KR20150055091A - 암 백신 조성물 - Google Patents

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Abstract

암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 포함하는, 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용 암 백신 조성물.

Description

암 백신 조성물{CANCER VACCINE COMPOSITION}
본 발명은 윌름스 종양(Wilms' tumor)의 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질(이하, 'WT1 단백질'이라고 약기하기도 한다.) 또는 그의 부분 펩타이드(이하, 'WT1 펩타이드'라고 약기하기도 한다.)를 포함하는 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용 암 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 코딩하는 DNA 또는 RNA를 포함하는 HLA-A*0206 양성자용 암 백신 조성물, WT1-특이적인 CTLs의 유도 방법, 암항원을 제시하는 수지상 세포의 유도 방법, HLA-A*0206 양성자용의 암의 진단 방법, 및 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, WT1 펩타이드의 변형 펩타이드(modified peptide)를 포함하는 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물에 관한 것이다.
윌름스 종양 유전자 WT1은 소아 신장 종양인 윌름스 종양의 종양 형성에 관여하는 유전자로서 단리되었다(비특허문헌 1 참조). 이 유전자는 세포증식 및 세포분화의 조절 기구, 및 세포사멸(apoptosis) 및 조직발달과 관련되는 징크·핑거(zinc finger) 전사 인자를 코딩하는 유전자이다.
WT1 유전자는, 처음에는 종양억제 유전자로서 분류되었다. 그러나, 최근 이하의 (i)∼(iii)의 증거;
(i) 백혈병 및 골수이형성증후군(MDS)과 같은 조혈기 악성 종양을 포함한 다양한 인간의 악성 종양 및 고형암에 있어서의 야생형 WT1 유전자의 고발현,
(ii) WT1 안티센스·올리고뉴클레오티드로 처리된 인간 백혈병 세포 및 고형 암 세포의 증식 저해,
(iii) 야생형 WT1 유전자의 구성적(constitutive) 발현에 의한 마우스 골수성 전구세포의 증식 촉진과 분화 저지
에 근거하여, 야생형 WT1 유전자가 다양한 형태의 악성 질환에서 종양억제 작용이라기 보다는 발암작용(oncogenic effect)을 행하는 것이 시사되고 있다(특허문헌 1 참조).
또한, WT1 유전자는 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암(germ cell cancer), 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 등의 고형암에 있어서도 고발현하는 것이 알려져 있다(특허문헌 2 참조).
외래 물질을 제거하기 위한 면역기구에는, 일반적으로 항원을 인식하여 항원제시 세포로서 기능하는 마크로파지, 상기 마크로파지의 항원제시를 인식하여 다양한 림포카인(lymphokines)을 생성하여 다른 T 세포 등을 활성화하는 헬퍼 T 세포, 상기 림포카인의 작용에 의해 항체 생성 세포로 분화되는 B 림프구 등이 관여하는 체액성 면역과, 항원의 제시를 받아 분화된 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTLs)가 표적세포를 공격하여 파괴하는 세포성 면역이 있다.
현재, 암의 면역은 주로 CTLs가 관여하는 세포성 면역에 의한 것으로 여겨지고 있다. CTLs에 의한 암면역에 있어서는, 주요조직적합항원(Major Histocompatibility Complex; MHC) 클래스 I과 암항원과의 복합체의 형태로 제시된 암항원을 인식한 전구체 T 세포가 분화 증식하여 생성한 CTLs가 암세포를 공격하고 파괴한다. 이때, 암세포는 MHC 클래스 I 항원과 암항원과의 복합체를 그의 세포 표면에 제시하고 있어, 이것이 CTLs의 표적이 된다(비특허문헌 2∼5 참조). MHC는, 인간에서는 인간 백혈구 항원(HLA)이라고 칭해진다.
표적세포인 암세포 상에 MHC 클래스 I 항원에 의해 제시되는 상기 암항원은, 암세포내에서 합성된 항원 단백질이 세포내 프로테아제에 의해 프로세싱되어 생성한 약 8∼12개의 아미노산으로 구성된 펩타이드인 것으로 여겨지고 있다(비특허문헌 2∼5 참조). 현재, 다양한 암에 대하여 항원 단백질의 검색이 행해지고 있으나, 암특이적인 항원으로서 증명되고 있는 것은 적다.
본 발명자들은, WT1 유전자의 발현산물인 아미노산 서열 중에서, HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201과의 결합에 있어서 앵커(anchor) 아미노산으로서 기능하는 것으로 예상되는 적어도 1개의 아미노산을 함유하는 연속하는 7∼30개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드를 합성하고, 이들 펩타이드가 HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201과 결합한다(HLA-A*2402 구속성 또는 HLA-A*0201 구속성)는 것을 확인함과 동시에, HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201과 결합한 경우에, CTLs를 유도하여 표적세포에 세포독성 반응(cytotoxic response)(이하, 'CTL 반응'이라고 약기한다.)을 나타낸다는 것을 발견하였다. 또한, 이러한 사실로부터, 이들 펩타이드가 WT1 유전자의 발현산물(WT 단백질) 유래의 CTL 에피토프(epitope)인 것으로 동정되었다.
현재, WT1-특이적인 CTLs 에피토프는 HLA-A*2402 및 HLA-A*0201(특허문헌 3 참조), HLA-A*3303(특허문헌 4 참조) 및 HLA-A*1101(특허문헌 5 참조)에 대하여만 동정되었으며, 상기 폴리펩타이드에 기초한 CTL 반응은 HLA-A*2402 구속성, HLA-A*0201 구속성, HLA-A*3303 구속성 및 HLA-A*1101 구속성에 의해서만 유도되는 특이적인 반응인 것이 확인되어 있다.
이는, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질이 유망한 종양거부항원(tumor rejection antigen)(종양관련항원(TAA)이라고도 말한다.)이라는 가능성을 나타낸다. 사실, 고빈도의 WT1-특이적인 CTLs 또는 고항체가(high-titer)의 항-WT1 항체는, 건강한 혈액 제공자의 말초혈에서가 아닌 암환자의 말초혈에서 검출되었다.
그렇지만, HLA는 개인을 규정하는 마커이기도 하기 때문에 다양하다. HLA의 경우, MHC 클래스 I 항원은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C, 클래스 II 항원은 HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR로 각각 복수 존재한다. 또한 HLA의 각각의 항원결합 부위는 유전적 다형(genetic polymorphism)을 가지며, 예를 들어 HLA-A에는 27종류 이상, HLA-B에는 59종류 이상, HLA-C에는 10종류 이상의 다형(대립 유전자)이 알려져 있다.
따라서, HLA-A*2402, HLA-A*0201, HLA-A*3303 또는 HLA-A*1101 이외의 다른 형의 HLA에 결합하여, CTL 반응을 유도하는 암항원을 특정함으로써, 면역요법을 적용할 수 있는 대상을 확대하는 것이 요망되고 있다.
한편, WT1 펩타이드의 변형 펩타이드 가운데, 이하에 나타내는 3개의 펩타이드가, 2건의 문헌에서 보고되어 있다;
WT1187P1Y 펩타이드(YLGEQQYSV; 서열번호 12) 및
WT1126P1Y 펩타이드(YMFPNAPYL; 서열번호 35) (모두 특허문헌 6 참조), 및,
WT1126P9M 펩타이드(RMFPNAPYM; 서열번호 52) (특허문헌 7 참조).
또한, 유럽 특허 1127068의 심사에 있어서의 의견서에 있어서, 이하에 나타내는 2개의 펩타이드가 보고되어 있다;
WT1126P2L 펩타이드(RLFPNAPYL; 서열번호 39)
WT1126P2L&P9V 펩타이드(RLFPNAPYV; 서열번호 75) (비특허문헌 7 참조).
그렇지만, 이들의 WT1 변형 펩타이드가 HLA-A*2402, HLA-A*0201, HLA-A*3303 또는 HLA-A*1101 이외의 형의 HLA에 결합하여, CTL 반응을 유도하는 암항원이 될지 여부에 대해서는 전혀 보고되어 있지 않다.
특허문헌 1: 일본특허공개 평 9-104629호 공보 특허문헌 2: 일본특허공개 평 11-035484호 공보 특허문헌 3: 국제특허공개 제WO00/06602호 팜플렛 특허문헌 4: 일본특허출원 제2006-045287호 특허문헌 5: 일본특허출원 제2006-355356호 특허문헌 6: 국제특허공개 제WO2005/053618호 팜플렛 특허문헌 7: 국제특허공개 제WO2007/016466호 팜플렛
비특허문헌 1: Gessler, M. 등, Nature, 제343권, 774-778페이지, 1990년 비특허문헌 2: Cur. Opin. Immunol., 제5권, 709페이지, 1993년 비특허문헌 3: Cur. Opin. Immunol., 제5권, 719페이지, 1993년 비특허문헌 4: Cell, 제82권, 13페이지, 1995년 비특허문헌 5: Immunol. Rev., 제146권, 167페이지, 1995년 비특허문헌 6: Mol. Cell. Biol., 제11권, 1707페이지, 1991년 비특허문헌 7: 유럽 특허 1127068의 심사에 있어서의 의견서
본 발명은 백혈병을 포함한 악성 종양 환자에 대한 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질(WT1 단백질) 또는 그의 부분 펩타이드(WT1 펩타이드)를 기초로 한 암의 치료 및/또는 예방법의 적용을 HLA-A*0206 양성자에게 확대하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자는 예의 연구를 수행하였다. 그 결과, 인간 WT1 단백질 유래의 WT1187 펩타이드(SLGEQQYSV) 및 WT1126 펩타이드(RMFPNAPYL)에 관하여, 종래는 HLA-A*0201 구속성의 CTLs를 유도하는 것만 알려져 있었으나, 놀랍게도 상기 펩타이드는 HLA-A*0206 구속성의 CTLs도 유도하는 것을 발견하였다. 또한, HLA-A*0201 구속성의 CTLs를 유도하는 WT1 펩타이드로는, 국제특허공개 제WO00/06602호 팜플렛에 기재되어 있는 펩타이드만이 알려져 있었으나, WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드('WT1187 변형 펩타이드'라고도 말한다) 및 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드('WT1126 변형 펩타이드'라고도 말한다)도 HLA-A*0201 분자에 결합하는 것을 발견하였다. 본 발명자는, 이들 지견에 기초하여 더욱 예의 연구를 수행하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은, 이하의 (1)∼(17)에 관한 것이다.
(1) 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 포함하는, 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용 암 백신 조성물.
(2) 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질이 하기 (a) 또는 (b)의 단백질인 상기 (1)에 기재의 조성물.
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열
(b) 아미노산 서열(a)에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 HLA-A*0206 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 단백질
(3) 부분 펩타이드가,
WT1187 펩타이드: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 2),
WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3),
WT1187P1F 펩타이드: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 11),
WT1187P2M 펩타이드: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 16),
WT1187P3M 펩타이드: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 20),
WT1126P1F 펩타이드: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 34),
WT1126P2L 펩타이드: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 39),
WT1126P3M 펩타이드: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 46), 또는
WT1126P9V 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(서열번호 49)
인 상기 (1)에 기재의 조성물.
(4) 추가로 아주반트를 포함하는 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재의 조성물.
(5) 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 코딩하는 DNA를 포함하는 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용 암 백신 조성물.
(6) 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 코딩하는 RNA를 포함하는 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용 암 백신 조성물.
(7) 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자 유래의 말초혈 단핵구를, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드의 존재하에서 배양하여, 상기 말초혈 단핵구로부터 WT1-특이적인 CTLs를 유도하는 공정을 포함하는, WT1-특이적인 CTLs의 유도방법.
(8) 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자 유래의 미성숙 수지상 세포를, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드의 존재하에서 배양하여, 상기 미성숙 수지상 세포로부터 상기 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 제시하는 수지상 세포를 유도하는 공정을 포함하는, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 제시하는 수지상 세포의 유도방법.
(9) 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자 유래의 시료 중의 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드, 이에 대한 항체 또는 WT1-특이적인 CTLs를 검출 또는 정량하는 공정 및 이어서 상기 단백질 또는 그의 부분 펩타이드, 이에 대한 항체 또는 WT1-특이적인 CTLs의 양을, 암을 발증하지 않는 경우와 비교하는 공정, 또는 상기 (7)에 기재의 방법에 의해 유도된 WT1-특이적인 CTLs 또는 상기 (8)에 기재의 방법에 의해 유도된 수지상 세포를 HLA-A*0206 양성 대상자에 투여하는 공정 및 HLA-A*0206 양성 대상자에 있어서의 상기 CTLs 또는 수지상 세포의 위치 또는 부위를 결정하는 공정을 포함하는 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용의 암의 진단방법.
(10) 하기 펩타이드를 포함하는 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0201 양성자용 암 백신 조성물.
암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드인 WT1187 펩타이드: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 2) 또는 WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3)의 변형 펩타이드이고, 또한 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 펩타이드.
(11) 펩타이드가
WT1187P1F 펩타이드: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 11),
WT1187P2M 펩타이드: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 16),
WT1187P3M 펩타이드: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 20),
WT1126P1F 펩타이드: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 34),
WT1126P2L 펩타이드: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 39),
WT1126P3M 펩타이드: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 46), 또는
WT1126P9V 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(서열번호 49)
인 상기 (10)에 기재의 조성물.
(12) 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 포함하는 조성물을, 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법.
(13) 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드.
(14) 하기 펩타이드를 포함하는 조성물을, 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0201 양성자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법.
암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드인 WT1187 펩타이드: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 2) 또는 WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3)의 변형 펩타이드이고, 또한 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 펩타이드.
(15) 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0201 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한, 하기 펩타이드.
암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드인 WT1187 펩타이드: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 2) 또는 WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3)의 변형 펩타이드이고, 또한 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 펩타이드.
(16) 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 코딩하는 RNA를 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자의 수지상 세포에 도입하는 것을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법.
(17) 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 코딩하는 RNA.
본 발명은 또한, HLA-A*0206 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한 암 백신 조성물을 제조하기 위한, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또한, HLA-A*0201 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한 암 백신 조성물을 제조하기 위한, 하기 펩타이드의 사용에 관한 것이다.
암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드인 WT1187 펩타이드: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 2) 또는 WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3)의 변형 펩타이드이고, 또한 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 펩타이드.
또한, 본 발명에 있어서, 「암 백신 조성물」이라 함은 인간을 포함한 동물에게 접종 또는 투여하여, 암의 예방 또는 치료를 위해 사용하는 의약을 의미한다. 「치료」라 함은 병태를 완전히 치유시키는 것, 기타 완전히 치유하지 않아도 증상의 진전 및/또는 악화를 억제하고, 병태의 진행을 멈추는 것, 또는 병태의 일부 혹은 전부를 개선하여 치유의 방향으로 유도하는 것을, 「예방」이라 함은 병태의 발증을 막는 것, 억제하는 것 또는 지연시키는 것을 각각 의미하는 것으로 한다.
또한, 예를 들어 HLA-A*0206 양성자 또는 HLA-A*0201 양성자 유래의 말초혈 단핵구, 미성숙 수지상 세포, WT1-특이적인 CTLs 및 시료 등은, HLA-A*0206 양성자 또는 HLA-A*0201 양성자로부터 분리 또는 채취된 말초혈 단핵구, 미성숙 수지상 세포, WT1-특이적인 CTLs 및 혈액 등의 생체시료 등을 각각 의미한다. 또한, HLA-A*0206 양성자 또는 HLA-A*0201 양성자 유래의 WT1-특이적인 CTLs에는, HLA-A*0206 양성자 또는 HLA-A*0201 양성자로부터 분리 또는 채취된 말초혈 단핵구, 미성숙 수지상 세포, 또는 혈액 등의 생체시료로부터 유도된 CTLs도 포함된다.
본 발명에 의해, HLA-A*0206 양성 대상자에 있어서의 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro)에서의 WT1-특이적인 CTLs의 유도가 가능하게 된다. 종래, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 포함하는 백신을 사용하는 면역요법의 적용은, HLA-A*0201 양성 환자 및 HLA-A*2402 양성 환자에게 한정되어 있었으나, 본 발명에 의해 대상을 HLA-A*0206 양성 환자에게까지 확대하는 것이 가능하게 되었다. HLA-A2는, 백인종에서 가장 빈도가 높은 HLA 클래스 I의 혈청형(약 50%)이며, 그 대다수는 HLA-A*0201이지만, 백인종의 약 4%은 HLA-A*0206을 가진다. 또한, 일본인에 있어서는, HLA-A24(그 대다수는 HLA-A*2402이다)는 가장 빈도가 높은 혈청형(약 58%)이며, HLA-A2는 일본인에서 약 42%를 나타낸다. 그러나, HLA-A2를 가지는 일본인의 약 43%만이 HLA-A*0201을 가지며, 그 나머지는 HLA-A*0206 또는 HLA-A*0207을 가진다. 환언하면, 일본인의 약 18%는 HLA-A*0201을 가지며, 일본인의 약 17%은 HLA-A*0206을 가진다. 이 때문에, HLA-A*0201 양성 구속성 CTL 에피토프와 동일하게, 적어도 일본인에서 HLA-A*0206 양성 구속성 CTL 에피토프를 발견한 것은, 암면역요법의 적용을 HLA-A*0206 양성자에게 확대할 수 있으므로 매우 유용하다. 게다가, 이 대립 유전자(allele)는, 중국인의 14%, 한국인의 9%로 나타나므로, 본 발명의 암 백신 조성물의 적용을 더욱 넓히는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 암 백신 조성물은 HLA-A*0206 양성자에 있어서의 WT1을 발현하는 암, 예를 들면, 조혈기 종양, 고형암 등의 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 암 백신 조성물은 HLA-A*0206 양성자의 암발병 예방에 대하여 유용하다.
[도 1] HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자의 PBMCs로부터의 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성을 나타내는 도면이다. a는, 51Cr으로 라벨된 B-LCLs에 대한 세포독성 활성을 나타내는 도면이다. b는, PBMCs에 펄스(pulse)한 WT1187 펩타이드의 농도에 평행하게, 51Cr으로 라벨된 자가 B-LCLs에 대한 세포독성 활성이 증가하는 것을 나타내는 도면이다.
[도 2] HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자의 PBMCs로부터의 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성을 나타내는 도면이다. a 및 b는, 도 1a에 나타낸 혈액 제공자 이외의 두사람의 다른 건강한 혈액 제공자로부터 얻은 CTLs의 51Cr으로 라벨된 B-LCLs에 대한 세포독성 활성을 나타내는 도면이다.
[도 3] a는 WT1 유전자로 형질전환시킨 B-LCLs 또는 공 벡터(mock vector)로 형질전환시킨 B-LCLs에 대한 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성을 나타내는 도면이다. b는 0206K562 세포, K562 세포, KH88 세포 및 JY 세포에 대한 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성을 나타내는 도면이다.
[도 4] HLA 클래스 I 항체 및 HLA 클래스 II 항체에 의한 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성의 억제를 나타내는 도면이다.
[도 5] HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자의 PBMCs로부터의 WT1126 펩타이드-특이적인 CTLs의, 51Cr으로 라벨된 B-LCLs에 대한 세포독성 활성을 나타내는 도면이다.
[도 6] a 및 b는 0206K562 세포, K562 세포, KH88 세포 및 JY 세포에 대한 별도의 공여자로부터 유도된 WT1126 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성을 나타내는 도면이다.
[도 7] HLA-A*0201 양성의 공여자 1의 PBMCs를 변형 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs를 WT1126 펩타이드의 테트라머(tetramer) 및 항-CD8 항체로 염색하여 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 8] HLA-A*0201 양성의 공여자 1의 PBMCs를 WT1126P1F 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 9] HLA-A*0201 양성의 공여자 1의 PBMCs를 WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 10] HLA-A*0201 양성의 공여자 2의 PBMCs를 WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs를 WT1126 펩타이드의 테트라머 및 항-CD8 항체로 염색하여 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 11] 공여자 2의 PBMCs를 WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 12] HLA-A*0206 양성의 공여자 3의 PBMCs를 WT1126 변형 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 13] HLA-A*0206 양성의 공여자 3의 PBMCs를 WT1126P9V 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 14] HLA-A*0206 양성의 공여자 4의 PBMCs를 WT1126 변형 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 15] HLA-A*0206 양성의 공여자 4의 PBMCs를 WT1126 변형 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 16] HLA-A*0201 양성의 공여자의 PBMCs를 WT1187 변형 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 17] HLA-A*0206 양성의 공여자의 PBMCs를 WT1187P1F 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 18] HLA-A*0206 양성의 공여자의 PBMCs를 WT1187P2M 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 19] WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 20] WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 21] WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 22] WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 23] WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 24] WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 25] WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 26] WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 27] WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 28] WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 29] WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 30] WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 31] WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
[도 32] WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성의 평가 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 설명한다.
본 명세서 및 도면에 있어서, 아미노산 잔기를 약호로 표시할 경우, 다음 약호로 기술한다.
Ala 또는 A: 알라닌 잔기
Arg 또는 R: 아르기닌 잔기
Asn 또는 N: 아스파라긴 잔기
Asp 또는 D: 아스파라긴산 잔기
Cys 또는 C: 시스테인 잔기
Gln 또는 Q: 글루타민 잔기
Glu 또는 E: 글루탐산 잔기
Gly 또는 G: 글라이신 잔기
His 또는 H: 히스티딘 잔기
Ile 또는 I: 이소로이신 잔기
Leu 또는 L: 로이신 잔기
Lys 또는 K: 라이신 잔기
Met 또는 M: 메티오닌 잔기
Phe 또는 F: 페닐알라닌 잔기
Pro 또는 P: 프롤린 잔기
Ser 또는 S: 세린 잔기
Thr 또는 T: 쓰레오닌 잔기
Trp 또는 W: 트립토판 잔기
Tyr 또는 Y: 타이로신 잔기
Val 또는 V: 발린 잔기
본 발명에 있어서의 WT1 단백질로는, 윌름스 종양의 원인 유전자로서 단리 된 징크·핑거(zinc finger) 전사 인자의 유전자 산물이며, 또한 HLA-A*0206 분자에 결합하여 악성 종양의 표적항원이 될 수 있는 것을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 WT1 단백질로는, 구체적으로는 449개의 아미노산으로 이루어진 인간 WT1 단백질(서열목록: 서열번호 1) 또는 상기 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇개(바람직하게는, 약 2∼6개)의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 HLA-A*0206 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 단백질을 바람직하게 들 수 있다. 삽입되는 아미노산 또는 치환되는 아미노산은, 유전자에 의해 코딩되는 20 종류의 아미노산 이외의 비천연 아미노산이어도 좋다.
WT1 단백질의 부분 펩타이드(WT1 펩타이드)라 함은 WT1 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 일부로 이루어진 펩타이드를 말한다. WT1 펩타이드로는 HLA-A*0206 분자에 결합하여 세포독성 T 세포(cytotoxic T cells)를 유도하는 WT1 단백질 유래의 8∼12개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 들 수 있고, 바람직하게는 8∼9개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 들 수 있다. 또한, 특히 바람직하게는, 국제특허공개 제WO00/06602호 팜플렛에 기재된 WT1187 펩타이드(Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val; 서열번호 2) 또는 WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3)이다.
또한, HLA-A*0206 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 펩타이드라면, WT1 펩타이드에 있어서 1 또는 몇개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 변형 펩타이드도 본 발명에 있어서의 WT1 펩타이드로서 이용할 수 있다. 이러한 변형 펩타이드로는 WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 및 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드를 들 수 있다.
WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드로는 N-말단으로부터 4∼8번째의 아미노산 잔기가 WT1187 펩타이드의 N-말단으로부터 4∼8번째의 아미노산 잔기(EQQYS)와 동일한 펩타이드가 바람직하며, N-말단으로부터 4∼9번째의 아미노산 잔기가 WT1187 펩타이드의 N-말단으로부터 4∼9번째의 아미노산 잔기(EQQYSV)와 동일한 펩타이드가 더욱 바람직하다. 이러한 WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드로는, 하기 서열번호 4∼26 및 54∼62 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 바람직하다.
WT1187P1G 펩타이드(GLGEQQYSV; 서열번호 4)
WT1187P1A 펩타이드(ALGEQQYSV; 서열번호 5)
WT1187P1V 펩타이드(VLGEQQYSV; 서열번호 6)
WT1187P1L 펩타이드(LLGEQQYSV; 서열번호 7)
WT1187P1I 펩타이드(ILGEQQYSV; 서열번호 8)
WT1187P1M 펩타이드(MLGEQQYSV; 서열번호 9)
WT1187P1W 펩타이드(WLGEQQYSV; 서열번호 10)
WT1187P1F 펩타이드(FLGEQQYSV; 서열번호 11)
WT1187P1Y 펩타이드(YLGEQQYSV; 서열번호 12)
WT1187P2V 펩타이드(SVGEQQYSV; 서열번호 13)
WT1187P2Q 펩타이드(SQGEQQYSV; 서열번호 14)
WT1187P2I 펩타이드(SIGEQQYSV; 서열번호 15)
WT1187P2M 펩타이드(SMGEQQYSV; 서열번호 16)
WT1187P3L 펩타이드(SLLEQQYSV; 서열번호 17)
WT1187P3A 펩타이드(SLAEQQYSV; 서열번호 18)
WT1187P3V 펩타이드(SLVEQQYSV; 서열번호 19)
WT1187P3M 펩타이드(SLMEQQYSV; 서열번호 20)
WT1187P3P 펩타이드(SLPEQQYSV; 서열번호 21)
WT1187P3W 펩타이드(SLWEQQYSV; 서열번호 22)
WT1187P3F 펩타이드(SLFEQQYSV; 서열번호 23)
WT1187P3Y 펩타이드(SLYEQQYSV; 서열번호 24)
WT1187P3S 펩타이드(SLSEQQYSV; 서열번호 25)
WT1187P3I 펩타이드(SLIEQQYSV; 서열번호 26)
WT1187P9L 펩타이드(SLGEQQYSL; 서열번호 53)
WT1187P1D 펩타이드(DLGEQQYSV; 서열번호 54)
WT1187P1E 펩타이드(ELGEQQYSV; 서열번호 55)
WT1187P1H 펩타이드(HLGEQQYSV; 서열번호 56)
WT1187P1K 펩타이드(KLGEQQYSV; 서열번호 57)
WT1187P1N 펩타이드(NLGEQQYSV; 서열번호 58)
WT1187P1P 펩타이드(PLGEQQYSV; 서열번호 59)
WT1187P1Q 펩타이드(QLGEQQYSV; 서열번호 60)
WT1187P1R 펩타이드(RLGEQQYSV; 서열번호 61)
WT1187P1T 펩타이드(TLGEQQYSV; 서열번호 62)
WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드로는, N-말단으로부터 4∼8번째의 아미노산 잔기가 WT1126 펩타이드의 N-말단으로부터 4∼8번째의 아미노산 잔기(PNAPY)와 동일한 펩타이드가 바람직하다. 이러한 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드로는, 하기 서열번호 27∼52 및 63∼75 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 바람직하다.
WT1126P1G 펩타이드(GMFPNAPYL; 서열번호 27)
WT1126P1A 펩타이드(AMFPNAPYL; 서열번호 28)
WT1126P1V 펩타이드(VMFPNAPYL; 서열번호 29)
WT1126P1L 펩타이드(LMFPNAPYL; 서열번호 30)
WT1126P1I 펩타이드(IMFPNAPYL; 서열번호 31)
WT1126P1M 펩타이드(MMFPNAPYL; 서열번호 32)
WT1126P1W 펩타이드(WMFPNAPYL; 서열번호 33)
WT1126P1F 펩타이드(FMFPNAPYL; 서열번호 34)
WT1126P1Y 펩타이드(YMFPNAPYL; 서열번호 35)
WT1126P2V 펩타이드(RVFPNAPYL; 서열번호 36)
WT1126P2Q 펩타이드(RQFPNAPYL; 서열번호 37)
WT1126P2A 펩타이드(RAFPNAPYL; 서열번호 38)
WT1126P2L 펩타이드(RLFPNAPYL; 서열번호 39)
WT1126P2I 펩타이드(RIFPNAPYL; 서열번호 40)
WT1126P3I 펩타이드(RMIPNAPYL; 서열번호 41)
WT1126P3L 펩타이드(RMLPNAPYL; 서열번호 42)
WT1126P3G 펩타이드(RMGPNAPYL; 서열번호 43)
WT1126P3A 펩타이드(RMAPNAPYL; 서열번호 44)
WT1126P3V 펩타이드(RMVPNAPYL; 서열번호 45)
WT1126P3M 펩타이드(RMMPNAPYL; 서열번호 46)
WT1126P3P 펩타이드(RMPPNAPYL; 서열번호 47)
WT1126P3W 펩타이드(RMWPNAPYL; 서열번호 48)
WT1126P9V 펩타이드(RMFPNAPYV; 서열번호 49)
WT1126P9A 펩타이드(RMFPNAPYA; 서열번호 50)
WT1126P9I 펩타이드(RMFPNAPYI; 서열번호 51)
WT1126P9M 펩타이드(RMFPNAPYM; 서열번호 52)
WT1126P1D 펩타이드(DMFPNAPYL; 서열번호 63)
WT1126P1E 펩타이드(EMFPNAPYL; 서열번호 64)
WT1126P1H 펩타이드(HMFPNAPYL; 서열번호 65)
WT1126P1K 펩타이드(KMFPNAPYL; 서열번호 66)
WT1126P1N 펩타이드(NMFPNAPYL; 서열번호 67)
WT1126P1P 펩타이드(PMFPNAPYL; 서열번호 68)
WT1126P1Q 펩타이드(QMFPNAPYL; 서열번호 69)
WT1126P1S 펩타이드(SMFPNAPYL; 서열번호 70)
WT1126P1T 펩타이드(TMFPNAPYL; 서열번호 71)
WT1126P2I&P9I 펩타이드(RIFPNAPYI; 서열번호 72)
WT1126P2I&P9V 펩타이드(RIFPNAPYV; 서열번호 73)
WT1126P2L&P9I 펩타이드(RLFPNAPYI; 서열번호 74)
WT1126P2L&P9V 펩타이드(RLFPNAPYV; 서열번호 75)
이 중에서도, WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드로는, WT1187P1F 펩타이드(서열번호 11), WT1187P2M 펩타이드(서열번호 16) 또는 WT1187P3M 펩타이드(서열번호 20)가 바람직하고, WT1187P1F 펩타이드 또는 WT1187P2M 펩타이드가 더욱 바람직하고, WT1187P2M 펩타이드가 더더욱 바람직하다. WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드로는, WT1126P1F 펩타이드(서열번호 34), WT1126P2L 펩타이드(서열번호 39), WT1126P3M 펩타이드(서열번호 46) 또는 WT1126P9V 펩타이드(서열번호 49)가 바람직하고, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P3M 펩타이드 또는 WT1126P9V 펩타이드가 더욱 바람직하고, WT1126P9V 펩타이드가 더더욱 바람직하다.
본 발명의 암 백신 조성물에 있어서 WT1 펩타이드로는, WT1187 펩타이드, WT1126 펩타이드, WT1187P1F 펩타이드, WT1187P2M 펩타이드, WT1187P3M 펩타이드, WT1126P1F 펩타이드, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P3M 펩타이드 또는 WT1126P9V 펩타이드가 바람직하다. 더욱 바람직하게는, WT1187 펩타이드, WT1126 펩타이드, WT1187P1F 펩타이드, WT1187P2M 펩타이드, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P3M 펩타이드 또는 WT1126P9V 펩타이드이며, 더더욱 바람직하게는 WT1187 펩타이드, WT1126 펩타이드, WT1187P2M 펩타이드 또는 WT1126P9V 펩타이드이며, 특히 바람직하게는, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드이다.
또한, WT1 펩타이드로서, WT1 펩타이드의 유도체도 이용할 수 있다. 예를 들어, WT1187 펩타이드 및 WT1126 펩타이드의 유도체로는, 상기 9개의 연속하는 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에, 다양한 물질을 결합시킨 것 등을 들 수 있다. 예를 들어, 아미노산, 펩타이드, 이들의 유사체(analogs) 등을 결합시켜도 좋다. WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드, 또는 그의 변형 펩타이드에 이러한 물질이 결합하고 있는 경우, 이들 물질이, 예를 들면, 생체내 효소 등에 의해 혹은 세포내 프로세싱 등의 과정에 의해 처리되어, 최종적으로 상기 9개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 생성하고, HLA-A*0206 분자와의 복합체로서 세포표면에 제시됨으로써, HLA-A*0206을 가지는 환자에 있어서 WT1-특이적인 CTL반응을 이끌어낼 수 있다.
WT1 펩타이드는, 해당 기술분야 있어서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; 펩타이드 합성, 마루젠(주), 1975; 펩타이드 합성의 기초와 실험, 마루젠(주) 1985; 의약품의 개발 (속) 제14권·펩타이드 합성, 히로카와 서점, 1991 등에 기재되어 있는 펩타이드 합성 방법에 의해 합성할 수 있다.
WT1 펩타이드 및 변형 펩타이드의 스크리닝 방법으로는, 예를 들면, HLA-A*0206을 가지는 몇사람의 환자의 PBMCs(말초혈 단핵구)를 이용하여, 1회의 펩타이드만의 자극으로 IFNγ 분석을 수행하고, 반응이 좋은 펩타이드를 선택하는 방법이 간편하기 때문에 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 상기의 HLA-A*0206 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 코딩하는 DNA 등의 폴리뉴클레오티드도 암 백신 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있다. 즉, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 삽입한 후, 인간을 포함한 동물에게 투여함으로써, 생체내에서 암면역을 생기게 할 수 있다. 폴리뉴클레오티드로는, DNA, RNA 등을 들 수 있고, DNA 또는 RNA가 바람직하다. 폴리뉴클레오티드의 염기서열은 HLA-A*0206 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드의 아미노산 서열에 근거하여 결정할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 공지의 DNA 또는 RNA 합성법, PCR 법 등에 의해 제조할 수 있다. 이러한 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 코딩하는 DNA를 포함하는 HLA-A*0206 양성자용 암 백신 조성물도, 본 발명의 하나이다. WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드로는, WT1 펩타이드가 바람직하고, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드 또는 그의 변형 펩타이드가 더욱 바람직하고, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드가 가장 바람직하다. 상기 DNA가 삽입되는 발현벡터는 특별히 한정되지 않는다. 한편, RNA는 벡터에 삽입하지 않고 그대로 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 암 백신 조성물은 아주반트를 함유할 수 있다. 아주반트로는, 항원이 되는 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 투여할 경우, 이들과 함께 또는 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드와는 별도로 투여하고, 그 항원에 대한 면역응답을 비특이적으로 높이는 물질이라면 한정되지 않는다. 아주반트로는, 예를 들면, 침강성 아주반트 또는 유성 아주반트를 들 수 있다. 침강성 아주반트로는, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화알루미늄, 인산칼슘, 인산알루미늄, 명반, 페페스(PEPES) 또는 카르복시비닐 폴리머 등을 들 수 있다. 유성 아주반트는 오일이 항원 수용액을 감싸서 미셀을 만들 수 있는 것이 바람직하고, 예를 들어 구체적으로는, 유동 파라핀, 라놀린, 프로인트(Freund), 몬타나이드(Montanide) ISA-763AVG, 몬타나이드 ISA-51, 불완전 프로인트 아주반트(incomplete Freund's adjuvant) 또는 완전 프로인트 아주반트(complete Freund's adjuvant) 등을 들 수 있다. 아주반트는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다. 바람직하게는, 유성 아주반트이다.
본 발명의 암 백신 조성물에 있어서의 아주반트의 배합량은, 항원에 대한 면역응답을 비특이적으로 높이는 양이라면 특별히 한정되지 않고, 아주반트의 종류등에 의해 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 암 백신 조성물은 경구투여 또는 비경구투여, 예를 들면 복강내 투여, 피하투여, 피내투여(intracutaneous administration), 근육내 투여, 정맥내 투여, 비강내 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 또한, 비경구투여로는, 백신 조성물을 피부에 도포하거나, 첨부제(patch)에 백신 조성물을 함유시켜 피부에 첨부하거나 하는 것에 의해, 유효성분인 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 경피흡수시키는 투여 방법도 들 수 있다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 흡인 등에 의해 투여할 수도 있다. 바람직하게는, 비경구투여에 의해 투여한다. 더욱 바람직하게는, 피내투여 또는 피하투여에 의해 투여한다. 피내투여, 피하투여하는 몸의 부위는, 예를 들면, 상완(upper arm) 등이 바람직하다.
본 발명의 암 백신 조성물은, 투여경로에 따라 다양한 제제 형태, 예를 들면, 고형제제, 액상제제 등일 수 있다. 예를 들면, 경구투여를 위한 내복용 고형제 또는 내복용 액제 또는 비경구 투여를 위한 주사제 등으로 할 수 있다.
경구투여를 위한 내복용 고형제로는, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다.
내복용 고형제에 있어서는, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드는 그대로 혹은 첨가제와 혼합 또는 조립(예를 들면, 교반조립법, 유동층 조립법, 건식조립법, 전동교반 유동층 조립법(rolling strirring fluidized bed granulation) 등)시켜, 통상의 방법에 따라 제조된다. 예를 들면, 캡슐제의 경우 캡슐 충진 등에 의해, 정제의 경우 타정(tableting) 등에 의해 제조할 수 있다. 첨가제는 1종 또는 2종 이상을 적당히 배합해도 좋다. 첨가제로는, 예를 들면, 락토오스, 만니톨, 글루코오스, 미결정 셀룰로오스, 옥수수 전분 등의 부형제; 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산 마그네슘 등의 결합제; 옥수수 전분 등의 분산제; 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스 등의 붕해제; 스테아린산 마그네슘 등의 활택제; 글루탐산, 아스파라긴산 등의 용해 보조제; 안정화제(stabilizers); 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올 등의 합성 고분자류 등의 수용성 고분자; 백당, 백당 분말(powder sugar), 수크로오스, 프럭토오스, 글루코오스, 락토오스, 환원 맥아당 시럽(reduced malt sugar syrup)(말티톨 시럽), 분말 환원 맥아당 시럽(말티톨 시럽 분말), 고-글루코오스 옥수수 시럽(high-glucose corn syrup), 고-프럭토오스 옥수수 시럽(high-fructose corn syrup), 꿀, 소르비톨, 말티톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 아스파르탐, 사카린, 사카린 나트륨 등의 감미제 등을 들 수 있다.
과립제 또는 정제는 필요에 따라 코팅제 등으로 피복되어도 좋고, 또한 상기 코팅은 2 이상의 층이어도 좋다. 코팅제로는, 예를 들면, 백당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트 등을 들 수 있다. 캡슐제로서 제조할 경우에는, 상기 부형제를 적당히 선택하고, 프란루카스트(pranlukast) 수화물과 균등하게 혼화 또는 과립상, 혹은 과립상으로 한 것에 적당한 코팅제로 제피를 실시한 것을 캡슐에 충진하거나, 적당한 캡슐 기제(젤라틴 등)에 글리세린 또는 소르비톨 등을 첨가하여 소성을 증가시킨 캡슐 기제로 캡슐화(encapsulation)해도 좋다. 이들 캡슐 기제에는 필요에 따라, 착색제 또는 보존제(이산화황; 파라옥시안식향산 메틸, 파라옥시안식향산 에틸, 파라옥시안식향산 프로필 등의 파라벤 류) 등을 첨가할 수 있다. 캡슐제에는, 경질캡슐 또는 연질캡슐이 포함된다.
경구투여를 위한 내복용 액제로는, 수제, 현탁제·유제, 시럽제, 건조시럽제 등의 사용시 용해형 제제, 엘릭서제 등을 들 수 있다. 이러한 내복용 액제에 있어서는, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드는 내복용 액제에서 일반적으로 사용되는 희석제에 용해, 현탁 또는 유화된다. 희석제로는, 예를 들면, 정제수, 에탄올 또는 이들의 혼합액 등을 들 수 있다. 또한 이 액제는 습윤제, 현탁화제, 유화제, 감미제, 풍미제, 방향제, 보존제 또는 완충제 등을 함유하고 있어도 좋다. 또한, 건조시럽제는 예를 들면 프란루카스트 수화물과 예를 들어 백당, 백당 분말, 수크로로스, 프럭토오스, 글루코오스 또는 락토오스 등을 혼합 등을 하여 제조할 수 있다. 또한, 건조시럽제는 통상의 방법에 따라 과립으로 해도 좋다.
비경구 투여를 위한 제형으로는 주사제, 연고제, 겔제, 크림제, 첨부제, 분무제, 스프레이제 등을 들 수 있지만, 주사제가 바람직하다. 예를 들면, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드와 통상의 담체와 함께 주사제로 하는 것이 바람직하다.
비경구투여를 위한 주사제로는 수성 주사제 또는 유성 주사제의 어느 것이라도 좋다. 수성 주사제로 할 경우, 공지의 방법을 따라, 예를 들면, 수성 용매(주사 용수, 정제수 등)에 약학적으로 허용되는 첨가제를 적당히 첨가한 용액에 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 혼합한 후, 필터 등으로 여과하여 멸균하고, 이어서 무균 용기에 충진함으로써 조제할 수 있다. 약학적으로 허용되는 첨가제로는, 예를 들면, 상술한 아주반트; 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨, 소르비톨, 붕산(boric acid), 붕사(borax), 글루코오스, 프로필렌글리콜 등의 등장화제; 인산 완충액, 초산 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 구연산 완충액, 트리스 완충액, 글루탐산 완충액, 엡실론-아미노카프론산(epsilon-aminocaproate) 완충액 등의 완충제; 파라 옥시안식향산 메틸, 파라옥시안식향산 에틸, 파라옥시안식향산 프로필, 파라옥시 안식향산 부틸, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 염화 벤잘코늄, 데히드로초산 나트륨(sodium dehydroacetate), 에데트산 나트륨, 붕산, 붕사 등의 보존제; 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜 등의 증점제; 아황산수소 나트륨, 치오황산 나트륨, 에테트산 나트륨, 구연산 나트륨, 아스코르브산, 디부틸히드록시톨루엔 등의 안정화제; 염산, 수산화나트륨, 인산, 초산 등의 pH 조정제 등을 들 수 있다. 또한 주사제에는, 적당한 용해 보조제, 예를 들면, 에탄올 등의 알코올; 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리알코올; 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 50, 리소레시틴(lysolecithin), 플루로닉 폴리올(pluronic polyols) 등의 비이온 계면활성제 등을 더욱 배합해도 좋다. 또한, 예를 들면, 소 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) 등의 단백질; 아미노덱스트란 등의 폴리사카라이드 등을 함유해도 좋다. 유성 주사제로 할 경우, 유성용매로는, 예를 들면, 참기름 또는 콩기름 등을 사용할 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질 또는 벤질 알코올 등을 배합해도 좋다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플 또는 바이알 등에 충진된다. 주사제 등의 액상 제제는 동결 보존 또는 동결 건조 등에 의해 수분을 제거하여 보존할 수도 있다. 동결 건조 제제는, 사용시 주사용 증류수 등을 가하여 재용해하여 사용된다.
또한, 본 발명의 암 백신 조성물의 다른 형태로서, 리포좀 중에 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 혼합하고, 또한 필요에 따라, 다당류 및/또는 암 백신 조성물중에 배합되는 다른 성분을 함유시킬 수도 있다.
본 발명의 암 백신 조성물의 투여량은, 사용하는 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드 또는 DNA나, 환자의 연령, 체중, 대상질환 등에 따라 다르지만, 예를 들면, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드 등의 WT1 펩타이드를 포함하는 백신 조성물의 경우, WT1 펩타이드량으로서, 1일에 체중당 약 0.1μg∼1mg/kg가 바람직하다. 또한 WT1 펩타이드의 투여량은 통상 0.0001mg∼1000mg, 바람직하게는 0.01mg∼1000mg, 더욱 바람직하게는 0.1mg∼10mg이며, 이 양을 수일∼몇개월에 1회 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 암 백신 조성물은, HLA-A*0206 양성자용의 암 백신 조성물이다. HLA-A*0206 양성자를 선택하기 위한 HLA형은, 예를 들면 혈액 제공자의 말초혈로부터 결정할 수 있다. HLA형을 결정하는 방법으로는, SBT(Sequencing Based Typing)법 또는 SSP법 등의 DNA 타이핑법 혹은 HLA 타이핑법 등 공지의 방법을 들 수 있다. SBT법은 PCR법에 의해 DNA를 증폭하고, 증폭 산물의 염기서열을 기존 대립형질(alleles)의 염기서열 정보와 대조하여 정밀하게 HLA 유전자형을 판정할 수 있다. SSP법은 HLA 대립형질(alleles)에 특이적인 다종의 프라이머로 PCR 후, 전기영동을 수행하고, 양성 밴드를 확인함으로써 HLA 유전자형을 판정할 수 있다.
본 발명의 암 백신 조성물을 HLA-A*0206 양성자에게 투여하면, 상기 백신 조성물에 함유된 HLA-A*0206 구속성을 갖는 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드 또는 DNA 또는 RNA에 의해 발현되는 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드가, HLA-A*0206 양성자의 항원제시세포(수지상 세포)의 표면에 있는 HLA-A*0206 분자에 결합한다. 이것에 의해, 특이적인 항종양면역, 즉 WT1-특이적인 CTLs가 유도되어, 이러한 WT1-특이적인 CTLs에 의해 대상자(HLA-A*0206 양성자) 중의 암 세포가 파괴된다. 이러한 항종양 면역은 예를 들면 WT1-특이적인 CTL 반응, 암세포에 대한 세포독성 시험(예를 들면, 51Cr 유리 세포독성 시험) 등에 의해 확인할 수 있다. 예를 들면, HLA-A*0201 구속성으로 WT1-특이적인 CTL 반응을 유도하는 것이 이미 보고된 9개의 아미노산으로 이루어진 WT1 단백질 유래의 WT1187 펩타이드 및 WT1126 펩타이드는, HLA-A*0206 구속성 반응을 유도할 수 있다. 일본인의 약 17%가 HLA-A*0206 구속성이며, 그 구속성도 HLA-A*0201 구속성과 거의 동일하게 많다. 이하의 실시예 1∼5에 있어서는, WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs는, 3명의 다른 HLA-A*0206 양성 혈액 제공자의 PBMCs로부터 생성했다. 유도된 CTLs는 WT1 발현 HLA-A*0206 양성 백혈병 세포에 대하여 세포독성 활성을 나타낸다. 또한, WT1187 펩타이드-특이적인 CTL 활성 및 WT1126 펩타이드-특이적인 CTL 활성은 항-HLA 클래스 I 항체에 의해 억제될 수 있기 때문에, 그 활성은 HLA 클래스 I 구속성 CTLs에 의한 것임을 확인할 수 있다. WT1187 펩타이드 및/또는 WT1126 펩타이드 또는 그의 변형 펩타이드를 포함한 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드는 HLA-A*0201과 동일하게 HLA-A*0206 양성 암환자의 백신이 될 수 있다. 이것으로부터, 조혈기 종양, 고형암 등의 악성 종양 환자에 대한 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 기초로 하는 면역요법은, 그 적용을 HLA-A*0206 양성 암환자에게 넓히는 것이 가능해진다. 본 발명의 암 백신 조성물을 HLA-A*0206 양성자에게 투여하는 HLA-A*0206 양성자의 암의 치료 및/또는 예방 방법은, 본 발명이 바람직한 실시형태 중 하나이다.
본 발명의 암 백신 조성물은 HLA-A*0206 양성자에 있어서 WT1 유전자의 발현 수준의 상승을 수반하는 암, 예를 들면, 백혈병, 골수이형성증후군, 다발성 골수종(multiple myeloma), 악성 임파종 등의 조혈기 종양; 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암(germ cell cancer), 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 등의 고형암의 치료 및/또는 예방을 위해서 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 암 백신 조성물의 투여 방법으로서, HLA-A*0206 양성 환자의 말초혈로부터 PBMCs를 채취하고, 이로부터 수지상 세포를 추출하고, 본 발명의 암 백신 조성물에 유효성분으로서 포함되는 펩타이드, 예를 들면, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드 또는 DNA 또는 RNA 등의 폴리뉴클레오티드를 펄스(pulsing)하여 환자에게 피하투여 등으로 환자에게 되돌리는 방법도 들 수 있다. 수지상 세포에 WT1 펩타이드 등을 펄스할 때의 조건으로는, 본 발명의 효과를 달성하는 한 특별히 한정되지 않고, 통상의 조건을 채용할 수 있다.
WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 코딩하는 RNA를 암 백신 조성물에 사용할 경우에는, 상기 RNA가 HLA-A*0206 양성자의 수지상 세포에 도입되도록 조성물을 투여하는 것이 바람직하다. RNA를 HLA-A*0206 양성자의 수지상 세포에 도입하는 방법으로는, 예를 들면, 상술한 바와 같이 HLA-A*0206 양성자로부터 수지상 세포를 채취하고, 상기 수지상 세포에, 전기 펄스에 의해 RNA를 도입하는 방법을 들 수 있다. 수지상 세포에 도입된 RNA로부터 발현되는 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드는, 상기 수지상 세포 표면에 제시되기 때문에, RNA를 펄스시킨 수지상 세포를 HLA-A*0206 양성자의 체내에 되돌림으로써, 생체내에서 신속하게 암면역을 생기게 할 수 있다. 이러한, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 코딩하는 RNA를 HLA-A*0206 양성자의 수지상 세포에 도입하는, 암의 치료 또는 예방 방법은, 본 발명이 바람직한 실시형태의 하나이다.
본 발명의 다른 태양은, HLA-A*0206 양성자 유래의 말초혈 단핵구를, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드의 존재하에서 배양하고, 상기 말초혈 단핵구로부터 WT1 특이적인 CTLs를 유도하는 WT1-특이적인 CTLs의 유도 방법에 관한 것이다. 말초혈 단핵구가 유래하는 대상은 HLA-A*0206 양성이라면 특별히 한정되지 않는다. WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드로는, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드 또는 그의 변형 펩타이드를 들 수 있고, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드가 바람직하다. 예를 들면, HLA-A*0206 양성자 유래의 말초혈 단핵구를 WT1187 펩타이드(또는 WT1126 펩타이드)의 존재하에서 배양함으로써, 말초혈 단핵구 중의 CTLs 전구세포로부터 WT1-특이적인 CTLs가 유도된다. HLA-A*0206 양성자 유래의 말초혈 단핵구의 배양 조건은 특별히 한정되지 않으며, 통상의 조건으로 배양할 수 있다. 이렇게 얻어진 CTLs는, WT1187 펩타이드(또는 WT1126 펩타이드)와 HLA-A*0206 분자와의 복합체를 인식한다. 따라서, 본 발명에 의해 유도된 WT1-특이적인 CTLs를 사용하면, HLA-A*0206 양성자에 있어서 WT1 고발현 종양세포를 특이적으로 파괴할 수 있고, 대상자인 HLA-A*0206 양성자의 조혈기 종양, 고형암을 치료 및/또는 예방할 수 있다. WT1-특이적인 CTLs를 HLA-A*0206 양성 대상자에게 투여하는 방법으로는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 상술한 암 백신 조성물과 동일하게 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 태양은, HLA-A*0206 구속성 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 필수구성성분으로서 포함하는, WT1-특이적인 CTLs를 유도하기 위한 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 키트는 상기 HLA-A*0206 양성자 유래의 WT1-특이적인 CTLs의 유도방법에 사용할 수 있다. 이러한 키트는 HLA-A*0206 구속성 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드 이외에, 예를 들면, 말초혈 단핵구의 취득수단, 아주반트, 반응 용기 등을 포함할 수도 있다. 이러한 키트를 이용하면, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드 등의 암항원과 HLA-A*0206 분자와의 복합체를 인식하는 WT1-특이적인 CTLs를 효율적으로 유도할 수 있다.
본 발명의 또다른 태양은, HLA-A*0206 양성자 유래의 미성숙 수지상 세포를, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드의 존재하에서 배양하고, 상기 미성숙 수지상 세포로부터 상기 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 제시하는 수지상 세포를 유도하는, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 제시하는 수지상 세포의 유도 방법에 관한 것이다. WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드로는, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드 또는 그의 변형 펩타이드를 들 수 있고, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드가 바람직하다. 미성숙 수지상 세포가 유래하는 대상은 HLA-A*0206 양성이라면 특별히 한정되지 않는다. 미성숙 수지상 세포는, 예를 들면, 말초혈 단핵구 등에 포함되어 있기 때문에, 관련 세포를 WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 존재하에서 배양할 수도 있있다. 이렇게 얻어진 수지상 세포를 HLA-A*0206 양성자에게 투여하면, 상기 WT1-특이적인 CTLs가 효율적으로 유도되어, 이것에 의해 대상의 조혈기 종양, 고형암을 치료 및/또는 예방할 수 있다. 수지상 세포를 HLA-A*0206 양성 대상자에게 투여하는 방법으로는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 상술한 암 백신 조성물과 동일하게 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 태양은, HLA-A*0206 구속성 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 필수구성성분으로서 포함하는, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 제시하는 수지상 세포를 유도하기 위한 키트에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 키트는 상기 수지상 세포의 유도 방법에 사용할 수 있다. 이러한 키트는 HLA-A*0206 구속성 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드 이외에, 예를 들면, 미성숙 수지상 세포나 말초혈 단핵구의 취득수단, 아주반트, 반응 용기 등을 포함할 수도 있다. 이러한 키트를 사용하면, HLA-A*0206 분자를 통해서 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 제시하는 수지상 세포를 효율적으로 유도할 수 있다.
(1) WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드, 상기 방법에 의해 유도된 WT1-특이적인 CTLs, 또는 상기 방법에 의해 유도된 수지상 세포, 또는, (2) WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드, 상기 방법에 의해 유도된 WT1-특이적인 CTLs, 또는 상기 방법에 의해 유도된 수지상 세포에 대한 항체를 이용함으로써, HLA-A*0206 양성자의 암을 진단할 수 있다. 이러한 암의 진단 방법도, 본 발명의 하나이다. (1)에 있어서는, 바람직하게는, 상술한 유도 방법으로 의해 유도된 WT1-특이적인 CTLs를 사용하여 진단을 수행한다. WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드로는, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드 또는 그의 변형 펩타이드를 들 수 있고, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드가 바람직하다.
본 발명의 HLA-A*0206 양성자의 암의 진단 방법으로는, 예를 들면, HLA-A*0206 양성자 유래의 시료 중의 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드, 이에 대한 항체 또는 WT1-특이적인 CTLs를 검출 또는 정량하는 공정, 및 이어서 상기 단백질 또는 그의 부분 펩타이드, 이에 대한 항체 또는 WT1-특이적인 CTLs 량을, 암을 발증하지 않는 경우와 비교하는 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다.
암을 발증한 환자 유래의 시료(예를 들면, 혈액) 중에는, 암세포로부터 유출된 WT1 펩타이드 및/또는 WT1 단백질이 포함되고, 또한 암항원에 대한 면역응답이 높아짐으로써, 상기 WT1 펩타이드 또는 WT1 단백질에 대한 항체, WT1-특이적인 CTLs 등의 양이 증가한다. 이 때문에, 암을 발증하지 않는 경우와 비교하여 상기 시료 중의 WT1 펩타이드 또는 WT1 단백질, 이에 대한 항체 또는 WT1-특이적인 CTLs 량이 증가한 경우에는, 암을 발증하고 있을 가능성이 있다. 항체량은, 예를 들면, ELISA법으로 측정할 수 있다. WT1-특이적인 CTLs는, 이하에 기재하는 MHC 테트라머(tetramers) 등의 WT1 멀티머(multimers)를 사용하는 방법에 의해 검출할 수 있다.
또한, 예를 들면 상기 CTLs, 수지상 세포 또는 항체를 HLA-A*0206 양성 대상유래의 시료와 인큐베이션(incubation)하거나, 또는 HLA-A*0206 양성 대상에게 투여한 다음 상기 CTLs, 수지상 세포 또는 항체의, 예를 들면, 위치, 부위, 양 등을 결정함으로써, 암의 진단이 가능해진다. CTLs 및 수지상 세포는 암세포로 모이는 성질을 갖기 때문에, CTLs 또는 수지상 세포를 투여한 후에 상기 CTLs 또는 수지상 세포의 위치 또는 부위를 조사함으로써, 암을 진단하는 것이 가능해진다. 상기 방법에 의해 유도된 WT1-특이적인 CTLs 또는 상기 방법에 의해 유도된 수지상 세포를 HLA-A*0206 양성 대상에게 투여하는 공정 및 이어서 상기 HLA-A*0206 양성 대상에 있어서의 상기 CTLs 또는 수지상 세포의 위치 또는 부위를 결정하는 공정을 포함하는 HLA-A*0206 양성자의 암의 진단 방법도 본 발명의 하나이다.
또한, 예를 들면 CTLs 또는 수지상 세포를 HLA-A*0206 양성 대상 유래의 시료와 인큐베이션하여 반응시킨 후, 이어서 상기 CTLs 또는 수지상 세포에 대한 항체를 가하여 추가로 인큐베이션하고, 항체에 첨부한 표지 등에 의해 상기 항체와 결합한 암세포와 CTLs와의 복합체, 상기 항체와 결합한 수지상 세포 등을 검출 또는 정량함으로써, 암의 진단이 가능해진다. 암을 발증하지 않는 경우와 비교하여 암세포와 CTLs와의 복합체, 상기 항체와 결합한 수지상 세포가 증가한 경우에는, 암을 발증하고 있을 가능성이 있다. 상기 CTLs, 수지상 세포 또는 항체는 표지된 것이어도 좋다. 상기 표지(label)를 첨부함으로써 진단을 효율적으로 수행할 수 있다. HLA-A*0206 양성 대상 유래의 시료로는, 뇨, 혈액, 조직 추출액, 타액, 눈물, 기타의 체액 등의 HLA-A*0206 양성 대상으로부터 채취한 생체시료를 들 수 있고, 혈액이 바람직하다.
상기 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 이용한 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용의 암의 진단 방법으로는, 예를 들면, WT1 펩타이드를 항원으로서 사용하는 MHC 테트라머 분석(MHC tetramer assay), MHC 펜타머 분석(MHC pentamer assay), MHC 덱스트라머 분석(MHC dextramer assay)을 들 수 있다. 예를 들면, WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드를 항원 펩타이드로서 사용하는 MHC 테트라머 분석 또는 MHC 펜타머 분석에 있어서는, MHC/WT1187 펩타이드 복합체 또는 MHC/WT1126 펩타이드 복합체를 프로브로 하여 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자에 있어서의 WT1-특이적인 CTLs를 검출할 수 있다. 암을 발증한 환자에 있어서는, WT1-특이적인 CTLs의 발현 빈도가 높아지는 것으로부터, WT1-특이적인 CTLs의 발현 빈도에 의해 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자의 암을 진단할 수 있다. 또한, 암을 발증한 환자에 있어서는, 암항원에 대한 면역응답이 높아지는 것으로부터, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드에 대한 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자의 면역응답을 조사하는 것에 의해서도, 암을 진단할 수 있다. 면역응답을 조사하는 방법으로는, ELISA로 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드에 대한 항체를 측정하는 방법을 들 수 있다. 이러한, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 이용한 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용의 암의 진단 방법도 본 발명의 하나이다. MHC 테트라머 분석, MHC 펜타머 분석은, 시판되는 키트 예를 들어 「WT1 tetramer」(Medical & Biological Laboratories, Co., Ltd.)을 이용하여 공지의 방법에 의해 수행할 수 있다.
또한, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드, 상기 방법에 의해 유도된 WT1-특이적인 CTLs, 또는 상기 방법에 의해 유도된 수지상 세포에 대한 항체를 HLA-A*0206 양성 대상 유래의 시료와 반응시키는 공정, 및 이어서 상기 항체와 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드, WT1-특이적인 CTLs 또는 수지상 세포와의 복합체를 검출 또는 정량하는 공정을 포함하는 방법에 의해서도, HLA-A*0206 양성 대상의 암의 진단이 가능하다. 암을 발증하지 않는 경우와 비교하여 항체와 WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드, WT1-특이적인 CTLs 또는 수지상 세포와의 복합체가 증가하는 경우에는, 암을 발증하고 있을 가능성이 있다.
수지상 세포에 대한 항체로는, WT1 펩타이드/HLA-A*0206 복합체를 인식하는 항체를 들 수 있다. 이러한 항체는 WT1 펩타이드 및 HLA-A*0206을 인식할 수 있으므로, 수지상 세포의 Class I 상에 WT1 펩타이드가 제시되어 있는 경우에 상기 수지상 세포를 인식할 수 있는 것이다.
또한, WT1 펩타이드/HLA-A*0206/CTLs의 TCR(T 세포 항원 수용체) 복합체를 인식하는 항체도, 수지상 세포에 대한 항체로서 사용할 수 있다. 이러한 항체는 수지상 세포와 CTLs와의 복합체 및 암세포와 CTLs와의 복합체를 인식할 수 있는 항체이다.
HLA-A*0206 양성 대상 유래의 시료와 이러한 항체를 인큐베이션하여 반응시켜 복합체를 형성시키고, 이어서 항체에 첨부한 형광 등에 의해 상기 항체와 결합한 암세포와 CTLs와의 복합체, 상기 항체와 결합한 WT1 펩타이드를 제시하는 수지상 세포 등을 검출 또는 정량함으로써, 암의 진단이 가능해진다. 암을 발증하지 않는 경우와 비교하여 상기 항체와 결합한 암세포와 CTLs와의 복합체, 상기 항체와 결합한 WT1 펩타이드를 제시하는 수지상 세포 등이 증가하는 경우에는, 암을 발증하고 있을 가능성이 있다.
WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 포함하는 조성물을 HLA-A*0206 양성자에게 투여하는 암의 치료 또는 예방 방법도 본 발명의 하나이다. WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드를 포함하는 조성물 및 그 바람직한 태양은 상술한 암 백신 조성물과 같다.
HLA-A*0206 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드; 및 HLA-A*0206 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한 암 백신 조성물을 제조하기 위한, WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드의 사용도 본 발명의 하나이다. WT1 단백질 또는 WT1 펩타이드 및 그의 바람직한 태양은, 상술한 암 백신 조성물에 있어서와 같다.
암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드인 WT1187 펩타이드(서열번호 2) 또는 WT1126 펩타이드(서열번호 3)의 변형 펩타이드이고, 또한 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 펩타이드를 포함한 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물도 본 발명의 하나이다.
WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드로는, 상술한 WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드에 있어서, 1 또는 몇개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩타이드를 들 수 있다. WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드로는, N-말단으로부터 4∼8번째의 아미노산 잔기가 WT1187 펩타이드의 N-말단으로부터 4∼8번째의 아미노산 잔기와 동일한 펩타이드가 바람직하다. 이러한 변형 펩타이드로는, 상술한 서열번호 4∼12, 서열번호 15 및 16, 서열번호 18∼20, 및 서열번호 22∼25의 펩타이드가 바람직하다. 또한, WT1187P9L 펩타이드(SLGEQQYSL; 서열번호 53)도 바람직하다. WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드로는, N-말단으로부터 4∼8번째의 아미노산 잔기가 WT1126 펩타이드의 N-말단으로부터 4∼8번째의 아미노산 잔기와 동일한 펩타이드가 바람직하고, 예를 들면, 상술한 서열번호 27∼37 및 서열번호 39∼52의 펩타이드가 바람직하다.
또한, 본발명이 다른 바람직한 태양에 있어서는, WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드로서 상술한 서열번호 4∼26 및 53∼62의 펩타이드를, WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드로서 서열번호 27∼52 및 63∼75의 펩타이드를 각각 사용할 수 있다. 서열번호 4∼75의 변형 펩타이드 중에서도, WT1187P1D 펩타이드, WT1187P1E 펩타이드, WT1187P1H 펩타이드, WT1187P1P 펩타이드 및 WT1187P2Q 펩타이드, 및 WT1126P1D 펩타이드, WT1126P1E 펩타이드, WT1126P1P 펩타이드, WT1126P2A 펩타이드 및 WT1126P2Q 펩타이드를 제외한 펩타이드가 바람직하다.
이 중에서도, WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드로는, WT1187P1F 펩타이드, WT1187P2M 펩타이드 또는 WT1187P3M 펩타이드가 바람직하고, WT1187P1F 펩타이드 또는 WT1187P2M 펩타이드가 더욱 바람직하다. WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드로는, WT1126P1F 펩타이드, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P3M 펩타이드 또는 WT1126P9V 펩타이드가 바람직하고, WT1126P1F 펩타이드 또는 WT1126P2L 펩타이드가 더욱 바람직하다.
HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 사용량으로는, 상술한 HLA-A*0206 양성자용 암 백신 조성물에 있어서의 WT1 펩타이드와 같다. 또한, HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물의 기타의 성분 및 바람직한 태양에 대해서는, 상술한 HLA-A*0206 양성자용 백신 조성물과 같다.
상기 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드를 코딩하는 DNA 및 RNA도 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물의 유효성분으로 할 수 있다. 이러한 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물도 본 발명의 하나이다.
상기 DNA 또는 RNA를 포함하는 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물의 기타의 성분 및 암 백신 조성물의 바람직한 태양으로는, 상술한 HLA-A*0206 양성자용 암 백신 조성물에 있어서 사용되는 것과 동일하다.
HLA-A*0201 양성자 유래의 말초혈 단핵구를 상기 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 존재하에서 배양함으로써, 상기 말초혈 단핵구로부터 WT1-특이적인 CTLs를 유도할 수 있다. 이러한 WT1-특이적인 CTLs의 유도 방법도 본 발명의 하나이다.
바람직한 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드로는, 상술한 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물에 있어서 사용되는 것과 동일하다.
HLA-A*0201 양성자 유래의 미성숙 수지상 세포를 상기 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 존재하에서 배양함으로써, 상기 미성숙 수지상 세포로부터 상기 변형 펩타이드를 제시하는 수지상 세포를 유도할 수 있다. 이러한, WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드를 제시하는 수지상 세포의 유도 방법도 본 발명의 하나이다. 바람직한 변형 펩타이드로는 상술한 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물에 있어서 사용되는 것과 동일하다.
상기 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드, 이에 대한 항체, 상기 변형 펩타이드에 의해 유도된 WT1-특이적인 CTLs, 또는 상기 변형 펩타이드에 의해 유도된 수지상 세포를 사용하면, 인간 백혈구 항원 HLA-A*0201 양성자의 암을 진단할 수 있다. 이러한 HLA-A*0201 양성자용의 암의 진단 방법도 본 발명의 하나이다. HLA-A*0201 양성자용의 암의 진단 방법 및 그의 바람직한 태양은 상술한 HLA-A*0206 양성자용의 암의 진단 방법 및 그의 바람직한 태양과 동일하다.
또한, 이러한 HLA-A*0201 양성자용의 암의 진단 방법으로는, HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드를 항원으로서 사용하는 MHC 테트라머 분석, MHC 펜타머 분석, MHC 덱스트라머 분석 등을 들 수 있다. 바람직한 변형 펩타이드로는, 상술한 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물에 있어서 사용되는 것과 동일하다.
상기 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드, 상기 변형 펩타이드에 의해 유도된 WT1-특이적인 CTLs, 또는 상기 변형 펩타이드에 의해 유도된 수지상 세포에 대한 항체를 사용하면, 인간 백혈구 항원 HLA-A*0201 양성자의 암을 진단할 수 있다. 이러한 HLA-A*0201 양성자용의 암의 진단 방법도 본 발명의 하나이다. 바람직한 변형 펩타이드로는 상술한 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물에 있어서 사용되는 것과 동일하다. HLA-A*0201 양성자용의 암의 진단 방법 및 그의 바람직한 태양은 상술한 HLA-A*0206 양성자용의 암의 진단 방법 및 그의 바람직한 태양과 동일하다.
이하의 펩타이드를 포함하는 암 백신 조성물을 HLA-A*0201 양성자에게 투여하는 암의 치료 또는 예방 방법도 본 발명의 하나이다.
암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드인 WT1187 펩타이드(서열번호 2) 또는 WT1126 펩타이드(서열번호 3)의 변형 펩타이드이고, 또한 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 펩타이드.
바람직한 변형 펩타이드로는 상술한 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물과 동일하다. 또한, 암 백신 조성물 및 그의 바람직한 태양으로는, 상술한 HLA-A*0201 양성자용 백신 조성물과 동일하다.
본 발명은 또한, HLA-A*0201 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한, 이하의 펩타이드; 및 HLA-A*0201 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한 암 백신 조성물을 제조하기 위한 이하의 펩타이드의 사용에 관한 것이다.
암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드인 WT1187 펩타이드(서열번호 2) 또는 WT1126 펩타이드(서열번호 3)의 변형 펩타이드이고, 또한 HLA-A*0201 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 펩타이드.
바람직한 변형 펩타이드로는, 상술한 HLA-A*0201 양성자용 암 백신 조성물에 있어서 사용되는 것과 동일하다. 또한, 암 백신 조성물 및 그의 바람직한 태양으로는, 상술한 HLA-A*0201 양성자용 백신 조성물에 있어서 사용되는 것과 동일하다.
실시예
이하 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되지 않는다. 한편, 실시예에 있어서 약어는 이하의 의미를 나타낸다. 또한 합성 펩타이드는 SIGMA GENOSYS JAPAN으로부터 구입하였다.
DCs: 수지상 세포
PBMCs: 말초혈 단핵구
CD: Cluster of Differentiation(백혈구분화항원)
GM-CSF: 과립구·단구 콜로니 자극 인자
IL: 인터루킨
TNFα: tumor necrosis factor-α(종양괴사인자)
PGE: 프로스타글란딘
Gy: 그레이(Gray)
B-LCLs: B-임파섬유아세포주(B-lymphoblastoid cell line)
EB 바이러스: 엡스타인·바·바이러스(Epstein-Barr virus)
tBu: t-부틸
Trt: 트리페닐메틸
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)
실시예 1 (WT1 펩타이드와 결합하는 HLA 분자의 예측)
NetMHC 2.0 서버 예측 프로그램을 이용하여 WT1187 펩타이드(서열번호 2)와 결합할 수 있는 HLA 분자의 예측을 수행하였다.
그 결과, HLA-A*0201의 구속성을 가지는 WT1-특이적인 CTLs를 유도하는 능력이 있는 WT1187 펩타이드는, NetMHC 2.0 서버 예측 프로그램(NetMHC 2.0 Server-prediction program; http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-2.0/)에 있어서, HLA-A*0206 분자에 대하여 높은 결합 친화성을 시사하는 위치에 순위매김되었다.
실시예 2 (HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자의 PBMCs로부터의 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 제작 및 이를 사용한 세포독성 시험)
(1) HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자의 PBMCs의 분리와 DCs의 제작
우선, HLA-A*0206 건강한 혈액 제공자(3명)의 말초혈로부터, Ficoll-Hypaque밀도구배원심법에 의해 PBMCs를 분리하였다. 이어서, 항-인간 CD14 입자-DM(Becton, Dickinson and company 제)을 이용하여 HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자의 PBMCs로부터 CD14 양성 세포를 선택하였다. 이 경우, CD14 양성 세포는 단구(monocyte) 중에 많은 것으로 생각되었다. 선택한 CD14 양성 세포를 1v/v% 인간 AB 혈청, 800IU/mL의 GM-CSF(Pepro Tech INC, Rokey Hill, NJ), 및 1000IU/mL의 IL-4(Pepro Tech INC 제)을 포함하는 X-VIVO15 배지(BioWhittaker, Walkersville, MD)에서 배양하여 DCs를 제작하였다.
(2) 자가성숙 DCs의 유도
(1)에서 제작한 DCs를 37℃에서 1일 동안 배양한 후, 10ng/mL의 TNFα(tumor necrosis factor-α; Pepro Tech INC, Rokey Hill, NJ), 10ng/mL의 IL-β, 1000IU/mL의 IL-6 및 1μg/mL의 PGE2을 포함하는 성숙 사이토카인 칵테일(maturation cytokine cocktail)을 DCs 배양웰(culture wells)에 첨가했다. 37℃에서 24시간 배양함으로써, 자가성숙 DCs를 얻었다.
(3) WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 유도
자가성숙 DCs에 WT1187 펩타이드를 펄스한 후, 방사선조사(30Gy)를 하고, HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자로부터 얻은 CD8 양성 T 세포 농축 PBMCs와 공배양하였다. WT1187 펩타이드로의 DCs의 펄스는 10μg/mL의 WT1187 펩타이드와 함께 DCs를 37℃에서 30분간 배양함으로써 수행하였다. CD8 양성 T 세포는 HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자의 PBMCs로부터 CD8 마이크로 비즈(CD8 MicroBeads) 및 MS 컬럼(Miltenyi Biotec GmbH 제)을 사용하여 농축시켰다.
2회째의 자극으로부터 펩타이드를 펄스시킨 후 방사선조사시킨 자가 PBMCs가 선택적 자극 세포로서 이용되었다. 2회째의 자극의 2일후, 재조합 rIL-2(시오노기 제약 주식회사에서 제공)과 IL-7(Pepro Tech INC 제)을 각각 10IU/mL과 10ng/mL의 농도로 배양액에 첨가하였다. 4회째의 자극후, 37℃에서 10일간 배양하여 얻어진 세포(CTLs)를 원심분리기로 원심분리하여 회수하였다. 이 세포(CTLs)를 이용하여 51Cr 유리 세포독성 시험에 의해 표적세포에 대한 세포독성활성을 조사하였다.
(4) 세포독성 시험(Cytotoxicity test)
세포독성 시험은, 51Cr 유리 세포독성 시험에 의해 수행하였다. 51Cr 유리 세포독성 시험은 아래와 같이 수행되었다. 우선, 표적세포(1×107 개/mL)을 100μL의 51Cr(비활성(specific activity) 1mCi/ml)과 함께, RPMI1640(니혼 제약사제)+10% 소태아혈청 배지 중에서 37℃에서 1.5시간 동안 배양하여 표적세포를 51Cr으로 라벨링하였다. 이후, 51Cr으로 라벨링된 표적세포를 다양한 수의 (3)에서 얻어진 CTLs(100μL의 분석 배지에 현탁한 것)을 포함하는 웰(둥근 바닥의 96 웰 플레이트(96 round-bottom well plate))에 첨가하고, 혼합하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. CTLs와 표적세포로는 CTLs를 「E」로 하고, 51Cr으로 라벨링한 표적세포를 「T」로 하여, E/T(세포수)비가 1:1, 5:1, 20:1 또는 25:1이 되도록 혼합하였다. 배양후, 100μL 상청액(supernatant)을 각 웰로부터 모았다. 표지된 세포로부터 유리 및 방출된 51Cr을 측정하고, 51Cr의 특이적 용해(%)을 산출하였다. 특이적 용해(%)는 이하의 방법으로 산출하였다.
<수학식 1>
Figure pat00001
상기 식 중, 자연방출량은 표적세포만의 배양 상청액의 형광발광량을 말하고, 최대방출량은 1질량% 트리톤(Triton)X-100으로 처리함으로써 표적세포를 완전히 용해한 배양액의 형광발광량을 말한다.
표적세포로는, 이하에 기재하는 B-LCLs, K562 세포, JY 세포 및 KH88 세포를 사용하였다. 한편, KH88 세포는 후술하는 실시예 9에서 사용한 KH88OF8 세포와 동일하다.
B-LCLs는 EB 바이러스를 이용하여 HLA-A*0206 양성 혈액 제공자로부터 얻은 말초혈 B 림프구의 형질전환에 의해 수립되었지만, WT1을 발현하지 않는다.
K562 세포는 만성 골수성 백혈병 아구 발증(chronic myelogenous leukemia in blastic crisis)를 갖는 환자로부터 수립되었고, WT1을 발현하지만, HLA 클래스 I 비발현 세포주이다. 본 발명자는 야생의 WT1 발현 HLA-A*0206 양성 백혈병 세포주를 얻을 수 없었다. 이 때문에, HLA-A*0206 유전자를 K562 세포에 도입하여 형질전환에 의해 제작된 0206K562 세포도 사용하였다. HLA-A*0206 유전자로 형질전환된 0206K562 세포는 항-HLA-A2 항체(클론 BB7.2; BD Biosciences Pharmingen 제)를 사용한 FACS 분석에 의해 세포표면에 HLA-A*0206 분자를 발현하는 것이 확인되었다.
WT1 유전자로 형질전환된 B-LCL 세포는 웨스턴 블롯 분석에 의해 WT1을 발현하는 것이 확인되었다. 한편, 공 벡터(mock vector)로 형질전환된 B-LCL 세포를 컨트롤로 하였다.
JY 세포주는 WT1 비발현 HLA-A*0206 음성 EB 바이러스로 형질전환된 B 세포주이다.
KH88은 WT1 발현 HLA-A*0206 음성 백혈병 세포주이다.
모든 세포주는 10v/v%의 가열-불활성화시킨 소태아혈청, 50IU/mL의 페니실린 및 50mg/mL의 스트렙토마이신을 보충한 RPMI1640 배양액에서 배양하였다.
(5) 항체 및 유세포 분석
항-인간 CD14, CD86, CD80, CD83, HLA-DR mAbs는 벡톤·디킨슨 주식회사(Becton Dickinson)로부터 구입하였다. DCs의 농축과 성숙의 확인은 상기에서 열거한 단일클론항체(mAbs)를 사용한 세포의 세포표면항원의 분석에 의해 수행하였다. 샘플은 CellQest 소프트웨어를 이용하여 유세포분석기(FACS Calibur; Becton Dickinson 제)로 분석하였다.
(6) 결과
WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs를 HLA-A*0206의 혈액 제공자의 PBMCs로부터 제조할 수 있는지 여부를 시험하였다. HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자로부터의 CD8 양성 T 세포 농축 PBMCs를, WT1187 펩타이드를 펄스시킨 자가 DCs 또는 PBMCs로 반복하여 자극하여 얻어진 CTLs에 대해서, WT1187 펩타이드-특이적인 세포독성 활성을 조사하였다. CTLs는 WT1187 펩타이드를 펄스시키지 않은 B-LCL 세포보다 WT1187 펩타이드를 펄스시킨 자가 B-LCL 세포에 대하여 더욱 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 1a). 도 1a에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CTLs(이펙터(effector): E)와 표적세포(타겟: T)의 비(E/T비)를 각각 나타낸다. 삼각형(▲)은 10μg/mL의 WT1187 펩타이드로 펄스시킨 세포를 나타내고, 사각형(■)은 WT1187 펩타이드로 펄스시키지 않은 세포를 나타낸다. 또한, 다른 두사람의 HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자로부터 분리한 PBMCs로부터 동일하게 제조한 CTLs에서도 상기와 동일한 세포독성 활성이 확인되었다(도 2a 및 b). 도 2 중, 삼각형(▲)은 10μg/mL의 WT1187 펩타이드로 펄스시킨 세포를 나타내고, 사각형(■)은 WT1187 펩타이드로 펄스시키지 않은 세포를 나타낸다. 이 결과는, 이들 세포독성 활성이 WT1187 펩타이드에 특이적이라는 것을 나타낸다.
또한, CTLs의 세포독성 활성은 DCs 또는 PBMCs로 펄스한 WT1187 펩타이드의 농도가 높아지는 것과 평행하게 증가하여, 0.1μg/mL의 농도에서 정체(plateau)에 도달하였다(도 1b). 특이적 용해의 WT1187 펩타이드의 하프 맥시멈 농도(half-maximal lysis)는 약 5×10- 5μg/mL이었다. 이는 CTLs의 TCRs(T 세포 항원 리셉터)의 WT1187 펩타이드/HLA-A*0206 복합체로의 친화성이 상대적으로 높았다는 것을 나타내고 있다. 이 결과는, WT1187 펩타이드에 의해 유도된 CTLs가 WT1187 펩타이드를 인식할 수 있다는 것을 강하게 시사하고 있다.
이어서, 상기한 바와 같이 WT1187 펩타이드를 펄스시킨 DCs또는 PBMCs를 이용하여 HLA-A*0206 양성 혈액 제공자의 CD8 양성 T 세포 농축 PBMCs를 자극함으로써 제작된 CTLs를 사용하여, 내재적으로(endogenously) WT1을 발현하는 다양한 표적세포에 대한 세포독성 활성을 조사하였다. 그 결과를 도 3a 및 b에 나타낸다. 한편, 도 3a 및 b에 나타낸 각 표적세포에 대한 세포독성 활성을 동시에 측정하였다.
도 3a는 WT1 유전자로 형질전환시킨 B-LCLs(WT1 발현, HLA-A*0206 양성; ▲) 또는 공 벡터(mock vector)로 형질전환시킨 B-LCLs(WT1 비발현, HLA-A*0206 양성; ■)에 대한 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성을 나타내는 도면이다. 도 3b는 0206K562 세포(WT1 발현, HLA-A*0206양성; ■), K562 세포(WT1 발현, HLA-A*0206 음성; □), KH88 세포(WT1 발현, HLA-A*0206 음성; ●) 및 JY 세포(WT1 비발현, HLA-A*0206 음성; ▲)에 대한 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성을 나타내는 도면이다.
CTLs는 공 벡터(mock vector)로 형질전환시킨 B-LCLs(WT1 비발현 HLA-A*0206 양성) 보다 WT1로 형질전환시킨 B-LCLs(WT1 발현 HLA-A*0206 양성)에 대하여 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 3a). 또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 이 CTLs는 K562(WT1 발현 HLA-A*0206 음성), KH88(WT1 발현 HLA-A*0206 음성), 또는 JY(WT1 비발현 HLA-A*0206 음성) 세포보다 HLA-A*0206으로 형질전환시킨 0206K562 세포(WT1 발현 HLA-A*0206 양성)에 대하여 더욱 강한 세포독성 활성을 나타냈다. 환언하면, CTLs는 WT1 발현 HLA-A*0206 양성 표적 백혈병 세포에 대하여 유의한 세포독성 활성을 나타내었으나, WT1 비발현 및/또는 HLA-A*0206 음성 세포에 대하여는 세포독성 활성을 나타내지 않았다. 이 결과는 시험관내(in vitro)에서 제조된 WT1187 펩타이드에 특이적인 CTLs가 HLA-A*0206의 구속성을 갖는 백혈병을 포함한 내재적으로 WT1을 발현하는 종양세포에 대하여 세포독성 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 도 3b에 나타낸 이 결과는 WT1187 펩타이드에 특이적인 CTLs에 의해 초래되는 세포독성 활성이 HLA-A 클래스 I에 제한(구속)된다는 것을 강하게 시사하였다. 이는 강한 세포독성 활성이 K562 세포 보다 0206K562 세포에 대하여 관찰되었기 때문이다.
이상의 것으로부터, 상기 배양 세포(CTLs)는 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs인 것이 입증되었다.
한편, 도면에 나타낸 결과는 전형적 데이터이며, 또한 기본적으로 다소의 편차가 있지만 모두 재현가능하다.
실시예 3 (WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 구속 HLA 클래스의 확인)
실시예 2에서 얻어진 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성이 HLA클래스 I 구속성인지를 확인하였다. HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II에 대한 mAb의 존재 또는 비존재하에서 51Cr 유리 세포독성 시험을 행하였다. 표적세포로서 자가 B-LCLs를 사용하였다. E/T비는 5:1로 행하였다.
그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4 중의 a는 B-LCLs(WT1187 비발현 HLA-A*0206 양성)을 표적세포로 하여 HLA 클래스 I에 대한 mAb(항-HLA 클래스 I mAb) 및 HLA 클래스 II에 대한 mAb(항-HLA 클래스 II mAb) 비존재하에서 시험을 수행한 결과이다. b는 WT1187 펩타이드를 펄스한 B-LCLs(WT1187 발현 HLA-A*0206 양성)을 표적세포로 하여 항-HLA 클래스 I mAb 비존재하에서 또한 항-HLA 클래스 II mAb 존재하에서 시험을 수행한 결과이다. c는 WT1187 펩타이드를 펄스한 HLA-A*0206 양성을 표적세포로 하여 항-HLA 클래스 I mAb 존재하에서 또한 항-HLA 클래스 II mAb 비존재하에서 시험을 수행한 결과이다. d는 WT1187 펩타이드를 펄스한 HLA-A*0206 양성을 표적세포로 하여 항-HLA 클래스 I mAb 및 항-HLA 클래스 II mAb 비존재하에서 시험을 수행한 결과이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성은 항-HLA 클래스 II 항체가 아닌 항-HLA 클래스 I 항체의 첨가에 의해 완전히 억제되었다. WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성은 예상대로 HLA 클래스 I 구속성인 것으로 나타났다.
실시예 4 (종양세포에 대한 세포독성 시험)
실시예 2에서 얻어진 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs를 사용하여, 시험관내(in vitro)에서 HLA-A*0206의 구속성을 갖는 WT1 발현 종양세포에 대한 세포독성 시험을 수행하였다. 세포독성 시험은 실시예 2에 기재된 51Cr 유리 세포독성 시험을 사용하여 행하였다. 그 결과, 상기 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs는 WT1 발현 종양세포에 대하여 세포독성 활성을 나타냈다(도면에 나타나있지 않음).
실시예 5 (WT1126 펩타이드-특이적인 CTLs의 제작 및 이를 사용한 세포독성 시험)
실시예 2(3)에 있어서, WT1187 펩타이드 대신 WT1126 펩타이드(서열번호 3)을 사용한 것 이외에는 동일하게 하여, WT1126 펩타이드-특이적인 CTLs를 제작하였다. 이 CTLs를 이용하여 실시예 2와 동일하게 하여 세포독성 시험을 수행하여 WT1126 펩타이드-특이적인 세포독성 활성을 측정했다. 도 5에, 도 2b와 동일한 HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자의 PBMCs로부터 유도된 WT1126 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 5에 있어서, 삼각형(▲)은 10μg/mL의 WT1126 펩타이드로 펄스시킨 세포를 나타내고, 사각형(■)은 WT1126 펩타이드로 펄스시키지 않은 세포를 나타낸다. CTLs는 WT1126 펩타이드를 펄스시키지 않은 B-LCL 세포보다 WT1126 펩타이드를 펄스시킨 자가 B-LCL 세포에 대하여 더욱 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 5). 이 결과는 CTLs의 세포독성 활성이 WT1126 펩타이드에 특이적이라는 것을 나타낸다.
또한, 실시예 2과 동일하게 하여, WT1126 펩타이드를 펄스시킨 DCs 또는 PBMCs를 이용하여 HLA-A*0206 양성 혈액 제공자의 CD8 양성 T 세포 농축 PBMCs를 자극함으로써 제작된 CTLs를 이용하여, 내재적으로 WT1을 발현하는 다양한 표적세포에 대한 세포독성 활성을 조사하였다. 각 표적세포에 대한 세포독성 활성을, 도 6a 및 b에 나타낸다. 도 a 및 b에 있어서의 표적세포는 0206K562 세포(WT1 발현, HLA-A*0206 양성; ■), K562 세포(WT1 발현, HLA-A*0206 음성; □), KH88 세포(WT1 발현, HLA-A*0206 음성; ●) 및 JY 세포(WT1 비발현, HLA-A*0206 음성; ▲)이다. 도 6a는 도 2a와 동일한 HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자의 PBMCs로부터 유도된 WT1126 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성을 나타내는 도면이며, 도 6b는 도 2b와 동일한 HLA-A*0206 양성의 건강한 혈액 제공자의 PBMCs로부터 유도된 WT1126 펩타이드-특이적인 CTLs의 세포독성 활성을 나타내는 도면이다.
WT1126 펩타이드-특이적인 CTLs는 WT1187 펩타이드-특이적인 CTLs와 동일하게, WT1 발현 HLA-A*0206 양성 표적 백혈병 세포에 대하여 유의한 세포독성 활성을 나타내었지만, WT1 비발현 및/또는 HLA-A*0206 음성 세포에 대하여는 세포독성 활성을 나타내지 않았다. 이 결과는, 시험관내(in vitro)에서 제조된 WT1126 펩타이드에 특이적인 CTLs가 HLA-A*0206의 구속성을 갖는 백혈병을 포함한 내재적으로 WT1을 발현하는 종양세포에 대하여 세포독성 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 도 6a 및 b에 나타낸 결과는 WT1126 펩타이드에 특이적인 CTLs에 의해 초래되는 세포독성 활성이 HLA-A 클래스 I에 제한(구속)된다는 것을 강하게 시사하였다. 이는 강한 세포독성 활성이 K562 세포보다 0206K562 세포에 대하여 관찰되었기 때문이다.
이상의 것으로부터, 이들 CTLs는 WT1126 펩타이드-특이적인 CTLs인 것이 입증되었다.
한편, 도면에 나타내 결과는 전형적 데이터이며, 또한 기본적으로 다소의 편차는 있지만 모두 재현 가능하다.
실시예 6 (백신 조성물의 조제)
이하의 암 백신 조성물 1∼8을 조제하였다. 또한 이들은 본 발명의 암 백신 조성물의 일예이다.
암 백신 조성물 1
WT1187 펩타이드 3mg
몬타나이드(Montanide) ISA-51 400mg
5% 포도당액 400mg
상기 성분을 혼합하여 암 백신 조성물 1로 하였다.
암 백신 조성물 2
WT1187 펩타이드 1mg
몬타나이드 ISA-51 400mg
5% 포도당액 400mg
상기 성분을 혼합하여 암 백신 조성물 2로 하였다.
암 백신 조성물 3
WT1187 펩타이드 0.001mg
몬타나이드 ISA-51 400mg
5% 포도당액 400mg
상기 성분을 혼합하여 암 백신 조성물 3으로 하였다.
암 백신 조성물 4
WT1187 펩타이드 10mg
몬타나이드 ISA-51 400mg
5% 포도당액 400mg
상기 성분을 혼합하여 암 백신 조성물 4로 하였다.
암 백신 조성물 5∼8
상기 암 백신 조성물 1∼4에 있어서, WT1187 펩타이드 대신 WT1126 펩타이드를 사용하여 암 백신 조성물 5∼8을 제조하였다.
실시예 7 (변형 펩타이드의 HLA-A*0206 분자에 대한 친화성)
WT1187 펩타이드, WT1126 펩타이드 및 이들의 펩타이드에 있어서 N-말단으로부터 1번째, 2번째, 3번째 또는 9번째의 아미노산 잔기를 치환한 변형 펩타이드에 대하여 HLA-A*0206 분자에 대한 친화성(affinity)을 NetMHC 2.0 서버 예측 프로그램으로 분석했다. WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드에 관한 분석 결과를 표 1에, WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드에 관한 분석 결과를 표 2에 각각 나타낸다. 친화성의 수치가 작을 수록(결합가능한 펩타이드 농도가 낮을 수록), 친화성이 높은 것을 의미한다.
펩타이드 아미노산 서열 서열번호 예측치 친화성(nM) 결합 강도
(Binding Strength)
WT1187 SLGEQQYSV 2 0.776 11 강한 결합
(Strong binding, SB)
WT1187P1G GLGEQQYSV 4 0.756 13 SB
WT1187P1A ALGEQQYSV 5 0.812 7 SB
WT1187P1V VLGEQQYSV 6 0.755 14 SB
WT1187P1L LLGEQQYSV 7 0.810 7 SB
WT1187P1I ILGEQQYSV 8 0.782 10 SB
WT1187P1M MLGEQQYSV 9 0.877 3 SB
WT1187P1W WLGEQQYSV 10 0.876 3 SB
WT1187P1F FLGEQQYSV 11 0.926 2 SB
WT1187P1Y YLGEQQYSV 12 0.896 3 SB
WT1187P2V SVGEQQYSV 13 0.722 20 SB
WT1187P2Q SQGEQQYSV 14 0.824 6 SB
WT1187P2I SIGEQQYSV 15 0.734 17 SB
WT1187P2M SMGEQQYSV 16 0.798 8 SB
WT1187P3L SLLEQQYSV 17 0.865 4 SB
WT1187P3A SLAEQQYSV 18 0.844 5 SB
WT1187P3V SLVEQQYSV 19 0.869 4 SB
WT1187P3M SLMEQQYSV 20 0.896 3 SB
WT1187P3P SLPEQQYSV 21 0.791 9 SB
WT1187P3W SLWEQQYSV 22 0.883 3 SB
WT1187P3F SLFEQQYSV 23 0.864 4 SB
WT1187P3Y SLYEQQYSV 24 0.857 4 SB
WT1187P3S SLSEQQYSV 25 0.801 8 SB
WT1187P3I SLIEQQYSV 26 0.880 3 SB
WT1187P9L SLGEQQYSL 53 0.586 88 약한 결합
(weak binding)
펩타이드 아미노산 서열 서열번호 예측치 친화성(nM) 결합 강도
WT1126 RMFPNAPYL 3 0.83 6 SB
WT1126P1G GMFPNAPYL 27 0.76 14 SB
WT1126P1A AMFPNAPYL 28 0.80 8 SB
WT1126P1V VMFPNAPYL 29 0.75 15 SB
WT1126P1L LMFPNAPYL 30 0.80 8 SB
WT1126P1I IMFPNAPYL 31 0.77 11 SB
WT1126P1M MMFPNAPYL 32 0.86 4 SB
WT1126P1W WMFPNAPYL 33 0.88 3 SB
WT1126P1F FMFPNAPYL 34 0.91 2 SB
WT1126P1Y YMFPNAPYL 35 0.88 3 SB
WT1126P2V RVFPNAPYL 36 0.78 11 SB
WT1126P2Q RQFPNAPYL 37 0.85 4 SB
WT1126P2A RAFPNAPYL 38 0.67 35 SB
WT1126P2L RLFPNAPYL 39 0.80 8 SB
WT1126P2I RIFPNAPYL 40 0.78 10 SB
WT1126P3I RMIPNAPYL 41 0.84 5 SB
WT1126P3L RMLPNAPYL 42 0.83 6 SB
WT1126P3G RMGPNAPYL 43 0.71 23 SB
WT1126P3A RMAPNAPYL 44 0.79 9 SB
WT1126P3V RMVPNAPYL 45 0.82 6 SB
WT1126P3M RMMPNAPYL 46 0.86 4 SB
WT1126P3P RMPPNAPYL 47 0.72 21 SB
WT1126P3W RMWPNAPYL 48 0.85 5 SB
WT1126P9V RMFPNAPYV 49 0.91 2 SB
WT1126P9A RMFPNAPYA 50 0.77 12 SB
WT1126P9I RMFPNAPYI 51 0.81 7 SB
WT1126P9M RMFPNAPYM 52 0.65 42 SB
실시예 8 (변형 펩타이드의 HLA-A*0201 분자에 대한 친화성)
WT1187 펩타이드, WT1126 펩타이드 및 이들의 펩타이드에 있어서 N-말단으로부터 1번째, 2번째, 3번째 또는 9번째의 아미노산 잔기를 치환한 변형 펩타이드에 대하여, HLA-A*0201 분자에 대한 친화성을 NetMHC 2.0 서버 예측 프로그램으로 분석하였다. WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드에 관한 분석 결과를 표 3에, WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드에 관한 분석 결과를 표 4에 각각 나타낸다. 친화성의 수치가 작을 수록 친화성이 높은 것을 의미한다.
펩타이드 아미노산 서열 서열번호 예측치 친화성(nM) 결합 강도
WT1187 SLGEQQYSV 2 0.721 20 SB
WT1187P1G GLGEQQYSV 4 0.672 34 SB
WT1187P1A ALGEQQYSV 5 0.648 44 SB
WT1187P1V VLGEQQYSV 6 0.705 24 SB
WT1187P1L LLGEQQYSV 7 0.658 40 SB
WT1187P1I ILGEQQYSV 8 0.698 26 SB
WT1187P1M MLGEQQYSV 9 0.717 21 SB
WT1187P1W WLGEQQYSV 10 0.628 55 SB
WT1187P1F FLGEQQYSV 11 0.824 6 SB
WT1187P1Y YLGEQQYSV 12 0.809 7 SB
WT1187P2I SIGEQQYSV 15 0.556 121 SB
WT1187P2M SMGEQQYSV 16 0.740 16 SB
WT1187P3A SLAEQQYSV 18 0.811 7 SB
WT1187P3V SLVEQQYSV 19 0.766 12 SB
WT1187P3M SLMEQQYSV 20 0.876 3 SB
WT1187P3W SLWEQQYSV 22 0.863 4 SB
WT1187P3F SLFEQQYSV 23 0.852 4 SB
WT1187P3Y SLYEQQYSV 24 0.854 4 SB
WT1187P3S SLSEQQYSV 25 0.793 9 SB
WT1187P9L SLGEQQYSL 53 0.640 49 SB
펩타이드 아미노산 서열 서열번호 예측치 친화성(nM) 결합 강도
WT1126P1G GMFPNAPYL 27 0.80 9 SB
WT1126P1A AMFPNAPYL 28 0.81 7 SB
WT1126P1V VMFPNAPYL 29 0.81 8 SB
WT1126P1L LMFPNAPYL 30 0.82 7 SB
WT1126P1I IMFPNAPYL 31 0.81 8 SB
WT1126P1M MMFPNAPYL 32 0.85 4 SB
WT1126P1W WMFPNAPYL 33 0.80 8 SB
WT1126P1F FMFPNAPYL 34 0.91 2 SB
WT1126P1Y YMFPNAPYL 35 0.90 2 SB
WT1126P2V RVFPNAPYL 36 0.55 127 SB
WT1126P2Q RQFPNAPYL 37 0.49 262 SB
WT1126P2L RLFPNAPYL 39 0.78 10 SB
WT1126P2I RIFPNAPYL 40 0.64 48 SB
WT1126P3I RMIPNAPYL 41 0.74 16 SB
WT1126P3L RMLPNAPYL 42 0.78 10 SB
WT1126P3G RMGPNAPYL 43 0.60 73 SB
WT1126P3A RMAPNAPYL 44 0.73 17 SB
WT1126P3V RMVPNAPYL 45 0.68 31 SB
WT1126P3M RMMPNAPYL 46 0.83 6 SB
WT1126P3P RMPPNAPYL 47 0.61 66 SB
WT1126P3W RMWPNAPYL 48 0.83 6 SB
WT1126P9V RMFPNAPYV 49 0.84 5 SB
WT1126P9A RMFPNAPYA 50 0.73 18 SB
WT1126P9I RMFPNAPYI 51 0.79 9 SB
WT1126P9M RMFPNAPYM 52 0.69 29 SB
실시예 9 (WT1126 변형 펩타이드에 의한 HLA-A*0201 구속성의 CTL 유도의 비교)
(1) 목적
실시예 8의 결과를 고려하여, WT1126 변형 펩타이드로서 WT1126P1F 펩타이드(서열번호 34), WT1126P2L 펩타이드(서열번호 39), WT1126P3M 펩타이드(서열번호 46) 및 WT1126P9V 펩타이드(서열번호 49)을 선택하여, 세포독성 활성이 높은 CTL을 유도할 수 있는 WT1126 변형 펩타이드를 스크리닝하는 것을 목적으로 본 실험을 수행하였다. 또한 실시예 9∼12에 있어서 사용한 시약, 배지, 실험방법 등은 달리 표기하지않는 한 실시예 1과 동일하다. 실시예 9∼12에 있어서, 배양은 달리 표기하지 않는 한 37℃에서 행하였다.
(2) 재료 및 방법
HLA-A*0201 분자를 발현하는 건강인 공여자(HLA-A*0201 건강한 혈액 제공자)로부터 말초혈 단핵구(PBMCs)을 분리하고, 또한 항-인간 CD14입자-DM(Anti-Human CD14 Particles-DM)을 이용하여 CD14 양성 세포를 분리하였다. 본 세포를 1v/v% 인간 AB 혈청(1% human AB serum)이 첨가된 X-VIVO15 배지에 800IU/mL의 GM-CSF 및 1000 IU/mL의 IL-4을 첨가하여 얻어진 배양액에서 1일 동안 배양하였다.
본 배양물에 10ng/mL의 TNFα, 10ng/mL의 IL-β, 1000IU/mL의 IL-6 및 1μg/mL의 PGE2을 포함하는 성숙 사이토카인 칵테일(maturation cytokine cocktail)을 첨가했다. 추가로 하루 동안 배양한 후에, 자가성숙 DCs(mature DCs)가 얻어졌다.
실시예 13에서 얻어진 10ug/mL의 WT1126 변형 펩타이드(WT1126P1F 펩타이드, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P3M 펩타이드 또는 WT1126P9V 펩타이드)로 펄스한 자가성숙DCs를 4시간 동안 배양한 후에, 방사선을 조사하여(35Gy), CTLs 유도의 자극 세포로서 이용하였다.
24 웰 플레이트의 하나의 웰에, 리스펀더(responder)로서 PBMCs(2×106개/웰)과 전술한 DCs(2×105개/웰)을 공배양하였다. 일주일 후, 펩타이드를 펄스한 방사선 조사(75Gy) T2 세포로 재자극하였다. 재자극의 3일 후에 20IU/mL의 IL-2을 첨가하였다. 펩타이드-펄스한 방사선 조사 T2 세포에 의한 자극을 동일하게 추가로 3회 반복한 후, responder 세포 중의 CD8 양성 세포를 농축하였다.
상기 CD8 양성 T 세포에 대하여, WT1126 펩타이드의 HLA-A*0201 테트라머를 이용한 유세포분석기에 의한 반응성의 분석 및 다양한 표적세포에 대한 세포독성 활성을 검토했다.
표적세포로는 표 5에 나타낸 K562 세포, 0206K562 세포, JY 세포, KH88OF8 세포, TF-1 세포 및 THP-1 세포를 이용했다. 이들 세포의 특징을 표 5에 나타낸다. 또한, HLA-A*0201 양성 공여자의 혈액으로부터 EB 바이러스 감염에 의해 수립된 B-임파섬유아세포(B-LCL)도 표적세포로서 이용하였다.
표적세포 HLA-A*0201 HLA-A*0206 WT1
K562 음성 음성 발현함
0206K562 음성 양성 발현함
JY 양성 음성 발현하지 않음
KH88OF8 음성 음성 발현함
TF-1 양성 음성 발현함
THP-1 양성 음성 발현함
(3) 결과
도 7에 각 WT1126 변형 펩타이드로 자극한 HLA-A*0201 양성의 공여자 1의 PBMCs를 PE(Phycoerythrin)으로 표지한 WT1126 펩타이드의 HLA-A*0201의 테트라머(Medical & Biological Laboratories, Co., Ltd) 및 APC-Cy7(Allophycocyanin-Cyanine-7)로 표지한 항-CD8 항체로 염색하고, 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸다. PBMCs를 상기 테트라머 및 항-CD8 항체로 염색하면, 변형 펩타이드에 의한 자극에 의해 유도된 CTLs는 상기 테트라머 및 항-CD8 항체와 결합하고, 그 결과 상기 데트라머에 의한 형광 및 항-CD8 항체에 의한 형광이 검출된다. 도 7a∼e에 있어서, 종축은 HLA-A*0201 테트라머에 의한 형광강도를, 횡축은 항-CD8 항체에 의한 형광강도를 각각 나타낸다. 도 7a∼e 중의 사각 박스는 유도된 HLA-A*0201 구속성을 갖고 WT1126 펩타이드를 인식할 수 있는 CTLs의 빈도(%)를 나타낸다. 도 7a는 WT1126 변형 펩타이드로 자극하지 않은 PBMCs를 상기 테트라머 및 항-CD8 항체로 염색한 것(background)이다. 도 7b는 WT1126P1F 펩타이드로 자극한 PBMCs를 염색하고 분석한 결과이다. 도 7c는 WT1126P2L 펩타이드로 자극한 PBMCs를 염색하고 분석한 결과이다. 도 7d는 WT1126P3M 펩타이드로 자극한 PBMCs를 염색하고 분석한 결과이다. 도 7e는 WT1126P9V 펩타이드로 자극한 PBMCs를 염색하고 분석한 결과이다.
WT1126P1F 펩타이드로 자극한 PBMCs에 있어서 유도된 상기 CTLs의 빈도는 0.14%(도 7b)이며, WT1126P2L 펩타이드로 자극한 PBMCs에 있어서 유도된 상기 CTLs의 빈도는 0.37%(도 7c)이며, 이들 펩타이드에 의해 유도된 CTLs는 HLA 테트라머 양성인 동시에 CD8 양성이며, WT1126 펩타이드의 HLA-A*0201의 테트라머와 결합가능한 CTLs이었다. 이 결과에 의해, PBMCs의 WT1126 변형 펩타이드 자극에 의해 야생형 펩타이드(WT1126 펩타이드)를 인식할 수 있는 CTLs가 유도된 것으로 나타났다.
도 8에 공여자 1의 PBMCs를 WT1126P1F 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 8에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CD8 양성 T 세포(이팩터(effector): E)와 표적세포(타겟: T)와의 비(E/T비)를 각각 나타낸다. 마름모(◆)는 표적세포로서 JY세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 WT1126P1F 펩타이드를 펄스한 JY 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다.
JY 세포는 HLA-A*0201 양성 및 WT1 음성이며, CTLs는 WT1126P1F 펩타이드를 펄스한 JY 세포에 대하여 펩타이드를 펄스하지 않은 JY 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다. 이 결과에 의해, 자극에 이용한 펩타이드 특이적인 HLA-A*0201 구속성의 CTLs가 유도된 것으로 나타났다.
도 9에 공여자 1의 PBMCs를 WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 9에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CD8 양성 T 세포(이팩터(effector): E)와 표적세포(타겟: T)과의 비(E/T비)를 각각 나타낸다. 도 9a에서는, 마름모(◆)는 표적세포로서 JY 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 WT1126P2L 펩타이드를 펄스한 JY 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다. 도 9b에서는, 마름모(◆)는 표적세포로서 TF-1 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 THP-1 세포를 이용한 경우를, 삼각형(▲)은 표적세포로서 KH88OF8 세포를 이용한 경우를, 엑스표(×)는 표적세포로서 B-CLC 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다.
유도한 CTLs는, WT1126P2L 펩타이드를 펄스한 JY 세포에 대하여, 상기 펩타이드를 펄스하지 않은 JY 세포에 대한 것 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 9a). 또한, 유도한 CTLs는, HLA-A*0201 양성 및 WT1 양성의 TF-1 세포 및 THP-1 세포에 대하여는, HLA-A*0201 음성 및 WT1 양성의 KH88OF8 세포주, 및 HLA-A*0201 양성 및 WT1 음성의 B-LCL 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 9b). 이 결과로부터, WT1126P2L 펩타이드의 자극으로 유도된 CTLs는 HLA-A*0201 구속성이며, 내인성으로 WT1을 발현하는 암세포를 파괴하는 것이 명확하게 되었다.
도 10에 WT1126P2L 펩타이드로 자극한 HLA-A*0201 양성의 공여자 2의 PBMCs를 PE로 표지한 WT1126 펩타이드의 HLA-A*0201의 테트라머 및 APC-Cy7로 표지한 항-CD8로 염색하고, 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸다. 즉, 도 10은 유도한 CTLs를 WT1126 펩타이드의 테트라머 및 항-CD8 항체로 염색하여 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸다. 종축은 HLA-A*0201 테트라머에 의한 형광강도를, 횡축은 항-CD8 항체에 의한 형광강도를 각각 나타낸다.
도 10의 우측 상부(UR)의 세포가 유도된 HLA-A*0201 구속성을 갖는 WT1126 펩타이드를 인식가능한 CTLs이다. WT1126P2L 펩타이드로 자극한 PBMCs의 림프구 중 5.43%가 HLA 테트라머 양성인 동시에 CD8 양성이며, WT1126 펩타이드의 HLA-A*0201의 테트라머와 결합가능한 CTLs이었다. 이 결과에 의해, PBMCs의 변형 펩타이드 자극에 의해 야생형 펩타이드를 인식할 수 있는 CD8 양성의 CTLs가 유도된 것으로 나타났다.
도 11에 공여자 2의 PBMCs를 WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 11a 및 도 1lb에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CD8 양성 T 세포(이팩터(effector): E)와 표적세포(타겟: T)와의 비(E/T비)를 나타낸다. 도 11a에서는, 마름모(◆)는 JY 세포를 표적세포로서 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 WT1126 펩타이드를 펄스한 JY세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다. 도 1lb에서는, 마름모(◆)는 JY 세포를 표적세포로서 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 WT1126P2L 펩타이드를 펄스한 JY세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다.
유도한 CTLs는 WT1126 펩타이드를 펄스한 JY세포에 대하여, 펩타이드를 펄스 하지 않은 JY 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 11a). 또한, 유도한 CTLs는 WT1126P2L 펩타이드를 펄스한 JY세포에 대하여, 펩타이드를 펄스 하지 않은 JY 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 1lb). 이 결과로부터, WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도시킨 CTLs는 WT1126P2L 펩타이드 및 야생형의 WT1126 펩타이드의 양쪽을 인식할 수 있는 것이 명확하게 되었다.
실시예 10 (WT1126 변형 펩타이드에 의한 HLA-A*0206 구속성의 CTLs 유도의 비교)
(1) 목적
실시예 7의 결과를 고려하여, WT1126 변형 펩타이드로서, WT1126P1F 펩타이드, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P3M 펩타이드 및 WT1126P9V 펩타이드를 선택하여, 세포독성 활성이 높은 CTLs를 유도할 수 있는 WT1126 변형 펩타이드를 스크리닝 하는 것을 목적으로, 본 실험을 행하였다.
(2) 재료 및 방법
HLA-A*0206 분자를 발현하는 건강한 공여자(HLA-A*0206 건강한 혈액 제공자)로부터 말초혈 단핵구(PBMCs)을 분리하고, 또한 항-인간 CD14 입자-DM(Anti-Human CD14 Particles-DM)을 이용하여 CD14 양성 세포를 분리하였다. 본 세포를 1v/v% 인간 AB 혈청(1% human AB serum)이 함유된 X-VIVO15 배지에 800IU/mL의 GM-CSF 및 1000IU/mL의 IL-4을 첨가하여 얻어진 배양액에서 1일 동안 배양하였다.
본 배양물에 10ng/mL의 TNFα, 10ng/mL의 IL-β, 1000IU/mL의 IL-6 및 1μg/mL의 PGE2을 포함한 성숙 사이토카인 칵테일(maturation cytokine cocktail)을 첨가했다. 추가로 하루 동안 배양한 후에, 자가성숙 DCs(mature DCs)가 얻어졌다.
실시예 13에서 얻어진 10ug/mL의 WT1126 변형 펩타이드(WT1126P1F 펩타이드, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P3M 펩타이드 또는 WT1126P9V 펩타이드)로 펄스한 자가성숙DCs를, 4시간 동안 배양한 후에 방사선 조사하여(35Gy), CTLs 유도의 자극 세포로서 이용하였다.
24 웰 플레이트의 하나의 웰에, CD8 양성 T 세포를 농축한 PBMCs(2×106개/웰)과 전술한 DCs(1×105개/웰)을 공배양하였다. 10일 후, 펩타이드를 펄스한 방사선 조사(35Gy) PBMCs 세포로 재자극하였다. 재자극의 2일 후에 10IU/mL의 IL-2 및 10ng/mL의 IL-7을 첨가했다. 동일한 자극을 추가로 4회 반복한 후, CD8 양성 T 세포를 농축했다. 상기 CD8 양성 T 세포에 대하여, 다양한 표적세포에 대한 세포독성 활성을 검토했다.
표적세포로는, HLA-A*0206 양성의 공여자의 혈액으로부터 EB 바이러스 감염에 의해 수립된 B-LCL 세포, K562 세포 및 0206K562 세포를 이용하였다.
(3) 결과
도 12에 HLA-A*0206 양성의 공여자 3의 PBMCs를 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 12a는 WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을, 도 12b는 WT1126P3M 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을, 도 12c는 WT1126P9V 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 각각 나타낸다. 도 12a∼c에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CD8 양성 T 세포(이팩터(effector): E)와 표적세포(타겟: T)와의 비(E/T비)를 각각 나타낸다. 마름모(◆)는 표적세포로서 자기 B-LCL 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 자극에 이용한 WT1126 변형 펩타이드를 펄스한 자기 B-LCL 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다.
WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs는 WT1126P2L 펩타이드를 펄스한 HLA-A*0206 양성인 동시에 WT1 음성의 자기 B-LCL 세포에 대하여, 펩타이드를 펄스 하지 않은 자기 B-LCL 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타내었다(도 12a). WT1126P3M 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs는 WT1126P3M 펩타이드를 펄스한 HLA-A*0206 양성인 동시에 WT1 음성의 자기 B-LCL 세포에 대하여, 펩타이드를 펄스 하지 않은 자기 B-LCL 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 12b). WT1126P9V 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs는 WT1126P9V 펩타이드를 펄스한 HLA-A*0206 양성인 동시에 WT1 음성의 자기 B-LCL 세포에 대하여, 펩타이드를 펄스 하지 않은 자기 B-LCL 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도12c).
이 결과에 의해, 자극에 이용한 펩타이드-특이적인 HLA-A*0206 구속성의 CTLs가 유도된 것으로 나타났다.
도 13에 HLA-A*0206 양성의 공여자 3의 PBMCs를 WT1126P9V 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 13에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CD8 양성 T 세포(이팩터(effector): E)와 표적세포(타겟: T)와의 비(E/T비)를 각각 나타낸다. 마름모(◆)는 표적세포로서 자기 B-LCL 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 자기 B-LCL 세포에 WT1 유전자를 도입한 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다.
도 13에 의해, WT1126P9V 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs는, HLA-A*0206 양성인 동시에 WT1 음성의 자기 B-LCL 세포에 WT1 유전자를 도입하여 WT1 양성으로 한 세포에 대하여, WT1 유전자를 도입하지 않은 자기 B-LCL 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타내었다. 이 결과로부터, WT1126P9V 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs는 HLA-A*0206 구속성이며, 내인성으로 제시된 야생형의 WT1126 펩타이드를 인식하여 세포독성 활성을 나타내는 것이 명확하게 되었다.
도 14에 HLA-A*0206 양성의 공여자 4의 PBMCs를 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 14a는 WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을, 도 14b는 WT1126P3M 펩타이드로 자극하여 유도한 CTL의 세포독성 활성을, 도 14c는 WT1126P9V 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 각각 나타낸다. 도 14a∼c에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CD8 양성 T 세포(이팩터(effector):E)와 표적세포(타겟: E)와의 비(E/T비)를 각각 나타낸다. 마름모(◆)는 표적세포로서 자기 B-LCL 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 자극에 이용한 WT1126 변형 펩타이드를 펄스한 자기 B-LCL 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다.
WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs는, WT1126P2L 펩타이드를 펄스한 HLA-A*0206 양성인 동시에 WT1 음성의 자기 B-LCL 세포에 대하여, 펩타이드를 펄스 하지 않은 자기 B-LCL 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 14a). WT1126P3M 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs는 WT1126P3M 펩타이드를 펄스한 HLA-A*0206 양성인 동시에 WT1 음성의 자기 B-LCL 세포에 대하여, 펩타이드를 펄스 하지 않은 자기 B-LCL 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 14b). WT1126P9V 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs는 WT1126P9V 펩타이드를 펄스한 HLA-A*0206 양성인 동시에 WT1 음성의 자기 B-LCL 세포에 대하여, 펩타이드를 펄스 하지 않은 자기 B-LCL 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 14c). 이 결과에 의해, 자극에 이용한 펩타이드-특이적인 HLA-A*0206 구속성의 CTLs가 유도된 것으로 나타났다.
도 15에 HLA-A*0206 양성의 공여자 4의 PBMCs를 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 표적세포로는 HLA-A*0206 음성인 동시에 WT1 양성의 K562 세포와, K562 세포에 HLA-A*0206 유전자를 도입하여 내인성으로 WT1의 항원 펩타이드를 제시시킨 세포(0206K562 세포)을 각각 이용하였다. 도 15a는 WT1126P2L 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을, 도 15b는 WT1126P3M 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을, 도 15c는 WT1126P9V 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 각각 나타낸다. 도 15a∼c에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CD8 양성 T 세포(이팩터(effector):E)와 표적세포(타겟:E)와의 비(E/T비)를 각각 나타낸다. 또한, 마름모(◆)는 표적세포로서 K562 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 K562 세포에 HLA-A*0206 유전자를 도입하여 내인성으로 WT1의 항원 펩타이드를 제시시킨 0206K562 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다.
도 15a∼c에 의해, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P3M 펩타이드 또는 WT1126P9V 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs는, 어느 것의 경우도, 0206K562 세포에 대하여, K562 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다. 이들 결과에 의해, 이들의 변형 펩타이드 자극으로 유도된 CTLs는 HLA-A*0206 구속성이며, 내인성으로 제시된 야생형의 WT1126 펩타이드를 인식하여 세포독성 활성을 나타내는 것이 명확히 되었다.
실시예 11 (WT1187 변형 펩타이드에 의한 HLA-A*0201 구속성의 CTLs 유도의 비교)
(1) 목적
실시예 8의 결과를 고려하여, WT1187 변형 펩타이드로서 WT1187P1F 펩타이드(서열번호 11), WT1187P2M 펩타이드(서열번호 16) 및 WT1187P3M 펩타이드(서열번호 20)을 선택하여, 세포독성 활성이 높은 CTLs를 유도할 수 있는 WT1187 변형 펩타이드를 스크리닝하는 것을 목적으로, 본 실험을 행하였다.
(2) 재료 및 방법
HLA-A*0201 분자를 발현하는 건강한 공여자(HLA-A*0201 건강한 혈액 제공자)로부터 말초혈 단핵구(PBMCs)을 분리하고, 또한 항-인간 CD14 입자-DM(Anti-Human CD14 Particles-DM)을 이용하여 CD14 양성 세포를 분리하였다. 본 세포를 1v/v% 인간 AB 혈청(1% human AB serum)이 함유된 X-VIVO15 배지에 800IU/mL의 GM-CSF 및 1000IU/mL의 IL-4을 첨가하여 얻어진 배양액에서 1일 동안 배양했다.
본 배양물에 10ng/mL의 TNFα, 10ng/mL의 IL-β, 1000IU/mL의 IL-6 및 1μg/mL의 PGE2을 포함한 성숙 사이토카인 칵테일(maturation cytokine cocktail)을 첨가하였다. 추가로 하루 동안 배양한 후에, 자가성숙 DCs(mature DCs)가 얻어졌다.
실시예 13에서 얻어진 10ug/mL의 WT1187 변형 펩타이드(WT1187P1F 펩타이드, WT1187P2M 펩타이드 또는 WT1187P3M 펩타이드)로 펄스한 자가성숙 DCs를 4시간 동안 배양한 후에, 방사선 조사하여(35Gy) CTLs 유도의 자극 세포로서 이용했다.
24 웰 플레이트의 하나의 웰에, 리스펀더(responder)로서 PBMCs(2×106개/웰)과 전술한 DCs(2×105개/웰)을 공배양하였다. 일주일 후, 펩타이드를 펄스한 방사선조사(75Gy) T2 세포로 재자극했다. 재자극의 3일 후에 20 IU/mL의 IL-2을 첨가하였다. 펩타이트-펄스한 방사선 조사 T2 세포에 의한 자극을 동일하게 추가로 3회 반복한 후, responder 세포 중의 CD8 양성 세포를 농축했다. 상기 CD8 양성 T 세포에 대해서, 표적세포, 즉 JY 세포에 대한 세포독성 활성을 검토했다.
(3) 결과
도 16에 HLA-A*0201 양성 공여자의 PBMCs를 WT1187P1F 펩타이드(도 16a) 또는 WT1187P2M 펩타이드(도 16b)로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 16a 및 도 16b에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CD8 양성 T 세포(이팩터(effector):E)와 표적세포(타겟: T)와의 비(E/T비)를 각각 나타낸다. 마름모(◆)는 표적세포로서 JY 세포를 이용한 경우를, 삼각형(▲)은 표적세포로서 WT1187 펩타이드를 펄스한 JY 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 자극에 이용한 WT1187 변형 펩타이드(WT1187P1F 펩타이드)을 펄스한 JY 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다. JY 세포는 HLA-A*0201 양성인 동시에 WT1 음성이다.
WT1187P1F 펩타이드로 유도한 CTLs는 WT1187 펩타이드를 펄스한 JY 세포 및 WT1187P1F 펩타이드를 펄스한 JY세포에 대하여 동등한 세포독성 활성을 나타내었고, 그 활성은 펩타이드를 펄스하지 않은 JY 세포에 대하여 보다도 강했다(도 16a). WT1187P2M 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs는 WT1187 펩타이드를 펄스한 JY 세포 및 WT1187P2M 펩타이드를 펄스한 JY 세포에 대하여 동등한 세포독성 활성을 나타내었고, 그 활성은 펩타이드를 펄스하지 않은 JY 세포에 대하여 보다도 강했다(도 16b). 이 결과로부터, 변형 펩타이드 자극으로 유도된 CTLs는 변형 펩타이드와 야생형의 WT1187 펩타이드의 양쪽을 인식할 수 있는 것이 명확하게 되었다.
실시예 12 (WT1187 변형 펩타이드에 의한 HLA-A*0206 구속성의 CTLs 유도의 비교)
(1) 목적
실시예 7의 결과를 고려하여, WT1187 변형 펩타이드로서 WT1187P1F 펩타이드, WT1187P2M 펩타이드 및 WT1187P3M 펩타이드를 선택하여, 세포독성 활성이 높은 CTLs를 유도할 수 있는 WT1187 변형 펩타이드를 스크리닝하는 것을 목적으로, 본 실험을 행하였다.
(2) 재료 및 방법
HLA-A*0206 분자를 발현하는 건강인 공여자(HLA-A*0206 건강한 혈액 제공자)로부터 말초혈 단핵구(PBMCs)을 분리하고, 또한 항-인간 CD14 입자-DM(Anti-Human CD14 Particles-DM)을 이용하여 CD14 양성 세포를 분리하였다. 본 세포를 1v/v% 인간 AB 혈청(1% human AB serum)이 함유된 X-VIVO15 배지에 800IU/mL의 GM-CSF 및 1000IU/mL의 IL-4을 첨가하여 얻어진 배양액에서, 1일 동안 배양했다.
본 배양물에, 10ng/mL의 TNFα, 10ng/mL의 IL-β, 1000IU/mL의 IL-6 및 1μg/mL의 PGE2를 포함한 성숙 사이토카인 칵테일(maturation cytokine cocktail)을 첨가했다. 추가로, 하루 동안 배양한 후에, 자가성숙 DCs(mature DCs)가 얻어졌다.
실시예 13에서 얻어진 WT1187 변형 펩타이드(WT1187P1F 펩타이드, WT1187P2M 펩타이드 또는 WT1187P3M 펩타이드)로 펄스한 자가성숙 DCs를 4시간 동안 배양한 후에, 방사선조사하여(35Gy) CTLs 유도의 자극 세포로서 이용하였다.
24 웰 플레이트의 하나의 웰에, CD8 양성 T 세포를 농축한 PBMCs(2×106개/웰)과 전술한 DCs(1×105개/웰)을 공배양하였다. 10일 후, 펩타이드를 펄스한 방사선조사(35Gy) PBMCs 세포로 재자극하였다. 재자극의 2일 후에 10IU/mL의 IL-2 및 10ng/mL의 IL-7을 첨가하였다. 동일한 자극을 추가로 4회 반복한 후, CD8 양성 T 세포를 농축하였다. 상기 CD8 양성 T 세포에 대해서, 다양한 표적세포에 대한 세포독성 활성을 검토하였다.
표적세포로는, HLA-A*0206 양성의 공여자의 혈액으로부터 EB 바이러스 감염에 의해 수립된 B-LCL 세포, K562 세포 및 0206K562 세포를 이용하였다.
(3) 결과
도 17에 HLA-A*0206 양성 공여자의 PBMCs를 WT1187P1F 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 17에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CD8 양성 T 세포(이팩터(effector): E)와 표적세포(타겟:T)와의 비(E/T비)를 각각 나타낸다. 도 17a에서는, 마름모(◆)는 표적세포로서 B-LCL 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 WT1187 펩타이드를 펄스한 B-LCL 세포를 이용한 경우를, 삼각형(▲)은 표적세포로서 WT1187P1F 펩타이드를 펄스한 B-LCL 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다. 도 17b에서는, 마름모(◆)는 표적세포로서 K562 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 K562 세포에 HLA-A*0206 유전자를 도입하여 내인성으로 WT1의 항원 펩타이드를 제시시킨 0206K562 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다.
WT1187P1F 펩타이드로 유도한 CTLs는 WT1187 펩타이드를 펄스한 B-LCL 세포 및 WT1187P1F 펩타이드를 펄스한 B-LCL 세포에 대하여 동등한 세포독성 활성을 나타내었고, 그 활성은 펩타이드를 펄스하지 않은 B-LCL 세포에 대하여 보다도 강했다(도 17a). 또한, 표적세포로서 HLA-A*0206 음성인 동시에 WT1 양성의 K562 세포와, K562 세포에 HLA-A*0206 유전자를 도입하여 내인성으로 WT1의 항원 펩타이드를 제시시킨 세포(0206K562 세포)를 이용한 경우, WT1187P1F 펩타이드로 유도한 CTLs는 0206K562 세포에 대하여, K562 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 17b). 이 결과로부터, WT1187P1F 펩타이드 자극으로 유도된 CTLs는 WT1187P1F 펩타이드 및 야생형의 WT1187 펩타이드의 양쪽을 인식할 수 있다는 것, HLA-A*0206 구속성이며, 내인성으로 제시된 야생형의 WT1187 펩타이드를 인식하여 세포독성 활성을 나타낸다는 것이 명확하게 되었다.
도 18에 HLA-A*0206 양성 공여자의 PBMCs를 WT1187P2M 펩타이드로 자극하여 유도한 CTLs의 세포독성 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 18에 있어서, 종축은 세포독성 활성을, 횡축은 펩타이드 자극에 의해 얻어진 CD8 양성 T 세포(이팩터(effector): E)와 표적세포(타겟: T)와의 비(E/T비)를 각각 나타낸다. 도 18a에서는, 마름모(◆)는 표적세포로서 B-LCL 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 WT1187 펩타이드를 펄스한 B-LCL 세포를 이용한 경우를, 삼각형(▲)은 표적세포로서 WT1187P2M 펩타이드를 펄스한 B-LCL 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다. 도 18b에서는, 마름모(◆)는 표적세포로서 K562 세포를 이용한 경우를, 사각형(■)은 표적세포로서 K562 세포에 HLA-A*0206 유전자를 도입하여 내인성으로 WT1의 항원 펩타이드를 제시시킨 0206K562 세포를 이용한 경우를 각각 나타낸다.
WT1187P2M 펩타이드로 유도한 CTLs는 WT1187펩타이드를 펄스한 B-LCL 세포 및 WT1187P2M 펩타이드를 펄스한 B-LCL 세포에 대하여 동등한 세포독성 활성을 나타내었고, 그 활성은 펩타이드를 펄스하지 않은 B-LCL 세포에 대하여 보다도 강했다(도 18a). 또한, 표적세포로서 HLA-A*0206 음성인 동시에 WT1 양성의 K562 세포와, K562 세포에 HLA-A*0206 유전자를 도입하여 내인성으로 WT1의 항원 펩타이드를 제시시킨 세포(0206K562 세포)을 사용한 경우, WT1187P2M 펩타이드로 유도한 CTLs는 0206K562 세포에 대하여, K562 세포에 대하여 보다도 강한 세포독성 활성을 나타냈다(도 18b). 이 결과로부터, WT1187P2M 펩타이드 자극으로 유도된 CTLs는 WT1187P2M 펩타이드 및 야생형의 WT1187 펩타이드의 양쪽을 인식할 수 있다는 것, HLA-A*0206 구속성이며, 내인성으로 제시된 야생형의 WT1187 펩타이드를 인식하여 세포독성 활성을 나타낸다는 것이 명확하게 되었다.
실시예 9∼12의 결과로부터, WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드인 WT1126P1F 펩타이드, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P3M 펩타이드 및 WT1126P9V 펩타이드의 자극으로 유도된 CTLs는 HLA-A*0206 구속성이며, 내인성으로 제시된 야생형의 WT1126 펩타이드를 인식하여, 세포독성 활성을 나타내는 것이 명확하게 되었다. 이중에서도, WT1126P9V 펩타이드, WT1126P2L 펩타이드 및 WT1126P3M 펩타이드는 효과가 높았다.
WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드인 WT1187P1F 펩타이드, WT1187P2M 펩타이드 및 WT1187P3M 펩타이드의 자극으로 유도된 CTLs는 HLA-A*0206 구속성이며, 내인성으로 제시된 야생형의 WT1187 펩타이드를 인식하여 세포독성 활성을 나타내는 것이 명확하게 되었다. 이중에서도, WT1187P2M 펩타이드 및 WT1187P1F 펩타이드는 효과가 높았다.
따라서, 이들 변형 펩타이드는 HLA-A*0206 양성자에 있어서 WT1 유전자의 발현 수준의 상승을 수반하는 암의 치료 및 예방에 유효한 것으로 나타났다.
WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드인 WT1126P1F 펩타이드, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P3M 펩타이드 및 WT1126P9V 펩타이드의 자극으로 유도된 CTLs는 HLA-A*0201 구속성이며, 내인성으로 제시된 야생형의 WT1126 펩타이드를 인식하여 세포독성 활성을 나타내는 것이 명확하게 되었다. 이중에서도, WT1126P1F 펩타이드 및 WT1126P2L 펩타이드는 효과가 높았다.
WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드인 WT1187P1F 펩타이드, WT1187P2M 펩타이드 및 WT1187P3M 펩타이드의 자극으로 유도된 CTLs는 HLA-A*0201 구속성이며, 내인성으로 제시된 야생형의 WT1187 펩타이드를 인식하여 세포독성 활성을 나타내는 것이 명확하게 되었다. 이중에서도, WT1187P2M 펩타이드 및 WT1187P1F 펩타이드는 효과가 높았다. 따라서, 이들 변형 펩타이드는 HLA-A*0201 양성자에 있어서 WT1 유전자의 발현 수준의 상승을 수반하는 암의 치료 및 예방에 유효한 것으로 나타났다.
실시예 13 WT1187P2V 펩타이드(SVGEQQYSV; 서열번호 13; H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH)의 합성
1. 보호 펩타이드 수지(H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin)의 합성
Fmoc-Val-Alko-수지(여기서, Alko는 p-알콕시벤질알코올) 0.4g (와타나베 화학제; 0.80mmol/g)을 Advanced ChemTech사제 ACT496형 고상 합성기(ACT496 solid-phase synthesizer)의 반응조내에 넣고, DMF(N,N'-디메틸포름아미드)로 세척(공정 1), 25% 피페리딘 DMF 용액으로 처리(5분×1회 및 30분×1회)하여 Fmoc기를 절단한 후(공정 2), 다시 DMF로 수지를 세척하여(공정 3) H-Val-Alko-수지를 얻었다. 이 반응조 내에 NMP(N-메틸피롤리디논) 0.7mL 및 DIPCI(N,N'-디이소프로필카르보디이미드) 121mg(0.96mmol)의 NMP용액 0.9mL을 가하고, 또한 Fmoc-Ser(tBu)-OH 368mg(0.96mmol) 및 HOBT(1-히드록시벤조트리아졸) 1수화물 147mg(0.96mmol)의 NMP 용액 1.8mL을 가하여 60분간 실온에서 커플링 반응을 수행하였다(공정 4). 동량의 Fmoc-Ser(tBu)-OH, HOBT 1수화물, 및 DIPCI를 이용하여 다시 커플링 반응을 수행하고(공정 5), 수지를 DMF로 세척(공정 6), 탈보호(공정 7), 및 세척(공정 8)을 수행함으로써 H-Ser(tBu)-Val-Alko-수지를 얻었다. 이후, 공정 4로부터 공정 8을 반복함으로써, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, 및 Fmoc-Ser(tBu)-OH를 순차 커플링하였다. 반응조로부터 펩타이드 수지를 꺼내어 에테르로 세척하고, 이후 감압건조함으로써 H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin 980mg를 얻었다. 상기 합성 공정의 개요를 표 6에 나타낸다.
<합성 공정>
공정 시약 처리회수 시간(분)
1) 세척 DMF 3mL 5 0.3
2) 탈보호 25% 피페리딘/DMF 3mL 1
1		 5
30
3) 세척 DMF 3mL 5 0.3
4) 커플링 각 Fmoc-아미노산(3 당량),
HOBT(3 당량),
DIPCI(3 당량)/NMP 3.4mL		 1 60
5) 커플링 각 Fmoc-아미노산 (3 당량),
HOBT(3 당량),
DIPCI(3 당량)/NMP 3.4mL		 1 60
6) 세척 DMF 3mL 5 0.3
7) 탈보호 25% 피페리딘/DMF 3mL 1
1		 5
30
8) 세척 DMF 3mL 5 0.3
2. 보호 펩타이드 수지의 탈보호
H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-Resin 980mg에 트리플루오로아세트산/물/트리이소프로필실란(95/2.5/2.5(용량비)) 혼합액 5mL을 가하고, 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 여액을 차가운 디에틸 에테르에 가하고, 얻어진 석출물을 글래스 필터로 여과하여 취하였다. 상기 잔사를 디에틸 에테르로 세척하고, 감압건조함으로써 조(crude) 펩타이드 268mg를 얻었다.
3. 조 펩타이드의 정제
얻어진 조 펩타이드 268mg를 20% 초산수용액에 용해시키고, 역상 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
펌프: 시마츠 LC-8A
컬럼: YMC-Pack Pro C18 AS12S11-2530WT 3cmΦ×25cm
용출액 1: H2O/0.1% TFA
용출액 2(2액): CH3CN/0.1% TFA
유속: 10mL/min
검출: UV220nm
컬럼을 2액 농도 1%로 평형화한 후, 조 펩타이드 용액을 충전했다. 이 후 30분간 걸어서 2액 농도 8%로 상승시키고, 추가로 120분간 걸어서 2액 농도를 14%로 상승시켰다. 목적물을 포함하는 분획을 모아 아세토니트릴을 감압증류하여 제거하고, 동결 건조함으로써, 목적으로 하는 WT1187P2V 펩타이드(SVGEQQYSV; 서열번호 13; H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH) 105mg를 얻었다.
정제 후의 펩타이드의 HPLC 분석 및 질량분석에서 사용한 조건은 아래와 같다.
HPLC분석(시마츠 LC-10Avp)
컬럼: YMC-Pack Pro C18 AS-302 4.6mmΦ×150mm
용출액 1: H2O/0.1% TFA
용출액 2: CH3CN/0.1% TFA
구배(Gradient): 용출액 2의 농도를 30분간으로 10%로부터 40%로 상승시켰다.
유속: 1mL/min
검출: UV220nm
순도: 97.4%, 체류시간(retention time): 11.22분
아미노산 분석(히타치 L-8500 아미노산 분석장치)
가수분해: 1% 페놀 / 6N 염산 수용액, 110℃ 24시간
분석법: 닌히드린법(Ninhydrin method)
Ser:1.78(2) Glx:3.26(3) *Gly:(1) Val:2.04(2) Tyr:1.06(1)
*)Gly= 기준 아미노산, ()내 이론치
질량분석 (Applied Biosystems API 150EX 질량분석계)
m/z = 996.9 [M+1]+ (이론치=996.5)
아미노산 서열 분석 (Applied Biosystems 491 Protein sequencer)
N-말단 Ser으로부터 C-말단 Val까지 순차 확인하였다.
상기와 같이 하여, 표 7 및 표 8에 나타낸 각각의 펩타이드를 합성하였다.
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 조 펩타이드
취득량
(mg)		 정제품
취득량
(mg)		 HPLC
순도
(%)		 HPLC
체류시간(분)		 질량
분석
(m/z)
WT1187P2Q SQGEQQYSV 14 251 88 98.2 9.21 1026.0
WT1187P2I SIGEQQYSV 15 244 91 97.6 12.98 1010.7
WT1187P2M SMGEQQYSV 16 260 22 96.9 11.91 1029.1
WT1187P3L SLLEQQYSV 17 238 176 96.8 18.24 1066.9
WT1187P3A SLAEQQYSV 18 268 172 99.1 13.67 1024.8
WT1187P3V SLVEQQYSV 19 267 182 98.7 15.26 1052.8
WT1187P3M SLMEQQYSV 20 280 63 94.8 16.12 1084.8
WT1187P3P SLPEQQYSV 21 227 132 98.1 14.02 1050.8
WT1187P3W SLWEQQYSV 22 248 40
(조 펩타이트 100mg으로부터)		 99.4 20.00 1139.5
WT1187P3F SLFEQQYSV 23 224 110 98.3 19.44 1100.8
WT1187P3Y SLYEQQYSV 24 236 114 98.5 15.76 1116.7
WT1187P3S SLSEQQYSV 25 261 130 99.1 13.33 1040.8
WT1187P3I SLIEQQYSV 26 270 162 97.3 17.51 1066.9
펩타이드 아미노산 서열 서열
번호		 조 펩타이드
취득량(mg)		 정제품
취득량
(mg)		 HPLC
순도
(%)		 HPLC
체류시간
(분)		 질량
분석
(m/z)
WT1126P2V RVFPNAPYL 36 253 130 96.5 20.65 1077.1
WT1126P2Q RQFPNAPYL 37 274 87 98.7 18.43 1106.1
WT1126P2A RAFPNAPYL 38 240 63 99.0 19.03 1049.1
WT1126P9A RMFPNAPYA 50 262 139 94.3 16.59 1066.8
WT1126P9M RMFPNAPYM 52 295 167 95.7 19.75 1126.8
표 9 ∼ 표 12에 나타낸 각 펩타이드도 동일하게 합성하였다. 단, 정제 후의 펩타이드의 HPLC 분석 및 질량분석에서 사용한 조건은 아래와 같다.
HPLC 분석(Agilent HP1100 또는 Thermo Fisher Scientific Surveyor)
컬럼: Thermo Fischer Scientific BioBasic-18 3mmΦ×250mm
용출액 1: H2O/0.1% TFA
용출액 2: CH3CN/0.1% TFA
구배(Gradient): 용출액 2의 농도를 20분간 걸어 표에 기재된 농도로 변화시켰다.
유속: 0.4mL/min
검출: 215nm
질량분석
Thermo Bioanalysis Dynamo 질량분석계 (MALDI-TOF)
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HPLC
순도
(%)		 HPLC
체류시간
(분)		 HPLC
구배		 질량
분석
(m/z)
WT1187P1G GLGEQQYSV 4 100 12.72 5-60% 980.7
WT1187P1A ALGEQQYSV 5 98.9 12.00 10-50% 993.0
WT1187P1V VLGEQQYSV 6 98.9 14.98 5-50% 1022.3
WT1187P1L LLGEQQYSV 7 97.6 12.75 10-65% 1037.6
WT1187P1I ILGEQQYSV 8 98.8 13.46 5-60% 1037.2
WT1187P1M MLGEQQYSV 9 95.5 14.15 5-60% 1054.0
WT1187P1W WLGEQQYSV 10 98.9 15.60 5-60% 1109.9
WT1187P1F FLGEQQYSV 11 95.8 13.14 10-65% 1070.8
WT1187P9L SLGEQQYSL 53 95.4 12.49 10-55% 1024.6
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HPLC
순도
(%)		 HPLC
체류시간
(분)		 HPLC
구배		 질량
분석
(m/z)
WT1126P1G GMFPNAPYL 27 99.6 15.39 10-70% 1009.5
WT1126P1A AMFPNAPYL 28 98.8 13.79 10-85% 1023.3
WT1126P1V VMFPNAPYL 29 98.4 14.00 10-85% 1052.2
WT1126P1L LMFPNAPYL 30 98.9 14.91 10-80% 1066.3
WT1126P1I IMFPNAPYL 31 99.2 13.93 10-80% 1065.4
WT1126P1M MMFPNAPYL 32 100 13.77 10-80% 1083.5
WT1126P1W WMFPNAPYL 33 97.5 15.64 10-80% 1139.3
WT1126P1F FMFPNAPYL 34 98.8 14.78 10-85% 1099.7
WT1126P2L RLFPNAPYL 39 98.6 13.11 10-80% 1090.9
WT1126P2I RIFPNAPYL 40 100 13.74 10-70% 1090.1
WT1126P3I RMIPNAPYL 41 97.4 14.17 10-70% 1076.7
WT1126P3L RMLPNAPYL 42 100 13.88 10-65% 1076.4
WT1126P3G RMGPNAPYL 43 96.7 12.63 10-65% 1020.9
WT1126P3A RMAPNAPYL 44 95.2 13.95 10-60% 1034.9
WT1126P3V RMVPNAPYL 45 92.9 14.67 10-60% 1062.7
WT1126P3M RMMPNAPYL 46 91.8 14.87 10-60% 1094.8
WT1126P3P RMPPNAPYL 47 95.8 13.56 10-65% 1058.8
WT1126P3W RMWPNAPYL 48 99.6 15.21 10-70% 1149.7
WT1126P9V RMFPNAPYV 49 99.2 13.86 10-60% 1096.5
WT1126P9I RMFPNAPYI 51 99.4 14.00 10-65% 1110.7
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HPLC
순도
(%)		 HPLC
체류시간
(분)		 HPLC
구배		 질량
분석
(m/z)
WT1187P1D DLGEQQYSV 54 96.6 13.43 5-60% 1038.2
WT1187P1E ELGEQQYSV 55 96.4 11.83 10-60% 1052.2
WT1187P1H HLGEQQYSV 56 98.0 15.79 5-40% 1060.2
WT1187P1K KLGEQQYSV 57 99.0 13.77 5-45% 1052.2
WT1187P1N NLGEQQYSV 58 95.8 14.34 5-50% 1037.0
WT1187P1P PLGEQQYSV 59 95.9 14.68 5-50% 1020.0
WT1187P1Q QLGEQQYSV 60 96.8 13.28 5-60% 1051.3
WT1187P1R RLGEQQYSV 61 100 13.27 5-60% 1079.6
WT1187P1T TLGEQQYSV 62 96.7 14.40 5-50% 1025.0
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HPLC
순도
(%)		 HPLC
체류시간
(분)		 HPLC
구배		 질량
분석
(m/z)
WT1126P1D DMFPNAPYL 63 99.2 14.72 10-75% 1067.3
WT1126P1E EMFPNAPYL 64 99.1 15.20 5-70% 1082.1
WT1126P1H HMFPNAPYL 65 96.7 14.52 10-70% 1089.9
WT1126P1K KMFPNAPYL 66 95.9 13.96 10-75% 1080.0
WT1126P1N NMFPNAPYL 67 99.8 14.69 10-75% 1066.3
WT1126P1P PMFPNAPYL 68 96.9 14.26 10-80% 1049.3
WT1126P1Q QMFPNAPYL 69 95.1 14.94 10-70% 1080.3
WT1126P1S SMFPNAPYL 70 99.8 14.28 10-80% 1040.8
WT1126P1T TMFPNAPYL 71 98.8 13.72 10-85% 1053.5
WT1126P2I&P9I RIFPNAPYI 72 97.0 14.23 10-65% 1089.5
WT1126P2I&P9V RIFPNAPYV 73 100 12.23 10-80% 1077.0
WT1126P2L&P9I RLFPNAPYI 74 97.7 13.43 10-75% 1090.8
WT1126P2L&P9V RLFPNAPYV 75 97.0 12.83 10-75% 1076.9
실시예 14 (HLA-A*0201 발현 트랜스제닉(transgenic) 마우스를 이용한 변형 펩타이드의 특이적 면역세포 유도 활성능의 평가, 및 유도된 특이적 면역세포의 야생형 펩타이드에 대한 교차 반응성의 확인)
<방법>
(1) 변형 펩타이드 후보
WT1187 펩타이드, WT1126 펩타이드 및 이들의 변형 펩타이드(WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드의 N-말단으로부터 1번째, 2번째, 3번째 또는 9번째의 하나 또는 둘의 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환한 펩타이드)에 대하여, 해당 기술분야에 있어서 기지의 방법인 BIMAS(http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html), SYFPEITHI(http://www.mpiib-berlin.mpg. de/MAPPP/binding.html), RANLPEP(http://immunax.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) 및 NetMHC 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)의 4개의 컴퓨터 데이터베이스의 방법을 이용하여, HLA-A*0201 분자에 대한 결합성(친화성)을 분석하였다. WT1187 펩타이드 및 그의 변형 펩타이드의 분석 결과를 표 13∼16 및 표 21에, WT1126 펩타이드 및 그의 변형 펩타이드의 분석 결과를 표 17∼20 및 표 22∼23에 각각 나타냈다. 추정되는 결합성의 크기를 스코어(Score)에 의해 나타낸다.
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1187 SLGEQQYSV 2 285 27 96/64.43% 0.721
WT1187P1A ALGEQQYSV 5 285 27 95/63.76% 0.720
WT1187P1F FLGEQQYSV 11 1312 26 82/55.03% 0.862
WT1187P1G GLGEQQYSV 4 285 26 86/57.72% 0.672
WT1187P1I ILGEQQYSV 8 485 27 90/60.40% 0.698
WT1187P1L LLGEQQYSV 7 485 27 89/59.73% 0.719
WT1187P1M MLGEQQYSV 9 485 25 92/61.74% 0.770
WT1187P1V VLGEQQYSV 6 485 26 92/61.74% 0.705
WT1187P1W WLGEQQYSV 10 1312 25 71/47.65% 0.693
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1187 SLGEQQYSV 2 285 27 96/64.43% 0.721
WT1187P2I SIGEQQYSV 15 39 25 85/57.05% 0.556
WT1187P2M SMGEQQYSV 16 206 25 84/56.38% 0.740
WT1187P2Q SQGEQQYSV 14 29 17 52/34.90% 0.455
WT1187P2V SVGEQQYSV 13 25 21 78/52.35% 0.461
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1187 SLGEQQYSV 2 285 27 96/64.43% 0.721
WT1187P3A SLAEQQYSV 18 285 29 110/73.83% 0.811
WT1187P3F SLFEQQYSV 23 1055 28 114/76.51% 0.852
WT1187P3I SLIEQQYSV 26 285 29 115/77.18% 0.817
WT1187P3L SLLEQQYSV 17 1055 29 116/77.85% 0.839
WT1187P3M SLMEQQYSV 20 1055 28 114/76.51% 0.876
WT1187P3P SLPEQQYSV 21 285 27 95/63.76% 0.748
WT1187P3S SLSEQQYSV 25 285 27 110/73.83% 0.793
WT1187P3V SLVEQQYSV 19 285 27 113/75.84% 0.766
WT1187P3W SLWEQQYSV 22 2367 28 98/65.77% 0.863
WT1187P3Y SLYEQQYSV 24 913 28 111/74.50% 0.854
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1187 SLGEQQYSV 2 285 27 96/64.43% 0.721
WT1187P9L SLGEQQYSL 53 88 27 89/59.73% 0.640
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% 0.802
WT1126P1A AMFPNAPYL 28 314 24 77/51.68% 0.808
WT1126P1F FMFPNAPYL 34 1444 23 64/42.95% 0.909
WT1126P1G GMFPNAPYL 27 314 23 68/45.64% 0.795
WT1126P1I IMFPNAPYL 31 534 24 72/48.32% 0.802
WT1126P1L LMFPNAPYL 30 534 24 71/47.65% 0.819
WT1126P1M MMFPNAPYL 32 534 22 74/49.66% 0.852
WT1126P1V VMFPNAPYL 29 534 23 74/49.66% 0.804
WT1126P1W WMFPNAPYL 33 1444 22 53/35.57% 0.799
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% 0.802
WT1126P2A RAFPNAPYL 38 6 18 47/31.54% 0.376
WT1126P2I RIFPNAPYL 40 60 22 71/47.65% 0.640
WT1126P2L RLFPNAPYL 39 435 24 82/55.03% 0.784
WT1126P2Q RQFPNAPYL 37 44 14 38/25.50% 0.485
WT1126P2V RVFPNAPYL 36 38 18 64/42.95% 0.552
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% 0.802
WT1126P3A RMAPNAPYL 44 85 23 66/44.30% 0.734
WT1126P3G RMGPNAPYL 43 85 21 52/34.90% 0.602
WT1126P3I RMIPNAPYL 41 85 23 71/47.65% 0.741
WT1126P3L RMLPNAPYL 42 314 23 72/48.32% 0.781
WT1126P3M RMMPNAPYL 46 314 22 70/46.98% 0.834
WT1126P3P RMPPNAPYL 47 85 21 51/34.23% 0.613
WT1126P3V RMVPNAPYL 45 85 21 69/46.31% 0.680
WT1126P3W RMWPNAPYL 48 2293 22 61/40.94% 0.867
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% 0.802
WT1126P9A RMFPNAPYA 50 73 16 53/35.57% 0.731
WT1126P9I RMFPNAPYI 51 153 20 74/49.66% 0.790
WT1126P9M RMFPNAPYM 52 73 16 65/43.62% 0.686
WT1126P9V RMFPNAPYV 49 1022 22 77/51.68% 0.838
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1187 SLGEQQYSV 2 285 27 96/64.43% 0.721
WT1187P1D DLGEQQYSV 54 21 24 81/54.36% 0.252
WT1187P1E ELGEQQYSV 55 21 22 85/57.05% 0.366
WT1187P1H HLGEQQYSV 56 10 25 83/55.70% 0.610
WT1187P1K KLGEQQYSV 57 998 26 89/59.73% 0.745
WT1187P1N NLGEQQYSV 58 285 25 90/60.40% 0.613
WT1187P1P PLGEQQYSV 59 6 22 78/52.35% 0.287
WT1187P1Q QLGEQQYSV 60 285 25 87/58.39% 0.630
WT1187P1R RLGEQQYSV 61 285 25 88/59.06% 0.690
WT1187P1T TLGEQQYSV 62 285 25 93/62.42% 0.669
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% 0.802
WT1126P1D DMFPNAPYL 63 24 21 63/42.28% 0.353
WT1126P1E EMFPNAPYL 64 24 19 67/44.97% 0.501
WT1126P1H HMFPNAPYL 65 11 22 65/43.62% 0.747
WT1126P1K KMFPNAPYL 66 1099 23 71/47.65% 0.841
WT1126P1N NMFPNAPYL 67 314 22 72/48.32% 0.734
WT1126P1P PMFPNAPYL 68 7 19 60/40.27% 0.802
WT1126P1Q QMFPNAPYL 69 314 22 69/46.31% 0.757
WT1126P1S SMFPNAPYL 70 314 24 78/52.35% 0.819
WT1126P1T TMFPNAPYL 71 314 22 75/50.34% 0.779
펩타이드 아미노산
서열		 서열
번호		 HLA-A*0201 결합 스코어
BIMAS SYFPEITHI RANKPEP NetMHC3.0
WT1126 RMFPNAPYL 3 314 22 70/46.98% 0.802
WT1126P2I&P9I RIFPNAPYI 72 29 20 75/50.34% 0.617
WT1126P2I&P9V RIFPNAPYV 73 195 22 78/52.35% 0.722
WT1126P2L&P9I RLFPNAPYI 74 212 22 86/57.72% 0.780
WT1126P2L&P9V RLFPNAPYV 75 1415 24 89/59.73% 0.818
임의의 1개의 데이터베이스에서도 야생형 펩타이드(WT1187 펩타이드 또는 WT1126 펩타이드)와 동등 또는 그 이상의 결합성을 갖는 것으로 추정된 변형 펩타이드를, 야생형 펩타이드와 함께, 계속된 (2)∼(4)의 시험 대상으로 삼았다.
(2) 펩타이드의 약제조제와 투여
실시예 13에서 합성하여 동결 건조한 펩타이드를 DMSO(나카라이테스크사(Nacalai Tesque, Inc.)제)에서 40mg/mL로 조제하였다. 그 후, 조제한 펩타이드 DMSO액 32.5μL과 540μL의 주사용 증류수(오츠쯔카제약사제)를 혼합하였다. 이어서, 이 혼합액 550μL을 유리 시린지를 이용하여 700μL의 프로인트 불완전 아주반트(Freund's incomplete adjuvant)(Montanide ISA-51)과 혼합함으로써 유중수(water-in-oil) 에멀젼을 제작하였다. 300μL의 해당 약제(유중수 에멀젼)을 HLA-A*0201 발현 트랜스제닉 마우스(종명(strain name): HLA-A2+HLA-DR1+/Iaβ°β2m, EMMA ID 번호 EM:01783)의 꼬리 기저부(base of the tail)에 피하주사하여 면역시켰다. 1 펩타이드당 2 또는 3마리의 마우스를 이용하여 평가하였다.
(3) 비장세포(splenic cells)의 조제
면역 7일후에 비장을 적출하였다. 슬라이드 글라스의 프로스트 부분(frothed part)으로 문질러 파괴한 뒤, ACK Lysing Buffer(Lonza사제)로 용혈처리함으로써 비장세포를 조제하였다. 이때 CTM(Complete T-cell Medium, 인비트로젠사제의 RPMI-1640 배지에 10% FBS, 10mM HEPES, 20mM L-글루타민, 1mM 피루빈산 나트륨(sodium pyruvate), 1mM MEM 비필수 아미노산, 1% MEM 비타민 및 55μM 2-머캅토에탄올을 최종농도로 첨가)을 배지로서 이용하여 비장 세포 농도 5×106cells/mL로 조제하였다.
(4) 엘리스팟 법(Elispot method)
IFNγ을 지표로 한 ELISPOT 법을 실시하여, 투여한 펩타이드가 WT1-특이적인 면역세포의 유도 활성을 갖는지 여부를 평가하였다. 방법은 첨부서를 따라서 수행하였다. ELISPOT(일본 벡톤디킨슨사제 카탈로그 번호 551083)의 플레이트에, 우선 CTM 배지를 1웰당 50μL씩 파종한 뒤, 비장세포 함유액을 100μL씩 파종했다 (1웰당 5×105cells). 또한, 투여 펩타이드 또는 야생형 펩타이드를 1웰당 50μL씩 첨가하였다(펩타이드 최종농도 2μg/mL). 상기 분석방법은 세포독성 활성을 예측할 수 있는 대체법의 하나로서 알려져 있다(J. Immunological Methods, 1995, 181, 45-54).
<결과>
WT1187 펩타이드의 변형 펩타이드의 특이적 세포면역 유도 활성의 평가 결과를 도 19 ∼ 도 22 및 도 28 ∼ 도 29에, WT1126 펩타이드의 변형 펩타이드의 평가 결과를 도 23 ∼ 도 27 및 도 30 ∼ 도 32에 각각 나타낸다. 도 19 ∼ 도 32의 각각의 도면에 있어서, 종축은 비장세포 5×105개 중에 존재하는 항원 펩타이드 특이적 반응 세포의 수(Spots/5×105cells)를, 횡축은 평가에 사용한 마우스 개체(2 또는 3마리)를 각각 나타낸다. 백색의 막대 그래프는 항원 펩타이드 미자극의 경우에 반응한 특이적 면역세포의 수, 회색의 막대 그래프는 야생형 펩타이드에 의한 자극에 반응한 특이적 면역세포의 수, 흑색의 막대 그래프는 투여 (변형) 펩타이드에 의한 자극에 반응한 특이적 면역세포의 수를 각각 나타낸다.
도 19∼32의 각 도면은 하기 펩타이드의 특이적인 세포면역 유도활성을 각각 나타낸다.
도 19 a:WT1187P1A 펩타이드, b:WT1187P1F 펩타이드, c:WT1187P1G 펩타이드, d:WT1187P1I 펩타이드, e:WT1187P1L 펩타이드, f;WT1187P1M 펩타이드.
도 20 a:WT1187P1V 펩타이드, b:WT1187P1W 펩타이드, c:WT1187P2I 펩타이드, d:WT1187P2M 펩타이드, e:WT1187P2Q 펩타이드, f:WT1187P2V 펩타이드.
도 21 a:WT1187P3A 펩타이드, b:WT1187P3F 펩타이드, c:WT1187P3I 펩타이드, d:WT1187P3L 펩타이드, e:WT1187P3M 펩타이드, f:WT1187P3P 펩타이드.
도 22 a:WT1187P3S 펩타이드, b:WT1187P3V 펩타이드, c:WT1187P3W 펩타이드, d:WT1187P3Y 펩타이드, e:WT1187P9L 펩타이드.
도 23 a:WT1126P1A 펩타이드, b:WT1126P1F 펩타이드, c:WT1126P1G 펩타이드, d:WT1126P1I 펩타이드, e:WT1126P1L 펩타이드, f:WT1126P1M 펩타이드.
도 24 a:WT1126P1V 펩타이드, b:WT1126P1W 펩타이드, c:WT1126P2A 펩타이드, d:WT1126P2I 펩타이드, e:WT1126P2L 펩타이드, f:WT1126P2Q 펩타이드.
도 25 a:WT1126P2V 펩타이드, b:WT1126P3A 펩타이드, c:WT1126P3G 펩타이드, d:WT1126P3I 펩타이드, e:WT1126P3L 펩타이드, f:WT1126P3M 펩타이드.
도 26 a:WT1126P3P 펩타이드, b:WT1126P3V 펩타이드, c:WT1126P3W 펩타이드, d:WT1126P9A 펩타이드, e:WT1126P9I 펩타이드, f:WT1126P9M 펩타이드.
도 27: WT1126P9V 펩타이드.
도 28 a:WT1187P1D 펩타이드, b:WT1187P1E 펩타이드, c:WT1187P1H 펩타이드, d:WT1187P1K 펩타이드.
도 29 a:WT1187P1N 펩타이드, b:WT1187P1P 펩타이드, c:WT1187P1Q 펩타이드, d:WT1187P1R 펩타이드, e:WT1187P1T 펩타이드.
도 30 a:WT1126P1D 펩타이드, b:WT1126P1E 펩타이드, c:WT1126P1H 펩타이드, d:WT1126P1K 펩타이드, e:WT1126P1N 펩타이드, f:WT1126P1P 펩타이드.
도 31 a:WT1126P1Q 펩타이드, b:WT1126P1S 펩타이드, c:WT1126P1T 펩타이드, d:WT1126P2I&P9I 펩타이드, e:WT1126P2I&P9V 펩타이드, f:WT1126P2L&P9I 펩타이드.
도 32: WT1126P2L&P9V 펩타이드.
이들 결과로부터, WT1187P1D 펩타이드, WT1187P1E 펩타이드, WT1187P1H 펩타이드, WT1187P1P 펩타이드 또는 WT1187P2Q 펩타이드, 또는 WT1126P1D 펩타이드, WT1126P1E 펩타이드, WT1126P1P 펩타이드, WT1126P2A 펩타이드 또는 WT1126P2Q 펩타이드를 제외한 변형 펩타이드를 투여한 경우에, 현저하게 특이적 면역세포가 효율적으로 유도되는 것이 밝혀졌다.
이어서, 변형 펩타이드에 의해 유도된 특이적 면역세포의 야생형 펩타이드에 대한 교차 반응성에 대하여 분석하였다(표 24∼25). 그 결과, WT1187 변형 펩타이드 중, WT1187P1A 펩타이드, WT1187P1I 펩타이드, WT1187P1L 펩타이드, WT1187P1M 펩타이드, WT1187P1N 펩타이드, WT1187P1Q 펩타이드, WT1187P1T 펩타이드, WT1187P1V 펩타이드, WT1187P2V 펩타이드, WT1187P2M 펩타이드, WT1187P2I 펩타이드, WT1187P3A 펩타이드, WT1187P3F 펩타이드, WT1187P3P 펩타이드, WT1187P3S 펩타이드, WT1187P3V 펩타이드 및 WT1187P9L 펩타이드가, WT1126 변형 펩타이드 중, WT1126P1S 펩타이드, WT1126P2I 펩타이드, WT1126P2L 펩타이드, WT1126P2V 펩타이드, WT1126P3W 펩타이드, WT1126P9I 펩타이드, WT1126P9M 펩타이드 및 WT1126P9V 펩타이드가, 변형 펩타이드 및 야생형 펩타이드 양자를 효율적으로 인식가능한 특이적 면역세포를 특히 유도할 수 있는 것이 밝혀졌다.
교차
반응성(%)		 WT1187 펩타이드의 변형체
1번위치 변형 2번위치 변형 3번위치 변형 9번위치 변형
80-100 WT1187P1A
WT1187P1N
WT1187P1Q
WT1187P1T
WT1187P1V		 WT1187P2V
WT1187P2M
WT1187P2I		 WT1187P3A
WT1187P3P
WT1187P3S		 WT1187P9L
60-80 WT1187P1I
WT1187P1L
WT1187P1M		 WT1187P3F
WT1187P3V
40-60 WT1187P1R WT1187P3Y
20-40 WT1187P1F
WT1187P1W		 WT1187P3L
0-20 WT1187P1G
WT1187P1K		 WT1187P3I
WT1187P3M
WT1187P3W
ND* WT1187P1D
WT1187P1E
WT1187P1H
WT1187P1P		 WT1187P2Q
교차
반응성
(%)		 WT1126 펩타이드의 변형체
1번위치 변형 2번위치 변형 3번위치 변형 9번위치 변형 2번 및 9번위치 변형
80-100 WT1126P2L
WT1126P2V		 WT1126P3W WT1126P9M
WT1126P9I
60-80 WT1126P1S WT1126P2I WT1126P9V
40-60 WT1126P1A
WT1126P1H
WT1126P1K
WT1126P1M
WT1126P1N
20-40 WT1126P1G
WT1126P1I
WT1126P1Q
WT1126P1W		 WT1126P9A
0-20 WT1126P1F
WT1126P1L
WT1126P1T
WT1126P1V		 WT1126P3A
WT1126P3G
WT1126P3I
WT1126P3L
WT1126P3M
WT1126P3P
WT1126P3V		 WT1126P2I&P9I
WT1126P2I&P9V
WT1126P2L&P9I
WT1126P2L&P9V
ND* WT1126P1D
WT1126P1E
WT1126P1P		 WT1126P2Q
WT1126P2A
ND*: 활성이 없어 측정불가능
본 발명의 암 백신 조성물은 HLA-A*0206 양성자의 WT1을 발현하는 암의 치료 및 예방에 사용하는 의약으로서 유용하다. 본 발명의 암 백신 조성물은 또한, HLA-A*0201 양성자의 WT1을 발현하는 암의 치료 및 예방에 사용하는 의약으로서 유용하다.
<110> International Institute of Cancer Immunology, Inc. <120> CANCER VACCINE COMPOSITION <130> G06F2975 <150> JP2007-314552 <151> 2007-12-05 <160> 75 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95 Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175 Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln 180 185 190 Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205 Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220 Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln 225 230 235 240 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270 Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile 275 280 285 His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro 290 295 300 Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320 Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335 Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350 Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365 Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln 370 375 380 Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415 Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430 Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala 435 440 445 Leu <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Gly Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Ala Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Val Leu Gly Glu Gln Gln Tyr 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<211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 22 Ser Leu Trp Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 23 Ser Leu Phe Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 24 Ser Leu Tyr Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 25 Ser Leu Ser Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 26 Ser Leu Ile Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Gly Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 28 Ala Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 29 Val Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 30 Leu Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 31 Ile Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 32 Met Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 33 Trp Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 34 Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 35 Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Arg Val Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 37 Arg Gln Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 38 Arg Ala Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 39 Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 40 Arg Ile Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 41 Arg Met Ile Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 42 Arg Met Leu Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 43 Arg Met Gly Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 44 Arg Met Ala Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 45 Arg Met Val Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 46 Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 47 Arg Met Pro Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 48 Arg Met Trp Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 49 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 50 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Ala 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 51 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Ile 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 52 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Met 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 53 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Leu 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 54 Asp Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 55 Glu Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 56 His Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 57 Lys Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 58 Asn Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 59 Pro Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 60 Gln Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 61 Arg Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 62 Thr Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 63 Asp Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 64 Glu Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 65 His Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 66 Lys Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 67 Asn Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 68 Pro Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 69 Gln Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 70 Ser Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 71 Thr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 72 Arg Ile Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Ile 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 73 Arg Ile Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 74 Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Ile 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 75 Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val 1 5

Claims (16)

  1. 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 포함하는, 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용 암 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질이 하기 (a) 또는 (b)의 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열
    (b) 아미노산 서열(a)에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 HLA-A*0206 양성자에 대하여 면역원성을 갖는 단백질
  3. 제1항에 있어서, 부분 펩타이드가,
    WT1187 펩타이드: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 2),
    WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3),
    WT1187P1F 펩타이드: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 11),
    WT1187P2M 펩타이드: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 16),
    WT1187P3M 펩타이드: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 20),
    WT1126P1F 펩타이드: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 34),
    WT1126P2L 펩타이드: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 39),
    WT1126P3M 펩타이드: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 46), 또는
    WT1126P9V 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(서열번호 49)
    인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가로 아주반트를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 코딩하는 DNA를 포함하는 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용 암 백신 조성물.
  6. 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질 또는 그의 부분 펩타이드를 코딩하는 RNA를 포함하는 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용 암 백신 조성물.
  7. 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자 유래의 말초혈 단핵구를, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드의 존재하에서 배양하여, 상기 말초혈 단핵구로부터 WT1-특이적인 CTLs를 유도하는 공정을 포함하는, WT1-특이적인 CTLs의 유도방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 부분 펩타이드가
    WT1187 펩타이드: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 2),
    WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3),
    WT1187P1F 펩타이드: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 11),
    WT1187P2M 펩타이드: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 16),
    WT1187P3M 펩타이드: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 20),
    WT1126P1F 펩타이드: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 34),
    WT1126P2L 펩타이드: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 39),
    WT1126P3M 펩타이드: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 46), 또는
    WT1126P9V 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(서열번호 49)
    인 것을 특징으로 하는 유도방법.
  9. 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자 유래의 미성숙 수지상 세포를, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드의 존재하에서 배양하여, 상기 미성숙 수지상 세포로부터 상기 부분 펩타이드를 제시하는 수지상 세포를 유도하는 공정을 포함하는, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드를 제시하는 수지상 세포의 생체 외(ex vivo) 유도방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 부분 펩타이드가
    WT1187 펩타이드: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 2),
    WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3),
    WT1187P1F 펩타이드: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 11),
    WT1187P2M 펩타이드: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 16),
    WT1187P3M 펩타이드: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 20),
    WT1126P1F 펩타이드: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 34),
    WT1126P2L 펩타이드: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 39),
    WT1126P3M 펩타이드: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 46), 또는
    WT1126P9V 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(서열번호 49)
    인 것을 특징으로 하는 생체 외 유도방법.
  11. (i) 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자 유래의 시료 중의 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드, 이에 대한 항체 또는 WT1-특이적인 CTLs를 검출 또는 정량하는 공정 및 이어서 상기 부분 펩타이드, 이에 대한 항체 또는 WT1-특이적인 CTLs의 양을, 암을 발증하지 않는 경우와 비교하는 공정, 또는
    (ii) 제7항에 따른 방법에 의해 유도된 WT1-특이적인 CTLs 또는 제9항에 따른 방법에 의해 유도된 수지상 세포가 투여된 HLA-A*0206 양성 대상자에서 상기 WT1-특이적인 CTLs 또는 수지상 세포의 위치 또는 부위를 결정하는 공정
    을 포함하는, 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자용의 시험관 내(in vitro) 암 진단방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 부분 펩타이드가
    WT1187 펩타이드: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 2),
    WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3),
    WT1187P1F 펩타이드: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 11),
    WT1187P2M 펩타이드: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 16),
    WT1187P3M 펩타이드: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 20),
    WT1126P1F 펩타이드: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 34),
    WT1126P2L 펩타이드: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 39),
    WT1126P3M 펩타이드: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 46), 또는
    WT1126P9V 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(서열번호 49)
    인 것을 특징으로 하는 시험관 내 암 진단방법.
  13. 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 조성물의 사용방법.
  14. 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한, 제3항 또는 제5항에 따른 조성물의 사용방법.
  15. 인간 백혈구 항원(HLA)-A*0206 양성자의 암의 치료 또는 예방을 위한 암 백신의 제조를 위한, 암억제 유전자 WT1의 유전자 산물인 단백질의 부분 펩타이드를 코딩하는 DNA 또는 RNA의 사용방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 부분 펩타이드가
    WT1187 펩타이드: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 2),
    WT1126 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 3),
    WT1187P1F 펩타이드: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 11),
    WT1187P2M 펩타이드: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 16),
    WT1187P3M 펩타이드: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val(서열번호 20),
    WT1126P1F 펩타이드: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 34),
    WT1126P2L 펩타이드: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 39),
    WT1126P3M 펩타이드: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(서열번호 46), 또는
    WT1126P9V 펩타이드: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val(서열번호 49)
    인 것을 특징으로 하는 사용방법.
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