侖司特水合物(pranlukast hydrate)混合均勻為粒狀，或做成粒狀後，以適當的包裹劑施加劑皮後，裝填於膠囊中，或在適當的膠囊底劑(明膠等)中添加甘油或山梨醇等增加塑性的膠囊底劑，以此包裹成形也可以。這些膠囊底劑視需要可添加著色劑或保存劑(二氧化硫；對羥基安息酸甲酯、對羥基安息酸乙酯、對羥基安息酸丙酯等對安息酸酯類)等。膠囊劑包含硬膠囊及軟膠囊。
用於經口給藥的內服用液劑，可舉水劑、懸液劑、 乳劑、漿劑、乾漿劑等使用時溶解型製劑、酏劑等。在這種內服液劑中，WT1蛋白質或WT1胜肽，是以內服用液劑一般所用的稀釋劑溶解、懸浮或乳化。稀釋劑可舉例如精製水、乙醇或其混液等。又，這個液劑也可以含有濕潤劑、懸浮化劑、乳化劑、甘味劑、風味劑、芳香劑、保存劑或緩衝劑等。又乾漿劑可舉例與普侖司特水合物及例如白糖、粉糖、蔗糖、果糖、葡萄糖或乳糖等混合等而製造。又，乾漿劑也可依常法製成顆粒。
用於非經口給藥的劑型可舉注射劑、軟膏劑、凝膠 劑、乳霜劑、貼附劑、噴霧劑、噴撒劑等，但以注射劑為佳。例如WT1蛋白質或WT1胜肽與慣用的載體一起做為注射劑為佳。
用於非經口給藥的注射劑，可以是水性注射劑或油 性注射劑的任一種。做為水性注射劑時，可以公知的方法，例如在水性溶媒(注射用水、精製水等)經適宜添加有醫學上容許的添加劑的溶液中，混合WT1蛋白質或WT1胜肽後，以過濾器等過濾而滅菌，繼而填充於無菌性容器而調製。醫藥上容許的添加劑 可舉例如上述的佐劑；氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、葡萄糖、丙二醇等的等滲透壓劑；磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、硼酸緩衝液、碳酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、TRIS緩衝液、麩胺酸緩衝液、ε-胺基己酸緩衝液等緩衝劑；對羥基安息酸甲酯、對羥基安息酸乙酯、對羥基安息酸丙酯、對羥基安息酸丁酯、氯丁醇、苄醇、氯化苯二甲烴銨(chlorobenzalkonium)、去水醋酸鈉、乙二胺四乙酸鈉(sodium edetate)、硼酸、硼砂等保存劑；羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇等增黏劑；亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、檸檬酸鈉、抗壞血酸、二丁基羥基甲苯等安定化劑；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸等pH調整劑等。又，注射劑也可以再調配適當的溶解輔助劑，例如乙醇等醇類；丙二醇、聚乙二醇等多元醇；聚山梨醇酯80、聚氧伸乙基硬化蓖麻油50、水解卵磷脂(lysolecithin)、普路蘭尼克多元醇(Pluronic polyols)等非離子界面活性劑等。又，也可以含有例如牛血清白蛋白、匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)等蛋白質；胺基聚葡糖(aminodextran)等多醣類等。做為油性注射劑時，可用胡麻油或大豆油，溶解輔助劑則可配合安息酸芐酯或苄醇等。經調製的注射液通常填充於適當的安瓿(ampoule)或小瓶(vial)。注射劑等液狀製劑也可冷凍保存或經由冷凍乾燥等除去水分而保存。冷凍乾燥製劑在使用時加入注射用蒸餾水等，再溶解後使用。
又，本發明的癌疫苗組成物之其他形態，也可在微脂體(liposome)中混合WT1蛋白質或WT1胜肽，再視需要而可含有多糖及/或在癌疫苗組成物中調配的其他成分。
本發明的癌疫苗組成物的給藥量，會因所使用的 WT1蛋白質或WT1胜肽，或患者的年齡體重，對象病症等而有不同，例如含有WT1187 胜肽或WT1126 胜肽等WT1胜肽的疫苗組成物時，WT1胜肽量以每日體重約0.1μg至1mg/kg為佳。又WT1胜肽的給藥量通常為0.0001mg至1000mg，而以0.01mg至1000mg為佳，較佳的是0.1mg至10mg，將此量在數日至數個月中給藥1次為佳。
本發明的癌疫苗組成物，是HLA-A＊ 0206陽性者用 的癌疫苗組成物。用於選擇HLA-A＊ 0206陽性者的HLA型，例如可由供血者的週邊血液決定。決定HLA型的方法可舉SBT(Sequencing Based Typing)法或SSP法等DNA分型法(DNA Typing)或HLA分型法等公知方法。SBT法是以PCR法將DNA擴增(amplify)，將擴增產物的鹼基序列，與既有的對偶基因(allele)的鹼基序列資訊對照，可精密地判定HLA基因型。SSP法，是以HLA對偶基因特異性的多種引子(primer)進行PCR後，進行電泳，由陽性條帶(positive band)的確認而可判定HLA基因型。
將本發明的癌疫苗組成物給藥至HLA-A＊ 0206陽性 者，則該疫苗組成物所含的有HLA-A＊ 0206限制性的WT1蛋白質或WT1胜肽，或由DNA或RNA所表現的WT1蛋白質或WT1胜肽，與HLA-A＊ 0206陽性者的抗原呈現細胞(樹狀細胞)表面的HLA-A＊ 0206分子結合。如此，特異性抗腫瘤免疫，即WT1特異性CTLs，受到誘導這種WT1特異性CTLs使對象(HLA-A＊ 0206陽性者)中的癌細胞受到傷害。這種抗腫瘤免疫，可由例如WT1特異性CTL反應，對癌細胞的細胞傷害性試驗(例如51 Cr遊離細胞傷害性試驗)等得到確認。例如以HLA-A＊ 0201限制性引發WT1特異 性CTL反應之先前已報導之由9個胺基酸所成的源自WT1蛋白質之WT1187 胜肽及WT1126 胜肽，可引發HLA-A＊ 0206限制性反應。 約17%的日本人為HLA-A＊ 0206限制性，其限制性也幾乎與HLA-A＊ 0201限制性同樣地多。在下面的實施例1至5中，WT1187 特異性CTLs是由3位不同HLA-A＊ 0206陽性供血者的PBMCs生成的。所誘導的CTLs對WT1表現HLA-A＊ 0206陽性白血病細胞顯示細胞傷害活性。又，因為WT1187 胜肽特異性CTL活性及WT1126 胜肽特異性CTL活性，可經由抗HLA class I抗體使其受到抑制，因此可確認其活性是由於HLA class I限制性CTLs所致。WT1187 胜肽及/或WT1126 胜肽，或含有其修飾胜肽的WT1蛋白質或WT1胜肽，與HLA-A＊ 0201同樣地，可以成為HLA-A＊ 0206陽性患者的疫苗。由於此，對於造血器官腫瘤、實體癌等惡性腫瘤患者之以WT1蛋白質或WT1胜肽為基礎的免疫療法，可以將其應用擴及HLA-A＊ 0206陽性患者。將本發明的癌疫苗組成物給藥至HLA-A＊ 0206陽性者之HLA-A＊ 0206陽性者的癌治療及/或預防法，是本發明的理想的實施態樣之一。
本發明的癌疫苗組成物可使用於在HLA-A＊ 0206陽 性者伴隨有WT1基因的表現程度上升的癌，例如，白血病、骨髓發育不良症候群、多發性骨髓瘤、惡性淋巴腫等造血器官腫瘤；胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等實體癌的治療及/或預防。
又，本發明的癌疫苗組成物的給藥方法，也可舉由 HLA-A＊ 0206陽性患者的末梢血收集PBMCs，由其中取出樹狀細 胞，經以本發明的癌疫苗組成物所含有之作為有效成分的胜肽，例如WT1187 胜肽或WT1126 胜肽、或DNA或RNA等多核苷酸，脈衝(pulse)至患者以皮下給藥等而回送至患者的方法。對樹狀細胞脈衝WT1胜肽等的條件，只要能顯現本發明的效果並無特別限定，可採用通常的條件。
編碼WT1蛋白質或WT1胜肽的RNA使用於癌疫苗 組成物時，以該RNA能被導入至HLA-A＊ 0206陽性患者的樹狀細胞的方式給藥組成物為佳。將RNA導入至HLA-A＊ 0206陽性者的樹狀細胞的方法，可舉如上述由HLA-A＊ 0206陽性者採取樹狀細胞，對該樹狀細胞以電脈衝(electric pulse)將RNA導入的方法。由導入至樹狀細胞的RMA表現的WT1蛋白質或WT1胜肽，由於呈現於該樹狀細胞表面，因此將經脈衝RNA的樹狀細胞回送至HLA-A＊ 0206陽性者體內，可迅速在生體內產生癌免疫。這種將編碼WT1蛋白質或WT1胜肽的RNA導入至HLA-A＊ 0206陽性者的樹狀細胞的癌的治療或預防方法，是本發明理想的實施態樣之一。
本發明的另一個態樣是關於一種WT1特異性CTLs 的誘導方法，係將源自HLA-A＊ 0206陽性者的週邊血液單核球，在WT1蛋白質或WT1胜肽的存在下培養，由該週邊血液單核球誘導WT1特異性CTLs。週邊血液單核球的來源對象，只要是HLA-A＊ 0206陽性即可，並無特別限制。WT1蛋白質或WT1胜肽，可舉WT1187 胜肽或WT1126 胜肽或其修飾胜肽，而以WT1187 胜肽或WT1126 胜肽為合適。例如將源自HLA-A＊ 0206陽性者的週邊血液單核球，在WT1187 胜肽(或WT1126 胜肽)的存在下培養，可由週邊血液單核球中的CTLs前驅細胞誘導WT1特異性CTLs。源自 HLA-A＊ 0206陽性者的週邊血液單核球的培養條件沒有特別限制，可在通常的條件下培養。如此得到的CTLs辨認WT1187 胜肽(或WT1126 胜肽)與HLA-A＊ 0206分子的複合體。因此，使用本發明誘導的WT1特異性CTLs，在HLA-A＊ 0206陽性者中可特異性地傷害WT1高表現腫瘤細胞，可治療及/或預防為其對象之HLA-A＊ 0206陽性者的造血器官腫瘤、實體癌。將WT1特異性CTLs給藥至HLA-A＊ 0206陽性對象者的方法並無特別限制，例如可與上述癌疫苗組成物同樣的方法給藥。
本發明的另一態樣是有關用於誘導WT1特異性 CTLs的套組(kit)，係包含HLA-A＊ 0206限制性WT1蛋白質或WT1胜肽為必需構成成分。理想的是，該套組使用於上述源自HLA-A＊ 0206陽性者的WT1特異性CTLs的誘導方法。這種套組除了HLA-A＊ 0206限制性WT1蛋白質或WT1胜肽之外，也可以含有例如週邊血液單核球的取得手段、佐劑、反應容器等。使用這種套組，則可將辨認WT1187 胜肽或WT1126 胜肽等癌抗原與HLA-A＊ 0206分子的複合體之WT1特異性CTLs有效率地誘導。
本發明的再另一態樣是關於一種呈現WT1蛋白質或WT1胜肽的樹狀細胞的誘導方法，係將源自HLA-A＊ 0206陽性者的未成熟樹狀細胞，在WT1蛋白質或WT1胜肽的存在下培養，由該未成熟樹狀細胞誘導呈現WT1蛋白質或WT1胜肽的樹狀細胞。WT1蛋白質或WT1胜肽可舉WT1187 胜肽或WT1126 胜肽或其修飾胜肽，而以WT1187 胜肽或WT1126 胜肽為合適。未成熟樹狀細胞的來源對象，只要為HLA-A＊ 0206陽性者即可，沒有特別限制。未成熟樹狀細胞是含在例如週邊血液單核球等中，因此也可以將 這種細胞在WT1187 胜肽或WT1126 胜肽的存在下培養。如此所得的樹狀細胞給藥至HLA-A＊ 0206陽性者，有效率地誘導上述WT1特異性CTLs，由此可治療及/或預防對象的造血器官腫瘤、實體癌。將樹狀細胞對HLA-A＊ 0206陽性對象者給藥方法並無特別限制，例如可與上述癌疫苗組成物同樣的方法給藥。
本發明的再另一態樣是有關一種套組，係用於誘導 呈現WT1蛋白質或WT1胜肽的樹狀細胞，係包含HLA-A＊ 0206限制性WT1蛋白質或WT1胜肽為必需構成成分。理想的是將該套組使用於上述樹狀細胞的誘導方法。這種套組除HLA-A＊ 0206限制性WT1蛋白質或WT1胜肽之外，也可以含有例如未成熟樹狀細胞或週邊血液單核球的取得手段、佐劑、反應容器等。使用這種套組，則可經由HLA-A＊ 0206分子將呈現WT1蛋白質或WT1胜肽之樹狀細胞有效率地誘導。
使用(1)WT1蛋白質或WT1胜肽，經由上述方法誘導 的WT1特異性CTLs，或經由上述方法誘導的樹狀細胞，或使用(2)對抗WT1蛋白質或WT1胜肽、經由上述方法誘導的WT1特異性CTLs、或經由上述方法誘導的樹狀細胞的抗體，可診斷HLA-A＊ 0206陽性者的癌。這種癌的診斷方法也是本發明之一。在(1)中，以使用經由上述誘導方法誘導的WT1特異性CTLs進行診斷為佳。WT1蛋白質或WT1胜肽可舉WT1187 胜肽或WT1126 胜肽或其修飾胜肽，而以WT1187 胜肽或WT1126 胜肽為合適。
本發明的HLA-A＊ 0206陽性者的癌的診斷方法，可 舉例如下述方法，包含：檢測或定量源自HLA-A＊ 0206陽性者的樣品中，WT1蛋白質或WT1胜肽、其抗體、或WT1特異性CTLs 的步驟；及其次將該蛋白質或其部分胜肽、其抗體、或WT1特異性CTLs的量，與癌未發症的情況相比較的步驟。
源自癌發症的患者的樣品(例如血液)中，含有由癌 細胞流出的WT1胜肽及/或WT1蛋白質，並由於對抗癌抗原的免疫應答提高，所以對抗該WT1胜肽或WT1蛋白質的抗體、WT1特異性CTLs等的量增加。因此，與癌未發症的情況相比較，該樣品中的WT1胜肽或WT1蛋白質、其抗體或WT1特異性CTLs的量增加時，則有癌發症的可能性。抗體量可用例如ELISA法測定。WT1特異性CTLs可用下述的使用MHC四聚體等WT1多聚體的方法檢測。
又例如，將上述CTLs、樹狀細胞或抗體，與源自 HLA-A＊ 0206陽性對象的樣品培育，或對HLA-A＊ 0206陽性對象給藥，繼而可決定該CTLs、樹狀細胞或抗體之例如位置、部位、量等，而做癌的診斷。由於CTLs及樹狀細胞有聚集於癌細胞的性質，因此在CTLs或樹狀細胞給藥後調查該CTLs或樹狀細胞的位置或部位，而可以做癌的診斷。包含將經由上述方法誘導的WT1特異性CTLs或經由上述方法誘導的樹狀細胞給藥至HLA-A＊ 0206陽性對象的步驟，及其次之決定HLA-A＊ 0206陽性對象中該CTLs或樹狀細胞的位置或部位的步驟之HLA-A＊ 0206陽性者的癌診斷，也是本發明之一。
又，例如將CTLs或樹狀細胞，與源自HLA-A＊ 0206 陽性對象的樣品培育反應後，繼而加入對該CTLs或樹狀細胞的抗體再培育，可由附在抗體的標識等，而檢測或定量與該抗體結合的癌細胞與CTLs的複合體、與該抗體結合的樹狀細胞等，而 做癌的診斷。與癌未發症的情況相比較，與癌細胞與CTLs的複合體、與該抗體結合的樹狀細胞增加時，則有癌發症的可能性。 上述CTLs、樹狀細胞或抗體，可以是經標識者。附上這種標識，可有效率地做診斷。源自HLA-A＊ 0206陽性對象的樣品可舉尿、血液、組織抽出液、唾液、淚液、其他體液等之由HLA-A＊ 0206陽性對象採取的生體樣品，而以血液為佳。
使用上述WT1蛋白質或WT1胜肽之人類白血球型 抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者用的癌的診斷法，可舉例如用WT1胜肽為抗原之MHC四聚體分析、MHC五聚體分析、MHC右旋體(dextramer)等。例如使用WT1187 胜肽或WT1126 胜肽做為抗原胜肽之MHC四聚體分析或MHC五聚體分析中，以MHC/WT1187 胜肽複合體或MHC/WT1126 胜肽複合體做為探針(probe)，可檢測人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者的WT1特異性CTLs。由於癌發症的患者中，WT1特異性CTLs的表現頻率增高，所以可由WT1特異性CTLs表現頻率，做人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者的癌的診斷。又，由於癌發症的患者中，對癌抗原的免疫應答增高，所以由調查人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者對WT1蛋白質或WT1胜肽的免疫應答，也可做癌的診斷。調查免疫應答的方法，可舉以ELISA測定對WT1蛋白質或WT1胜肽的抗體的方法。這種使用癌抑制基因WT1的基因產物之蛋白質或其部分胜肽的人類白血球型抗原(HLA)-A＊ 0206陽性者用的癌的診斷法，也是本發明之一。MHC四聚體分析、MHC五聚體分析，則可使用市售的套組，例如「WT1四聚體」(醫學生物學研究所)，而以公知的方法進行。
又，藉由下述方法，包含：將對抗WT1蛋白質或 WT1胜肽、經由上述方法誘導的WT1特異性CTLs、或經由上述方法誘導的樹狀細胞的抗體，與源自HLA-A＊ 0206陽性對象的樣品反應的步驟，及其次之檢測或定量該抗體與WT1蛋白質或WT1胜肽、與WT1特異性CTLs或與樹狀細胞的複合體的步驟，也可以做HLA-A＊ 0206陽性對象的癌的診斷。與癌未發症的情況相比較，抗體與WT1蛋白質或WT1胜肽、與WT1特異性CTLs或與樹狀細胞的複合體增加時，就有癌發症的可能性。
對樹狀細胞的抗體，可舉辨認WT1胜肽/HLA-A＊ 0206 複合體的抗體。這種抗體可辨認WT1胜肽及HLA-A＊ 0206，因此在樹狀細胞的class I上有呈現WT1胜肽時，可以辨認該樹狀細胞。
又，辨認WT1胜肽/HLA-A＊ 0206/CTRs的TCR(T細 胞抗原受體)複合體的抗體，也可使用做為對樹狀細胞的抗體。這種抗體是可辨認樹狀細胞與CTLs的複合體及癌細胞與CTLs的複合體的抗體。
源自HLA-A＊ 0206陽性對象的樣品與這種抗體培育 反應而形成複合體，繼而由附在抗體的螢光等，檢測或定量與該抗體結合之癌細胞與CTLs的複合體、與該抗體結合之呈現WT1胜肽的樹狀細胞等，而可做癌的診斷。與癌未發症的情況相比較，與該抗體結合之癌細胞與CTLs的複合體、與該抗體結合之呈現WT1胜肽的樹狀細胞有增加時，有癌發症的可能性。
將含有WT1蛋白質或WT1胜肽的組成物，給藥至 HLA-A＊ 0206陽性者的癌的治療或預防法，也是本發明之一。含有WT1蛋白質或WT1胜肽的組成物及其較佳態樣，是與上述的癌疫 苗組成物一樣。
用於HLA-A＊ 0206陽性者的癌的治療或預防的WT1 蛋白質或WT1胜肽；及用於製造HLA-A＊ 0206陽性者的癌的治療或預防的癌疫苗組成物之WT1蛋白質或WT1胜肽的使用，也是本發明之一。WT1蛋白質或WT1胜肽以及其較佳態樣，是與上述癌疫苗組成物一樣。
一種HLA-A＊ 0201陽性者用癌疫苗組成物，含有癌 抑制基因WT1的基因產物的蛋白質的部分胜肽之WT1187 胜肽(序列編號2)或WT1126 胜肽(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A＊ 0206陽性者有免疫原性的胜肽，也是本發明之一。
WT1187 胜肽的修飾胜肽或WT1126 胜肽的修飾胜肽， 可舉在上述的WT1187 胜肽或WT1126 胜肽中，有1個或數個胺基酸欠缺、取代或附加的胜肽。WT1187 胜肽的修飾胜肽，以N末端起第4至第8個胺基酸殘基，與WT1187 胜肽的N末端起第4至第8個胺基酸殘基相同的胜肽為佳。這種修飾胜肽以上述序列編號4至12，序列編號15及16，序列編號18至20，以及序列編號22至25的胜肽為佳。又，WT1187 P9L胜肽(SLGEQQYSL；序列編號53)也佳。WT1126 胜肽的修飾胜肽，以N末端起第4至第8個胺基酸殘基，與WT1126 胜肽的N末端起第4至第8個胺基酸殘基相同的胜肽為佳，例如上述序列編號27至37及序列編號39至52的胜肽為佳。
又在本發明的另一種較佳態樣中，可分別使用上述 序列編號4至26及53至62的胜肽作為WT1187 胜肽的修飾胜肽，序列編號27至52及序列編號63至75的胜肽作為WT1126 胜肽的 修飾胜肽。序列編號4至75的修飾胜肽中，除WT1187 P1D胜肽、WT1187 P1E胜肽、WT1187 P1H胜肽、WT1187 P1P胜肽及WT1187 P2Q胜肽，以及WT1126 P1D胜肽、WT1126 P1E胜肽、WT1126 P1P胜肽、WT1126 P2A胜肽、及WT1126 P1D以外的胜肽為佳。
其中，WT1187 胜肽的修飾胜肽以WT1187 P1F胜肽、 WT1187 P2M胜肽或WT1187 P3M胜肽為佳，以WT1187 P1F胜肽、WT1187 P2M胜肽為較佳。WT1126 胜肽的修飾胜肽以WT1126 P1F胜肽、WT1126 P2L胜肽、WT1126 P3M胜肽或WT1126 P9V胜肽為佳，而以WT1126 P1F胜肽或WT1126 P2L胜肽較佳。
對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的WT1187 胜肽的 修飾胜肽或WT1126 胜肽的修飾胜肽的使用量，則與上述HLA-A＊ 0206陽性者用疫苗組成物中的WT1胜肽相同。又，HLA-A＊ 0201陽性者用癌疫苗組成物的其他成分及較佳態樣，則與上述HLA-A＊ 0206陽性者用疫苗組成物相同。
編碼上述對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的 WT1187 胜肽的修飾胜肽或WT1126 胜肽的修飾胜肽DNA及RNA，也可做為HLA-A＊ 0201陽性者用癌疫苗組成物的有效成分。這種HLA-A＊ 0201陽性者用癌疫苗組成物也是本發明之一。
含有上述DNA或RNA的HLA-A＊ 0201陽性者用癌疫 苗組成物的其他成分及癌疫苗的較佳態樣，則與上述HLA-A＊ 0206陽性者用癌疫苗組成物所使用者相同。
將源自HLA-A＊ 0201陽性者的週邊血液單核球，於 上述對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的WT1187 胜肽的修飾胜肽或WT1126 胜肽的修飾胜肽的存在下培養，可由該週邊血液單核球 誘導WT1特異性的CTLs。這種WT1特異性的CTLs的誘導方法也是本發明之一。
較佳的HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的WT1187 胜 肽的修飾胜肽或WT1126 胜肽的修飾胜肽，與上述HLA-A＊ 0201陽性者用疫苗組成物所使用者相同。
將源自HLA-A＊ 0201陽性者的未成熟樹狀細胞，於 上述對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的WT1187 胜肽的修飾胜肽或WT1126 胜肽的修飾胜肽的存在下培養，可由該未成熟樹狀細胞誘導呈現該修飾胜肽的樹狀細胞。這種呈現WT1187 胜肽的修飾胜肽或WT1126 胜肽的修飾胜肽的樹狀細胞的誘導方法也是本發明之一。較佳的修飾胜肽，是與上述HLA-A＊ 0201陽性者用癌疫苗組成物所使用者相同。
使用自上述對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的 WT1187 胜肽的修飾胜肽或WT1126 胜肽的修飾胜肽、其抗體、該修飾胜肽所誘導的WT1特異性CTLs或該修飾胜肽所誘導之樹狀細胞，可做人類白血球型抗原HLA-A＊ 0201陽性者的癌的診斷。這種HLA-A＊ 0201陽性者的癌的診斷方法也是本發明之一。HLA-A＊ 0201陽性者的癌的診斷方法及其較佳態樣，是與上述HLA-A＊ 0206陽性者用的的癌的診斷方法及其較佳態樣相同。
又，這種HLA-A＊ 0201陽性者用的癌的診斷方法， 可舉使用對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的WT1187 胜肽的修飾胜肽或WT1126 胜肽的修飾胜肽為抗原的MHC四聚體分析、MHC五聚體分析、MHC右旋體等。較佳的修飾胜肽與上述HLA-A＊ 0201陽性者用癌疫苗組成物所使用者相同。
使用自對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的WT1187 胜肽的修飾胜肽或WT1126 胜肽的修飾胜肽、該修飾胜肽誘導的WT1特異性CTLs或該修飾胜肽所誘導之樹狀細胞的抗體，可做人類白血球型抗原HLA-A＊ 0201陽性者的癌的診斷。這種HLA-A＊ 0201陽性者的癌的診斷方法也是本發明之一。較佳的修飾胜肽與上述HLA-A＊ 0201陽性者用癌免疫組成物所使用者相同。 HLA-A＊ 0201陽性者的癌的診斷方法及其較佳態樣，與上述HLA-A＊ 0206陽性者用的癌的診斷方法及其較佳態樣相同。
將含有下列胜肽的癌疫苗組成物給藥至HLA-A＊ 0201 陽性者的癌的治療或預防法也是本發明之一。
癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質的部分胜肽的 WT1187 胜肽(序列編號2)或WT1126 胜肽(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的胜肽。
較佳的修飾胜肽，與上述HLA-A＊ 0201陽性者用癌 疫苗組成物相同。又，癌疫苗組成物及其較佳態樣，與上述HLA-A＊ 0201陽性者用疫苗組成物相同。
本發明又關於下列胜肽的使用，係用於HLA-A＊ 0201 陽性者的癌的治療或預防；及下列胜肽之使用，係用於製造HLA-A＊ 0201陽性者的癌的治療或預防用的癌疫苗組成物的使用。
癌抑制基因WT1的基因產物蛋白質的部分胜肽的 WT1187 胜肽(序列編號2)或WT1126 胜肽(序列編號3)的修飾胜肽，且對HLA-A＊ 0201陽性者有免疫原性的胜肽。
較佳的修飾胜肽，與上述HLA-A＊ 0201陽性者用癌 疫苗組成物所使用者相同。又，癌疫苗組成物及其較佳態樣，與 上述HLA-A＊ 0201陽性者用疫苗組成物所使用者相同。
[實施例]
其次以實施例詳細說明本發明，但本發明並不限定於下列實施例。又，在實施例中的縮寫字有下列的意思。又合成胜肽是由SIGMA GENOSYS JAPAN購入。
DCs：樹狀細胞
PBMCs：週邊血液單核球
CD：Cluster of Differentiation(白血球分化抗原)
GM-CSF：顆粒單核球群落生長因子
IL：介白素(interleukin)
TNF α：腫瘤壞死因子(tumer necrosis factor-α)
PGE：前列腺素(prostaglandin)
Gy：戈雷(gray)
B-LCLS：B-淋巴母細胞株
EB病毒：依波病毒(Epstein Barr Virus)
tBu：三級丁基
Trt：三苯甲基
Fmoc：9-茀甲氧基羰基(9-Fluorenylmethoxy Carbonyl)
實施例1(與WT1胜肽結合之HLA分子的預測)
用NetMHC2.0伺服預測程式，進行與WT1187 胜肽(序列編號2)結合之HLA分子的預測。
結果，有引發具HLA-A＊ 0201限制性之WT1胜肽特異性CTLs的能力的WT1187 胜肽，在NetMHC2.0伺服預測程式(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-2.0/)中，位於顯示對 HLA-A＊ 0206分子有高結合親和性的位置。
實施例2(由HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的PBMCs製作WT1187 胜肽特異性CTLs，及使用其細胞傷害性試驗) (1)由HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的PBMCs的分離及DCs的製作
首先，由HLA-A＊ 0206陽性健康供血者(3人)的週邊血液，以Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMCs。繼而以抗人類CD14粒子-DM(Becton,Dickinson and Company製)，由HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的PBMCs選出CD14陽性細胞。此時，認為CD14陽性細胞多數在單核球中。所選出的CD14陽性細胞以含1v/v%人類AB血清、800IU/ml的GM-CSF(Pepro Tech.Inc.,Rokey Hill,NJ製)、及1000IU/ml的IL-4(Pepro Tech.Inc.製)X-VIVO15培養基(BioWhittaker,Walkersville,MD製)培養而製作DCs。
(2)自體成熟DCs的誘導
在(1)製成的DCs在37℃培養1日後，將含10ng/ml的TNF α(tumor necrosis factor α；Pepro Tech.Inc.,Rokey Hill,NJ)、10ng/ml的IL-β、1000IU/ml的IL-6及1μg/ml的PGE2的成熟細胞介素混合物(cytokine cocktail)加入於DCs培養孔。在37℃培養24小時，得到自體成熟的DCs。
(3)WT1187 胜肽特異性CTLs的誘導
在自體成熟DCs脈衝WT1187 胜肽後，照射放射線(30Gy)，與由HLA-A＊ 0206陽性健康供血者得到的CD8陽性T細胞濃縮PBMCs一起培養。以WT1187 胜肽之DCs脈衝，係與10μg/ml的WT1187 胜肽一起，將DCs在37℃培養30分鐘而進行。CD8 陽性T細胞，是由HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的PBMCs使用CD8微珠(CDs microbeads)及MS管柱(Miltenyi Biotec GmbH製)濃縮。
由第2次的刺激起，將經胜肽脈衝後經放射放射線的自體成熟PBMCs，使用做為選擇性刺激細胞。第2次刺激的2日後，將重組rIL-2(鹽野義製藥股份公司提供)與IL-7(Pepro Tech.Inc.製)分別以10IU/ml與10ng/ml的濃度添加於培養液。在第4次刺激後，在37℃培養10日所得細胞(CTLs)以離心機離心而回收。使用這個細胞(CTLs)，以51 Cr遊離細胞傷害性試驗，調查對目標細胞的細胞傷害活性。
(4)細胞傷害性試驗
細胞傷害性試驗，是以51 Cr遊離細胞傷害性試驗實施。51 Cr遊離細胞傷害性試驗是以下面方式進行。首先，將目標細胞(1×107 個/ml)與100μl的51 Cr(比活性1mCi/ml)一起，在RPMI1640(日本製藥公司製)+10%胎牛血清培養基中，在37℃培養1.5小時，將目標細胞以51 Cr標識。繼而將經51 Cr標識的目標細胞，加入於含有不同濃度的在(3)所得的CTLs(100μl的分析培養基中懸浮者)的孔(圓底的96孔板)，混合，在37℃培養4小時。CTLs與目標細胞，設CTLs為「E」，經51 Cr標識的目標細胞為「T」，則以成為E/T(細胞數)1：1、5：1、20：1或25：1的方式混合。培養後，由各孔收集100μl的上澄液。測定由標識細胞遊離及放出的51 Cr，算出51 Cr的特異性溶解(%)。特異性溶解(%)是以下列方法算出。
上式中，自然放出量是指只有目標細胞的培養上澄液的螢光發光量，最大放出量是指以1質量%Triton X-100處理而完全溶解目標細胞的培養液的螢光發光量。
目標細胞是使用下面所記載的B-LCLs、K562細胞、JY細胞及KH88細胞。又，KH88細胞是與後述的實施例9所使用的KH88OF8細胞相同。
B-LCLs是以EB病毒由HLA-A＊ 0206陽性供血者所得的週邊血液B淋巴球的形質轉換而建立的，但不表現WT1。
K562細胞是由慢性骨髓性白血病母細胞危象(Chronic myeloid leukemiablast crisis)的患者建立，表現WT1，但為HLA class I非表現細胞株。本發明者未能得到野生型WT1表現HLA-A＊ 0206陽性白血病細胞株。因此，也使用了將HLA-A＊ 0206基因導入於K562細胞經形質轉換而做出來的0206K562細胞。以HLA-A＊ 0206基因形質轉換的0206K562細胞，是以使用抗HLA-A2抗體(cloneBB7.2；BD Biosciences Pharmingen製)的FACS分析，確認在細胞表面表現HLA-A＊ 0206分子。
以WT1基因形質轉換的B-LCL細胞，是以西方墨點分析法(Western blot analysis)確認表現WT1。又，以空的載體做為經形質轉換的B-LCL細胞的對照。
JY細胞株是以WT1不表現HLA-A＊ 0206陰性EB病毒轉換的B細胞株。
KH88是WT1表現HLA-A＊ 0206陰性白血病細胞株。
所有的細胞株，都以補充有10v/v%的經加熱不活性 化的胎牛血清、50IU/ml的盤尼西林及50mg/ml的鏈黴素的RPMI1640培養液培養。
(5)抗體及流式細胞技術(flow cytometry)解析
抗人類CD14、CD86、CD80、CD83、HLA-DR mAbs是由Becton Dickinson公司購入。DCs的濃度及成熟的確認，是使用上述列表的單株抗體(mAbs)的細胞的細胞表面抗原的分析實施。樣品是以使用CellQest軟體的流式細胞儀(FACS Calibur；Becton Dickinson製)解析。
(6)結果
試驗WT1胜肽特異性CTLs是否可由HLA-A＊ 0206的供血者的PBMCs做出。將由HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的CD8陽性T細胞濃縮PBMCs，經WT1187 胜肽特異性脈衝的自體DCs或以PBMCs反覆刺激而得到的CTLs，調查其WT1187 胜肽特異性細胞傷害活性。CTLs對經WT1187 胜肽脈衝的自體B-LCL細胞，比未經WT1187 胜肽脈衝的B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第1圖a)。在第1圖a中，縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激而得的CTLs(Effector：E)與目標細胞(Target：T)之比(E/T)。三角(▲)表示經10μg/ml的WT1187 胜肽脈衝的細胞，四角(■)表示未經WT1187 胜肽脈衝的細胞。又，由不同二人的HLA-A＊ 0206陽性健康供血者分離的PBMCs同樣方式做出的CTLs，也確認與上述同樣的細胞傷害活性(第2圖a及b)。第2圖中，三角(▲)表示經10μg/ml的WT1187 胜肽脈衝的細胞，四角(■)表示未經WT1187 胜肽脈衝的細胞。這些結果表示，這些細胞傷害活性是WT1187 胜肽特異性的。
並且，CTLs的細胞傷害活性，是與對DCs或PBMCs 脈衝的WT1187 胜肽的濃度增高成平行地增加，在0.1μg/ml的濃度達穩定(plateace)(第1圖b)。特異性溶解的WT1187 胜肽的半數最大分解(half maximul lysis)濃度約為5×10-5 μg/ml。這表示CTLs的TCRs(T細胞抗原受體)對WT1187 胜肽/HLA-A＊ 0206複合體的親和性相對性的高。這個結果強列暗示由WT1187 胜肽誘導的CTLs可辨認WT1187 胜肽。
其次，如上述使用經WT1187 胜肽脈衝的DCs或 PBMCs，刺激由HLA-A＊ 0206陽性供血者的CD8陽性T細胞濃縮PBMCs而製作的CTLs，調查其對內在性表現WT1的各種目標細胞的細胞傷害活性。其結果示於第3圖a及b。第3圖a及b所示對各目標細胞的細胞傷害活性是同時測定的。第3圖a顯示對於以WT1形質轉換的B-LCLs(WT1表現，HLA-A＊ 0206陽性；▲)或以空載體形質轉換的B-LCLs(WT1不表現，HLA-A＊ 0206陽性；■)之WT1187 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性。第3圖b顯示對0206K562細胞(表現WT1，HLA-A＊ 0206陽性；■)、K562細胞(表現WT1，HLA-A＊ 0206陰性；□)、KH88細胞(表現WT1，HLA-A＊ 0206陰性；●)及JY細胞(非表現WT1，HLA-A＊ 0206陰性；▲)之WT1187 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性。
CTLs對於以WT1187 胜肽形質轉換過的B-LCL(WT1 非表現HLA-A＊ 0206陽性)比以空白載體形質轉換的B-LCL(WT1表現HLA-A＊ 0206陽性)顯示較強的細胞傷害活性(第3圖a)。又，如第3圖b所示，該CTLs對以HLA-A＊ 0206形質轉換的0206K562細胞(WT1表現HLA-A＊ 0206陽性)比對K562細胞(WT1表現 HLA-A＊ 0206陰性)、KH88(WT1表現HLA-A＊ 0206陰性)、或JY(WT1非表現HLA-A＊ 0206陽性)顯示更強的細胞傷害活性。換言之，CTLs對WT1表現HLA-A＊ 0206陽性目標白血病細胞顯示顯著的細胞傷害活性，但對WT1不表現及/或HLA-A＊ 0206陰性細胞則不顯示細胞傷害活性。這個結果顯示，在活體外作成的對WT1187 胜肽特異性的CTLs，對包含具HLA-A＊ 0206限制性的白血病在內之表現WT1的腫瘤細胞，顯示細胞傷害活性。第3圖b所示的結果，強列暗示由WT1187 胜肽特異性的CTLs所帶來的細胞傷害活性，受到HLA-A class I限制。這是由於觀察到，對0206K562細胞比K562細胞有較強的細胞傷害活性之故。
由以上的事實，證明前述培養細胞(CTLs)為WT1187 胜肽特異性CTLs。
又，圖所示的結果是典型的數據，且基本上多少有 變異，但都可以再現的。
實施例3(WT1187 胜肽特異性CTLs的限制HLA class的確認)
在實施例2所得的WT1187 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性是否為HLA class I限制性，加以確認。對於HLA class I或HLA class II之mAb的存在或不存在下進行51 Cr遊離細胞傷害性試驗。目標細胞是使用自體B-LCLs。以E/T比為5：1進行。
其結果示於第4圖。第4圖中的a是以B-LCLs(WT1187 不表現HLA-A＊ 0206陽性)為目標細胞，在對HLA class I的mAb(抗-HLA class I mAb)及對HLA class II的mAb(抗-HLA class II mAb)不存在下做試驗的結果。b是經WT1187 胜肽脈衝的B-LCLs(WT1187 表現HLA-A＊ 0206陽性)為目標細胞，在抗-HLA class I mAb不存在 且對抗-HLA class II mAb存在下做試驗的結果。c是經WT1187 胜肽脈衝的HLA-A＊ 0206陽性為目標細胞，在抗-HLA class I mAb存在下且抗-HLA class II mAb不存在下做試驗的結果。d是經WT1187 胜肽脈衝的HLA-A＊ 0206陽性為目標細胞，在抗-HLA class I mAb及抗-HLA class II mAb不存在下做試驗的結果。
由第4圖可知WT1187 胜肽特異性CTLs的細胞傷害 活性，非由抗HLA class II抗體的添加，而是由抗HLA class I抗體的添加而完全被抑制。WT1187 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性，顯示如預料為HLA class I限制性。
實施例4(對腫瘤細胞的細胞傷害性試驗)
使用在實施例2所得的WT1187 胜肽特異性CTLs，在活體外進行對具有HLA-A＊ 0206限制性的WT1表現腫瘤細胞的細胞傷害性試驗。細胞傷害性試驗是使用實施例2所記載的51 Cr遊離細胞傷害性試驗而實施。其結果，該WT1187 胜肽特異性CTLs對WT1表現腫瘤細胞顯示細胞傷害活性(圖未示)。
實施例5(WT1126 胜肽特異性CTLs的製作，及使用該CTLs的細胞傷害性試驗)
在實施例2(3)中，除了以WT1126 胜肽(序列編號3)取代WT1187 胜肽以外，以同樣的方法製成WT1126 胜肽特異性CTLs。使用此CTLs，與實施例2同樣進行細胞傷害性試驗，測定WT1126 胜肽特異性細胞傷害活性。第5圖中顯示，由與第2圖b同一位HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的PBMCs誘導的WT1126 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性。第5圖中，三角印(▲)表示經10μg/ml的WT1126 胜肽脈衝的細胞，四角印(■)表示未經以WT1126 胜肽脈衝的細胞。CTLs對經以WT1126 胜肽脈衝的自體B-LCL細胞，比未經以WT1126 胜肽脈衝的B-LCL細胞，顯示更強的細胞傷害活性(第5圖)。這個結果顯示，CTLs的細胞傷害活性是WT1126 胜肽特異性者。
又，與實施例2同樣的方法，使用以經WT1126 胜肽 脈衝過的DCs或PBMCs刺激HLA-A＊ 0206陽性供血者的CD8陽性T細胞濃縮PBMCs而製成CTLs，調查對內在性表現WT1的各種目標細胞的細胞傷害活性。對各目標細胞的細胞傷害活性示於第6圖a及b。圖a及b中的目標細胞是，0206K562細胞(WT表現1，HLA-A＊ 0206陽性；■)，K562細胞(WT1表現，HLA-A＊ 0206陰性；□)，KH88細胞(WT1表現，HLA-A＊ 0206陰性；●)及JY細胞(WT1非表現，HLA-A＊ 0206陰性；▲)。第6圖a顯示，由與第2圖a同一HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的PBMCs誘導的WT1126 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性圖，第6圖b顯示，由與第2圖b同一HLA-A＊ 0206陽性健康供血者的PBMCs誘導的WT1126 胜肽特異性CTLs的細胞傷害活性圖。
WT1126 胜肽特異性CTLs，與WT1187 胜肽特異性CTLs 同樣，對WT1表現HLA-A＊ 0206陽性目標白血病細胞顯示顯著的細胞傷害活性，對WT1非表現及/或HLA-A＊ 0206陰性細胞則不顯示細胞傷害活性。此結果顯示，在活體外作成的WT1126 胜肽特異性CTLs，對包含具HLA-A＊ 0206限制性的白血病之內在性表現WT1的腫瘤細胞，顯示細胞傷害活性。第6圖a及b所示結果，強烈暗示WT1126 胜肽特異性CTLs所帶來的細胞傷害活性，受到HLA-A class I限制。這是由於觀察到對0206K562細胞，比對K562 細胞有更強的細胞傷害活性之故。
由以上所述，證明這些CTLs為WT1126 胜肽特異性CTLs。
又，圖所示的結果是典型的數據，且基本上多少有變異，但都是可再現的。
實施例6(疫苗組成物的調製)
調製如下所列的疫苗組成物1至8。這些是本發明的癌疫苗組成物的一例。
癌疫苗組成物1
將上述成分混合，做為癌疫苗組成物1。
癌疫苗組成物2
將上述成分混合，做為癌疫苗組成物2。
癌疫苗組成物3
將上述成分混合，做為癌疫苗組成物3。
癌疫苗組成物4
將上述成分混合，做為癌疫苗組成物4。
癌疫苗組成物5至8
在上述癌疫苗組成物1至4中，以WT1126 胜肽取代WT1187 胜肽，而製造癌疫苗組成物5至8。
實施例7(修飾胜肽對HLA-A＊ 0206分子的親和性)
對WT1187 胜肽、WT1126 胜肽及這些胜肽的N末端起第1個、第2個、第3個或第9個的胺基酸殘基經置換的修飾胜肽，以NetMHC2.0伺服預測程式分析其對HLA-A＊ 0206分子的親和性(affinity)。分別將WT1187 胜肽的修飾胜肽的分析結果示於表1，WT1126 胜肽的修飾胜肽的分析結果示於表2。親和性數值越小(可結合的胜肽濃度低)，表示親和性越高。
實施例8(修飾胜肽對HLA-A＊ 0201分子的親和性)
對WT1187 胜肽、WT1126 胜肽及這些胜肽的N末端起第1個、第2個、第3個或第9個的胺基酸殘基經置換的修飾胜肽，以NetMHC2.0伺服預測程式分析其對HLA-A＊ 0201分子的親和性(affinity)。將WT1187 胜肽的修飾胜肽的分析結果示於表3，將 WT1126 胜肽的修飾胜肽的分析結果示於表4。親和性數值越小，表示親和性越高。
實施例9(因WT1126 修飾胜肽之HLA-A＊ 0201限制性CTL誘導的比較) (1)目的
考慮實施例8的結果在內，WT1126 修飾胜肽選擇WT1126 P1F胜肽(序列編號34)、WT1126 P2L胜肽(序列編號39)、WT1126 P3M胜肽(序列編號46)及WT1126 P9V胜肽(序列編號49)，篩選能誘導細胞傷害活性高的CTL的WT1126 修飾胜肽為目的，而進 行本實驗。又，在實施例9至12所用的試藥、培養基、實驗方法等，如無特別說明，與實施例1相同。在實施例9至12中，如無特別說明，培養均在37℃進行。
(2)材料及方法
由表現HLA-A＊ 0201分子的健康提供者(HLA-A＊ 0201健康供血者)分離週邊血液單核球(PBMCs)，再以抗人類CD14粒子-DM(Anti-Human CD14 Particles-DM)分離CD14陽性細胞。將本細胞以含有1v/v%人類AB血清(1% human AB serum)的X-VIVO15培養基，添加800IU/ml的GM-CSF及1000IU/ml的IL-4的培養液中，培養1日。
對本培養物添加含有10ng/ml的TNF α、10ng/ml的IL-β、1000IU/ml的IL-6及1μg/ml的PGE2的成熟細胞介素混合物(maturation cytokine cocktail)。再培養1日後，獲得自體成熟DCs(mature DCs)。
經在實施例13所得10μg/ml的WT1126 修飾胜肽(WT1126 P1F胜肽、WT1126 P2L胜肽、WT1126 P3M胜肽或WT1126 P9V胜肽)脈衝的自體成熟DCs，在培養4小時後，照射放射線(35Gy)，使用做為CTLs誘導的刺激細胞。
在24孔盤的1個孔中，PBMCs(2×105 個/孔)做為應答細胞(responder)，而與前述的DCs(2×105 個/孔)一起培養。1週後，以經胜肽脈衝的放射線照射(75Gy)T2細胞再刺激。再刺激3日後，添加20IU/ml的IL-2。經胜肽脈衝的放射線照射T2細胞同樣再刺激再反覆3次後，濃縮應答細胞中的CD8陽性細胞。
將此CD8陽性T細胞，使用WT1126 胜肽的HLA-A＊ 0201 四聚體的流式細胞儀解析反應性以及檢討對各種目標細胞的細胞傷害活性。
目標細胞是使用表5所示的K562細胞、0206K562細胞、JY細胞、KH88OF8細胞、TF-1細胞及THP-1細胞。這些細胞的特徵示於表5。又，由HLA-A＊ 0201陽性提供者的血液以EB病毒感染所建立的B淋巴母細胞(B-LCL)也做為目標細胞而使用。
(3)結果
將以各WT1126 刺激的HLA-A＊ 0201陽性的提供者1的PBMCs，以PE(Phycoerythrin)標識的WT1126 胜肽的HLA-A＊ 0201的四聚體(醫學生物研究所)及APC-Cy7(Allophycocyanin-Cyanine-7)標識的抗CD8抗體染色，而以流式細胞儀解析的結果，示於第7圖。將PBMCs以上述四聚體及抗CD8抗體染色時，由修飾胜肽的刺激而誘導的CTLs與該四聚體及抗CD8抗體結合，結果可檢測該四聚體的螢光及抗CD8抗體的螢光。在第7圖a至e中，分別為縱軸表示HLA-A＊ 0201四聚體的螢光強度，橫軸為抗CD8抗體的螢光強度。在第7圖a至e中的四邊形所圍的範圍，是表示 被誘導的、具有HLA-A＊ 0201限制性的、可辨認WT1126 胜肽的CTLs的頻率(%)。第7圖a是將未以WT1126 修飾胜肽刺激的PBMCs，以上述四聚體及抗CD8抗體染色者(背景)。第7圖b是將以WT1126 P1F胜肽刺激的PBMCs染色而解析的結果。第7圖c是將以WT1126 P2L胜肽刺激的PBMCs染色而解析的結果。第7圖d是將以WT1126 P3M胜肽刺激的PBMCs染色而解析的結果。第7圖e是將以WT1126 P9V胜肽刺激的PBMCs染色而解析的結果。
以WT1126 P1F胜肽刺激的PBMCs誘導的上述CTLs 的頻率是0.14%(第7圖b)，以WT1126 P2L胜肽刺激的PBMCs誘導的上述CTLs的頻率是0.37%(第7圖c)，由這些胜肽誘導的CTLs是HLA四聚體陽性且CD8陽性，為可與WT1126 胜肽的HLA-A＊ 0201四聚體結合的CTLs。由此結果顯示，由PBMCs的WT1126 修飾胜肽刺激，誘導出能辨認野生型胜肽(WT1126 修飾胜肽)的CTLs。
測定提供者1的PBMCs以WT1126 P1F胜肽刺激誘導 的CTLs之細胞傷害活性的結果示於第8圖。第8圖中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞(Effector,E)與目標細胞(Target,T)之比(E/T比)。菱型(◆)表示以JY細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示以經WT1126 P1F胜肽脈衝的JY細胞做為目標細胞的情況。
JY細胞是HLA-A＊ 0201陽性，且是WT1陰性，CTLs 對經WT1126 P1F胜肽脈衝的JY細胞，比未脈衝過的JY細胞，顯示較強的細胞傷害活性。由此結果顯示，用於刺激之胜肽特異性的HLA-A＊ 0201限制性的CTLs受到誘導。
測定提供者1的PBMCs以WT1126 P2L胜肽刺激誘導 的CTLs之細胞傷害活性的結果示於第9圖。第9圖中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞(Effector,E)與目標細胞(Target,T)之比(E/T比)。在第9圖a中，分別為菱型(◆)表示以JY細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示以經WT1126 P2L胜肽脈衝的JY細胞做為目標細胞的情況。在第9圖b中，分別為菱型(◆)表示以TF-1細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示以THP-1細胞做為目標細胞的情況，三角(▲)表示以KH88OF8細胞做為目標細胞的情況，叉型(×)表示以B-CLC細胞做為目標細胞的情況。
所誘導的CTLs，對經WT1126 P2L胜肽脈衝的JY細 胞，比未經該胜肽脈衝的JY細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第9圖a)。又，所誘導的CTLs對於HLA-A＊ 0201陽性且WT1陽性的TF-1細胞及THP-1細胞，比對於HLA-A＊ 0201陰性且WT1陽性的KH88OF8細胞株，及HLA-A＊ 0201陽性且WT1陰性的B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第9圖b)。由此結果可知，以WT1126 P2L胜肽刺激所誘導的CTLs為HLA-A＊ 0201限制性，傷害內因性表現WT1的癌細胞。
將經WT1126 P2L胜肽刺激的HLA-A＊ 0201陽性提供者 2的PBMCs以經PE標識的WT1126 胜肽的HLA-A＊ 0201的四聚體及經APC-Cy7標識的抗CD8染色，以流式細胞儀解析的結果示於第10圖。即第10圖顯示，所誘導的CTLs以WT1126 胜肽的四聚體及抗CD8抗體染色而以流式細胞儀解析的結果。分別為縱軸表示由HLA-A＊ 0201四聚體所致之螢光強度，橫軸表示由抗CD8抗體所致之螢光強度。
第10圖的右上(UR)部分的細胞，被誘導而具有 HLA-A＊ 0201限制性的，為可辨認WT1126 胜肽的CTLs。經WT1126 P2L胜肽刺激PBMCs的淋巴球中，5.43%為HLA四聚體陽性且CD8陽性，為可與WT1126 胜肽的HLA-A＊ 0201四聚體結合的CTLs。此結果顯示，由PBMCs的修飾胜肽刺激所致之能辨認野生型胜肽的CD8陽性的CTLs受到誘導。
經WT1126 P2L胜肽刺激提供者2的PBMCs所誘導的 CTLs的細胞傷害活性的測定結果，示於第11圖。第11圖a及第11圖b中，縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞(Effector,E)與目標細胞(Target,T)之比(E/T比)。 在第11圖a中，分別為菱型(◆)表示以JY細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示經WT1126 胜肽脈衝的JY細胞做為目標細胞的情況。在第11圖b中，菱型(◆)表示以JY細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示經WT1126 P2L胜肽脈衝的JY細胞做為目標細胞的情況。
所誘導的CTLs對經WT1126 胜肽脈衝的JY細胞，比未以胜肽脈衝的JY細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第11圖a)。又，所誘導的CTLs對經WT1126 P2L胜肽脈衝的JY細胞，比未以胜肽脈衝的JY細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第11圖b)。由此結果可明白，以WT1126 P2L胜肽刺激所誘導的CTLs，可辨認WT1126 P2L胜肽及野生型WT1126 胜肽二者。
實施例10(以WT1126 修飾胜肽所致之HLA-A＊ 0206限制性CTLs誘導的比較) (1)目的
考慮實施例7的結果，選擇WT1126 P1F胜肽、WT1126 P2L胜肽、WT1126 P3M胜肽及WT1126 P9V胜肽做為WT1126 P2L修飾胜肽，以篩選能誘導細胞傷害活性高的CTLs的WT1126 修飾胜肽為目的，進行本實驗。
(2)材料及方法
由表現HLA-A＊ 0206的健康提供者(HLA-A＊ 0206健康供血者)分離週邊血液單核球(PBMCs)，再使用抗人類CD14粒子-DM(Anti-Human CD14 Particles-DM)分離CD14陽性細胞。將該細胞以含有1v/v%人類AB血清(1% human AB serum)的X-VIVO15培養基中，添加800IU/ml的GM-CSF及1000IU/ml的IL-4的培養液，培養1日。
在本培養物中，添加含有10ng/ml的TNF α、10ng/ml的IL-β、1000IU/ml的IL-6及1μg的PGE2的成熟細胞介素混合物(maturation cytokine cocktail)。再培養1日後，獲得自體成熟DCs(mature DCs)。
經在實施例13所得的10μg/ml的WT1126 修飾胜肽(WT1126 P1F胜肽、WT1126 P2L胜肽、WT1126 P3M胜肽或WT1126 P9V胜肽)脈衝的自體成熟DCs，在培養4小時後，照射放射線(35Gy)，使用做為誘導CTLs的刺激細胞。
在24孔盤的一個孔，經濃縮CD8陽性T細胞的BMCs(2×106 個/孔)及前述的DCs(1×105 個/孔)一起培養。10日後，經胜肽脈衝之以放射線照射(35Gy)的PBMCs細胞再刺激。再刺激的2日後，添加10IU/ml的IL-2及10ng/ml的IL-7。同樣的刺激再重複4次後，濃縮CD8陽性T細胞。以此CD8陽性T細胞，檢討 其對各種目標細胞的細胞傷害活性。
使用HLA-A＊ 0206陽性提供者的血液以EB病毒感染而建立的B-LCL細胞、K562細胞及0206K562細胞，做為目標細胞。
(3)結果
測定HLA-A＊ 0206陽性提供者3的PBMCs，以胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性結果示於第12圖。分別為第12圖a顯示以WT1126 P2L胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性，第12圖b顯示以WT1126 P3M胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性，第12圖c顯示：以WT1126 P9V胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性。第12圖a至c中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞(Effector,E)與目標細胞(Target,T)之比(E/T比)。分別為菱型(◆)表示使用自己B-LCL細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示使用經用於刺激之WT1126 胜肽脈衝的自己B-LCL細胞做為目標細胞的情況。
以WT1126 P2L胜肽刺激所誘導的CTLs，對經WT1126 P2L胜肽脈衝的HLA-A＊ 0206陽性且WT1陰性的自己B-LCL細胞，比未以胜肽脈衝的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第12圖a)。以WT1126 P3M胜肽刺激所誘導的CTLs，對經WT1126 P3M胜肽脈衝的HLA-A＊ 0206陽性且WT1陰性的自己B-LCL細胞，比未以胜肽脈衝的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第12圖b)。以WT1126 P9V胜肽刺激所誘導的CTLs，對經WT1126 P9V胜肽脈衝的HLA-A＊ 0206陽性且WT1陰性的自己B-LCL細胞，比未以胜肽脈衝的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害 活性(第12圖c)。
此結果顯示，用於刺激的胜肽特異性的HLA-A＊ 0206限制性的CTLs受到誘導。
測定HLA-A＊ 0206陽性提供者3的PBMCs，以WT1126 P9V胜肽刺激誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第13圖。第13圖中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞(Effector,E)與目標細胞(Target,T)之比(E/T比)。分別為菱型(◆)表示以自己B-LCL細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示使用於自己B-LCL細胞經導入WT1基因的細胞的情況。
第13圖顯示，以WT1126 P9V胜肽刺激所誘導的CTLs，對HLA-A＊ 0206陽性且WT1陰性的於自己B-LCL細胞經導入WT1基因而成為WT1陽性的細胞，比未導入WT1基因的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性。由此結果可知，以WT1126 P9V胜肽刺激所誘導的CTLs，為HLA-A＊ 0206限制性，辨認內因性呈現野生型的WT1126 胜肽，顯示細胞傷害活性。
測定HLA-A＊ 0206陽性提供者4的PBMCs，以胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第14圖。分別為第14圖a顯示以WT1126 P2L胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性，第14圖b顯示以WT1126 P3M胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性，第14圖c顯示以WT1126 P9V胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性。第14圖a至c中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞(Effector,E)與目標細胞(Target,T)之比(E/T比)。分別為菱型(◆)表示使用自己 B-LCL細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示使用用於刺激之經WT1126 修飾胜肽脈衝的自己B-LCL細胞做為目標細胞的情況。
以WT1126 P2L胜肽刺激所誘導的CTLs，對經 WT1126 P2L胜肽脈衝的HLA-A＊ 0206陽性且WT1陰性的自己B-LCL細胞，比未以胜肽脈衝的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第14圖a)。以WT1126 P3M胜肽脈衝所誘導的CTLs，對經WT1126 P3M胜肽脈衝的HLA-A＊ 0206陽性且WT1陰性的自己B-LCL細胞，比未以胜肽脈衝的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第14b圖)。以WT1126 P9V胜肽刺激所誘導的CTLs，對經WT1126 P9V胜肽脈衝的HLA-A＊ 0206陽性且WT1陰性的自己B-LCL細胞，比未以胜肽脈衝的自己B-LCL細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第14圖c)。由此結果顯示，所誘導的CTLs，對於使用於刺激的胜肽有特異性的HLA-A＊ 0206限制性的CTLs受到誘導。
測定HLA-A＊ 0206陽性提供者4的PBMCs，以胜肽 刺激誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第15圖。目標細胞是分別使用HLA-A＊ 0206陰性且WT1陽性的K562細胞，及在K562細胞導入HLA-A＊ 0206基因而內因性地呈現WT1的抗原胜肽的細胞(0206K562細胞)。第15圖a顯示以WT1126 P2L胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活，第15圖b顯示以WT1126 P3M胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性，第15圖c顯示以WT1126 P9V胜肽刺激所誘導的CTLs的細胞傷害活性。第15圖a至c中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞(Effector,E)與目標細胞(Target,T)之比(E/T比)。又，分別為菱型(◆)表示使用K562細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示 使用在K562細胞導入HLA-A＊ 0206基因而內因性地呈現WT1的抗原胜肽的0206K562細胞做為目標細胞的情況。
由第15圖a至c顯示，以WT1126 P2L胜肽、WT1126 P3M 胜肽或WT1126 P9V胜肽刺激所誘導的CTLs，在任一情況都對0206K562細胞，比K562細胞，顯示較強的細胞傷害活性。由此結果可知，以這些修飾胜肽刺激所誘導的CTLs，為HLA-A＊ 0206限制性，辨認內因性呈現野生型的WT1126 胜肽，而顯示細胞傷害活性。
實施例11(WT1126 修飾胜肽所致之HLA-A＊ 0201限制性的CTLs誘導的比較) (1)目的
考慮實施例8的結果，而選擇WT1187 P1F胜肽(序列編號11)、WT1187 P2M胜肽(序列編號16)及WT1187 P3M(序列編號20)做為WT1187 修飾胜肽，以篩選能誘導細胞傷害活性高的CTLs的WT1187 修飾胜肽為目的，進行本實驗。
(2)材料及方法
由表現HLA-A＊ 0201的健康提供人(HLA-A＊ 0201健康供血者)分離週邊血液單核球(PBMCs)，再使用抗人類CD14粒子-DM(Anti-Human CD14 Particles-DM)分離CD14陽性細胞。將該細胞以含有1v/v%人類AB血清(1% human AB serum)的X-VIVO15培養基中添加800IU/ml的GM-CSF及1000IU/ml的IL-4的培養液，培養1日。
在本培養物中，添加含有10ng/ml的TNF α、10ng/ml的IL-β、1000IU/ml的IL-6及1μg/ml的PGE2的成熟細胞介素混 合物(maturation cytokine cocktail)。再培養1日後，獲得自體成熟DCs(mature DCs)。
經在實施例13所得的10μg/ml的WT1187 修飾胜肽 (WT1187 P1F胜肽、WT1187 P2M胜肽或WT1187 P3M胜肽)脈衝的自體成熟DCs，在培養4小時後，照射放射線(35Gy)，使用做為誘導CTLs的刺激細胞。
在24孔盤的一個孔，做為應答細胞的PBMCs(2×106 個/孔)及前述的DCs(2×105 個/孔)一起培養。1週後，經胜肽脈衝的放射線照射(75Gy)T2細胞再刺激。再刺激的3日後，添加20IU/ml的IL-2。同樣地重複3次經胜態脈衝的放射線照射T2細胞的刺激，濃縮應答細胞中的CD8陽性T細胞。以此CD8陽性T細胞，檢討其對JY細胞做為目標細胞的細胞傷害活性。
(3)結果
測定HLA-A＊ 0201陽性提供者的PBMCs，以WT1187 P1F胜肽(第16圖a)或WT1187 P2M胜肽(第16圖b)刺激誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第16圖。第16圖a及第16圖b中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞(Effector,E)與目標細胞(Target,T)之比(E/T比)。分別為菱型(◆)表示使用JY細胞做為目標細胞的情況，三角(▲)表示使用經WT1187 脈衝的JY細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示使用經用於刺激的WT1187 修飾胜肽(WT1187 P1F胜肽)脈衝的JY細胞做為目標細胞的情況。JY細胞是HLA-A＊ 0201陽性且WT1陰性。
以WT1187 P1F胜肽所誘導的CTLs，對經WT1187 胜肽脈衝的JY細胞及經WT1187 P1F胜肽脈衝的JY細胞，顯示同等的 細胞傷害活性，其活性比未以胜肽脈衝的JY細胞較強(第16圖a)。以WT1187 P2M胜肽刺激所誘導的CTLs，對經WT1187 胜肽脈衝的JY細胞及經WT1187 P2M胜肽脈衝的JY細胞顯示同等的細胞傷害活性，其活性比未以胜肽脈衝的JY細胞較強(第16圖b)。由此結果可知，以修飾胜肽刺激所誘導的CTLs，可辨認修飾胜肽及野生型WT1187 胜肽兩者。
實施例12(WT1187 修飾胜肽所致之HLA-A＊ 0206限制性CTLs誘導的比較) (1)目的
考慮實施例7的結果，選擇WT1187 P1F胜肽、WT1187 P2M胜肽及WT1187 P3M胜肽做為WT1187 修飾胜肽，以篩選能誘導細胞傷害活性高的CTLs的WT1187 修飾胜肽為目的，進行本實驗。
(2)材料及方法
由表現HLA-A＊ 0206的健康提供人(HLA-A＊ 0206健康供血者)分離週邊血液單核球(PBMCs)，再使用抗人類CD14粒子-DM(Anti-Human CD14 Particles-DM)分離CD14陽性細胞。將該細胞以含有1v/v%人類AB血清(1% human AB serum)的X-VIVO15培養基中添加800IU/ml的GM-CSF及1000IU/ml的IL-4的培養液，培養1日。
在本培養物中，添加含有10ng/ml的TNF α、10ng/ml的IL-β、1000IU/ml的IL-6及1μg/ml的PGE2的成熟細胞介素混合物(maturation cytokine cocktail)。再培養1日後，獲得自體成熟DCs(mature DCs)。
經在實施例13所得的10μg/ml的WT1187 修飾胜肽 (WT1187 P1F胜肽、WT1187 P2M胜肽或WT1187 P3M胜肽)脈衝的自體成熟DCs，在培養4小時後，照射放射線(35Gy)，使用做為誘導CTLs的刺激細胞。
在24孔盤的一個孔，經濃縮CD8陽性T細胞的 PBMCs(2×106 個/孔)及前述的DCs(2×105 個/孔)一起培養。10日後，經胜肽脈衝的放射線照射(35Gy)PBMCs細胞再刺激。再刺激的2日後，添加10IU/ml的IL-2及10ng/ml的IL-7。同樣的刺激再重複4次後，濃縮CD8陽性T細胞。以此CD8陽性T細胞，檢討其對各種目標細胞的細胞傷害活性。
使用的目標細胞有HLA-A＊ 0206陽性提供者的血液以EB病毒感染而建立的B-LCL細胞、K562及0206K562細胞。
(3)結果
測定HLA-A＊ 0206陽性提供者的PBMCs，以WT1187 P1F胜肽刺激誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第17圖。第17圖中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞(Effector,E)與目標細胞(Target,T)之比(E/T比)。在第17圖a中，菱型(◆)表示使用B-LCL細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示使用經WT1187 脈衝的B-LCL細胞做為目標細胞的情況，三角(▲)表示使用經WT1187 P1F胜肽脈衝的B-LCL細胞做為目標細胞的情況。在第17圖b中，菱型(◆)表示使用K562細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示使用在K562細胞導入HLA-A＊ 0206基因而內因性呈現WT1的抗原胜肽的0206K562細胞做為目標細胞的情況。
以WT1187 P1F胜肽所誘導的CTLs，對經WT1187 胜肽 脈衝的B-LCL細胞，及經WT1187 P1F胜肽脈衝的B-LCL細胞，顯示同等的細胞傷害活性，其活性比未以胜肽脈衝的B-LCL細胞較強(第17圖a)。又，在使用HLA-A＊ 0206陰性且WT1陽性的K562細胞，與在K562細胞導入HLA-A＊ 0206基因而內因性呈現WT1抗原胜肽的細胞(0206K52細胞)的情況，以WT1187 P1F胜肽所誘導的CTLs，對0206K52細胞，比對K562細胞，顯示較強的細胞傷害活性(第17圖b)。由這些結果可知，以WT1187 P1F胜肽刺激所誘導的CTLs，可辨認WT1187 P1F胜肽及野生型的WT1胜肽兩者，為HLA-A＊ 0206限制性，辨識內因性呈現的野生型WT1187 胜肽而顯示細胞傷害活性。
測定HLA-A＊ 0206陽性提供者的PBMCs，以WT1187 P2M 胜肽刺激誘導的CTLs的細胞傷害活性的結果示於第18圖。第18圖中，分別為縱軸表示細胞傷害活性，橫軸表示由胜肽刺激得到的CD8陽性T細胞(Effector,E)與目標細胞(Target,T)之比(E/T比)。在第18圖a中，分別為菱型(◆)表示使用B-LCL細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示使用經WT1187 脈衝的B-LCL細胞做為目標細胞的情況，三角(▲)表示使用經WT1187 P2M脈衝的B-LCL細胞做為目標細胞的情況。在第18圖b中，分別為菱型(◆)表示使用K562細胞做為目標細胞的情況，四角(■)表示在K562細胞導入HLA-A＊ 0206基因而內因性呈現WT1的抗原胜肽的0206K562細胞做為目標細胞的情況。
以WT1187 P2M胜肽所誘導的CTLs，對經WT1187 胜肽 脈衝的B-LCL細胞及經WT1187 P2M胜肽脈衝的B-LCL細胞，顯示 同等的細胞傷害活性，其活性比未以胜肽脈衝的B-LCL細胞較強(第18圖a)。又，在使用HLA-A＊ 0206陰性且WT1陽性的K562細胞，與在K562細胞導入HLA-A＊ 0206基因而內因性呈現WT1抗原胜肽的細胞(0206K562細胞)做為目標細胞的情況，以WT1187 P2M胜肽誘導的CTLs，對0206K562細胞比對K562細胞顯示較強的細胞傷害活性(第18圖b)。由這些結果可知，以WT1187 P2M胜肽刺激所誘導的CTLs，可辨認WT1187 P2M胜肽及野生型的WT1187 胜肽雙方，為HLA-A＊ 0206限制性，內因性呈現的野生型WT1187 胜肽而顯示細胞傷害活性。
由實施例9至12的結果可知，以WT1126 修飾胜肽之 WT1126 P1F胜肽、WT1126 P2L胜肽WT1126 P3M胜肽及WT1126 P9V胜肽刺激所誘導的CTLs，為HLA-A＊ 0206限制性，辨識內因性呈現的野生型WT1126 胜肽，而顯示細胞傷害活性。其中，尤以WT1126 P9V胜肽、WT1126 P2L胜肽及WT1126 P3M胜肽的效果為高。
以WT1187 修飾胜肽之WT1187 P1F胜肽、WT1187 P2M胜 肽及WT1187 P3M胜肽刺激所誘導的CTLs，為HLA-A＊ 0206限制性，辨識內因性呈現的野生型WT1187 胜肽，而顯示細胞傷害活性。其中，尤以WT1187 P2M胜肽及WT1187 P1F胜肽的效果為高。
如此顯示，這些修飾胜肽，在HLA-A＊ 0206陽性者中，有效於伴隨WT1基因的表現水準上升之癌的治療及預防。
由上述結果也可知，以WT1126 胜肽的修飾胜肽之WT1126 P1F胜肽、WT1126 P2L胜肽、WT1126 P3M胜肽及WT1126 P9V胜肽刺激所誘導的CTLs，為HLA-A＊ 0201限制性，辨識內因性呈現的野生型WT1126 胜肽，而顯示細胞傷害活性。其中，尤以WT1126 P1F 胜肽及WT1126 P2L胜肽的效果為高。
由上述結果也可知，以WT1187 胜肽的修飾胜肽之 WT1187 P1F胜肽、WT1187 P2M胜肽及WT1187 P3M胜肽刺激所誘導的CTLs，為HLA-A＊ 0201限制性，辨識內因性呈現的野生型WT1187 胜肽，而顯示細胞傷害活性。其中，尤以WT1187 P2M胜肽及WT1187 P1F胜肽的效果為高。因此顯示，這些修飾胜肽在HLA-A＊ 0206陽性者中，有效於伴隨WT1基因的表現水準上升之癌的治療及預防。
實施例13WT1187 P2V胜肽(SVGEQQYSV；序列編號13；H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH)的合成 1、保護胜肽樹脂(H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin)的合成。
將Fmoc-Val-Alko-樹脂(在此處，Alko表示p-烷氧基苄醇)0.4g(渡邊化學製；0.80mmol/g)放在Advanced ChemTech公司製ACT496型固相合成機的反應槽內，以DMF(N,N’-二甲醯胺)清洗(步驟1)，以2.5%哌啶(piperidine)DMF處理(5分鐘×1次及30分鐘×1次)切斷Fmoc基後(步驟2)，再以DMF清洗(步驟3)而得H-Val-Alko-樹脂。在此反應槽中加入NMP(N-甲基吡咯烷酮)0.7ml，及DIPCI(N,N’-二異丙基碳二亞胺)121mg(0.96mmol)的NMP溶液0.9ml，再加入Fmoc-Ser(tBu)-OH 368mg(0.96mmol)及HOBT(1-羥基苯並三唑)1水合物147mg(0.96mmol)的NMP溶液1.8ml，在室溫下進行偶合反應60分鐘(步驟4)。以同量的Fmoc-Ser(tBu)-OH、HOBT1水合物及DIPCI再度進行偶合反應(步驟5)，以DMF清洗樹脂(步驟6)，脫保護(步驟7)及清洗(步驟8)而得 H-Ser(tBu)-Val-Alko-樹脂。繼而反覆步驟4至步驟8依次偶合Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Val-OH及Fmoc-Ser(tBu)-OH。由反應槽取出胜肽樹脂以乙醚清洗，之後減壓乾燥而得H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin 980mg。將上述合成步驟的概要示於表6。
<合成步驟>
2、保護胜肽樹脂的脫保護
H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin 980mg中加入三氟乙酸/水/三異丙基矽烷(95/2.5/2.5(容量比))混合液5ml，在室溫攪拌2.5小時。過濾樹脂，將濾液加至冷乙醚中，所得析出物以玻璃過濾器過濾。濾器上物以乙醚清洗，減壓乾燥而得粗胜肽268mg。
3、粗胜肽的精製
所得粗胜肽268mg溶解於20%乙酸水，以逆相液體層析法精製。
幫浦：島津LC-8A
管柱：YMC-Pack Pro C18 AS12S11-2530WT 3cmΦ×25cm
溶出液1：H2 O/0.1%TFA
溶出液2(2液)：CH3 CN/0.1%TFA
流速：10ml/min
檢測：UV220nm
管柱以2液濃度1%平衡化以後，將粗胜肽溶液饋入。之後費30分鐘將2液濃度提高為8%，再費120分鐘將2液濃度提高到14%。將含有目的物的部分收集，將乙腈減壓餾去，冷凍乾燥而得目的之WT1187 P2V胜肽(SVGEQQYSV；序列編號13；H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH)105mg。
精製後的胜肽的HPLC分析及質量分析的條件如下。HPLC分析(島津LC-10Avp)
管柱：YMC-Pack Pro C18 AS-302 4.6mmΦ×150mm
溶出液1：H2 O/0.1%TFA
溶出液2：CH3 CN/0.1%TFA
濃度梯度：溶出液2的濃度在30分鐘內由10%提高到40%。
流速：1ml/min
檢測：UV220nm
純度：97.4%，保持時間：11.22分鐘
胺基酸分析(日立L-8500胺基酸分析裝置)
加水分解：1%酚/6N鹽酸水，110℃ 24小時
分析法：茚三酮(ninhydrin)法
Ser：1.78(2) Glx：3.26(3)＊ Gly：(1) Val：2.04(2) Tyr：1.06(1)
＊ )Gly=基準胺基酸 ( )內 理論值
質量分析(Applied Biosystems API 150EX質量分析計)
m/z=996.9【M+1】+ (理論值=996.5)
胺基酸序列分析(Applied Biosystems 491蛋白質序列分析儀，Protein Sequencing System)
序確認由N末端Ser到C末端Val。
與上述相同，表7及表8所示為所合成的各胜肽。
表9至表12所示的各胜肽，也以同樣方法合成。但，精製後的胜肽的HPLC分析及質量分析的條件如下。
HPLC分析(Agilent HP1100或Thermo Fisher Scientific Surveyor)
管柱：Thermo Fischer Scientific BioBasic-18 3mmΦ×250mm
溶出液1：H2 O/0.1%TFA
溶出液2：CH3 CN/0.1%TFA
梯度：溶出液2的濃度在20分鐘內依表中所列的濃度改變。
流速：0.4ml/min
檢測：215nm
質量分析
Applied Biosystems Dynamo質量分析計(MALDI-TOF)
實施例14(使用HLA-A＊ 0201表現之基因轉殖小鼠的修飾胜肽的特異性免疫細胞誘導活性能的評估，及所誘導的特異性免疫細胞對野生型胜肽的交叉反應性的確認) <方法> (1)修飾胜肽候補
WT1187 胜肽、WT1126 胜肽及其修飾胜肽(WT1187 胜肽或WT1126 胜肽的N末端起第1個、第2個、第3個或第9個的1個或2個胺基酸以其他胺基酸置換的胜肽)，利用在該領域已知的BIMAS(http：//www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/ binding.html)、SYFPEITHI(http：//www.mpiip-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html )、RANLPEP(http：//immunax.dfci.harvard.edu/Tools/ rankpep.html)及NetMHC3.0(http：//cbs.dtu.dk/services/NetMHC/ )等4個電腦資料庫的方法，分析對HLA-A＊ 0201分子的結合性(親和性)。WT1187 胜肽 及其修飾胜肽的分析結果示於表13至16，WT1126 胜肽及其修飾胜肽的分析結果示於表17至20及表22至23。所推定的結合性的高度以分數(score)表示。
任一資料庫中，推定具有與野生型胜肽(WT1187 胜肽或WT1126 胜肽)同等或其以上的結合性之修飾胜肽，與野生型胜肽一起做為其次之(2)至(4)的試驗對象。
(2)胜肽的藥劑調製與給藥
在實施例13合成並冷凍乾燥的胜肽，以DMSO(Nacalai Tesque公司製)調製為40mg/ml。之後，將調製好的胜肽DMSO液32.5μl與540μl的注射用蒸餾水(大塚製藥公司製)混合。繼而將此混合液550μl用玻璃注射器與700μl的弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant,Montanide ISA51)混合，做成油中水(water-in-oil)型乳化物。將300μl的該藥劑(油中水乳液)在HLA-A＊ 0201表現的基因轉殖小鼠(品系名HLA-A2+HLA-DR1+/I αβ°β 2m，EMMA ID號碼EM：01783)的尾根部皮下做免疫。每1胜肽使用2或3隻小鼠做評估。
(3)脾細胞的調製
免疫7日後，將脾臟取出。在玻片的毛玻璃部分磨破之後，以ACK Lysing Buffer(Lonza公司製)做溶血處理，而調製脾細胞。此時以CTM(Complete T-cell Medium，Invitrogen公司製的RPMI-1640培養基中以最後濃度添加為10% FBS、10mM HEPES、20mM L-麩醯胺、1mM丙酮酸鈉、1mM MEM非必需胺基酸、1% MEM維生素及55μM 2-巰乙醇)做為培養基，調整脾細胞濃度為5×106 cells/ml。
(4)Elispot法(酶聯免疫斑點法)
由以IFN γ做為指標的ELISPOT法的實施，評估給藥的胜肽是否具有WT1特異性免疫細胞的誘導活性。方法是遵照 附帶的說明書進行。在ELISPOT(日本Becton Dickinson公司製，型錄號碼551083)的盤上，先將CTM培養基每孔播種50μl後，將脾細胞含有液每孔播種100μl(5×105 cells/well)。再將給藥胜肽或野生型胜肽每孔添加50μl(胜肽最終濃度2μg/ml)。本分析方法是被認為可預測細胞傷害活性的代替法之一(J.Immunological Methods,1995,181,45-54)。
<結果>
WT1187 胜肽之修飾胜肽的特異性細胞免疫誘導活性的評估結果，分別示於第19圖至第22圖，WT1126 胜肽之修飾胜肽的評估結果，分別示於第23圖至第27圖及第30圖至第32圖。第19圖至第32圖之各圖中，分別為縱軸表示脾細胞5×105 個中存在的對抗原胜肽特異性反應細胞的數目(Spots/5×105 cells)，橫軸表示用於評估的小鼠個體(2隻或3隻)。白柱表示在抗原胜肽未刺激之際反應的特異性免疫細胞的數目，灰柱表示對野生型胜肽刺激反應的特異性免疫細胞的數目，黑柱表示對所給藥(改變)胜肽的刺激反應的特異性免疫細胞的數目。
第19圖至第32圖的各圖，分別表示以下各胜肽的特異性細胞免疫誘導活性。
第19圖a：WT1187 P1A胜肽，b：WT1187 P1F胜肽，c：WT1187 P1G胜肽，d：WT1187 P1I胜肽，e：WT1187 P1L胜肽，f：WT1187 P1M胜肽。
第20圖a：WT1187 P1V胜肽，b：WT1187 P1W胜肽，c：WT1187 P2I胜肽，d：WT1187 P2M胜肽，e：WT1187 P2Q胜肽，f：WT1187 P2V胜肽。
第21圖a：WT1187 P3A胜肽，b：WT1187 P3F胜肽，c：WT1187 P3I胜肽，d：WT1187 P3L胜肽，e：WT1187 P3M胜肽，f：WT1187 P3P胜肽。
第22圖a：WT1187 P3S胜肽，b：WT1187 P3V胜肽，c：WT1187 P3W胜肽，d：WT1187 P3Y胜肽，e：WT1187 P9L胜肽。
第23圖a：WT1126 P1A胜肽，b：WT1126 P1F胜肽，c：WT1126 P1G胜肽，d：WT1126 P1I胜肽，e：WT1126 P1L胜肽，f：WT1126 P1M胜肽。
第24圖a：WT1126 P1V胜肽，b：WT1126 P1W胜肽，c：WT1126 P2A胜肽，d：WT1126 P2I胜肽，e：WT1126 P2L胜肽，f：WT1126 P2Q胜肽。
第25圖a：WT1126 P2V胜肽，b：WT1126 P3A胜肽，c：WT1126 P3G胜肽，d：WT1126 P3I胜肽，e：WT1126 P3L胜肽，f：WT1126 P3M胜肽。
第26圖a：WT1126 P3P胜肽，b：WT1126 P3V胜肽，c：WT1126 P3W胜肽，d：WT1126 P9A胜肽，e：WT1126 P9I胜肽，f：WT1126 P9M胜肽。
第27圖：WT1126 P9V胜肽。
第28圖a：WT1187 P1D胜肽，b：WT1187 P1E胜肽，c：WT1187 P1H胜肽，d：WT1187 P1K胜肽。
第29圖a：WT1187 P1N胜肽，b：WT1187 P1P胜肽，c：WT1187 P1Q胜肽，d：WT1187 P1R胜肽，e：WT1187 P1T胜肽。
第30圖a：WT1126 P1D胜肽，b：WT1126 P1E胜肽，c：WT1126 P1H胜肽，d：WT1126 P1K胜肽，e：WT1126 P1N胜肽，f：WT1126 P1P 胜肽。
第31圖a：WT1126 P1Q胜肽，b：WT1126 P1S胜肽，c：WT1126 P1T胜肽，d：WT1126 P2I&P9I胜肽，e：WT1126 P2I&P9V胜肽，f：WT1126 P2L&P9I胜肽。
第32圖WT1126 P2L&P9V胜肽。
由此結果可知，在給藥除WT1187 P1D胜肽、WT1187 P1E胜肽、WT1187 P1H胜肽、WT1187 P1P胜肽或WT1187 P2Q胜肽，或WT1126 P1D胜肽、WT1126 P1E胜肽、WT1126 P1P胜肽、WT1126 P2A胜肽或WT1126 P2Q胜肽之外的修飾胜肽時，顯著地有效率地誘導特異性免疫細胞。
其次，由修飾胜肽所誘導的特異性免疫細胞對野生型胜肽的交叉反應性，加以解析(表24至25)。其結果可知，在WT1187 修飾胜肽中之WT1187 P1A胜肽、WT1187 P1I胜肽、WT1187 P1L胜肽、WT1187 P1M胜肽、WT1187 P1N胜肽、WT1187 P1Q胜肽、WT1187 P1T胜肽、WT1187 P1V胜肽、WT1187 P2V胜肽、WT1187 P2M胜肽、WT1187 P2I胜肽、WT1187 P3A胜肽、WT1187 P3F胜肽、WT1187 P3P胜肽、WT1187 P3S胜肽、WT1187 P3V胜肽及WT1187 P9L胜肽，WT1126 修飾胜肽中之WT1126 P1S胜肽、WT1126 P2I胜肽、WT1126 P2L胜肽、WT1126 P2V胜肽、WT1126 P3W胜肽、WT1126 P9I胜肽、WT1126 P9M胜肽及WT1126 P9V胜肽，特別可有效率地誘導可辨認修飾胜肽及野生型胜肽二者的特異性免疫細胞。
[產業上的利用可能性]
本發明的癌疫苗組成物，有用於做為HLA-A＊ 0206陽性者之表現WT1的癌的治療及預防用醫藥。本發明的癌疫苗組成物，也有用於做為HLA-A＊ 0201陽性者之表現WT1的癌的治療及預防用醫藥。
<110> 癌免疫研究所股份有限公司
<120> 癌疫苗組合物
<130> G06F2975
<150> JP2007-314552
<151> 2007-12-05
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該代表圖無元件符號及其代表之意義。

Claims (8)

  1. 一種癌疫苗組成物的用途，其係用於人類白血球型抗原(HLA)-A*0206陽性者用癌的治療劑或預防劑的製造中，係以含有癌抑制基因WT1的基因產物之胜肽為特徵：WT1187 胜肽：Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號2)、WT1126 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)、WT1187 P1F胜肽：Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號11)、WT1187 P2M胜肽：Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號16)、WT1187 P3M胜肽：Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列編號20)、WT1126 P1F胜肽：Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號34)、WT1126 P2L胜肽：Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號39)、WT1126 P3M胜肽：Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號46)、或WT1126 P9V胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(序列編號49)。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中，該癌疫苗組成物復含有佐劑。
  3. 一種癌疫苗組成物的用途，其係用於人類白血球型抗原(HLA)-A*0206陽性者用癌的治療劑或預防劑的製造中，係以 含有編碼癌抑制基因WT1的基因產物之申請專利範圍第1項所述之胜肽的DNA為特徵。
  4. 一種癌疫苗組成物的用途，其係用於人類白血球型抗原(HLA)-A*0206陽性者用癌的治療劑或預防劑的製造中，係以含有編碼癌抑制基因WT1的基因產物之申請專利範圍第1項所述之胜肽的RNA為特徵。
  5. 一種WT1特異性CTLs的誘導方法，包含下述步驟：將源自人類白血球型抗原(HLA)-A*0206陽性者之週邊血液單核球，在癌抑制基因WT1的基因產物之申請專利範圍第1項所述之胜肽的存在下培養，由該週邊血液單核球誘導WT1特異性CTLs。
  6. 一種樹狀細胞的誘導方法，該樹狀細胞係呈現癌抑制基因WT1的基因產物之申請專利範圍第1項所述之胜肽者，該方法包含下述步驟：將源自人類白血球型抗原(HLA)-A*0206陽性者的未成熟樹狀細胞，在癌抑制基因WT1的基因產物之申請專利範圍第1項所述之胜肽的存在下培養，由該未成熟樹狀細胞誘導呈現該胜肽的樹狀細胞。
  7. 一種胜肽的用途，該胜肽係癌抑制基因WT1的基因產物之申請專利範圍第1項所述之胜肽者，係用於製造人類白血球型抗原(HLA)-A*0206陽性者的癌的治療劑或預防劑。
  8. 如申請專利範圍第1項之癌疫苗組成物之用途，其中，該胜肽為：WT1126 胜肽：Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列編號3)的胜肽。
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